專利名稱：雜構多核苷酸及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及使用L-DNA檢測核酸的方法和組合物。
背景技術：
核酸檢測試驗是分子生物學研究和醫(yī)學診斷的重要工具。許多檢測樣品中的特定核酸分子的核酸探針試驗都是以檢測表明發(fā)生了雜交、連接、引物延伸和復制事件的信號為基礎。核酸檢測是鑒定微生物、監(jiān)測基因表達和類型和鑒定組織和血樣試驗中的關鍵。
已有各種DNA雜交技術用于檢測含有大量序列區(qū)域的樣品中一種或多種選擇的多核苷酸序列的存在。在一種依賴片段的捕獲和標記的方法中，含有選擇的序列的核酸片段通過雜交而被捕獲到固定的探針上。通過與含有可檢測的報道部分的第二探針雜交而標記該捕獲的片段?；蛘撸刹捎酶鞣N方法，包括標記核苷酸的引物延伸摻入、利用標記的引物進行的擴增、化學標記反應、標記探針的連接、以及雜交復合物的交聯(lián)，在捕獲之前標記該核酸片段。
現(xiàn)有試驗的一個缺點是探針與非想要的靶序列之間或不同的探針之間的交叉-雜交可能干擾試驗的性能。因此，需要對此進行改進，以避免交叉-雜交，同時保持良好的試驗性能。

發(fā)明內容
一方面，本發(fā)明包括含有雜構多核苷酸(heteroconfigurational polynucleotide)的多核苷酸組合物，該雜構多核苷酸含有D型多核苷酸序列部分和與其共價連接的L型多核苷酸序列部分。在一些實施例中，該L型多核苷酸序列部分包含5-50個L-核苷酸。在一些實施例中，該D型多核苷酸序列部分包含5-50個D-核苷酸。
在一些實施例中，該L型多核苷酸序列部分包含至少一種L型2′-4′LNA核苷酸。在一些實施例中，該L型多核苷酸序列部分包含至少一種L型核苷酸，包括1′-α-端基異構核苷酸或4′-α-端基異構核苷酸。在一些實施例中，該L型多核苷酸序列部分包含至少一種含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-β端基異構構型。在一些實施例中，該L型多核苷酸序列部分包含至少一種含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-α端基異構構型。在一些實施例中，該L型多核苷酸序列部分包含至少一種含核糖、2′-脫氧核糖、2′，3′-雙脫氧核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖或2′-O-甲基核糖的L型多核苷酸。在一些實施例中，該D型多核苷酸序列部分包含一種D型2′-4′LNA核苷酸。在一些實施例中，該D型多核苷酸序列部分含有至少一種L型核苷酸，包括1′-α-端基異構核苷酸或4′-α-端基異構核苷酸。在一些實施例中，該D型多核苷酸序列部分包含至少一種含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-β端基異構構型。在一些實施例中，該D型多核苷酸序列部分包含至少一種含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-α端基異構構型。在一些實施例中，該D型多核苷酸序列部分包含至少一種含核糖、2′-脫氧核糖、2′，3′-雙脫氧核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖或2′-O-甲基核糖的L型多核苷酸。在一些實施例中，至少一種D型多核苷酸序列部分和L型多核苷酸序列部分包含選自2-氨乙基甘氨酸、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、三磷酸酯和氨基磷酸酯的核苷酸間連接鍵。
在一些實施例中，前述任一權利要求的組合物中的雜構多核苷酸包含選自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、7-脫氮腺嘌呤、鳥嘌呤和7-脫氮尿苷的核苷酸堿基。
在一些實施例中，該雜構多核苷酸包含選自2，6-二氨基嘌呤、次黃嘌呤、假尿苷、C-5-丙炔、異胞嘧啶、異鳥嘌呤和2-硫代嘧啶的核苷酸堿基。
在一些實施例中，該組合物含有與L型多核苷酸序列部分雜交的第一互補多核苷酸。在一些實施例中，該第一互補核苷酸含有至少一種L型核苷酸。在一些實施例中，該第一互補多核苷酸含有至少一種L型2′脫氧核糖或2′-4′LNA核苷酸。在一些實施例中，該第一互補多核苷酸含有至少兩種肽核酸亞基。
在一些實施例中，該第一互補多核苷酸連接于固相載體。在一些實施例中，該固相載體包括聚苯乙烯、玻璃、硅膠、硅石、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、羥乙基甲基丙烯酸酯、聚酰胺、聚乙烯、聚乙烯氧基(polyethyleneoxy)或尼龍。在一些實施例中，該固相載體包括小顆粒、珠、膜、玻璃料、載玻片、平板、顯微機械加工芯片、鏈烷硫醇-金層(alkanethoil-gold layer)、無孔表面、可尋址陣列或凝膠。在一些實施例中，該固相載體包括珠、聚苯乙烯珠和/或尼龍膜。在一些實施例中，該固相載體包括選自納米顆粒、微球體或脂質體的小顆粒。在一些實施例中，該固相載體是玻璃。在一些實施例中，所述第一互補多核苷酸通過可切割的連接物連接于該載體。在一些實施例中，該可切割的連接物包含羰基，該第一互補多核苷酸通過該羰基與該載體連接。
在一些實施例中，組合物含有與D型多核苷酸序列部分雜交的第二互補多核苷酸。
在一些實施例中，組合物含有可檢測的標記物，如熒光染料、熒光猝滅劑、能量轉移對、量子點(quantum dot)或化學發(fā)光前體。在一些實施例中，該標記物包括熒光素、羅丹明或花青。在一些實施例中，該標記物連接于與D型多核苷酸序列部分雜交的第二互補多核苷酸。
還提供的是含有5-100個L型核苷酸的不同序列多核苷酸陣列，其中，多核苷酸被固定在固相載體上的可尋址位置。在一些實施例中，該固相載體包括聚苯乙烯、玻璃、硅膠、硅石、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、羥乙基甲基丙烯酸酯、聚酰胺、聚乙烯、聚乙烯氧基或尼龍。在一些實施例中，該固相載體包括小顆粒、珠、膜、玻璃料、載玻片、平板、顯微機械加工芯片、鏈烷硫醇-金層、無孔表面、可尋址陣列或凝膠。在一些實施例中，該固相載體包括珠、聚苯乙烯珠和/或尼龍膜。在一些實施例中，該固相載體包括選自納米顆粒、微球體或脂質體的小顆粒。在一些實施例中，該固相載體是玻璃，如可控空隙玻璃(contolled pore glass)。在一些實施例中，所述第一互補多核苷酸通過可切割的連接物連接于該載體。在一些實施例中，該可切割的連接物包含羰基，該第一互補多核苷酸通過該羰基與該載體連接。在一些實施例中，該固相載體被制成96孔模式。在一些實施例中，至少一種多核苷酸含有標記物。在一些實施例中，該標記物包括熒光染料、猝滅劑、能量轉移染料、量子點、洋地黃毒苷、生物素、遷移率改變劑、多肽、穩(wěn)定雜交的部分或者化學發(fā)光前體。在一些實施例中，至少一種固定的多核苷酸包含以下結構 式中，S是固相載體；A是連接物；X是具有3個或多個連接位點的連接物；Y是O、NH或S，其中R選自C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C5-C14芳基和取代的C5-C14芳基；L是氫或標記物；NL是L型核苷酸序列；ND是D型核苷酸序列；m是0-100的整數(shù)；n是5-100的整數(shù)；q是0-100的整數(shù)。
在一些實施例中，A是可切割的連接物。在一些實施例中，A包含一個或多個以下結構 在一些實施例中，(ND)m和(NL)n、(NL)n和(ND)q通過連接物相互連接。在一些實施例中，該連接物含有一個或多個乙烯氧亞基。在一些實施例中，m＝0。在一些實施例中，m＝q＝0。
還提供各種方法。在一些實施例中，本發(fā)明包括形成多核苷酸雜交物的方法，包括提供含有D型多核苷酸序列部分和與之共價連接的L型多核苷酸序列部分的雜構多核苷酸，使該雜構多核苷酸與第一互補多核苷酸雜交，形成該第一互補多核苷酸與該L型多核苷酸序列部分之間的雙鏈體。在一些實施例中，該L型多核苷酸序列部分包含5-50個L型核苷酸。在一些實施例中，該L型多核苷酸序列部分包括5-50個L型核苷酸。在一些實施例中。該L型多核苷酸序列部分包括至少一種L型2′-4′LNA核苷酸。在一些實施例中，該L型多核苷酸序列部分包含至少一種為1′-α-端基異構核苷酸或4′-α-端基異構核苷酸的L型核苷酸。在一些實施例中，該L型多核苷酸序列部分包含至少一種含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-β端基異構構型。在一些實施例中，該L型多核苷酸序列部分包含至少一種含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-α端基異構構型。在一些實施例中，該L型多核苷酸序列部分包含至少一種含核糖、2′-脫氧核糖、2′，3′-雙脫氧核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖或2′-O-甲基核糖的L型多核苷酸。在一些實施例中，該D型多核苷酸序列部分包含一種D型2′-4′LNA核苷酸。在一些實施例中，D型多核苷酸序列部分含有至少一種為1′-α-端基異構核苷酸或4′-α-端基異構核苷酸的L型核苷酸。在一些實施例中，該D型多核苷酸序列部分包含至少一種含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-β端基異構構型。在一些實施例中，該D型多核苷酸序列部分包含至少一種含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-α端基異構構型。在一些實施例中，該D型多核苷酸序列部分包含至少一種含核糖、2′-脫氧核糖、2′，3′-雙脫氧核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖或2′-O-甲基核糖的L型多核苷酸。在一些實施例中，至少一種D型多核苷酸序列部分和L型多核苷酸序列部分包含選自2-氨乙基甘氨酸、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、三磷酸酯和氨基磷酸酯的核苷酸內連接鍵。在一些實施例中，該第一互補多核苷酸包含至少一種L型核苷酸。在一些實施例中，該第一互補多核苷酸含有至少一種L型2′脫氧核糖或2′-4′LNA核苷酸。在一些實施例中，該第一互補多核苷酸含有至少兩種肽核酸亞基。在一些實施例中，可從所述雜交物分離未雜交的第一互補多核苷酸。在一些實施例中，所述方法包括檢測該雜交物。在一些實施例中，所述方法包括對該雜構多核苷酸進行引物延伸。在一些實施例中，該方法包括使用核酸酶切割該雜構多核苷酸。在一些實施例中，該方法包括將該雜構多核苷酸連接于雜交到其末端毗連位置上的多核苷酸。在一些實施例中，該雜交物固定在固相載體上。
