本發(fā)明屬于化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種名為茶山奈酚糖苷c的?；S酮四糖苷及其提取方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

茶起源于中國(guó)，最早是以其藥用功能而被我們的祖先發(fā)現(xiàn)并利用的，距今已有3000多年的歷史，先后經(jīng)歷了從藥用到食用至而今普及全球的飲品的演變。作為風(fēng)靡世界的飲料，茶葉不僅僅是依靠其獨(dú)特的風(fēng)味而備受消費(fèi)者親睞，更關(guān)鍵的因素是由于茶葉所含有的功能成分和保健功效。隨著人們對(duì)健康的日益重視，茶葉的健康功能研究也引起了研究者的廣泛興趣。研究表明茶葉具有抗癌、抗氧化、降脂減肥、降血糖、抗過敏、殺菌、抗病毒、保護(hù)肝臟等作用。

六安瓜片屬于綠茶類，產(chǎn)于安徽六安，為中國(guó)十大名茶之一，有著悠久的歷史底蘊(yùn)和深厚的文化內(nèi)涵。大部分的茶葉都是以芽葉相連采摘加工而成的，而六安瓜片則是以單片葉加工而成的，同時(shí)還兼具干燥過程中的獨(dú)特的拉老火技藝，使得其與其他綠茶不同，同時(shí)也深受消費(fèi)者親睞。

黃大茶顧名思義屬于黃茶類，安徽的黃大茶主要產(chǎn)于安徽霍山一帶，黃大茶的特點(diǎn)是葉大、梗長(zhǎng)、黃色黃湯，具有濃裂的高火香，俗稱鍋粑香。黃大茶的加工原料以粗老葉為主，悶黃是其特有的加工工序。近期有相關(guān)研究表明黃大茶有很好的降血糖功效且降血糖功效優(yōu)于綠茶和紅茶。

關(guān)于六安瓜片和黃大茶生物活性的化學(xué)基礎(chǔ)的報(bào)道比較少，如果能成功的從六安瓜片及黃大茶中研究開發(fā)出具有生物活性的黃酮苷類生物成分，將會(huì)對(duì)皖西地區(qū)六安瓜片及黃大茶品牌的發(fā)展和宣傳提供一定的幫助，同時(shí)也能對(duì)農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域作出重要貢獻(xiàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種從六安瓜片和黃大茶中分離制備得到的名為茶山奈酚糖苷c的酰基化黃酮四糖苷，此名為茶山奈酚糖苷c的?；S酮四糖苷具有如下所示結(jié)構(gòu)：

本發(fā)明的目的之二是提供一種上述名為茶山奈酚糖苷c的酰基化黃酮四糖苷的制備方法，包括以下兩種路徑：

路徑a：

1)原料粉碎：

取干燥的六安瓜片成品茶或者黃大茶，將其粉碎成粉末狀；

2)浸提

用70-80％丙酮水浸提粉碎后的六安瓜片成品茶或者黃大茶得到浸提液，經(jīng)過分級(jí)萃取和減壓濃縮得到最后剩余的水部位膏狀物；

3)分離純化

將水部位膏狀物分離純化得到茶山奈酚糖苷c。

作為優(yōu)選，所述步驟2)浸提中，先用70-80％丙酮水浸提粉碎后的六安瓜片或黃大茶得到浸提液，再用二氯甲烷、乙酸乙酯分級(jí)萃取，提取液經(jīng)過減壓濃縮制得相應(yīng)萃取部位膏狀提取物：二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位和剩余的水部位膏狀物。

作為優(yōu)選，所述步驟3)中所述的分離純化是將所述水部位膏狀物溶解后依次經(jīng)mci柱層析、硅膠柱層析、sephadexlh-20凝膠柱層析、toyopearl柱層析分離純化。

作為優(yōu)選，所述步驟3)中所述的分離純化的具體步驟為：將水部位膏狀物用水溶解后過mci柱使用meoh-h2o體積比0∶100到100∶0作為梯度洗脫，收集其中meoh-h2o體積比70∶30到80∶20的洗脫組分；然后將所得的洗脫組份經(jīng)硅膠柱層析，以ch2cl2-meoh體積比20∶1，15∶1，10∶1，5∶1到0∶1作為梯度洗脫，收集其中ch2cl2-meoh體積比5∶1的洗脫組分；所得洗脫組份再經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱層析，以meoh作為洗脫劑洗脫，收集得到洗脫組分；洗脫組分再經(jīng)toyopearl柱層析、洗脫，得到山奈酚糖苷c。

