本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，特別是一種從北葶藶子中提取酚苷化合物的方法及其應用。

背景技術：

葶藶子為常用中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為草部下品，該藥味辛、苦，性大寒，歸肺與膀胱經(jīng)，具有宣泄平喘、行水消腫的功效。2015版《中國藥典》收錄的“葶藶子”有南北之分，其中十字花科植物獨行菜lepidiumapetalumwilld.的干燥成熟種子習稱“北葶藶子”，而播娘蒿descurainiasophia(l.)webbexprantl.的干燥成熟種子習稱“南葶藶子”?，F(xiàn)代藥理學表明，北葶藶子主要具有強心作用，而其化學成分主要是黃酮類。而從葶藶子的水提物中分離新的化合物以及研究其應用至今還未見有這方面的相關報道。

技術實現(xiàn)要素：

針對上述情況，為解決現(xiàn)有技術之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種從北葶藶子中提取酚苷化合物的方法及其應用，可有效挖掘北葶藶子的新作用。

本發(fā)明解決的技術方案是，從北葶藶子中提取酚苷化合物的方法：取炮制后的北葶藶子，加北葶藶子10倍重量的水提取三次，每次1.5h，提取液減壓濃縮至浸膏狀，濃縮的浸膏用北葶藶子2-3倍重量的體積濃度為80％的乙醇醇沉，將上清液離心過濾，濃縮至無醇味，上dianionhp-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脫附樹脂)，依次用水、20％乙醇(v/v)、40％乙醇(v/v)、60％乙醇(v/v)、95％乙醇(v/v)洗脫，將各部位減壓濃縮干燥，其中20％乙醇洗脫組分通過toyopearlhw-40柱色譜，依次用水、10％甲醇、20％甲醇、30％甲醇、100％甲醇梯度洗脫，得組分a1～a5(分別對應水、10％甲醇、20％甲醇、30％甲醇、100％甲醇洗脫部位，以下同)，組分a1經(jīng)ods-18反相柱色譜，依次用水、10％甲醇、20％甲醇、30％甲醇、40％甲醇、100％甲醇梯度洗脫，得到b1～b6組分，b1經(jīng)sephadexlh-20柱色譜，依次用水、70％甲醇梯度洗脫，茴香醛-濃硫酸(其配比為茴香醛：濃硫酸：95％乙醇＝1:2:100)噴霧薄層檢識，合并茴香醛-濃硫酸顯色的部分再次上sephadexlh-20柱，100％甲醇反復洗脫，茴香醛-濃硫酸噴霧薄層檢識，合并顯色部分，組分b1以上述方法反復進行三次，得到組分c1，組分c1再經(jīng)toyopearlhw-40柱色譜，依次用水、20％乙醇、40％乙醇、70％乙醇梯度洗脫，得組分d1-d4，其中組分d4用半制備hplc分離，色譜柱為ymc-packods-a色譜柱(規(guī)格型號：250×10mm,粒徑5μm,孔徑12nm)，流動相為乙腈:0.05％三氟乙酸(v/v)＝10:90，得到北葶新苷a和北葶新苷b；

其中，北葶新苷a，分子式為c18h24o12[m+na]⁺m/z455.1196(計算值455.1165)。其結構式如下：

北葶新苷b，分子式為c18h24o12[m+na]⁺m/z455.1202(計算值455.1165)，其結構式如下：

本發(fā)明從北葶藶子的水提物中從中分離并鑒定了兩個新的酚苷化合物，即：北葶新苷a和北葶新苷b，且兩個新酚苷化合物均能顯著提高雙氧水(h2o2)誘導的大鼠心肌細胞h9c2損傷的細胞存活率，具有心肌細胞保護作用，為制備心肌保護類藥物提供了新的途徑。