還提供試劑盒。在一些實施例中，該試劑盒包括上述雜構多核苷酸和固相載體，在該固相載體上連接有至少一種含L型多核苷酸序列部分的多核苷酸，該L型多核苷酸序列部分與該雜構多核苷酸中的L型多核苷酸序列部分互補。在一些實施例中，試劑盒含有多種固相載體，各載體連接有含有L型多核苷酸序列部分的雜構多核苷酸，該L型多核苷酸序列部分包含與所述多種載體中的其它固相載體上的L型多核苷酸序列部分的序列不同的獨特序列。在一些實施例中，該試劑盒包含處于不同位置的雜構多核苷酸的可尋址陣列，陣列中各多核苷酸含有L型雜構多核苷酸序列部分，該部分含有與陣列中其它位置上的雜構多核苷酸中的L型多核苷酸序列部分的序列不同的獨特序列。在一些實施例中，該試劑盒包括至少10種不同的雜構多核苷酸，各多核苷酸含有與其它雜構多核苷酸中的L型多核苷酸序列部分不同的獨特序列。在一些實施例中，該試劑盒含有至少100種不同的雜構多核苷酸，各多核苷酸含有與其它雜構多核苷酸中的L型多核苷酸序列部分不同的獨特序列。
結合附圖和以下描述，本發(fā)明的這些和其它特征將更明了。


圖1顯示寡核苷酸的D型DNA部分和該寡核苷酸的鏡像L型DNA部分。
圖2顯示雜構寡核苷酸與靶多核苷酸的雜交，和該雜構多核苷酸/靶雜交物的引物延伸。
圖3顯示標記的雜構寡核苷酸/靶雜交物的示范性實施例，其中(a)L型序列部分的末端共價連接于標記物；(b)D型序列部分共價連接于標記物；(c)靶標被多重標記；和(d)通過與標記的核苷酸5′-三磷酸的引物延伸摻入標記物。
圖4顯示雜構寡核苷酸探針與第二探針的連接。
圖5顯示使用雜構寡核苷酸引物進行PCR，形成L型序列標記的擴增子。
圖6顯示包含L型序列的固定寡核苷酸的可尋址陣列。以圓圈(“○”)代表的各位置可包含獨特的L型序列。該L型序列可與雜構寡核苷酸的互補L型序列雜交。
圖7顯示標記有熒光染料(F)和猝滅劑(Q)的探針，由此，通過接近非雜交狀態(tài)的猝滅劑而猝滅熒光(左)。當與靶序列雜交后，熒光染料和猝滅劑物理上分開得足夠遠，使得產(chǎn)生熒光。
圖8顯示示范性連接反應，接著PCR擴增。
圖9顯示可尋址陣列上的固定的標記雜交物的示范性實施例。
圖10顯示固定的標記雜交物的示范性例子，其中，該靶序列的多個核苷酸被標記，一個位置可被標記為對照。
圖11顯示使用標記的雙脫氧核苷酸5′-三磷酸在SNP位點(X)對雜構寡核苷酸/靶雜交物進行的引物延伸?？蓪⒀由斓碾s交物變性，使延伸的引物與靶標分離、純化和檢測。
圖12顯示點狀陣列上雜交的平均熒光強度的定量、三維圖像。
具體實施例方式
以下將涉及本發(fā)明一些實施方式的詳細內容，這些實施方式的實施例將在后面的實施例中闡述。雖然本發(fā)明以代表性實施方式進行描述，但是，應該理解的是，不能認為本發(fā)明受到這些實施方式的限制。相反，本發(fā)明覆蓋可包含于本發(fā)明范圍之內的所有變化、改動和等價形式。
定義按照《有機化合物的立體化學》〔(1994)，E.Eliel和S.Wilen，John Wiley&Sons，Inc.，紐約〕使用立體化學的術語。
術語“構型”指區(qū)分立體異構體(相同結構的異構體)的原子空間排列，而非由于構象不同而產(chǎn)生的差異。構象異構體是構象不同的立體異構體。本文新的組合物的絕對構型是由它們的手性中心所確定(如糖碳原子)。手性碳用字母符號表示其旋轉R表示順時針，S表示逆時針；由Cahn、Ingold和Prelog的鍵優(yōu)先原則定義〔《有機化學》，第15版(2000)，J.McMurry，Brooks/Cole，Pacific Grove，CA，第315-319頁〕。
術語“異構”指含有由不同立體化學構型組成的亞基的化合物。
“核苷酸堿基”指含氮的、在與互補的核苷酸堿基或核苷酸堿基類似物配對時能形成Watson-Crick氫鍵的雜環(huán)部分，如嘌呤、7-脫氮嘌呤或嘧啶。典型的核苷酸堿基是天然產(chǎn)生的核苷酸堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶和天然產(chǎn)生的核苷酸堿基的類似物(Seela，美國專利號5446139)，如7-脫氮腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮-8-氮鳥嘌呤、7-脫氮-8-氮腺嘌呤、次黃嘌呤、煙云杯傘素、硝基吡咯〔Bergstrom，1995，J.Amer.Chem.Soc.，1171201-09〕、硝基吲哚、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、次黃嘌呤、假尿苷、假胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤(Seela，美國專利號6147199)、7-脫氮鳥嘌呤(Seela，美國專利號5990303)、2-氮雜嘌呤(Seela，WO 01/16149)、2-硫代嘧啶、6-硫代鳥嘌呤、4-硫代胸腺嘧啶、4-硫代尿嘧啶、O6-甲基鳥嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、O4-甲基胸腺嘧啶、5，6-二氫胸腺嘧啶、5，6-二氫尿嘧啶、4-甲基吲哚、吡唑啉酮[3，4-D]嘧啶、“PPG”〔Meyer，美國專利號6143877和6127121；Gall，WO 01/38584〕、和亞乙?；汆堰省睩asman(1989)，《生物化學和分子生物學實踐手冊》，第385-394頁，CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)1〕。
“核苷”指由核苷酸堿基連接于糖(如呈天然的β或α端基異構構型的核糖、阿拉伯糖、木糖和吡喃糖)的C-1′碳組成的化合物。所述糖可以是取代或未取代的。取代的核糖包括但不限于其一個或多個碳原子(如2′-C原子)被一個或多個相同或不同的Cl、F、-R、-OR、-NR2或鹵素基團取代的那些核糖，其中各R獨立為H、C1-C6烷基或C5-C14芳基。核糖例子包括核糖、2′-脫氧核糖、2′，3′-雙脫氧核糖、2′-鹵代核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖和2′-烷基核糖，如2′-O-甲基、4′-α-端基異構核苷酸、1′-α-端基異構核苷酸〔Asseline，1991，Nucl.Acids.Res.，194067-74〕、2′-4′-和3′-4′-連接的和其它“鎖定的”(locked)或“LNA”雙環(huán)糖修飾物(WO 98/22489、WO 98/39352、WO 99/14226)。多核苷酸內的代表性LNA糖類似物包括以下結構
式中，B是任何核苷酸堿基。
糖類包括在2′或3′位置上的修飾，如甲氧基、乙氧基、烯丙基氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、甲氧基乙基、烷氧基、苯氧基、疊氮基、氨基、烷基氨基、氟、氯和溴。核苷和核苷酸包括天然D構型異構體(D型)以及L構型異構體(L型)〔Beigelman，美國專利號6251666；Chu，美國專利號5753789；Shudo，EP0540742；Garbesi(1993)，Nucl.Acids Res.，214159-65；Fujimori(1990)，J.Amer.Chem.Soc.，1127435；Urata，1993，Nucleic Acids Symposium Ser.No.2969-70〕。當核苷酸堿基是嘌呤如A或G時，所述核糖通常連接于該核苷酸堿基的N9位置。當核苷酸堿基是嘧啶如C、T或U時，該戊糖通常連接于該核苷酸堿基的N1位置〔Kornberg和Baker，1992，《DNA復制》，第二版，F(xiàn)reeman，San Francisco，CA〕。
“核苷酸”指核苷的磷酸酯，作為單體單元或者位于核酸之內?！昂塑账?′-三磷酸”指在其5′位置上具有三磷酸酯基團的核苷酸，有時稱為“NTP”或“dNTP”和“ddNTP”，以具體指出該核糖的結構特征。三磷酸酯基團還包括取代各個氧的硫，例如α-硫代-核苷酸5′-三磷酸。關于核酸化學的綜述，可參見Shabarova，Z.和Bogdanov，A.，《核酸的高級有機化學》“Advanced OrganicChemistry of Nucleic Acids”，VCH，紐約，1994。
