本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為制備了系列環(huán)二核苷酸cgamp的創(chuàng)新衍生物，該系列cgamp的衍生物具有顯著抗腫瘤作用，其在抗腫瘤和制備抗腫瘤藥物中具有重要應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的常見多發(fā)病，已成為人類死亡的一個重要原因。目前，腫瘤的主要治療手段包括藥物治療、外科手術(shù)治療和放射治療。盡管以分子靶向藥物為代表的新型抗腫瘤藥物不斷地涌現(xiàn)出來，在相當(dāng)一段時期內(nèi)，傳統(tǒng)的細(xì)胞毒抗腫瘤藥依然在腫瘤的藥物治療中占據(jù)主導(dǎo)地位。
傳統(tǒng)的細(xì)胞毒抗腫瘤藥主要通過影響腫瘤細(xì)胞的核酸和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能，直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。盡管人們在腫瘤的藥物治療方面做出很多努力，研究新的化療藥物，改進(jìn)化療方案，但是治療效果仍不理想。傳統(tǒng)的細(xì)胞毒抗腫瘤藥對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞缺乏理想的選擇作用，在殺傷惡性腫瘤細(xì)胞的同時，對人體的正常組織也有損害，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的全身不良反應(yīng)，其中比較常見的不良反應(yīng)為骨髓抑制、消化道反應(yīng)和脫發(fā)。所以很多患者無法堅持，甚至放棄化療，臨床上難以期望通過增加藥物劑量來獲得理想的效果。這些因素嚴(yán)重影響了化療療效。
最近有研究表明，環(huán)二核苷酸合成酶（cgas）在結(jié)合dna后的活化條件下催化cgamp的合成，進(jìn)一步通過sting介導(dǎo)irf-3的活化，進(jìn)而促進(jìn)ifn-β的合成。外源性給予重組cgas在dna結(jié)合條件下促進(jìn)環(huán)二核苷酸cgamp的生成，發(fā)揮抗病毒、增強(qiáng)免疫的作用。也有專利報道，體外合成的環(huán)二核苷酸cgamp具有抗腫瘤的應(yīng)用。硫(硒)代磷酸環(huán)二核苷酸cgamp具有比cgamp更好的抗腫瘤活性。
本發(fā)明制備了系列環(huán)二核苷酸2’3’-cgamp的創(chuàng)新衍生物，該系列衍生物比cgamp具有更好的穩(wěn)定性和與靶蛋白sting的親和性，具有更好的抗腫瘤作用，其在抗腫瘤和制備抗腫瘤藥物中具有重要的潛在應(yīng)用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了環(huán)二核苷酸cgamp的系列衍生物的結(jié)構(gòu)組成、制備方法、及其在抗腫瘤和制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
環(huán)二核苷酸cgamp-xyz衍生物的結(jié)構(gòu)組成，主要指由2’3’-cgamp進(jìn)行修飾改造制備的cgamp衍生物。分為如下幾類：
（1）2’3’-cgamp-x，cgamp在腺嘌呤部分有取代基修飾的衍生物（2-r1/8-r2,r1/r2=氨基、鹵素、甲氧基等）
（2）2’3’-cgamp-y，cgamp在鳥嘌呤部分有取代基修飾的衍生物（8-r3,r3=氨基、鹵素、甲氧基等）
（3）2’3’-cgamp-xy，cgamp在腺嘌呤和鳥嘌呤部分都有取代基修飾的衍生物（2-r1/8-r2,r1/r2=氨基、鹵素、甲氧基等；8-r3,r3=氨基、鹵素、甲氧基等）
（4）2’3’-cgamp-xz，cgamp在腺嘌呤部分有取代基修飾，同時環(huán)化磷酸脂鍵部分的磷酸根有硫取代或硒取代的衍生物。
（5）2’3’-cgamp-yz，cgamp在鳥嘌呤部分有取代基修飾，同時環(huán)化磷酸脂鍵部分的磷酸根有硫取代或硒取代的衍生物。
（6）2’3’-cgamp-xyz，cgamp在腺嘌呤和鳥嘌呤部分都有取代基修飾，同時環(huán)化磷酸脂鍵部分的磷酸根有硫取代或硒取代的衍生物。
2’3’-cgamp-xyz衍生物的制備方法：
（1）三磷酸腺苷atp和三磷酸鳥苷gtp的取代基衍生物，通過結(jié)合雙聯(lián)dna后活化的環(huán)二核苷酸合成酶（cgas）催化，制備2’3’-cgam-xy衍生物（包括：2’3’-cgamp-x，2’3’-cgamp-y，2’3’-cgamp-xy）；