路徑b：

1)原料粉碎：

取干燥的六安瓜片成品茶或者黃大茶，將其粉碎成粉末狀；

2)浸提

用70-80％丙酮水浸提粉碎后的六安瓜片成品茶或者黃大茶得到浸提液，經(jīng)過分級(jí)萃取和減壓濃縮得到最后剩余的正丁醇部位膏狀物；

3)分離純化

將正丁醇部位膏狀物分離純化得到茶山奈酚糖苷c。

作為優(yōu)選，所述路徑b步驟2)浸提中，先用70-80％丙酮水浸提粉碎后的六安瓜片或黃大茶得到浸提液，再用二氯甲烷、乙酸乙酯分級(jí)萃取，提取液經(jīng)過減壓濃縮制得相應(yīng)萃取部位膏狀提取物：二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位和剩余的水部位，水部位用正丁醇萃取，最后得到正丁醇部位膏狀物。

作為優(yōu)選，所述路徑b步驟3)中所述的分離純化是將正丁醇部位膏狀物溶解后依次經(jīng)mci柱層析、sephadexlh-20凝膠柱層析分離純化得到山奈酚糖苷c。

作為優(yōu)選，所述路徑b步驟3)中所述的分離純化的具體步驟為：

將正丁醇部位膏狀物用水溶解后過mci柱層析使用meoh-h2o體積比20∶80到100∶0作為梯度洗脫，收集其中meoh-h2o體積比70∶30到80∶20的洗脫組分；然后將所得的洗脫組份經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱層析，以甲醇作為洗脫劑洗脫，收集得到洗脫組分；洗脫組分再經(jīng)層析、洗脫，得到山奈酚糖苷c。

作為優(yōu)選，以上a、b兩種路徑中：所述步驟2)浸提中，有機(jī)溶劑提取采用浸泡方式提取，即將粉碎后的六安瓜片或黃大茶都同樣分別浸泡在有機(jī)溶劑中70-80小時(shí)；或者將粉碎后的六安瓜片或黃大茶都同樣分別用有機(jī)溶劑超聲波振蕩提取。

本發(fā)明的目的之三是將如上所述的名為茶山奈酚糖苷c的酰基化黃酮四糖苷應(yīng)用于降脂減肥藥物方面的應(yīng)用。

具體地說是將如上所述的茶山奈酚糖苷c的?；S酮四糖苷和藥學(xué)上所通用的輔料制成一種降脂減肥藥物，所述藥物劑型包括口服型、外用型和注射型。

本發(fā)明的有益效果如下：

1)通過試驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明所述名為茶山奈酚糖苷c的?；S酮四糖苷在誘導(dǎo)的3t3-l1細(xì)胞中有一定抑制脂質(zhì)積累作用，可以應(yīng)用于制備降脂減肥藥物方面。因此本發(fā)明提供的具有醫(yī)學(xué)活性的黃酮苷類化合物，對(duì)農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的意義；

2)同時(shí)為有效開發(fā)利用六安瓜片和黃大茶提供了更為廣闊的前景。

3)本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，成本較低。

附圖說明

圖1為茶山奈酚糖苷c的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

圖2為茶山奈酚糖苷c及另外三個(gè)黃酮糖苷對(duì)3t3-l1細(xì)胞中脂質(zhì)積累的抑制試驗(yàn)示意圖，其中1為茶山奈酚糖苷c，2為茶山奈酚糖苷a，3為茶槲皮素糖苷c，4為茶槲皮素糖苷a。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。

一、茶山奈酚糖苷c的制備

實(shí)施例1：

從六安瓜片中的制備

(1)取9.0公斤干燥的六安瓜片成品茶，并將其粉碎成粉末狀；

(2)首先將9.0公斤干燥的六安瓜片用29升80％丙酮水常溫浸提72小時(shí)，然后在70hz下超聲浸提2小時(shí)；得80％丙酮水部位提取液；按上述步驟浸提三次，合并提取液并將提取液濃縮至膏狀，得提取液5升；