在本文中，術語“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互換使用，指核苷酸單體的單鏈或雙鏈聚合物，包括通過核苷酸間的磷酸二酯鍵連接如3′-5′和2′-5′、反向連接、如3′-3′和5′-5′、支鏈結構或核苷酸間類似物而連接的2′-脫氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)。多核苷酸與平衡離子如H+、NH4+、三烷基銨、Mg2+、Na+等相結合。多核苷酸可全部由脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其嵌合混合物組成。多核苷酸可由核苷酸堿基和糖類似物組成。多核苷酸大小通常從幾個單體單元(如通常在本領域中將其稱為寡核苷酸時，為5-40個單體單元)到幾千個單體核苷酸單元。除非另有說明，否則不論在什么時候表示多核苷酸，都應理解為核苷酸順序從左到右是5′到3′，且除非另有說明，否則A表示脫氧腺苷、C表示脫氧胞苷、G表示脫氧鳥苷、T表示胸苷。
術語“雜構寡核苷酸”指含有不同構型的核苷酸組成的寡核苷酸。雜構寡核苷酸具有一個或多個L型核苷酸部分和一個或多個D型核苷酸部分。
“核苷酸間類似物”指多核苷酸的磷酸酯類似物或非磷酸酯類似物。磷酸酯類似物包括(i)C1-C4烷基膦酸酯，如甲基膦酸酯；(ii)氨基磷酸酯；(iii)C1-C6烷基-磷酸三酯；(iv)硫代磷酸酯；和(v)二硫代磷酸酯。非磷酸酯類似物包括其糖/磷酸酯部分被酰胺鍵取代的化合物，如2-氨基乙基甘氨酸單元，通常稱為PNA〔Buchardt，WO 92/20702；Nielsen(1991)，Science，2541497-1500〕。
“多肽”指包括蛋白質、合成肽、抗體、肽類似物和肽模擬物的聚合物，其中其單體是氨基酸，并通過酰胺鍵相互連接。當氨基酸是α氨基酸時，不論是L-光學異構體還是D-光學異構體都可使用。此外，也包括非天然的氨基酸，例如valanine、苯基甘氨酸和高精氨酸。通常遇到的非基因編碼的氨基酸也可用于本發(fā)明。用于本發(fā)明的所有氨基酸可是D-或L-光學異構體。此外，其它肽模擬物也可用于本發(fā)明。關于一般綜述，可參見Spatola，A.F.，《氨基酸、肽和蛋白質的 化學和生物化學》，B.Weinstein編輯，Marcel Dekker，紐約，第267頁，1983。
術語“氨基酸”指天然產(chǎn)生的氨基酸和合成的氨基酸，以及含有氨基和羧酸基團的氨基酸類似物。
“連接位點”指在某部分或分子如猝滅劑、熒光染料或多核苷酸上的位點，連接物或其它部分可通過該位點進行共價連接，或者能夠被共價連接。
“連接物”指含有共價鍵或將其一部分或其自身共價連接于另一部分(如將猝滅劑連接于多核苷酸)的原子鏈的分子的化學部分?！翱汕懈钸B接物”是具有一個或多個可由反應或條件而斷裂的共價鍵的連接物。例如，分子中的酯是可被試劑如氫氧化鈉切斷的連接物，結果產(chǎn)生含有羧酸酯的片段和含羥基的產(chǎn)物。
“反應性連接基團”指分子上的化學反應性取代基團或部分，如親核的或親電子的，能與另一分子發(fā)生反應形成共價鍵。反應性連接基團包括活性酯類，它們通常被用于與氨基連接。例如，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯具有針對脂肪族氨基的選擇性，可形成非常穩(wěn)定的脂肪族酰胺產(chǎn)物。它們與芳族胺、醇和苯酚(酪氨酸)以及組氨酸的反應速率相對較低。NHS酯與胺在非水性條件下的反應是容易進行的，因此可用它們衍生化小肽和其它低分子量的生物分子。實際上，含羧酸的任何分子或經(jīng)化學修飾而含有羧酸的任何分子可被轉化成其NHS酯。NHS酯具有具改善水溶性的磺酸基團。
“取代的”在本文指分子中有一個或多個氫原子被一個或多個非氫原子、官能團或部分取代。例如，未取代的氮是-NH2，而取代的氮是-NHCH3。代表性的取代基包括但不限于鹵素，如氟和氯；C1-C8烷基；硫酸基；磺酸基；氨基；銨；酰氨基；腈；硝基；烷氧基(-OR，其中R是C1-C12烷基)；苯氧基；芳基；苯基；多環(huán)芳基；雜環(huán)基；水溶性基團以及連接部分。
“烷基”指從母鏈烷烴、烯烴或炔烴的單個碳原子上除去一個氫原子而得到的飽和或不飽和的、支鏈、直鏈、支鏈、環(huán)狀、或取代的烴基。典型的烷基由1-12個飽和和/或不飽和碳組成，包括但不限于甲基、乙基、氰基乙基、異丙基、丁基等。
“亞烷基(alkyldiyl)”指飽和或不飽和的、支鏈、直鏈、環(huán)狀或取代的1-12個碳原子烴基，具有兩個單價自由基中心，這兩個單價自由基中心從母鏈烷烴、烯烴或炔烴的相同碳原子或兩個不同碳原子除去兩個氫原子而產(chǎn)生。典型的亞烷基包括但不限于1，2-亞甲基(-CH2CH2-)、1，3-亞丙基(-CH2CH2CH2-)、1，4-亞丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等等?！皝喭檠趸?alkoxydiyl)”指具有兩個單價自由基中心的烷氧基，其中一單價自由基中心由除去氧的氫原子而獲得，另一單價自由基中心由除去碳原子的氫原子而獲得。代表性的亞烷氧基包括但不限于亞甲氧基(-OCH2-)或1，2-亞乙氧基或亞乙烯氧基(-OCH2CH2-)?！皝喭榛被?alkylaminodiyl)指具有兩個單價自由基中心的烷基氨基基團，其中一個自由基由除去氮的氫原子獲得，另一個自由基由除去碳原子的氫原子而獲得。代表性的亞烷基氨基包括但不限于-NHCH2-、-NHCH2CH2-和-NHCH2CH2CH2-?！皝喭榛０坊?alkylamidediyl)指具有兩個單價自由基中心的烷基酰胺基團，其中一個自由基由除去氮的氫原子獲得，另一自由基由除去碳原子的氫原子獲得。代表性的亞烷基酰胺基包括但不限于-NHC(O)CH2-、-NH(CO)CH2CH2-和-NH(CO)CH2CH2CH2-。
“芳基”指5-14個碳原子的單價芳族烴基，由除去母芳環(huán)系統(tǒng)一個碳原子的一個氫原子而獲得。代表性的芳基包括但不限于從苯、取代的苯、萘、蒽、聯(lián)苯等獲得的基團，包括取代的芳基。
“亞芳基”指未飽和的5-14個碳原子的環(huán)狀或多環(huán)烴基，具有共軛共振電子系統(tǒng)和至少兩個單價自由基中心，其中所述自由基由除去母芳基化合物的兩個不同碳原子的兩個氫原子而獲得，包括取代的亞芳基。
“取代的烷基”、“取代的亞烷基”、“取代的芳基”、“取代的亞芳基”分別指其一個或多個氫原子獨立被其它取代基取代的烷基、亞烷基、芳基和亞芳基。典型的取代基包括但不限于F、Cl、Br、I、R、OH、-OR、-SR、SH、NH2、NHR、NR2、-+NR3、-N＝NR2、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-NCO、-NCS、-NO、-NO2、-N2+、-N3、-NHC(O)R、-C(O)R、-C(O)NR2、-S(O)2O-、-S(O)2R、-OS(O)2OR、-S(O)2NR、-S(O)R、-OP(O)(OR)2、-P(O)(OR)2、-P(O)(O-)2、-P(O)(OH)2、-C(O)R、-C(O)X、-C(S)R、-C(O)OR、-CO2-、-C(S)OR、-C(O)SR、-C(S)SR、-C(O)NR2、-C(S)NR2、-C(NR)NR2，其中R獨立為-H、C1-C6烷基、C5-C14芳基、雜環(huán)或連接基團。取代基還包括二價的橋連官能團，如二疊氮基(-N＝N-)、酯、醚、酮、磷酸酯、亞烷基和亞芳基。
“雜環(huán)”指環(huán)系統(tǒng)中具有其一個或多個環(huán)原子是雜原子如氮、氧和硫(相對于碳)的分子。
“可酶促延伸的”指一種核苷酸，它能(i)通過聚合酶的作用被酶促摻入多核苷酸的末端；(ii)支持進一步的引物延伸?？擅复傺由斓暮塑账岚ê塑账?′-三磷酸，即dNTP和NTP以及它們的標記形式。
“可酶促摻入的”指能通過聚合酶的作用經(jīng)酶促摻入多核苷酸的末端的核苷酸?？擅复贀饺氲暮塑账岚╠NTP、NTP以及2′，3′-雙脫氧核苷酸5′-三磷酸(即ddNTP)以及它們的標記形式。
“終止子核苷酸”指能通過聚合酶的作用經(jīng)酶促摻入多核苷酸的末端，但之后不能被延伸的核苷酸，即，終止子核苷酸可酶促摻入但不可酶促延伸。終止子核苷酸的例子包括ddNTP和2′-脫氧，3′-氟核苷酸5′-三磷酸及其標記的形式。
“靶標”、“靶多核苷酸”和“靶序列”指待檢測其存在與否的特殊的多核苷酸序列，它是與互補的多核苷酸如引物或探針雜交的對象。靶序列可由DNA、RNA及其類似物組成，包括它們的組合。靶標可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。在引物延伸過程中，與引物形成雜交雙鏈體的靶多核苷酸也可稱為“模板”。模板可用作另一互補核酸的合成的樣板〔《生物醫(yī)學和分子生物學簡明詞典》，1996，CPL Scientific Publishing Services，CRC出版社，Newbury，UK〕。用于本發(fā)明的靶序列可衍生自任何活的或曾經(jīng)活著的生物體，包括但不限于原核生物、真核生物、植物、動物和病毒。靶序列可源自細胞核，如基因組DNA，或可源自核外核苷酸，如質粒、線粒體核酸、各種RNA等。如果靶核酸是RNA的話，可先將其反轉錄成cDNA。存在各種方法，用于獲得用于本發(fā)明組合物和方法的靶核酸序列。當通過從生物學樣品中分離獲得靶序列時，優(yōu)選的分離技術包括(1)有機抽提，接著乙醇沉淀，如使用苯酚/氯仿有機試劑〔如Ausubel等編輯，1993，《分子生物學的目前方法》，第1卷，第2章，第I部分，JohnWiley&Sons，紐約〕，或者DNA自動提取儀(如341型DNA提取儀，AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)；(2)固相吸附方法〔如Boom等，美國專利號5234809；Walsh等，1991，Biotechniques，10(4)506-513〕；和(3)鹽誘導的DNA沉淀法〔如Miller等，1988，Nucleic Acids Research，16(3)9-10〕。