（2）α-磷酸硫取代（硒取代）的三磷酸腺苷atp和三磷酸鳥苷gtp）的取代基衍生物，通過結(jié)合雙聯(lián)dna后活化的環(huán)二核苷酸合成酶（cgas）催化，制備α-磷酸硫取代（硒）取代-2’3’-cgamp衍生物（包括：2’3’-cgamp-xz，2’3’-cgamp-yz，2’3’-cgamp-xyz）；
所述的2’3’-cgamp衍生物在抗腫瘤中的用途是指醫(yī)藥、食品或試劑等技術(shù)領(lǐng)域中，用于預(yù)防、保護(hù)、治療腫瘤及其直接相關(guān)疾病的產(chǎn)品，是包括藥物、試劑、食品或保健食品等類型中的一種或多種。
本發(fā)明中，所述腫瘤包括但不限于結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胃癌等。
本發(fā)明中2’3’-cgamp衍生物所制備的抗腫瘤藥可以按常規(guī)藥劑學(xué)制備成各種劑型，包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、混懸劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑或注射劑等。
本發(fā)明中2’3’-cgamp衍生物抗腫瘤藥可以采取口服或注射（包括靜脈注射、靜脈滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一種或多種）等中的一種或多種給藥途徑進(jìn)行腫瘤相關(guān)疾病的預(yù)防、保護(hù)或治療。
本發(fā)明提供的2’3’-cgamp衍生物抗腫瘤藥在腫瘤的藥物治療中具有良好的應(yīng)用前景。
具體實施方式
下面通過實施例，具體說明本發(fā)明的內(nèi)容。在本發(fā)明中，以下所述的實施例是為了更好地闡述本發(fā)明，并不是用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1：環(huán)二核苷酸cgamp衍生物組成和制備方法
（1）各種atp和gtp的衍生物從美國sigma公司購買。atp和gtp的衍生物如下：
(a)atp-x，atp取代基修飾的衍生物（2-r1/8-r2,r1/r2=氨基、鹵素、甲氧基等）
(b)gtp-y,gtp取代基修飾的衍生物（8-r3,r3=氨基、鹵素、甲氧基等）
(2)腺苷5’-α硫代（硒代）磷酸和鳥苷5’-α硫代（硒代）磷酸按文獻(xiàn)方法制備。（huangzhen等，sciencechina,chemistry,2012,55(1),80-89.,boylen.a.,etal,nucleosides,nucleotidesandnucleicacids,2005,24,1651-1664.）所有化學(xué)試劑均購于sigma公司。
(3)2’3’-cgamp衍生物、硫（硒）代磷酸-2’3’-cgamp衍生物的制備
參照2’3’-cgamp的制備方法（pingweili，etal.,immunity,2013,39(6),1019-1031.），將atp-x衍生物和gtp-y衍生物替代atp和gtp，在結(jié)合dna結(jié)合后的活化條件下，由環(huán)化二核苷酸合成酶（cgas）催化2’3’-cgamp-xy衍生物（包括：2’3’-cgamp-x，2’3’-cgamp-y，2’3’-cgamp-xy）的合成，純度在98％以上。
（4）硫（硒）代磷酸-2’3’-cgamp-xyz衍生物的制備，參照2’3’-cgamp的制備方法，腺苷衍生物-5’-α硫代（硒代）磷酸和鳥苷衍生物-5’-α硫代（硒代）磷酸按文獻(xiàn)方法制備。（huangzhen等，sciencechina,chemistry,2012,55(1),80-89.,boylen.a.,etal,nucleosides,nucleotidesandnucleicacids,2005,24,1651-1664.）5’-α硫代（硒代）磷酸腺苷衍生物atp和5’-α硫代（硒代）磷酸鳥苷衍生物gtp，在結(jié)合dna結(jié)合后的活化條件下，由環(huán)化二核苷酸合成酶（cgas）催化硫（硒）代磷酸-2’3’-cgamp-xyz衍生物（包括：2’3’-cgamp-xz，2’3’-cgamp-yz，2’3’-cgamp-xyz）的合成，純度在98％以上。
實施例2：環(huán)二核苷酸cgamp衍生物用于抗腫瘤的動物實驗
采用荷瘤鼠模型檢測2’3’-cgamp衍生物對動物皮下移植瘤生長的抑制作用及對動物的毒性作用。
用于抗腫瘤實驗的2’3’-cgamp衍生物選擇如下五類：