附圖說明

圖1為本發(fā)明北葶新苷a的¹h-nmr譜(cd3od)。

圖2為本發(fā)明北葶新苷a的¹³c-nmr譜(cd3od)。

圖3為本發(fā)明北葶新苷a的dept135譜(cd3od)。

圖4為本發(fā)明北葶新苷a的¹h-¹hcosy譜。

圖5為本發(fā)明北葶新苷a的hsqc譜。

圖6為本發(fā)明北葶新苷a的hmbc譜。

圖7為本發(fā)明北葶新苷a的noesy譜。

圖8為本發(fā)明北葶新苷a的ms譜。

圖9為本發(fā)明北葶新苷a的ir譜。

圖10為本發(fā)明北葶新苷a的ms譜。

圖11為本發(fā)明北葶新苷b的¹h-nmr譜(cd3od)。

圖12為本發(fā)明北葶新苷b的¹³c-nmr譜(cd3od)。

圖13為本發(fā)明北葶新苷b的dept135譜(cd3od)。

圖14為本發(fā)明北葶新苷b的¹h-¹hcosy譜。

圖15為本發(fā)明北葶新苷b的hsqc譜。

圖16為本發(fā)明北葶新苷b的hmbc譜。

圖17為本發(fā)明北葶新苷b的noesy譜。

圖18為本發(fā)明北葶新苷b的ms譜。

圖19為本發(fā)明北葶新苷b的ir譜。

圖20為本發(fā)明北葶新苷b的ms譜。

圖21為本發(fā)明北葶新苷a對h2o2誘導的h9c2大鼠心肌細胞存活率的影響(n＝6)。

圖22為本發(fā)明北葶新苷b對h2o2誘導的h9c2大鼠心肌細胞存活率的影響(n＝6)。

具體實施方式

以下結合實施例對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。

實施例1

取北葶藶子8kg，于240℃，清炒5.5min，加北葶藶子10倍重量的水提取三次，每次1.5h，提取液減壓濃縮至浸膏，濃縮的浸膏用20l體積濃度為80％的乙醇醇沉，將上清液離心過濾，濃縮至無醇味，上dianionhp-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脫附樹脂)，依次用水、20％乙醇(v/v)、40％乙醇(v/v)、60％乙醇(v/v)、95％乙醇(v/v)洗脫，將各部位減壓濃縮干燥，分別得到水、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、95％乙醇洗脫(分別為361.0g、71.2g、89.6g、67.2g、28.7g)的組分，其中20％乙醇洗脫組分通過toyopearlhw-40柱色譜，依次用水、10％甲醇、20％甲醇、30％甲醇、100％甲醇梯度洗脫，得組分a1～a5，組分a1(25.3g)經(jīng)ods-18反相柱色譜，依次用水、10％甲醇、20％甲醇、30％甲醇、40％甲醇、100％甲醇梯度洗脫，得到b1～b6，組分b1(7.8g)經(jīng)sephadexlh-20柱色譜，依次用水、70％甲醇梯度洗脫，茴香醛-濃硫酸噴霧薄層檢識，茴香醛-濃硫酸按茴香醛：濃硫酸：95％乙醇＝1:2:100配比，合并茴香醛-濃硫酸顯色的部分再次上sephadexlh-20柱，100％甲醇反復洗脫，茴香醛-濃硫酸噴霧薄層檢識，合并顯色部分，組分b1以上述方法反復進行三次，得到組分c1(1.2g)，組分c1再經(jīng)toyopearlhw-40柱色譜，依次用水、20％乙醇、40％乙醇、70％乙醇梯度洗脫，得組分d1-d4，其中組分d4(50.3mg)用半制備hplc分離，色譜柱為ymc-packods-a色譜柱(規(guī)格型號：250×10mm,粒徑5μm,孔徑12nm)，流動相為乙腈-0.05％三氟乙酸(體積比10:90)，得到北葶新苷a(14.0mg,tr＝80.3min)和北葶新苷b(2.9mg,tr＝62.5min)。