術語“探針”指能通過與靶多核苷酸序列的堿基互補而形成雙鏈體結構的多核苷酸。例如，探針可被標記，如被猝滅劑部分或由一個報道子和猝滅劑組成的能量轉移對標記。
“引物”指設計用于與靶序列、探針或連接產(chǎn)物的互補的引物特異性部分雜交、并進行引物延伸的序列明確的寡核苷酸。引物起到核苷酸聚合的起始位點的作用〔《生物醫(yī)學和分子生物學簡明詞典》，1996，CPL Scientific PublishingServices，CRC出版社，Newbury，UK〕。
術語“雙鏈體”指核酸的分子間或分子內雙鏈部分，該部分通過核苷酸堿基的Watson-Crisk、Hoogsteen或其它序列特異性相互作用可發(fā)生堿基配對。雙鏈體可由引物和模板鏈或探針和靶鏈組成?！半s交物”指通過堿基特異性相互作用(如氫鍵)而形成的核酸的雙鏈體、三鏈體或其它堿基配對復合物。
術語“引物延伸”指使用模板依賴性聚合酶沿著5′到3′方向使與靶序列退火的引物延伸的過程。根據(jù)某些實施例，在適當?shù)木彌_液、鹽、pH、溫度和核苷酸三磷酸(包括其類似物和衍生物)的存在下，模板依賴性聚合酶在退火引物的3′端開始，將與該模板鏈互補的多核苷酸摻入，以產(chǎn)生互補的鏈。
術語“標記物“指可被連接到多核苷酸的任何部分，該部分(i)可提供可檢測的信號；(ii)可與第二標記物相互作用，從而改變由第二標記物(如FRET)提供的可檢測信號；(iii)可使雜交(即雙鏈體形成)穩(wěn)定；(iv)賦予捕獲功能，即疏水性親和力、抗體/抗原、離子配位；或(v)改變物理特性，如電泳遷移率、疏水性、親水性、溶解度或色譜行為?？刹捎么罅康囊阎夹g中的任何一種，使用已知的標記物、連接鍵、連接基團、試劑、反應條件和分析和純化方法實施標記。標記物包括能產(chǎn)生或猝滅可測熒光、化學發(fā)光或生物發(fā)光信號的發(fā)射光或吸收光的化合物〔Kricka，L.，Nonisotopic DNA Probe Techniques(1992)，Academic出版社，San Diego，第3-28頁〕。用于標記生物分子的熒光報道染料包括熒光素(例如，美國專利號5188934、5654442、6008379、6020481)、羅丹明(例如，美國專利號5366860、5847162、5936087、6051719、6191278)、二苯嗪(benzophenoxazines)(例如，美國專利號6140500)、供體或受體的能量轉移染料對(例如，美國專利號5863727、5800996、5945526)和花青(例如，Kubista，WO 97/45539)，以及任何其它能產(chǎn)生可檢測信號的熒光標記物。熒光染料的具體例子包括6-羧基熒光素、2′，4′，1，4-四氯熒光素、和2′，4′，5′，7′，1，4-六氯熒光素(如美國專利號5654442)。
另一類標記物是使雜交穩(wěn)定的部分，它們起到增強、穩(wěn)定或影響雙鏈體的雜交的作用，如嵌入劑、小溝槽粘合劑和交聯(lián)官能團〔Blackburn，G.和Gait，M.編輯，《DNA和RNA結構》，NucleicAcids in Chemistry and Biology，第2版，1996，牛津大學出版社，第15-81頁〕。另一類標記物通過特異性或非特異性捕獲影響到分子的分離或固定，例如生物素、洋地黃毒苷和其它半抗原〔Andrus，《PCR探針和引物的5′非同位素標記的化學方法》，1995，PCR2 A PracticalApproach，牛津大學出版社，牛津，第39-54頁〕。非反應性標記方法、技術和試劑可在《非反應性標記，實踐介紹》(Garman，A.J.，1997，Academic出版社，San Diego)中查閱。
在本文中，“能量轉移”指激發(fā)基團(如熒光報道染料)的激發(fā)態(tài)能量通過空間或通過鍵轉移給其它基團(如猝滅劑部分)的過程，該過程可能減弱(猝滅)或驅散或轉移能量。可通過熒光共振能量轉移、直接的能量轉移和其它機制發(fā)生能量轉移。確切的能量轉移機制并不限制本發(fā)明。應理解，本申請中提及能量轉移的任何內容都包括所有的這些機制不同的現(xiàn)象。
“能量轉移對”指參與能量轉移的任何兩個部分。通常，所述部分的一個起到熒光報道子(即供體)的作用，另一部分起到熒光猝滅劑(即受體)的作用〔《熒光共振能量轉移》，Selvin P.(1995)，Methods Enzymol，246300-334；dosRemedios C.G.(1995)，J.Struct.Bio1.，115175-185；《共振能量轉移方法和應用》，Wu P.和Brand L.(1994)，Anal Biochem，2181-13〕。熒光共振能量轉移(FRET)是兩個部分之間的距離依賴性相互作用，其中，激發(fā)能量(即光)從供體(“報道子”)轉移給受體而不發(fā)射光子。受體可以是熒光，并以較長的波長發(fā)射轉移的能量，或者，它可以是非熒光，并起到消除報道子的可檢測熒光的作用(猝滅)。FRET可以是分子間或分子內的事件，依賴于供體和受體的分離的相反第六能量(inverse sixth power)，使其可用于遠距離比較生物大分子的維度。因而，如果兩個部分之間的距離受到一些可檢測的量而變化時，能量轉移對的光譜特征在一些可測量方法中將產(chǎn)生整體變化。已發(fā)展了摻入了熒光供體-非熒光受體組合的自猝滅探針，主要用于檢測蛋白質水解〔Matayoshi，(1990)Science 247954-958〕和核酸雜交〔《能量轉移和熒光猝滅的檢測》，Morrison，L.，Nonisotopic DNA Probe Techniques，L.Kricka編輯，Academic出版社，SanDiego，(1992)，第311-352頁；Tyagi S.(1998)Nat.Biotechnol.1649-53；TyagiS.(1996)Nat.Biotechnol 14303-308〕。在大多數(shù)應用中，供體和受體染料不同，在這種情況下，可通過受體的光敏熒光或供體熒光的猝滅的發(fā)生檢測FRET。
術語“猝滅”指由猝滅劑部分通過(不論何種形式機制的)能量轉移引起熒光報道子部分的熒光減少。因此，熒光報道子的發(fā)光因猝滅劑的存在導致發(fā)射信號的強度比期望的低，甚至完全無信號。
術語“退火”和“雜交”可交互使用，指一個核苷酸與另一核苷酸的堿基配對相互作用，結果形成雙鏈體或其它較高等級的結構。主要的相互作用是通過Watson/Crisk和Hoogsteen型氫鍵的堿基特異性，即A/T和G/C。
術語“固相載體”指可在其上合成、連接或固定寡核苷酸的任何固相材料。固相載體包括術語如“樹脂”、“固相”和“載體”。固相載體可以由有機聚合物如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚乙烯氧基和聚丙烯酰胺組成，以及它們的共聚物和移植物。固相載體還可以是無機物，如玻璃、硅石、可控空隙玻璃(CPG)或反相硅石。固相載體的構型可以是珠、球體、顆粒(particle)、細粒(granule)、凝膠或表面。表面可以是平坦的，基本上平坦的或非平坦的表面。固相載體可以是多孔或無孔，可具有膨脹或非膨脹性能。固相載體可以被制成孔、凹陷或其它容器、器皿、特征或定位的形式。多個固相載體可被制成各種位置的陣列，對于機器人傳送試劑而言是可尋址的，或者根據(jù)檢測方法而制造，包括激光照射和共聚焦或偏斜光收集的掃描。
“陣列”或“微陣列”指固相載體上或器皿排列中存在的多核苷酸的預定空間排列。某些陣列模式指“芯片”或“生物芯片”〔M.Schena編輯，MicroarrayBiochip Technology，BioTechnique Books，Eaton Publishing，Natick，MA(2000〕。陣列可包含低密度數(shù)量的可尋址位置，如2到約12，中等密度如約上百或更多的位置，或者高密度數(shù)量，如上千或更多。通常，陣列模式是幾何學形狀規(guī)則的，這考慮到了制作、操作、放置、堆放、試劑引入、檢測和儲存。陣列可以被制作成行列的形式，各位置之間具有規(guī)律性間隔?；蛘?，各位置可成束狀(bundle)、混合或均勻地摻合，以進行均等的處理或采樣。陣列可包含大量的通過檢測方法(包括激光和共聚焦或偏斜光收集的掃描)而制作的可尋址位置，這樣各位置在空間上可尋址，適用于高通量處理、機器人傳送、掩蔽或試劑采樣。
術語“終點分析”指僅當反應基本完成時才采集數(shù)據(jù)的方法。
術語“實時分析”指PCR過程中定期性監(jiān)測。在各預定的熱循環(huán)過程中或各循環(huán)中用戶定義的階段，使用某些系統(tǒng)如ABI7700和7900HT序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)進行監(jiān)測。使用FRET探針實時分析PCR，測量每輪循環(huán)的熒光染料信號變化，優(yōu)選減去任何內部的對照信號。代表性雜構寡核苷酸組合物在一些實施例中，本發(fā)明的組合物包括具有多種用途(如用于分子生物學和核酸診斷試驗)的雜構寡核苷酸。雜構寡核苷酸是含有至少一種連接于至少一種D型(D構型核苷酸)序列部分的L型(L構型核苷酸)序列部分。所述序列部分可通過任何方式相互連接，通常通過鍵或連接物連接。在一些實施例中，D型序列部分含有至少5個D-核苷酸，通過雜交到其L型序列互補物而形成穩(wěn)定的雙鏈體。在一些實施例中，雜構寡核苷酸包括通過鍵或連接物共價連接于D型序列部分的L型序列部分，該L型序列部分包含5-50個L-核苷酸，該D型序列部分包含5-50個D-核苷酸。本發(fā)明化合物糖部分的L構型與大多數(shù)天然產(chǎn)生的核苷如胞苷、腺苷、胸苷、鳥苷和尿苷的核糖部分的D構型相反。糖的L構型由1′、3′和4′碳原子以及核糖的2′碳原子的手性所確定。L型核苷酸是天然產(chǎn)生的D型核苷酸的鏡像、對映立體異構體。圖1顯示DNA寡核苷酸的鏡像D型和L型部分。絕對構型在1′、3′和4′不對稱手性碳位置標出。RNA在2′位置具有額外的手性碳。