（1）cgamp-x1（2’3’-cgamp中腺嘌呤2位氨基取代衍生物）
（2）cgamp-y1（2’3’-cgamp中鳥嘌呤8位氨基取代衍生物）
（3）cgamp-x1y1（2’3’-cgamp中腺嘌呤2位和鳥嘌呤8位氨基取代衍生物）
（4）cgamp-x1z1（cgamp-x1中磷酸硫取代衍生物）
（5）cgamp-x1y1z1（cgamp-x1y1中磷酸硫取代衍生物）
balb/c普通小鼠、c57/bl6普通小鼠，雄性，體重16-18g，6-8周齡，spf級，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司[實驗動物質(zhì)量合格證號：scxk（滬）2007-0005]。
飼養(yǎng)條件
所有小鼠均自由覓食和飲水，在室溫（23±2）℃下飼養(yǎng)于中國人民解放軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。飼料及水均經(jīng)高壓滅菌處理，全部實驗飼養(yǎng)過程為spf級。
劑量設(shè)置
靜脈注射小鼠，設(shè)置1個劑量組：10mg/kg
試驗對照
陰性對照：生理鹽水溶液
陽性對照：cgamp，劑量10mg/kg
給藥方法
給藥途徑：尾靜脈注射給藥
給藥體積：100微升/只
給藥次數(shù)：每天1次，連續(xù)21天
每組動物數(shù)：10只
腫瘤細(xì)胞株
小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞株ct26，小鼠肺癌lewis瘤株ll/2，人卵巢癌細(xì)胞株sk-ov-3，人黑色素瘤細(xì)胞株a375，人胃癌細(xì)胞株mnk-45均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。
試驗主要步驟
1．腫瘤模型鼠的建立與干預(yù)
細(xì)胞培養(yǎng)，傳代，在細(xì)胞對數(shù)期收集細(xì)胞，做成濃度為(1.0×107)每毫升的細(xì)胞懸液，小鼠右前肢腋下注射0.2ml細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)目為2.0×106個/只)，10天左右腫瘤長至直徑約5mm，致瘤成功，隨機(jī)均分為5組。分別為a：陰性對照組（靜脈注射生理鹽水組）；b：cgamp組(靜脈注射cgamp)10mg/kg;c、d、e、f、g：2’3’-cgamp衍生物組(靜脈注射2’3’-cgamp衍生物)10mg/kg。每天給藥1次，連續(xù)給藥21天。21天后，處死小鼠并稱瘤體重量，抑瘤率=[1-實驗組平均瘤重(b、c、d、e、f、g組)／a組平均瘤重)]×100％。
分別制備皮下移植瘤模型：小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞株ct26，小鼠肺癌lewis瘤株ll/2，人卵巢癌細(xì)胞株sk-ov-3，人黑色素瘤細(xì)胞株a375，人胃癌細(xì)胞株mnk-45，觀察cgamp衍生物抗腫瘤效果。
2．統(tǒng)計分析
數(shù)據(jù)用x±s表示，利用spss10.0軟件進(jìn)行處理，采用單因素方差分析（one-wayanova）檢驗比較各組瘤重差異的顯著性，顯著性水平a=0.05。
結(jié)果
小鼠皮下接種腫瘤細(xì)胞后制備成功皮下移植瘤模型，2’3’-cgamp-xyz衍生物均可明顯抑制腫瘤生長，給藥21天后的瘤重均顯著低于陰性對照組（p<0.05，p<0.01），2’3’-cgamp-xyz優(yōu)于cgamp單獨用藥，表明2’3’-cgamp-xyz具有更優(yōu)的抗腫瘤作用。具體結(jié)果表1-表5：
表1、cgamp-xyz對balb/c小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞ct26皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±sd）
組別平均瘤重（g）平均抑瘤率（%）
陰性對照組2.268±0.246（g）-
cgamp組0.769±0.185（g）**66.0
cgamp-x1組0.558±0.154（g）**75.0
cgamp-y1組0.590±0.146（g）**73.9
cgamp-x1y1組0.436±0.215（g）*80.7
cgamp-x1z1組0.442±0.210（g）*80.5
cgamp-x1y1z1組0.429±0.263（g）*81.0
注：*p<0.05vs陰性對照組；**p<0.01vs陰性對照組.