實施例2

取北葶藶子2kg，于240℃，清炒5.5min，加北葶藶子10倍重量的水提取三次，每次1.5h，提取液減壓濃縮至浸膏，濃縮的浸膏用5l體積濃度為80％的乙醇醇沉，將上清液離心過濾，濃縮至無醇味，上dianionhp-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脫附樹脂)，依次用水、20％乙醇(v/v)、40％乙醇(v/v)、60％乙醇(v/v)、95％乙醇(v/v)洗脫，將各部位減壓濃縮干燥，分別得到水、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、95％乙醇洗脫(分別為90.1g、18.0g、22.5g、17.0g、7.3g)的組分，其中20％乙醇洗脫組分通過toyopearlhw-40柱色譜，依次用水、10％甲醇、20％甲醇、30％甲醇、100％甲醇梯度洗脫，得組分a1～a5，組分a1(6.2g)經(jīng)ods-18反相柱色譜，依次用水、10％甲醇、20％甲醇、30％甲醇、40％甲醇、100％甲醇梯度洗脫，得到b1～b6，組分b1(1.9g)經(jīng)sephadexlh-20柱色譜，依次用水、70％甲醇梯度洗脫，茴香醛-濃硫酸噴霧薄層檢識，茴香醛-濃硫酸按茴香醛：濃硫酸：95％乙醇＝1:2:100配比，合并茴香醛-濃硫酸顯色的部分再次上sephadexlh-20柱，100％甲醇反復洗脫，茴香醛-濃硫酸噴霧薄層檢識，合并顯色部分，組分b1以上述方法反復進行三次，得到組分c1(300mg)，組分c1再經(jīng)toyopearlhw-40柱色譜，依次用水、20％乙醇、40％乙醇、70％乙醇梯度洗脫，得組分d1-d4，其中組分d4(13.0mg)用半制備hplc分離，色譜柱為ymc-packods-a色譜柱(規(guī)格型號：250×10mm,粒徑5μm,孔徑12nm)，流動相為乙腈-0.05％三氟乙酸(10:90)，得到北葶新苷a(3.2mg,tr＝80.3min)和北葶新苷b(0.6mg,tr＝62.5min)。

實施例3

取北葶藶子1kg，于240℃，清炒5.5min，加北葶藶子10倍重量的水提取三次，每次1.5h，提取液減壓濃縮至浸膏，濃縮的浸膏用3l體積濃度為80％的乙醇醇沉，將上清液離心過濾，濃縮至無醇味，上dianionhp-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脫附樹脂)，依次用水、20％乙醇(v/v)、40％乙醇(v/v)、60％乙醇(v/v)、95％乙醇(v/v)洗脫，將各部位減壓濃縮干燥，分別得到水、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、95％乙醇洗脫(分別為45.0g、9.0g、11.3g、8.5g、3.6g)的組分，其中20％乙醇洗脫組分(9.0g)通過toyopearlhw-40柱色譜，依次用水、10％甲醇、20％甲醇、30％甲醇、100％甲醇梯度洗脫，得組分a1～a5，組分a1(3.2g)經(jīng)ods-18反相柱色譜，依次用水、10％甲醇、20％甲醇、30％甲醇、40％甲醇、100％甲醇梯度洗脫，得到b1～b6，組分b1(0.9g)經(jīng)sephadexlh-20柱色譜，依次用水、70％甲醇梯度洗脫，茴香醛-濃硫酸噴霧薄層檢識，茴香醛-濃硫酸按茴香醛：濃硫酸：95％乙醇＝1:2:100配比，合并茴香醛-濃硫酸顯色的部分再次上sephadexlh-20柱，100％甲醇反復洗脫，茴香醛-濃硫酸噴霧薄層檢識，合并顯色部分，組分b1以上述方法反復進行三次，得到組分c1(150mg)組分，c1再經(jīng)toyopearlhw-40柱色譜，依次用水、20％乙醇、40％乙醇、70％乙醇梯度洗脫，得組分d1-d4，其中組分d4(6.3mg)用半制備hplc分離，色譜柱為ymc-packods-a色譜柱(規(guī)格型號：250×10mm,粒徑5μm,孔徑12nm)，流動相為乙腈-0.05％三氟乙酸(10:90)，得到北葶新苷a(1.8mg,tr＝80.0min)和北葶新苷b(0.4mg,tr＝62.0min)。