在一些實施例中，本發(fā)明包括含有至少一個標記物的標記的雜構寡核苷酸。通常，標記物可通過鍵或連接物共價連接于雜構寡核苷酸。標記物可以是上述定義的標記物，如熒光染料、猝滅劑、能量轉移染料、量子點、洋地黃毒苷、生物素、遷移率改變劑、多肽、使雜交穩(wěn)定的部分或化學發(fā)光前體。代表性的熒光染料標記物包括選自熒光素、羅丹明和花青結構類型的化合物，代表性的結構如下
猝滅劑標記物通過分子內熒光共振能量轉移(FRET)作用而經(jīng)歷熒光染料發(fā)射的熒光能量轉移。猝滅劑可自身是熒光性的或非熒光性的(例如，參見Reed，WO 01/42505；和Cook，WO 00/75378)。猝滅劑標記物包括選自熒光素、羅丹明、硝基花青(Lee，美國專利號6080868)的化合物、和如芳基疊氮結構類型的化合物。
標記物還可包含使雜交穩(wěn)定的部分，如小溝槽粘合劑、嵌入劑、聚陽離子(如多賴氨酸和精胺)或者交聯(lián)官能團。雜交穩(wěn)定劑可增加堿基配對的穩(wěn)定性，即親和性，或者引物和靶標或探針和靶標的雜交速率〔Corey(1995)，J.Amer.Chem.Soc.，1179373-74〕。雜交穩(wěn)定劑起到增加堿基配對的特異性的作用，這可以極佳的互補寡核苷酸與靶序列之間Tm的大差異為例證，其中所得的雙鏈體含有一個或多個Watson/Crick堿基對的錯配〔Blackburn，G.和Gait，M.編輯，《DNA和RNA結構》，在《核酸化學和生物學》中，第2版，1996，牛津大學出版社，第15-81頁和337-46頁〕。代表性的小溝槽粘合劑包括Hoechst33258〔Rajur(1997)，J.Org.Chem.，62523-29〕、偏端霉素、紡錘菌素(Gong(1997)Biochem.and Biophys.Res.Comm.，240557-60〕和CDPI1-3(美國專利號5801155；WO 96/32496)。小溝槽粘合劑的一個例子是CDPI3，由下式表示 式中，L是連接于雜構寡核苷酸的位點(Dempcy，WO 01/31063)。
當標記物的連接物連接于雜構寡核苷酸的核苷酸堿基時，雖然其它的連接位點也可以使用，但核苷酸堿基的連接位點通常為嘌呤核苷酸堿基的8位、7-脫氮嘌呤核苷酸堿基的7或8位、嘧啶核苷酸堿基的5位。標記物的連接物可以是任何亞烷基或亞芳基連接物，或其取代的形式，包括以下結構B-C≡C-CH2(OCH2CH2)mNR1-LB-C≡C-CH2(OCH2CH2)mNR1-X-L式中，B是核苷酸堿基；L是標記物；R1是H或C1-C8烷基；m是0、1或2(Khan，美國專利號5770716和5821356；Hobbs，美國專利號5151507)；X是酰胺結構，包含以下代表性結構 其中n是1-5的整數(shù)。
標記的雜構寡核苷酸可具有連接于其核苷酸堿基的標記物。代表性的例子是結構I 式中，L是標記物；B是核苷酸堿基，包括尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、7-脫氮腺嘌呤、鳥嘌呤和7-脫氮鳥苷；R10是H、OH、鹵化物、疊氮化物、胺、烷基胺、烷基(C1-C6)烯丙基、烷氧基(C1-C6)、OCH3或OCH2CH＝CH2；R15是H、磷酸酯、核苷酸間磷酸二酯或核苷酸間類似物；R16是H、磷酸酯、核苷酸間磷酸二酯或核苷酸間類似物；和R17是鍵或連接物。含有炔丙基或乙烯基的代表性連接物如下所示
式中，n是0、1或2。
或者，標記的雜構寡核苷酸可具有連接于5′末端的標記物。代表性的例子是結構II 式中，L、B和R10和R15的定義如結構I所述。各Y獨立為O、NH、NR或S，其中R選自C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C5-C14芳基和取代的C5-C14芳基。R18可以是連接鍵或任何共價連接物，用于連接雜構寡核苷酸和標記物的5′磷酸酯或磷酸酯類似物。例如，R18可以是長1-100的乙烯氧基鏈(也稱為聚乙烯氧基或PEO)單元，-(CH2CH2O)n-，其中n為1-100；C1-C12亞烷基、取代的C1-C12亞烷基；C5-C14亞芳基和取代的C5-C14亞芳基。R18的代表性例子如下所示 其中n是1-10。
或者，標記的雜構寡核苷酸可在其3′末端連接有標記物。代表性的例子是結構III 式中，L、Y、B、R10、R16和R18的定義如結構I和結構II的定義。
標記的雜構寡核苷酸可含有一個以上標記物。雜構寡核苷酸的一個實施例包含含有報道子染料和猝滅劑的能量轉移對，從而可在報道子染料和猝滅劑之間發(fā)生熒光能量轉移。報道子染料可以是任何合適的染料，如熒光素、羅丹明、1，2-二二酮(dioxetane)化學發(fā)光染料、香豆素、萘胺、花青或bodipy染料。
通常，報道子染料通過第一鍵連接于雜構寡核苷酸，猝滅劑通過第二鍵連接于雜構寡核苷酸。報道子染料和猝滅劑的取向為，當標記的雜構寡核苷酸雜交到靶多核苷酸序列時，報道子染料不被猝滅劑完全猝滅，當標記的寡核苷酸未與靶多核苷酸序列雜交時，報道子染料被猝滅劑有效猝滅。
在一些實施例中，報道子染料和猝滅劑標記物共價連接于雜構寡核苷酸的末端。例如，報道子染料和猝滅劑中有一個連接于3′端，另一個連接于5′端。
可以選擇報道子/猝滅劑雜構寡核苷酸的核苷酸序列，使其包含足夠的自我互補性，能形成穩(wěn)定的發(fā)夾結構，這是由于存在側接與靶標互補的D型序列部分的互補L型DNA序列部分的緣故，當該雜構寡核苷酸未與互補的靶序列雜交時，該L型DNA序列部分形成雙鏈體。在此實施例中，報道子和猝滅劑部分可位于各L型序列部分的遠端，這樣，在形成發(fā)夾結構時，該報道子和猝滅劑部分非?？拷?，當內部D型序列部分雜交到互補的靶序列時，報道子和猝滅劑部分遠離?？赏ㄟ^序列設計優(yōu)化形成發(fā)夾的報道子/猝滅劑雜構寡核苷酸的熱熔點性能(Tm)，以便在不存互補靶序列時，報道子產(chǎn)生的熒光能被猝滅劑有效猝滅，而在存在互補靶序列并形成雜交雙鏈體后，不發(fā)生猝滅，或者基本上不發(fā)生和不可測量，而熒光增加。通過這樣的作用，可檢測樣品中特異性靶序列的存在，且在一些情況中可進行定量。當靶序列在PCR復制子中時，可監(jiān)測和檢測PCR。
在一些實施例中，本發(fā)明包括標記有能量轉移對的雜構寡核苷酸，該能量轉移對含有供體和受體。供體染料吸收第一波長光，并發(fā)射激發(fā)能量。受體染料能吸收供體染料發(fā)射的激發(fā)能量，作為應答，產(chǎn)生第二波長的熒光。能量轉移對具有可用于同時檢測混合物(如DNA測序)中的多個標記底物的優(yōu)點?？稍谝唤M能量轉移染料中使用一種供體染料，這樣各染料對相同的波長具有強吸收。然后改變能量轉移組中的受體染料，可通過它們各自的發(fā)射最大值而通過光譜分辨這些受體染料。
供體染料可通過促進供體和受體染料間有效能量轉移的連接物而連接于受體染料〔如參見Lee，美國專利號5800996；Lee，美國專利號5945526；Mathies，美國專利號5654419；Lee(1997)，Nucleic Acids Res.252816-22〕?；蛘撸稍陔s構寡核苷酸上的不同連接位點標記供體染料和受體染料。例如，可用供體染料在5′末端標記該雜構寡核苷酸，用受體染料在3′末端標記該雜構寡核苷酸。
含有能量轉移染料對的供體和受體染料可以是能經(jīng)受能量轉移過程的任何熒光部分，包括熒光素、對甲氨基酚、羅丹明、花青、酞菁、squaraine、bodipy、香豆素或二苯嗪。
通常，供體染料和受體染料之間的連接物含有如下顯示的結構 式中，Z是NH、S或O；R21是連接于供體染料的C1-C12烷基；R22是鍵、C1-C12亞烷基，或具有至少一個不飽和鍵的5或6元環(huán)，或連接于羰基碳的稠合環(huán)結構；R23包括將連接物連接于受體染料的官能團。R22可以是環(huán)戊烯、環(huán)己烯、呋喃、硫代呋喃、吡咯、吡唑、苯、吡啶、嘧啶、吡嗪、唑、茚、苯并呋喃、硫代萘、吲哚和萘或它們的取代形式。具體而言，連接物可具有以下結構 式中，n為2-10，通常而言，R23可包含以下結構 式中，R24是C1-C12烷基，Z的定義同上。
在一個實施例中，供體染料和受體染料之間的連接物包括賦予該連接物一定程度結構剛性的官能團，如烯烴、二烯烴、炔烴、具有至少一個不飽和鍵的5或6元環(huán)或稠合環(huán)結構。能量轉移對的供體染料和受體染料可通過連接物而連接，該連接物具有以下代表性結構 式中，(D/A)是供體染料或受體染料，X可以是 苯環(huán)可被如磺酸、膦酸和/或其它帶電基團取代。
在一些實施例中，雜構寡核苷酸或標記的雜構寡核苷酸可通過連接鍵或連接物共價于固相載體。寡核苷酸的連接和固定可在以下情況發(fā)生(1)在寡核苷酸合成過程中(原位)；或(2)可預先合成寡核苷酸，然后在溶液中通過偶聯(lián)、點樣(spotting)、固定或沉積方法連接于固相載體。
