玫瑰功能基因RrFLS1在調(diào)控植物類(lèi)黃酮代謝中應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及一種玫瑰功能基因RrFLS1在調(diào)控植物類(lèi)黃酮代謝中的應(yīng)用。分離得到玫瑰花色功能基因RrFLS1，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示，其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)的序列如SEQ?ID?NO：2所示。轉(zhuǎn)化試驗(yàn)表明：該基因能夠改變植物特別是煙草的花色，提高植物類(lèi)黃酮的含量。將該基因轉(zhuǎn)化煙草，使轉(zhuǎn)基因植物的花色發(fā)生改變，類(lèi)黃酮含量增加，轉(zhuǎn)基因煙草花瓣顏色由粉紅色變成白色。
【專利說(shuō)明】玫瑰功能基因RrFLSI在調(diào)控植物類(lèi)黃酮代謝中應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及一種玫瑰功能基因RrFLSl片段的分離克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。所述的基因與植物類(lèi)黃酮代謝有關(guān)。將該基因的完整翻譯區(qū)與花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子結(jié)合后直接轉(zhuǎn)入一般植物體，轉(zhuǎn)基因植株的花色發(fā)生變化，類(lèi)黃酮含量也增加了。
【背景技術(shù)】
[0002]類(lèi)黃酮(Flavonoids)是一類(lèi)在植物中廣泛存在被研究最深入的多酣類(lèi)次生代謝產(chǎn)物，目前發(fā)現(xiàn)的大約有6000多種(喬小燕等，2009)。類(lèi)黃酮在植物界分布最多的是被子植物，種類(lèi)最全，含量較高；大量研究證實(shí)類(lèi)黃酮化合物是一種強(qiáng)活性氧自由基清除劑，它可以通過(guò)抗自由基活性、抗氧活性、抗脂質(zhì)氧化活性和金屬螯合活性而發(fā)揮抗氧化活性(Benavente, 1993;Bombardelli and Morazzoni, 1993)。國(guó)內(nèi)報(bào)道沙棘總黃麗、懈皮素、盧丁、甘草黃酮 、燈蓋花素等都具有不同程度抗氧化作用(孟申等，1992)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種具有抗癌功能的類(lèi)黃酮物質(zhì)，如山奈素、槲皮素和楊梅酮等類(lèi)黃酮，可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡發(fā)揮抗癌功能(Kampa era, 2007);國(guó)內(nèi)外科研工作者發(fā)現(xiàn)類(lèi)黃酮化合物具有降血脂、膽固醇的作用，還具有抑制血栓和擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈的功能，因此可以用于治療心腦血管系統(tǒng)的一些疾病。
[0003]玫瑰(Rosa rugosa Thunb.)是薔薇科薔薇屬落葉叢生灌木,花型秀美,芳香四溢，色彩絢麗，在中國(guó)傳統(tǒng)名花中評(píng)價(jià)極高，素有“花中皇后”之稱。玫瑰具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其花瓣葉片含有多種類(lèi)黃酮物質(zhì)，應(yīng)用于醫(yī)療、保健等。
[0004]目前尚未見(jiàn)玫瑰功能基因RrFLSl在調(diào)控植物類(lèi)黃酮代謝中的應(yīng)用的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種分離的玫瑰功能基因RrFLSl，本發(fā)明的目的還涉及該基因在調(diào)控植物類(lèi)黃酮合成中的應(yīng)用，所述的基因與花色的形成相關(guān)。
[0006]本發(fā)明提供了玫瑰中表達(dá)RrFLSl的基因編碼序列及其功能，具體包括=RrFLSl基因的核苷酸編碼序列的克隆，表達(dá)載體的構(gòu)建，以及將該基因轉(zhuǎn)化宿主煙草，對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行分子鑒定和表型觀察，以評(píng)估該基因在在調(diào)控植物類(lèi)黃酮代謝中的應(yīng)用的前景。
[0007]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0008]首先從玫瑰中克隆出RrFLSl功能基因。該基因片段為具有特定序列的DNA分子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，其開(kāi)放閱讀框(編碼區(qū))為1008bp。