表2、cgamp-xyz對c57小鼠肺癌lewis瘤株ll-2皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±sd）
組別平均瘤重（g）平均抑瘤率（%）
陰性對照組2.638±0.356（g）-
cgamp組0.880±0.252（g）*66.7
cgamp-x1組0.669±0.154（g）**74.6
cgamp-y1組0.680±0.165（g）**74.2
cgamp-x1y1組0.582±0.186（g）**78.0
cgamp-x1z1組0.646±0.254（g）*75.5
cgamp-x1y1z1組0.496±0.268（g）*81.2
注：*p<0.05vs陰性對照組；**p<0.01vs陰性對照組.
表3、cgamp-xyz對人黑色素瘤細(xì)胞株a375鼠皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±sd）
組別平均瘤重（g）平均抑瘤率（%）
陰性對照組2.690±0.356（g）-
cgamp組0.882±0.248（g）*67.3
cgamp-x1組0.678±0.149（g）**75.0
cgamp-y1組0.698±0.253（g）**74.0
cgamp-x1y1組0.586±0.292（g）*78.3
cgamp-x1z1組0.624±0.352（g）*76.8
cgamp-x1y1z1組0.499±0.253（g）**81.4
注：*p<0.05vs陰性對照組；**p<0.01vs陰性對照組.
表4、cgamp-xyz對人胃癌細(xì)胞株mnk-45鼠皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±sd）
組別平均瘤重（g）平均抑瘤率（%）
陰性對照組2.686±0.328（g）-
cgamp組0.868±0.284（g）**74.5
cgamp-x1組0.656±0.219（g）**75.6
cgamp-y1組0.598±0.235（g）**77.7
cgamp-x1y1組0.529±0.228（g）**80.3
cgamp-x1z1組0.524±0.238（g）**80.5
cgamp-x1y1z1組0.499±0.228（g）**81.4
注：*p<0.05vs陰性對照組；**p<0.01vs陰性對照組.
表5、cgamp-xyz對人卵巢癌細(xì)胞株sk-ov-3鼠皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±sd）
組別平均瘤重（g）平均抑瘤率（%）
陰性對照組2.726±0.318（g）-
cgamp組0.869±0.245（g）**68.0
cgamp-x1組0.628±0.263（g）**76.9
cgamp-y1組0.586±0.216（g）**78.5
cgamp-x1y1組0.529±0.234（g）**80.5
cgamp-x1z1組0.519±0.215（g）**80.9
cgamp-x1y1z1組0.499±0.237（g）**81.7
注：*p<0.05vs陰性對照組；**p<0.01vs陰性對照組.
實施例3cgamp衍生物的急性毒性研究
實驗材料
icr小鼠20只（購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司[實驗動物質(zhì)量合格證號：scxk（滬）2007-0005]），雌雄各半，體重18～22g，動物以顆粒飼料喂養(yǎng)，自由攝食和飲水。
cgamp衍生物由實施例1制備，用生理鹽水配制成濃度為200mg/ml的溶液。
實驗方法
icr小鼠按體重單次尾靜脈注射2g/kg的cgamp衍生物緩釋藥物，觀察給藥后小鼠14天內(nèi)的毒性反應(yīng)及死亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠單次尾靜脈注射給藥后，小鼠活動正常。給藥后14天內(nèi)，小鼠未出現(xiàn)死亡，第15天，全部小鼠處死，解剖，肉眼檢查各臟器，均未見明顯病變。
實驗結(jié)果
上述急性毒性實驗結(jié)果表明，靜脈注射給藥最大耐受量mtd不低于2g/kg，說明cgamp衍生物藥物的急性毒性低。