例如，固相載體可以是聚苯乙烯、可控空隙玻璃、硅膠、硅石、聚丙烯酰胺、磁珠、聚丙烯酸酯、羥乙基甲基丙烯酸酯、聚酰胺、聚乙烯、聚乙烯氧基或它們的共聚物或移植物。在一些實施例中，固相載體可含有小顆粒、珠、膜、玻璃料、載玻片、平板、顯微機械加工芯片、鏈烷硫醇-金層、無孔表面、可尋址陣列、凝膠或固定多核苷酸的基質。
在一些實施例中，可通過可切割的或不可切割的連接物將雜構寡核苷酸連接于此固相載體?？汕懈畹倪B接物可因化學試劑、光或其它條件而斷裂。例如，連接物可包含以下一種或多種結構 含酯的連接物可被堿性試劑如水性、水蒸氣或氣相的氫氧化銨〔Kempe，美國專利號5514789〕、無水胺〔Kempe，美國專利號5750672〕、水性氫氧化物試劑以及水性胺切斷?？筛鶕?jù)其速率和猝滅劑部分與固相載體之間的連接鍵的所需穩(wěn)定性選擇酯連接物。例如，草酸酯連接鍵相對不穩(wěn)定，實際上，在室溫下在濃氫氧化銨中它在幾分鐘內完全斷裂。琥珀酸酯連接鍵在相同的條件下可能需要一個小時或更多才斷裂。醌和二乙醇酸酯連接鍵對堿性解離具有中等穩(wěn)定性。烷氧基甲硅烷基連接物可被強堿和氟化物試劑切割。二硫化物連接物可被還原劑如二硫蘇糖醇(DTT)切割。
在一些實施例中，使用不可切割的連接物在固相載體上合成雜構寡核苷酸。然后可直接將該寡核苷酸用于雜交和其它目的。不可切割的連接物對于亞磷酰胺合成方法的酸性、堿性和氧化條件下穩(wěn)定。不可切割的連接物可包括乙烯氧基單元、亞烷基、磷酸酯和/或酰胺官能團。
雜構寡核苷酸，不論是標記的還是未標記的，都可含有標準核苷酸堿基、糖和核苷酸間連接鍵的各種修飾和類似物。這些修飾和類似物可存在于寡核苷酸序列中的任何位置，并以任何適當?shù)念l率出現(xiàn)。這些修飾和類似物可存在于L型核苷酸、D型核苷酸或兩者之中。
除了天然產(chǎn)生的磷酸二酯連接鍵外，本發(fā)明的寡核苷酸可含有一個或多個包含磷酸酯類似物(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯或氨基磷酸酯)的核苷酸間連接鍵。其它核苷酸間連接鍵包括DNA或RNA的糖/磷酸酯骨架已被一個或多個非環(huán)狀的、非手性的和/或中性聚酰胺連接鍵所取代的那些連接鍵。一類核苷酸間類似物是肽核酸(PNA)家族。使核苷酸堿基通過酰胺鍵連接于連接物的2-氨乙基甘氨酸多酰胺連接是PNA的一個例子，已得到很好的研究，并顯示具有異常的雜交特異性和親和性〔Buchardt，WO 92/20702；Nielsen(1991)Science，2541497-1500；Egholm(1993)，Nature，365566-68〕。PNA可以相同或相反的方向雜交到其靶互補物上。但是，反向雙鏈體(其中，PNA的羧基末端結合于DNA的5′末端，PNA的氨基末端結合于DNA的3′末端)通常更穩(wěn)定〔Egholm(1993)，Nature，365566-68〕。已知PNA探針以高特異性和親和性與靶DNA序列結合〔Coull，美國專利號6110676〕。本發(fā)明的雜構寡核苷酸包含PNA-DNA嵌合物，具有不連續(xù)的PNA和L型核苷酸序列部分。實際上，在任何組合或序列中共價連接PNA單體與亞磷酰胺核苷，可合成這些嵌合物。已開發(fā)了合成PNA-DNA嵌合物的有效自動化方法〔Vinayak(1997)，Nucleosides&Nucleotides，161653-56；Uhlmann(1997)，Angew.Chem.，Intl.Ed.Eng.，352632-35；Uhlmann，EP 829542；Van derLaan(1997)Tetrahedron Lett.，382249-52；Van der Laan(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.，8663-68〕。
核苷酸堿基類似物的具體例子包括如2，6-二氨基嘌呤、次黃嘌呤、假尿苷、C-5-丙炔、異胞嘧啶、異鳥嘌呤或2-硫代嘧啶。
2′或3′位置上的糖修飾包括如C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、C5-C14芳氧基、C5-C14芳基、氨基、C1-C6烷基氨基、氟、氯或溴。其它糖修飾可包括例如4′-α-端基異構核苷酸、1′-α-端基異構核苷酸、2′-4′L型LNA、2′-4′D型LNA、3′-4′L型LNA或3′-4′D型LNA。任何這些修飾可出現(xiàn)在L型序列部分、D型序列部分或兩種之中。
代表性合成方法可采用亞磷酰胺方法，使用市售獲得的亞磷酰胺核苷(ChemGenes公司，Ashland，MA；Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA；Caruthers，美國專利號4415732)、載體如硅石、可控空隙玻璃(Caruthers，美國專利號4458066)和聚苯乙烯(Andurs，美國專利號5047524和5262530)和自動合成儀如392型、394型、3948型、3900型和Expedite DNA/RNA合成儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，在固相載體上合成雜構寡核苷酸〔Caruthers，美國專利號4973679；Beaucage(1992)，Tetradron，482223-2311〕?？梢猿Ｒ?guī)的3′到5′方向、其中5′被保護、3′-亞磷酰胺核苷的合成方法進行寡核苷酸合成，如IV?；蛘撸梢?′到3′方向、其中3′被保護、5′為亞磷酰胺核苷的方法合成寡核苷酸，如V〔Wagner(1997)，Nucleosides&Nucleotides，161657-60〕。
對于結構式IV和V，代表性的取代基包括其中R1選自C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基(如氰基乙基)、C5-C14芳基、和取代的C5-C14芳基；R2是外向環(huán)(egocyclic)氮保護基團，如芐氧基、異丁?；?、乙?；?、苯氧基乙?；?、芳氧基乙?；?、二甲基甲脒、二烷基甲脒和/或二烷基乙脒；R3是酸不穩(wěn)定性保護基團，如DMT、MMT、pixyl、三苯甲基和三烷基甲硅烷基，其中烷基是C1-C6烷基；和R4和R5各自選自C1-C6烷基(如異丙基)、取代的C1-C6烷基、C5-C14芳基、取代的C5-C14芳基；或者，R4和R5一起形成C5-C14環(huán)烷基或C5-C14雜環(huán)烷基。
代表性的亞磷酰胺核苷IV和V是通常用于DNA合成的L構型的單體。用于制備本發(fā)明組合物的其它單體試劑包括D型亞磷酰胺核苷、RNA亞磷酰胺核苷、2-氨乙基甘氨酸以及其它，它們具有適當?shù)谋Ｗo基團?？稍O計好自動合成儀程序，使其能在任何循環(huán)過程中傳送安裝在合成儀上試劑傳送瓶中的L型和D型亞磷酰胺核苷。因而，雜構多核苷酸可使用L型和D型核苷酸的任何序列合成。
可根據(jù)各核苷的糖和核苷酸堿基的保護和亞磷酸化的已知程序和方法制備L型和D型亞磷酰胺核苷，用于寡核苷酸合成。D型核苷衍生自天然產(chǎn)生的D-DNA來源?？刹捎萌魏魏线m的合成方法制備L型亞磷酰胺核苷。例如，可由L核糖制備L型亞磷酰胺核苷，該L核糖可通過一系列步驟由L木糖制得〔Chu，美國專利號5753789；Fujimori〔1992)，Nucleosides&Nucleotides，11341-49；Beigelman，美國專利號6251666；Furste，WO 98/08856〕。
在一些實施例中，先用具有下式結構VI的標記的固相載體的方法合成標記的雜構寡核苷酸
其中，S是固相載體；A是連接物；X是具有三個或多個連接位點的連接物；L是標記物；Y選自O、NH、NR和S，其中R選自C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C5-C14芳基和取代的C5-C14芳基；R3是可酸切斷的保護基團或具有可酸切斷的保護基團的核苷。使標記的固相載體與酸性試劑反應，以除去該可酸切斷的保護基團。亞磷酰胺核苷單體具有可酸切斷保護基團R3。將激活劑加到去保護的標記固相載體中，從而在Y和該核苷酸單體(可以是L型核苷或D型核苷)的3′或5′末端之間形成鍵。然后使固相載體與氧化劑反應，以將三價的核苷酸間亞磷酸酯轉變成磷酸酯。步驟包括(1)去保護可酸切斷的保護基團；(2)偶聯(lián)核苷單體；(3)以循環(huán)的方式重復進行氧化，直到完成L型和D型核苷酸的所需序列。在氧化步驟之前或之后可進行額外的加帽步驟，以除去正在延伸的寡核苷酸上任何未反應的3′或5′羥基。
在一些實施例中，作為最后的偶聯(lián)步驟，將亞磷酰胺標記物試劑偶聯(lián)于寡核苷酸的末端，對其3′或5′末端進行標記。
標記的固相載體VI的代表性例子包括 式中，n為1-12，S是固相載體，A、L、Y和R3的定義見結構VI中的定義。
標記的固相載體VI的另一代表性例子是 式中，DMT是4，4′-二甲氧基三苯甲基。
標記的固相載體VI的另一代表性例子是 式中，R1是C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C5-C14芳基或取代的C5-C14芳基；R2是外向環(huán)氮保護基團，如芐氧基、異丁酰基、乙?；⒈窖趸阴；?、芳氧基乙?；?、二甲基甲脒、二烷基甲脒和/或二烷基乙脒。