[0009]本發(fā)明還提供了這種玫瑰RrFLSl蛋白編碼序列，它有335個(gè)氨基酸殘基，其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0010]本發(fā)明還提供了用于調(diào)取獲得玫瑰樣品中基因RrFLSl的一對(duì)核苷酸引物。該引物對(duì)根據(jù)基因RrFLSl設(shè)計(jì)，使用該對(duì)引物對(duì)玫瑰花瓣樣品cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增可獲得IOOSbp的基因片段。所述引物對(duì)的DNA序列如下所示:
[0011]Pl 正向引物:5’ ATGGGGGTAGAGAGAGTTCAAG 3’(序列見(jiàn)序列表 SEQ ID NO:3)；
[0012]P2 反向引物:5’ TTACTGGGGGATCTTGTTGA 3’ (序列見(jiàn)序列表 SEQ ID NO:4)。
[0013]本發(fā)明還提供了一對(duì)用于檢測(cè)玫瑰RrFLSl基因在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)的核苷酸的引物對(duì)。該引物對(duì)根據(jù)基因RrFLSl設(shè)計(jì)，使用此對(duì)引物對(duì)轉(zhuǎn)化該基因的煙草樣品cDNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)該基因是否在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)，可獲得176bp的基因片段。該引物對(duì)的DNA序列如下所示:
[0014]P3 正向引物:5，TGGAGGGATACGGAACATTTTTA 3’ (序列見(jiàn)序列表 SEQ ID NO:5)；
[0015]P4 反向引物:5，CACCACCTTGTGTAGATTCTTTGC 3，(序列見(jiàn)序列表 SEQ ID NO:6)。
[0016]可利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，例如可以通過(guò)直接DNA轉(zhuǎn)化、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物技術(shù)方法將本發(fā)明提供的RrFLSl的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。使用本發(fā)明的基因片段構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前面可加上任意一種增強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或者植株進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所使用的載體進(jìn)行加工，如加入具有抗性的抗生素標(biāo)記物(例如卡那霉素或潮霉素等)。被轉(zhuǎn)化的宿主是包括煙草在內(nèi)的多種植物，培育不同花色的植物種類(lèi)。
[0017]與本發(fā)明的配套的，本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因煙草代謝物提取方法，這對(duì)于全面理解本發(fā)明的技術(shù)方案是有益的。方法是準(zhǔn)確稱取0.5g轉(zhuǎn)基因煙草植株的葉片和花瓣，加入2.5mL提取液(甲醇: 鹽酸:水體積比=70: 0.1: 29.9)于黑暗條件下4°C浸提24h，期間每隔6h用旋轉(zhuǎn)振蕩器振蕩lmin。12000rpm離心IOmin,取上清至新的離心管中，再用孔徑0.22 μ m的尼龍微孔濾器過(guò)濾后，保存于-40°C冰箱中，用于花青苷與其他類(lèi)黃酮的HPLC-DAD 分析。
[0018]本發(fā)明的配套方法還提供了一種轉(zhuǎn)基因煙草植株中類(lèi)黃酮代謝物檢測(cè)方法。具體是:使用日本島津公司生產(chǎn)的“島津液相系統(tǒng)”進(jìn)行定性分析，步驟包括:LC-20AT型二元梯度泵，SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器，CT0-20AC色譜柱控溫箱，SPD-20AC檢測(cè)器，LC-Solution工作站；色譜柱為日本Tosoh株式會(huì)社生產(chǎn)的TSK gel 0DS-80Ts QA反相硅膠柱(4.6mmX 250mm,粒徑5 μ m,日本Tosoh株式會(huì)社)。分析條件:流速0.8mL.min-1,柱溫35°C，進(jìn)樣體積10 μ L，200~800nm范圍內(nèi)全波長(zhǎng)掃描吸收光譜，在520nm和360nm波長(zhǎng)下一次性同時(shí)檢測(cè)花青苷和花黃素。流動(dòng)相組成為:A相，10%甲酸超純水(體積比)；B相，乙腈。分析時(shí)間 35min。梯度洗脫程序?yàn)?0min,90%A, 10%B ；20min, 70%A, 30%B ；25min,90%A,
10%Bo
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]序列表SEQ ID NO:1是本發(fā)明分離克隆的包含有RrFLSl基因編碼區(qū)的DNA片段(其中l(wèi)-1008bp為CDS)。序列全長(zhǎng)為1008bp，編碼335個(gè)氨基酸。
