本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域領(lǐng)域，具體來說是一種快速檢測(cè)slco1b1基因突變的試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
新生兒中高膽紅素血癥是最常見的臨床情況，8％-11％的新生兒會(huì)出現(xiàn)較為嚴(yán)重的膽紅素血癥,但是總血清膽紅素(tsb)上升到一個(gè)很高的水平時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)期疾病的產(chǎn)生，包括血紅素腦病、核黃疸,因此，意識(shí)到新生兒高膽紅素血癥的嚴(yán)重性是非常重要的,造成高膽紅素血癥的因素有很多，包括abo、rh不相容、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(g6pd)和丙酮酸脫氫酶的缺乏、遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥、血紅蛋白合成缺陷、甲狀腺功能衰退、母乳性黃疸、顱內(nèi)血腫等。
udp糖基轉(zhuǎn)移酶家族1、多肽a1(ugt1a1)、溶質(zhì)載體有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族酶中的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽2(oatp2)作用于膽紅素的攝取和代謝過程，對(duì)膽紅素水平的調(diào)節(jié)起到重要作用。oatp2位于人類肝細(xì)胞膜底部外側(cè)，是由溶質(zhì)載體有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員1b1基因所(slco1b1)編碼。近期有研究顯示slco1b1突變體388g>a,521t>c和463c>a可能通過限制肝膽紅素的攝取來影響。所以快速高效準(zhǔn)確度高的檢測(cè)slco1b1基因突變的試劑盒及檢測(cè)方法對(duì)高膽紅素血癥的診斷和治療都起到重要作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的檢測(cè)精度不高、特異性差缺陷，提供一種快速檢測(cè)slco1b1基因突變的試劑盒及檢測(cè)方法來解決上述問題。
本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)slco1b1基因突變的試劑盒，包括：taqdna聚合酶、10×pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、dntps、內(nèi)源上游引物fi、內(nèi)源下游引物ri、外源上游引物fo、外源下游引物ro。
作為優(yōu)選，所述內(nèi)源上游引物fi、內(nèi)源下游引物ri、外源上游引物fo、外源下游引物ro分別是：
fi：5’-tcttatctacataggttgtttaaaggattc-3’
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作為優(yōu)選，所述taqdna聚合酶的濃度為0.1u/ul，mg2+濃度為4mm，dntp混合物濃度為0.4mm，引物濃度為10μm。
作為優(yōu)選，本發(fā)明還公開了上述快速檢測(cè)slco1b1基因突變的試劑盒的檢測(cè)方法，具體步驟如下：
(1)、提取血液dna，并稀釋至100ng/ul；
(2)、取20ularms-pcr反應(yīng)體系；
(3)、將混合后的反應(yīng)液放入pcr儀中，設(shè)置程序如下：
95℃預(yù)變性10min，接著進(jìn)入1個(gè)循環(huán)，95℃變性15s，45℃退火45s，72℃延伸45s，共32個(gè)循環(huán)，之后，繼續(xù)72℃延伸8min，1個(gè)循環(huán)，然后將pcr反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。
作為優(yōu)選，所述的步驟(2)中，所述的arms-pcr反應(yīng)體系，具體包括：10×pcrbuffer2μl，fi1μl，ri1μl，fo1-10μl，ro1-10μldntp混合物1.6μl，taqdna聚合酶0.4μl，mg2+1.6μl,dna模板1μl，加ddh2o至20μl。
作為優(yōu)選，所述的pcr反應(yīng)體系中內(nèi)源引物和外源引物的比為1:1-10。
作為優(yōu)選，凝膠電泳分析中使用濃度為3％瓊脂糖凝膠。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：
本發(fā)明提供一種快速、高效、設(shè)備要求簡(jiǎn)單、低成本、操作容易的檢測(cè)slco1b1基因突變的試劑盒及檢測(cè)方法，具體包括：taqdna聚合酶、10×pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、dntps、內(nèi)源上游引物fi、內(nèi)源下游引物ri、外源上游引物fo、外源下游引物ro。本發(fā)明中涉及armspcr技術(shù)是一種特有的在同一個(gè)pcr反應(yīng)中使用兩對(duì)引物的pcr技術(shù)，從凝膠電泳的結(jié)果中就可以清晰分析出陽(yáng)性突變和野生型擴(kuò)增產(chǎn)物，同時(shí)也能保證擴(kuò)增產(chǎn)物的高特異性和高準(zhǔn)確性。本發(fā)明中試劑盒適用幾乎所有的pcr儀，對(duì)設(shè)備的要求低，操作的可行性大大提高，相對(duì)于需要精密設(shè)備的檢測(cè)方法，成本也大大降低。本發(fā)明試劑盒及檢測(cè)方法可應(yīng)用于slco1b1基因突變的初步檢測(cè)，為slco1b1基因突變相關(guān)疾病，如：高膽紅素血癥，提供診斷依據(jù)，提高診斷效率。