對于一些應用，可能需要制備多種除獨特序列部分外具有共同或保守的序列部分的雜構寡核苷酸。例如，在需要一組在其5′端具有共同的L型核苷酸序列、在其3′端具有不同的D型核苷酸序列的雜構寡核苷酸時，可在固相載體上，以5′到3′的方向，先用L型3′-保護(如DMT)的5′亞磷酰胺核苷(如V)開始合成。固相載體通常位于柱、頂端、孔、點或其它容器或位置中。合成規(guī)?？蓮膸准{摩爾到一微摩爾或數(shù)微摩爾，雖然也可合成更多或更少的量?？赏ㄟ^依次添加L型3′-保護的5′亞磷酰胺核苷合成結合于該固相載體的L型核苷酸的序列(如包含5-50或更多的核苷酸)?？蓪⒃摴滔噍d體存儲備用，或立即使用?？蓪⑵浞峙涞蕉鄠€容器或位置中，用于后續(xù)合成不同D型核苷酸序列。當該固相載體為珠或顆粒形式時，柱、頂端或其它容器形式可以分開時，可將珠以等量或不等量分配在兩個或多個柱、頂端或其它容器中，并再收集起來，用于后續(xù)添加D型3′-保護的5′亞磷酰胺核苷。當該固相載體是固體表面、膜或玻璃料，可將該載體分開、碾碎、撕裂、切開，或者以其它分配方式處理，用于隨后D型核苷酸序列的分開合成。D型序列部分的合成可以是平行或連續(xù)進行；在L型序列部分合成后立即或順次進行直到達到需要。更通常，可先分別合成D型和L型序列部分，然后將它們連接形成嵌段聚合物，或者，可先合成一部分，接著順次加入具有相反構型的單體。
可通過在合適的溶劑中(在該溶劑中，標記物和雜構寡核苷酸都是可溶的或略微可溶的)，采用本領域已知的方法，將標記物上的反應性連接基團(如猝滅劑部分)與該雜構寡核苷酸偶聯(lián)，從而形成標記的雜構寡核苷酸。對于標記的方法，可參見Hermanson，Bioconjugate Techniques，(1996)，Academic出版社，San Diego，CA，第40-55、643-71頁；Garman，1997，Non-Radioactive LabellingA Practical Approach，Academic出版社，倫敦。可除去起始原料或不需要的副產(chǎn)物，純化得到出粗的標記雜構寡核苷酸，較佳在低溫下并將其干燥保存，或保存在溶液中，以備用。
標記物可在其一個取代基位置上具有反應性連接基團，如猝滅劑的芳基-羧基基團或熒光素或羅丹明的5-或6-羧基，以用于通過連接鍵而共價連接。在一些實施例中，將標記物連接于雜構寡核苷酸的連接鍵不應(i)干擾雜交的親和力或特異性；(ii)消除猝滅；(iii)干擾引物延伸；(iv)抑制聚合酶活性；或(v)不利地影響標記物的產(chǎn)生熒光、猝滅、捕獲或雜交穩(wěn)定特性。親電子反應性連接基團與親核基團如多核苷酸上的氨基和巰基形成共價鍵。親電子反應性連接基團的例子包括活性酯、異硫氰酸酯、磺酰氯、磺酸酯、甲硅烷基鹵化物、2，6-二氯三嗪、亞磷酰胺、馬來酰胺、馬來酰亞胺、鹵代乙酰、環(huán)氧化物、烷基鹵、烯丙基鹵、醛、酮、酰疊氮、酐和碘乙酰胺。活性酯包括琥珀酰亞胺基(NHS)、羥基苯并三唑基(HOBt)和五氟苯基酯。
可預先形成、分離、純化和/或特征分析標記物試劑的NHS酯，或者可原位形成該NHS酯，并使其與雜構寡核苷酸的親核基團反應。通常，標記物的羰基通過與以下組合反應而被激活，從而獲得NHS酯(1)碳二亞胺(carnodiimide)試劑，如二環(huán)己基碳二亞胺、二異丙基碳二亞胺、EDC〔1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)；或脲試劑如TSTU〔O-(N-琥珀酰亞胺)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯〕、HBTU〔(O-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯〕或HATU〔O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯〕和(2)激活劑，如HOBt(1-羥基苯并三唑)或HOAt(1-羥基-7-疊氮苯并三唑)；和(3)N-羥基琥珀酰亞胺。
代表性的非核苷的亞磷酰胺標記物試劑具有以下通式VII 式中，L被保護或未保護，形成標記物；X是連接物或連接鍵；R30和R31分別為C1-C12烷基、C4-C10芳基和/或含有達10個碳原子的環(huán)烷基，或者R30和R31與亞磷酰胺的氮原子一起形成飽和的氮雜環(huán)；R32是亞磷酸酯保護基團，它防止寡核苷酸延伸〔Theisen(1992)，《寡核苷酸的熒光染料亞磷酰胺標記》，在Nucleic Acid Symposium Series No.27中，牛津大學出版社，牛津，第99-100頁〕。通常，R32對于寡核苷酸合成條件是穩(wěn)定的，并能用對雜構寡核苷酸或標記物的整合無不利影響的試劑從合成的寡核苷酸產(chǎn)物中除去。代表性的R32取代基包括(i)甲基；(ii)2-氰基乙基(-CH2CH2CN)；或(iii)2-(4-硝基苯基)乙基〔-CH2CH2(對硝基苯基)〕。亞磷酰胺標記物試劑的代表性例子包括其中(i)R30和R31各自是異丙基、(ii)R30和R31一起形成嗎啉基、(iii)X是C1-C12烷基、和(iv)R32是2-氰基乙基的標記物試劑?；蛘?，連接物X可以是 式中，n為1-10。代表性的亞磷酰胺標記物試劑具有結構式VIII 亞磷酰胺標記物試劑VII或VIII可與羥基(如共價連接于固相載體的雜構寡核苷酸的5′末端OH)在溫和的酸激活條件下(如四唑)反應，形成核苷酸間亞磷酸酯基團，該基團之后被氧化成核苷酸間磷酸酯基團。在一些例子中，該亞磷酰胺標記物試劑含有的官能團在該試劑的合成過程中或在其接著用于標記雜構寡核苷酸的過程中需要被保護。所使用的保護基團依賴于官能團的性質，對于本領域技術人員而言是顯而易見的〔Greene，T.和Wuts，P.，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，第2版，John Wiley&Sons，紐約，1991〕。作為使用5′-保護的3′-亞磷酰胺核苷(如IV)的通用3′到5′方向合成方法的結果，標記物將連接到寡核苷酸的5′末端?；蛘?，當用3′-保護的5′-亞磷酰胺核苷(如V)的5′到3′合成方法時，寡核苷酸的3′末端被標記上亞磷酰胺標記物試劑(Vinayak，美國專利號6255476)。
其它亞磷酰胺標記物試劑(包括核苷性的和非核苷性的)都能在雜構寡核苷酸的其它位點進行標記，如在3′末端、核苷酸堿基、核苷酸間連接鍵、糖。在核苷酸堿基、核苷酸間連接鍵和糖位點上的標記得以實現(xiàn)內部標記和多個標記。
L型寡核苷酸陣列在一些實施例中，本發(fā)明包括含有固定的L型核苷酸的寡核苷酸陣列。含L型核苷酸的寡核苷酸(也稱為“L型多核苷酸”或“L型寡核苷酸”)包含能與靶多核苷酸中的L型互補物(如雜構寡核苷酸的L型序列部分)雜交的L型核苷酸序列。通常，L型序列部分長至少為5個L-核苷酸，其長度可多至100或更多。陣列可包含兩個到幾千個含L型核苷酸的寡核苷酸的獨特或相同的序列。在一個實施例中，該陣列上各位置具有預選擇量的獨特序列，如1皮摩爾到1納摩爾。
在一些實施例中，固定的寡核苷酸含有本發(fā)明的雜構寡核苷酸。在一些實施例中，固定的寡核苷酸不含有雜構寡核苷酸。在一些實施例中，固定的寡核苷酸含有L型核苷酸但不含有D型核苷酸。
在本發(fā)明的陣列中，一個或多個L型寡核苷酸固定在各可尋址位置上?？蓪ぶ肺恢每梢允瞧髅?、分隔的區(qū)域、點或其它構型的排列，這樣試劑、光、加熱、冷卻或其它操作可精心地針對這些分開的位置。該陣列為所有位置提供共同的操作，如通過沖洗陣列表面而對各位置平行洗滌、或直接照射整個表面、或對多孔微滴定板的各孔施加真空壓力。
在一些實施例中，該陣列中的載體可含有一種或多種膜、珠或包被或未包被的顆粒。載體可含有磁性或順磁性材料。
載體可含有結合的或固定的可空間尋址的L型核苷酸寡核苷酸或者特殊的配體，該寡核苷酸含有預定的捕獲序列。
本發(fā)明的陣列和載體可具有各種幾何學形狀和構型，并可用大量不同已知的制作技術中的任何一種制成。代表性的制作技術包括但不限于原位合成技術(Southern，美國專利號5436327)；光介導的原位合成技術(Fodor，美國專利號5744305)；機器人點樣技術〔Cheung(1999)，Nature Genetics，2115-19；Brown，美國專利號5807522；Cantor，美國專利號5631134；Drmanac，美國專利號6025136〕；或其上連接有寡核苷酸的珠陣列(Walt，美國專利號6023540)。本發(fā)明的固相載體還可包括大量固定在微滴定板中的硅圓片上的L型寡核苷酸(Rava，美國專利號5545531)。此外，本發(fā)明還包括固定在微球體或珠上的大量L型寡核苷酸，這些微球體固定于、安放在或以其它方式放置在光纖的末端?？捎沙墒墓饫w制作陣列組合物。由標記的L型寡核苷酸或其標記的雜交復合物產(chǎn)生的可檢測信號可產(chǎn)生獨特的光信號，可對該光信號進行解碼，使單個位點所處的位置與雜交序列相關(Walt，美國專利號5244636和5250264)。
含L型核苷酸的固定寡核苷酸的一個例子具有結構式IX 式中，S、A、X和Y的定義如上述結構VI的定義。NL是L型核苷酸的序列；ND是D型核苷酸的序列；m是0-100的整數(shù)；n是5-100的整數(shù)；q是0-100的整數(shù)。在一些實施例中，q＝0和m＞0。在一些實施例中，m＝0。
在一些實施例中，固定的含L型核苷酸的寡核苷酸含有至少5個L型核苷酸，可含有或不含有D型核苷酸。寡核苷酸中任何D型核苷酸可出現(xiàn)在該序列的任何部分。因此，結構式IX還可具有以下例子 以及具有多個L型和D型核苷酸部分的例子。
固相載體可以是任何合適的材料，如聚苯乙烯、玻璃如可控空隙玻璃、硅膠、硅石、聚丙烯酰胺、磁珠、聚丙烯酸酯、羥乙基甲基丙烯酸酯、聚酰胺、聚乙烯、聚乙烯氧基和/或它們的共聚物或移植物。固相載體的形式可以是小顆粒、珠、膜、玻璃料、載玻片、平板、顯微機械加工芯片、烷烴硫醇-金層、無孔表面、可尋址陣列或固定多核苷酸的基質。在一個實施例中，固相載體是尼龍膜。在另一實施例中，固相載體是聚苯乙烯珠。