為了明確北葶藶子的藥效物質(zhì)基礎，本發(fā)明采用水煎煮法對其進行提取，而由于其遇水發(fā)黏，使得水煎液提取率低不說，提取出來的成分絕大部分是粘液質(zhì)，因此本發(fā)明首先采用清炒法，于240℃，炒制5.5min對其進行簡單炮制，以使北葶藶子中的成分更易溶出，從北葶藶子的水提物中從中分離并鑒定了兩個新的酚苷化合物，即：北葶新苷a和北葶新苷b，實驗結果顯示這兩個新酚苷化合物均能顯著提高雙氧水(h2o2)誘導的大鼠心肌細胞h9c2損傷的細胞存活率，具有心肌細胞保護作用。并經(jīng)試驗進行了充分證明，相關試驗資料如下：

1儀器與試藥

核磁共振用brukeravanceⅲ500核磁共振儀(tms內(nèi)標)(bruker)，紅外光譜用nicoletis10microscopespectrometer(thermoscientific,usa)，高分辨質(zhì)譜用brukermaxishdmassspectrometer，紫外光譜用shimadzuuv-2401pcapparatus，高效液相色譜用watersalliance系列2695高效液相系統(tǒng)，配備2998型二極管陣列檢測器，empower3色譜數(shù)據(jù)工作站，lc50型高壓制備液相色譜儀，uv200型紫外檢測器[賽譜銳思(北京)科技有限公司]，ymc-packods-a色譜柱(250×10mm.d.s-5mm,12mm)(ymc有限公司)，其余有n-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)，a-1000s型水流抽氣機(上海愛朗儀器有限公司)，n-1111型冷凍水循環(huán)裝置(上海愛朗儀器有限公司)，fdu-2110型冷凍干燥機(上海愛朗儀器有限公司)，dfz-60508型真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)，ab204-n萬分之一精密分析天平(mettlertoledo)，imark型酶標儀(美國bio-rad)，二氧化碳培養(yǎng)箱(上海stik)，超凈工作臺(蘇凈集團)，arium611vf超級組合型超純水器(sartorius)，倒置顯微鏡(nikon)，pb-10酸度計(德國賽多利斯集團)。

柱層析填料diaionhp-20、mcigelchp-20(日本三菱化學公司)，toyopearlhw-40(日本tosoh公司)，sephadexlh-20(parmaciabiotech公司)，柱層析所用硅膠h(160-200目)為青島海洋化工廠生產(chǎn)，培養(yǎng)皿、96孔培養(yǎng)板、細胞凍存管(corning公司)，所用色譜純試劑位天津四友精細化學品有限公司生產(chǎn)，所用分析純試劑為北京化工廠和天津第三化學試劑廠生產(chǎn)。

dmem高糖培養(yǎng)液(gibco)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，胰蛋白酶(gibco)，dmso(solarbio)；mtt(biosharp)，h2o2溶液(天津市恒興化學試劑制造有限公司)，水為超純水，pbs緩沖液等為自配。

北葶藶子于2014年采自河南南陽，經(jīng)鑒定為十字花科植物獨行菜lepidiumapetalumwilld.的干燥成熟種子。

2結構鑒定

北葶新苷a，淡黃色結晶性粉末(meoh)，分子式為c18h24o12[m+na]⁺m/z455.1196(計算值455.1165)，uv(meoh)λmax:206.0,230.0,315.0nm；ir(kbr)νmaxcm^-1：3364,2931,1576,1489,1039。其結構式及核磁數(shù)據(jù)如下：