附圖說明
圖1為實(shí)施例1的凝膠電泳結(jié)果圖。
其中：附圖中的標(biāo)識(shí)分別代表：m：marker，1-4分別為引物組1-4。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)slco1b1基因突變的試劑盒，包括：taqdna聚合酶、10×pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、dntps、內(nèi)源上游引物fi、內(nèi)源下游引物ri、外源上游引物fo、外源下游引物ro。
作為優(yōu)選，所述內(nèi)源上游引物fi、內(nèi)源下游引物ri、外源上游引物fo、外源下游引物ro分別是：
fi：5’-tcttatctacataggttgtttaaaggattc-3’
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作為優(yōu)選，所述taqdna聚合酶的濃度為0.1u/ul，mg2+濃度為4mm，dntp混合物濃度為0.4mm，引物濃度為10μm。
作為優(yōu)選，本發(fā)明還公開了上述快速檢測(cè)slco1b1基因突變的試劑盒的檢測(cè)方法，具體步驟如下：
(1)、提取血液dna，并稀釋至100ng/ul；
(2)、取20ularms-pcr反應(yīng)體系；
(3)、將混合后的反應(yīng)液放入pcr儀中，設(shè)置程序如下：
95℃預(yù)變性10min，接著進(jìn)入1個(gè)循環(huán)，95℃變性15s，45℃退火45s，72℃延伸45s，共32個(gè)循環(huán)，之后，繼續(xù)72℃延伸8min，1個(gè)循環(huán)，然后將pcr反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。
作為優(yōu)選，所述的步驟(2)中，所述的arms-pcr反應(yīng)體系，具體包括：10×pcrbuffer2μl，fi1μl，ri1μl，fo1-10μl，ro1-10μldntp混合物1.6μl，taqdna聚合酶0.4μl，mg2+1.6μl,dna模板1μl，加ddh2o至20μl。
作為優(yōu)選，所述的pcr反應(yīng)體系中內(nèi)源引物和外源引物的比為1:1-10。
作為優(yōu)選，凝膠電泳分析中使用濃度為3％瓊脂糖凝膠。
實(shí)施例1
(1)、提取血液dna，并稀釋至100ng/ul；
(2)、取20ularms-pcr反應(yīng)體系，具體包括：10×pcrbuffer2μl，fi1μl，ri1μl，fo5μl，ro5μldntp混合物1.6μl，taqdna聚合酶0.4μl，mg2+1.6μl,dna模板1μl，加ddh2o至20μl；
(3)、將混合后的反應(yīng)液放入pcr儀中，設(shè)置程序如下：95℃預(yù)變性10min，接著進(jìn)入1個(gè)循環(huán)，95℃變性15s，45℃退火45s，72℃延伸45s，共32個(gè)循環(huán)，之后，繼續(xù)72℃延伸8min，1個(gè)循環(huán)，然后將pcr反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析pcr反應(yīng)產(chǎn)物使用3％瓊脂糖凝膠進(jìn)行凝膠電泳分析。
本發(fā)明最初設(shè)計(jì)4組引物進(jìn)行引物篩選，具體序列如下：
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經(jīng)過凝膠電泳結(jié)果圖中可以分析出，引物組2和4是具有高分離度，并且沒有產(chǎn)生的非特異性條帶的引物，再根據(jù)引物的gc含量計(jì)算，引物組2具有更好的穩(wěn)定性，故本發(fā)明選用引物組2作為特異性引物。
實(shí)施例2
(1)、提取血液dna，并稀釋至100ng/ul；
(2)、取20ularms-pcr反應(yīng)體系，具體包括：10×pcrbuffer2μl，fi1μl，ri1μl，fo5μl，ro5μldntp混合物1.6μl，taqdna聚合酶0.4μl，mg2+1.6μl,dna模板1μl，加ddh2o至20μl；
(3)、將混合后的反應(yīng)液放入pcr儀中，設(shè)置程序如下：95℃預(yù)變性10min，接著進(jìn)入1個(gè)循環(huán)，95℃變性15s，45℃退火45s，72℃延伸45s，共32個(gè)循環(huán)，之后，繼續(xù)72℃延伸8min，1個(gè)循環(huán)，然后將pcr反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析pcr反應(yīng)產(chǎn)物使用3％瓊脂糖凝膠進(jìn)行凝膠電泳分析。
pcr反應(yīng)產(chǎn)物使用3％瓊脂糖凝膠進(jìn)行凝膠電泳分析。
實(shí)施例2中內(nèi)源引物和外源引物的比為1:1。
實(shí)施例3
(1)、提取血液dna，并稀釋至100ng/ul；
(2)、arms-pcr最優(yōu)反應(yīng)體系為20ul，具體包括：10×pcrbuffer2μl，fi1μl，ri1μl，fo10μl，ro10μldntp混合物1.6μl，taqdna聚合酶0.4μl，mg2+1.6μl,dna模板1μl，加ddh2o至20μl；
(3)、將混合后的反應(yīng)液放入pcr儀中，設(shè)置程序如下：
pcr反應(yīng)產(chǎn)物使用3％瓊脂糖凝膠進(jìn)行凝膠電泳分析。
實(shí)施例2和3中內(nèi)源引物和外源引物的比分別為1:1和1:10，均沒有獲得理想的結(jié)果，所以本發(fā)明中適用的內(nèi)源引物和外源引物比為1:5。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明要求的保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。