然后將提取液用5升二氯甲烷萃取三次，得水層及二氯甲烷層，合并二氯甲烷層并濃縮，得二氯甲烷提取浸膏400克；

水層再加4升乙酸乙酯萃取三次，得水層及乙酸乙酯層，分別合并乙酸乙酯層及水層濃縮后得乙酸乙酯部位浸膏760克，得水部位浸膏630克。

(3)取400克水部位浸膏用500ml熱水溶解，再通過mci柱層析，使用meoh-h2o體積比0∶100到100∶0梯度洗脫，收集其中meoh-h2o體積比70∶30到80∶20的洗脫組分；然后將所得的洗脫組份經(jīng)硅膠柱層析，以ch2cl2-meoh體積比20∶1，15∶1，10∶1，5∶1到0∶1作為梯度洗脫，收集其中ch2cl2-meoh體積比5∶1的洗脫組分；所得洗脫組份再經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱層析，以meoh作為洗脫劑洗脫，收集得到七個(gè)洗脫組分；組分六經(jīng)toyopearl柱層析，以甲醇作為洗脫劑洗脫，收集得到四個(gè)洗脫組分；組分二為茶山奈酚糖苷c(kaempferol3-o-[e-p-coumaroyl-(1→2)][α-l-arabinopyranosyl-(1→3)][β-d-glucopyranosyl-(1→3)-α-l-rhamnopyranosyl(1→6)]-β-d-glucopyranoside，12.7毫克)。該分離流程同時(shí)也分到了另外三個(gè)黃酮糖苷，分別為茶山奈酚糖苷a，茶槲皮素糖苷a，茶槲皮素糖苷c。

實(shí)施例2：從黃大茶中的制備

(1)取10公斤干燥的黃大茶，并將其粉碎成粉末狀；

(2)首先將10公斤干燥的黃大茶先用30升80％丙酮水常溫浸提72小時(shí)，然后在70hz下超聲浸提2小時(shí)；得80％丙酮水部位提取液；按上述步驟浸提三次，合并提取液并將提取液濃縮至膏狀，得提取液5升；

然后將提取液液用5升二氯甲烷萃取三次，得水層及二氯甲烷層，合并二氯甲烷層并濃縮，得二氯甲烷提取浸膏700克。

水層再加4升乙酸乙酯萃取三次，得水層及乙酸乙酯層，合并乙酸乙酯層得乙酸乙酯部位浸膏625克。

水層加3l正丁醇萃取三次，得水層及正丁醇層，分別合并正丁醇層及水層濃縮后得正丁醇部位浸膏128克，得水部位浸膏150克。

取93.4克正丁醇部位浸膏用150ml熱水溶解，經(jīng)過mci柱層析，使用meoh-h2o體積比20∶80到100∶0作為梯度洗脫，收集其中meoh-h2o體積比70∶30到80∶20的洗脫組分；然后將所得的洗脫組份經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱層析，以甲醇作為洗脫劑洗脫，收集得到八個(gè)洗脫組分；組分四經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱層析，以甲醇作為洗脫劑洗脫，收集得到三個(gè)洗脫組分；組分一為山奈酚糖苷c(kaempferol3-o-[e-p-coumaroyl-(1→2)][α-l-arabinopyranosyl-(1→3)][β-d-glucopyranosyl-(1→3)-α-l-rhamnopyranosyl(1→6)]-β-d-glucopyranoside，6.1毫克)。

實(shí)施例3

將原料換為9.0公斤干燥的黃大茶，采用實(shí)施例1的方法，制備得到本發(fā)明茶山奈酚糖苷c4.2毫克。

實(shí)施例4

將原料換為10公斤干燥的六安瓜片成品茶，采用實(shí)施例2的方法，制備得到本發(fā)明茶山奈酚糖苷c12.5毫克。

從以上實(shí)施例可以看出，從經(jīng)過正丁醇萃取后，后續(xù)分離純化得到該化合物的步驟明顯簡(jiǎn)單。

對(duì)比例1

購(gòu)買市場(chǎng)上的一種花茶，采用實(shí)施例1和實(shí)施例2的方法沒有提取到本發(fā)明所述的茶山奈酚糖苷c。

本發(fā)明茶山奈酚糖苷c的特性如下：

1)、可溶于甲醇和dmso，黃色固體，

2)、ir(kbr)vmax(cm^-1)：3394，1700，1654，1604，1511，1078；

3)、hr-esi-ms：m/z1033.28429([m-h]^-，c24h19o9^-的理論計(jì)算值為1033.28251)；核磁共振光譜數(shù)據(jù)見表1。