北葶新苷b，淡黃色結晶性粉末(meoh)，分子式為c18h24o12[m+na]⁺m/z455.1202(計算值455.1165)，uv(meoh)λmax:206.0,238.0,302.0nm；ir(kbr)νmaxcm^-1：3413,2925,1672,1466,1246,1046。其結構式及核磁數(shù)據(jù)如下：

表1北葶新苷a和b的¹hnmr(500mhz)和¹³cnmr(125mhz)數(shù)據(jù)(incd3od)

3北葶新苷a和北葶新苷b對雙氧水(h2o2)損傷大鼠心肌細胞h9c2的保護作用試驗

3.1細胞

h9c2細胞株購自深圳市百恩維生物科技有限公司。

3.2細胞培養(yǎng)

將h9c2培養(yǎng)在含體積分數(shù)為10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基中(含青霉素和鏈霉素100ku·l^-1)，置于37℃、5％co2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，均取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

3.3h2o2誘導的h9c2大鼠心肌細胞損傷模型的建立

傳代培養(yǎng)時，將對數(shù)生長期的細胞以5×10⁴的密度接種于96孔板中，待細胞完全貼壁后，換用含藥的高糖dmem培養(yǎng)液。h2o2給予含200μmh2o2的含血清高糖dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)6h。

3.4實驗分組

每組設6個平行孔，設正常組(nc)、h2o2組(m)、北葶藶子各單體化合物給藥組。h2o2組：給予含200μmh2o2的含血清高糖dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)6h；北葶新苷a和北葶新苷b給藥組：分別給予含200μmh2o2和1、2、4、8、16、32、64μm北葶新苷a和北葶新苷b的含血清高糖dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)6h。

3.5mtt法檢測北葶新苷a和北葶新苷b對h9c2損傷細胞存活率的影響

細胞接種于96孔板，貼壁后加藥干預培養(yǎng)后，吸除上清液，各孔分別加入含1％mtt(5g/l)的高糖dmem培養(yǎng)液200μl，37℃孵育4h，吸除上清液，加入150μl的dmso，震蕩10min使結晶充分溶解。用酶標儀檢測490nm波長處od值，用公式計算細胞存活率＝(od實驗組/od對照組)×100％。實驗重復3次，取平均值。

3.6統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，用spss18.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，各組間比較采用單因素方差分析(one-wayanova)，p<0.05表示有顯著性意義，p<0.01表示有極顯著性意義。3.7結果

研究結果表明：與空白組相比，模型組細胞活力顯著降低(p<0.01)；與模型組相比，北葶新苷a給藥劑量為1μm時，能夠極顯著提高細胞活力(p<0.01)，在2、4、8、16μm時，能夠顯著提高細胞活力(p<0.05)；北葶新苷b給藥劑量在4、8、16、32μm時，能夠顯著提高細胞活力(p<0.05)。表明北葶藶子單體北葶新苷a和b對心肌細胞有一定的保護作用。

表2北葶新苷a對h2o2誘導的h9c2大鼠心肌細胞存活率的影響(n＝6)

注：與正常組比較:*p<0.05；**p<0.01與h2o2組比較:^#p<0.05；^##p<0.01

表3北葶新苷b對h2o2誘導的h9c2大鼠心肌細胞存活率的影響(n＝6)

注：與正常組比較:*p<0.05；**p<0.01與h2o2組比較:^#p<0.05；^##p<0.01

綜上，從北葶藶子的水提物中分離并鑒定的兩個新的酚苷化合物，實驗結果顯示這兩個新酚苷化合物均能顯著提高雙氧水(h2o2)誘導的大鼠心肌細胞h9c2損傷的細胞存活率，具有心肌細胞保護作用，可有效用于制備心肌保護類藥物，開發(fā)了北葶藶子的新用途，具有實際的臨床意義和良好的應用推廣價值。