[0020]序列表SEQ ID N0:2是上述RrFLSl基因片段對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)的序列。
[0021]序列表SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4是擴(kuò)增上述玫瑰花瓣樣品cDNA的引物對(duì)的DNA序列。
[0022]序列表SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)基因片段引物對(duì)的DNA序列。
[0023]圖1:是原始超量植物表達(dá)載體pCAMBIA2300s結(jié)構(gòu)示意圖(載體大小為11630bp)。
[0024]圖2:對(duì)照早花煙草與轉(zhuǎn)化RrFLSl基因的早花煙草的花色比較圖。圖中:圖2A是對(duì)照早花煙草花色；圖2B是本發(fā)明轉(zhuǎn)RrFLSl早花煙草的花色。
[0025]圖3 =RrFLSl基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量情況圖。圖3A是RrFLSl基因在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的表達(dá)量圖；圖38是煙草看家基因在轉(zhuǎn)基因煙草以及早花煙草中的表達(dá)量圖；上述圖3A和圖3B中:M為分子量大小，泳道1-3為3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，P為質(zhì)粒，CK為早花煙草(作為轉(zhuǎn)基因早花煙草的對(duì)照)。
[0026]圖4:對(duì)照早花煙草與轉(zhuǎn)化RrFLSl基因的早花煙草花瓣代謝物HPLC圖。圖中:圖4A為早花煙草花瓣520nm下的HPLC圖；圖4B為早花煙草花瓣360nm下的HPLC圖；圖4C為轉(zhuǎn)RrFLSl早花煙草花瓣520nm下的HPLC圖；圖4D為轉(zhuǎn)RrFLSl早花煙草花瓣360nm下的HPLC圖。
[0027]圖5:對(duì)照早花煙草與轉(zhuǎn)化RrFLSl基因的早花煙草花瓣代謝物含量圖。圖中:圖5A為花青素含量比較圖；圖58為類(lèi)黃酮含量比較圖；圖5八和圖5B中標(biāo)記說(shuō)明:CK為早花煙草；FLS1-5、FLS1-10、FLS1-12為3個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系。
[0028]圖6:表達(dá)載體pCAMBIA2300s-RrFLSl構(gòu)建圖(插入片段大小為1008bp)。
【具體實(shí)施方式】
[0029]實(shí)施例1:分離、克隆RrFLSl基因
[0030]本發(fā)明的前期工作對(duì)豐花玫瑰(又稱“平陰一號(hào)”，http://tc.cctv.com/20100412/103621, shtml，豐花玫瑰的選育文獻(xiàn)已經(jīng)公開(kāi)發(fā)表，見(jiàn):呂傳潤(rùn)(平陰玫瑰研究所)，玫瑰新品種-豐花玫瑰及栽培技術(shù)，山東林業(yè)科技，2007，5:77 ;華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院園藝植物生物學(xué)花卉實(shí)踐教學(xué)基地從山東省平陰縣平陰玫瑰研究所引種)不同時(shí)期的花朵進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由深圳華大基因科技有限公司完成)，在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中得到了 RrFLSl基因的全長(zhǎng)序列。根據(jù)轉(zhuǎn)錄測(cè)序RrFLSl基因的已知序列全長(zhǎng)，設(shè)計(jì)特異引物Pl (見(jiàn)序列表SEQ ID NO:3)正向引物5’ ATGGGGGTAGAGAGAGTTCAAG 3’和P2 (見(jiàn)序列表 SEQ ID NO:4)反向引物 5，TTACTGGGGGATCTTGTTGA 3’，將測(cè)序序列的 l_1008bp 的片段從玫瑰品種‘豐花’(即豐花玫瑰)花瓣RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA中擴(kuò)增出來(lái)，擴(kuò)增得到的片段如下所示(見(jiàn)序列表SEQ ID NO:1):
[0031]
【權(quán)利要求】
1.核苷酸序列如序列表SEQID NO:1所示的玫瑰功能基因RrFLSl在調(diào)控植物類(lèi)黃酮代謝中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所 述的應(yīng)用，其特征在于所述的植物是煙草。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103789328SQ201410019736
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月16日
【發(fā)明者】寧國(guó)貴, 羅平, 包滿珠, 王楨, 肖曉 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)