表1：茶山奈酚糖苷c的核磁共振光譜數(shù)據(jù)(¹hnmr在600mhz，¹³cnmr在150mhz條件下測(cè)試，δ單位為ppm，耦合常數(shù)j單位為hz，溶劑為氘代dmso)。

表1.山奈酚糖苷c的核磁共振光譜數(shù)據(jù)

所有波譜數(shù)據(jù)均通過¹hnmr，¹³cnmr，esi-hr-ms及¹h-¹hcosy，hmqc、hmbc等二維核磁共振譜歸屬，證明了所得化合物的結(jié)構(gòu)。

二、茶山奈酚糖苷c和另外三個(gè)黃酮糖苷的抑制3t3-l1脂肪細(xì)胞脂質(zhì)積累試驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)：取3t3-l1前脂肪細(xì)胞，用含10％胎牛血清和1％雙抗的dmem培養(yǎng)基，以一定條件(溫度37℃，二氧化碳濃度5％，濕度95％)培養(yǎng)于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中。

細(xì)胞活力檢測(cè)：采用噻唑藍(lán)法測(cè)定細(xì)胞活力。取3t3-l1前脂肪細(xì)胞按照3×10⁴個(gè)/ml接種于96孔板，培養(yǎng)24h后分別加入不同質(zhì)量濃度的化合物(25，50，100和200μm)，連續(xù)培養(yǎng)72h后加入20μl的噻唑藍(lán)培養(yǎng)液(5mg/ml)，培養(yǎng)4h后將培養(yǎng)液吸干，每孔加入150μl二甲基亞砜，搖床振蕩10min后用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值。

細(xì)胞的誘導(dǎo)分化和油紅o染色：將3t3-l1前脂肪細(xì)胞接種于24孔板，使用dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞完全融合后，加入胰島素分化誘導(dǎo)劑(10μg/ml胰島素、0.5mol/l3-異丁基1-甲基黃磦呤和1μmol/l地塞米松)誘導(dǎo)；3天后更換成dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)8天。自誘導(dǎo)開始(0天)，實(shí)驗(yàn)組加入不同質(zhì)量濃度(25，50，100μm)化合物，白藜蘆醇作為陽性對(duì)照組(20μg/me)。8天后細(xì)胞用磷酸緩沖液沖洗，用10％的福爾馬林固定后再用60％的異丙醇淋洗，使用0.5％油紅o染色，觀察胞漿中脂肪的沉積并拍照。油紅染色后每孔加入400ul異丙醇處理染色的細(xì)胞，在酶標(biāo)儀510nm出檢測(cè)光密度值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茶山奈酚糖苷c及其他三個(gè)黃酮糖苷對(duì)3t3-l1脂肪細(xì)胞幾乎不產(chǎn)生細(xì)胞毒性，同時(shí)能有效降低3t3-l1脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的積累。當(dāng)山奈酚糖苷c為50μm作用于3t3-l1脂肪細(xì)胞時(shí)，3t3-l1脂肪細(xì)胞中的脂質(zhì)的相對(duì)含量為55.53％；山奈酚糖苷c為100μm時(shí)，3t3-l1脂肪細(xì)胞中的脂質(zhì)的相對(duì)含量降低到了50％以下。說明茶山奈酚糖苷c能夠有效抑制3t3-l1脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的積累，同時(shí)這種抑制效果不是由茶山奈酚糖苷c對(duì)3t3-l1細(xì)胞的細(xì)胞毒性所造成的。

表2.四個(gè)黃酮糖苷單體化合物對(duì)3t3-l1細(xì)胞的細(xì)胞毒性

1為茶山奈酚糖苷c，2為茶山奈酚糖苷a，3為茶槲皮素糖苷c，4為茶槲皮素糖苷a。

因此本發(fā)明名為茶山奈酚糖苷c的酰基化黃酮四糖苷可應(yīng)用降脂減肥藥物方面的制備。

具體地說是將如上本發(fā)明的茶山奈酚糖苷c的?；S酮四糖苷按醫(yī)學(xué)上可接受的劑量和藥學(xué)上所通用的輔料制成一種降脂減肥藥物。該藥物劑型包括口服型、外用型和注射型等。

以上內(nèi)容描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。