代表性雜交方法本發(fā)明包括形成多核苷酸雜交物的方法，包括提供含有D型多核苷酸序列部分和共價連接于該D型多核苷酸序列部分的L型多核苷酸序列部分的雜構多核苷酸，使該雜構多核苷酸與至少第一互補多核苷酸雜交，在該第一互補多核苷酸和(1)該L型多核苷酸序列部分、(2)該D型多核苷酸序列部分或(3)在(1)和(2)兩者之間形成雙鏈體。
在一些實施例中，通過使雜構多核苷酸與全部或部分L型多核苷酸序列部分互補的第一互補多核苷酸雜交而形成雜交物。在一些實施例中，通過使雜構多核苷酸與部分或全部D型多核苷酸序列部分互補的第一互補多核苷酸雜交而形成雜交物。在一些實施例中，在雜構多核苷酸、與全部或部分D型多核苷酸序列部分互補的第一互補多核苷酸以及與全部或部分L型多核苷酸序列部分互補的第二互補多核苷酸之間形成雜交物。在一些實施例如上述的實施例中，當該雜構多核苷酸和互補多核苷酸都不連接于或固定于固相載體時，在溶液中進行雜交。
在一些實施例中，含有雜構多核苷酸的雜交物被捕獲或固定在固相載體上。在一些實施例中，該雜交物含有雜構多核苷酸和與全部或部分L型多核苷酸序列部分雜交的第一互補多核苷酸，其中，該第一互補多核苷酸連接于固相載體。在一些實施例中，該雜交物含有雜構多核苷酸和與全部或部分L型多核苷酸序列部分雜交的第一互補多核苷酸，其中該雜構多核苷酸連接于固相載體。在一些實施例中，雜交物含有雜構多核苷酸和與全部或部分D型多核苷酸序列部分雜交的第一互補多核苷酸，其中，該第一互補多核苷酸連接于固相載體。在一些實施例中，雜交物含有雜構多核苷酸和與全部或部分D型多核苷酸序列部分雜交的第一互補多核苷酸，其中，該雜構多核苷酸連接于固相載體。在一些實施例中，在雜構多核苷酸、與全部或部分D型多核苷酸序列部分互補(和雜交)的第一互補多核苷酸和與全部或部分L型多核苷酸序列部分互補(和雜交)的第二互補多核苷酸之間形成雜交物，其中，該第一互補多核苷酸或第二互補多核苷酸或雜構多核苷酸連接于固相載體。在上述實施例中，可通過共價或非共價實現(xiàn)連接或固定。此外，在上述實施例中，可在固定、連接或捕獲在載體上之前、當中或之后形成雜交物。
雜交物可含有一個或多個雙鏈體、三鏈體或其它高級別結構，其中至少雜構寡核苷酸的L型序列部分或D型序列部分的核苷酸堿基通過特殊的相互作用與互補多核苷酸中的相應核苷酸堿基配對。在一些實施例中，雜構多核苷酸包括具有5-50個L-核苷酸的L型序列部分，該L型序列部分通過連接鍵或連接物共價連接于具有5-50個D-核苷酸的D型序列部分。圖2顯示了代表性的雜構寡核苷酸(上面的結構)與互補“靶”多核苷酸(下面的結構)之間的雜交。在此闡述性實施例中，雜構寡核苷酸的D型序列部分與靶標中的所有或部分D型互補物雜交。
執(zhí)行與本發(fā)明的寡核苷酸雜交的方法將根據(jù)結合于載體的捕獲多核苷酸和溶液中將被捕獲的多核苷酸的性質而變〔Bowtell(1999)，Nature Genetics，2125-32；Brown(1999)，Nature Genetics，2133-37〕。關于雜交的其它參考文獻可參見WO 02/02823 A2和本文所引用的文獻。
在一些實施例中，雜構寡核苷酸和靶多核苷酸(或互補寡核苷酸)之一或兩者共價連接有一個或多個標記物。各標記物可產(chǎn)生可標記的信號，或者能促進后續(xù)反應、轉變或與其它試劑相互作用產(chǎn)生可檢測的信號?；蛘呋虼送猓鳂擞浳锟墒闺s交穩(wěn)定，促進引物延伸，或者促使標記的雜構寡核苷酸/靶雜交物或其衍生產(chǎn)物的捕獲、復合或多價螯合。在一些實施例中，該標記物可以是熒光染料、猝滅劑、能量轉移染料、量子點、洋地黃毒苷、生物素、遷移率改變劑、多肽、雜交穩(wěn)定部分以及化學發(fā)光前體。
可在含有具有不同序列的多個靶多核苷酸的混合物中通過雜交形成含有雜構寡核苷酸和一個或多個互補寡核苷酸的雜交物。然后，如果需要，可從雜交物中分離除去未雜交的靶多核苷酸，并檢測該雜交物。在一些實施例中，這樣的分離步驟是不需要的，因為可以均一形式檢測雜交物，其中可檢測信號由雜構寡核苷酸和互補靶序列之間的雜交產(chǎn)生。
在一些實施例中，靶多核苷酸包括含SNP核酸、mRNA、cRNA、cDNA或基因組DNA。在一些實施例中，靶標包含與雜構寡核苷酸互補的合成的多核苷酸序列或序列部分。
雜交的雜構寡核苷酸可包括報道子和猝滅劑。報道子或猝滅劑可通過連接鍵或連接物各自共價連接于雜構寡核苷酸的L型序列部分或D型序列部分。例如，報道子可通過連接物連接于L型序列部分，猝滅劑可通過連接物連接于D型序列部分。
在一些實施例中，可在靶多核苷酸固定于固相載體上時進行雜交。
可使標記的雜構寡核苷酸/靶標雜交物變性，然后使標記的雜構寡核苷酸與具有互補的L型序列部分的另一寡核苷酸雜交，形成雜構寡核苷酸/L多核苷酸雜交物。構型特異性是雜構寡核苷酸的有利特征，它們的L型序列部分僅與互補的L型序列部分雜交，同樣，它們的D型序列部分僅與互補的D型序列部分雜交。構型特異性，即正交性盡可能減少或消除了多種核酸雜交試驗中常見的靶向步驟和捕獲步驟之間的交叉雜交。
雖然L型和D型多核苷酸序列相互堿基配對不穩(wěn)定，但是它們在非手性環(huán)境中的性能必然是相當?shù)?。例如，采用亞磷酰胺合成方法的鏡像亞磷酰胺核苷的合成效率必然是相當?shù)?。使用非手性標記試劑進行的化學標記反應同等有效?？刹捎孟嗤姆椒▽︾R像、對映體L型和D型寡核苷酸進行純化和分析，并獲得相同的結果，只要環(huán)境是非手性的。例如，典型的反相HPLC分析將為鏡像L型和D型寡核苷酸提供相同的圖譜和滯留時間。但應注意的是，其單個核苷酸不是相同的L型或D型構型的相同序列的雜構寡核苷酸是非對映異構體，不具有相同的性能。
L型雙鏈體的雜交性能與D型雙鏈體天然相當，雖然是正交性的(orthoganal)。例如，特定序列中所有的L型寡核苷酸結合其L型互補寡核苷酸的Tm與相同序列中所有D型寡核苷酸與其D型互補物結合時的Tm是相同的。雙鏈體的雜構寡核苷酸中非互補性L型或D型序列部分的存在可能對親和性(穩(wěn)定化或去穩(wěn)定化)有某種影響。
雜構寡核苷酸的靶序列特異性部分長度足以與互補靶序列發(fā)生特異性退火。提供序列特異性退火的探針設計的詳細的描述，除本文的描述外，還可在如以下文獻中找到Diffenbach和Dveksler，《PCR引物，實驗室手冊》，ColdSpring Harbor出版社，1995；和Kwok等，Nucl.Acid Res.，18999-1005；1990。
本發(fā)明的熒光劑/猝滅劑雜構寡核苷酸可用作各種DNA擴增/定量策略中的檢測試劑，如5′-核酸酶試驗、鏈替換擴增(SDA)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、滾動循環(huán)擴增(Rolling Circle Amplification，RCA)、寡核苷酸連接試驗(OLA)、連接酶鏈式反應(LCR)〔Barany，美國專利號5494810〕、連接酶檢測反應(LDR)(Barany，美國專利號6312892和6027889)、轉錄介導的擴增(TMA)和Q-β復制酶。熒光劑/猝滅劑雜構寡核苷酸探針也可用于直接檢測其它液相或固相(如陣列)試驗中的靶標。此外，可以任何形式使用這些探針，包括如分子信標、Scorpion probesTM、Sunrise probesTM、點亮探針(light up probe)、InvaderTM檢測探針和TaqManTM探針。例如可參見Cardullo，R.(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，858790-8794；Stryer，L.(1978)，Ann.Rev.Biochem.，47819-846；Rehman，F(xiàn).N.(1999)，Nucleic Acids Research，27649-655；Gibson，E.M.，(1996)Genome Methods，6995-1001；Livak，美國專利號5538848；Wittwer，C.T.(1997)，BioTechniques，22176-181；Wittwer，C.T.，(1997)，BioTechniques，22130-38；Tyagi，WO 95/13399；Tyagi，美國專利號6037130、6150097和6103476；Uehara(1999)，BioTechniques，26552-558；Whitcombe，(1999)，NatureBiotechnology，17804-807；Lyamichev，(1999)，Nature Biotechnology，17292；Daubendiek(1991)，Nature Biotechnology，15273-350；Nardone，WO99/64432；Nadeau，美國專利號5846726和5928869；和Nazarenko美國專利號5866336。
在一些實施例中，本發(fā)明包括一方法，其中標記的雜構多核苷酸探針和第二寡核苷酸探針作為一探針組相鄰雜交到靶多核苷酸上。在適當?shù)臈l件下，相鄰雜交的探針可連接在一起，形成連接產(chǎn)物，條件是它們在連接前含有適當?shù)姆磻曰鶊F，例如(不限于)，游離的3′-羥基或5′磷酸酯基團(如參見圖4)。一些連接反應可包含一個以上的雜構寡核苷酸探針或一個以上第二探針，以使得能區(qū)分含一個或多個不同核苷酸的靶序列(圖8)。
在一些實施例中，靶序列包含上游或5′區(qū)域、下游或3′區(qū)域和位于上游區(qū)域和下游區(qū)域之間的SNP核苷酸。該SNP是一種可通過可連接的探針對(“探針組”)而被檢測的核苷酸，可代表多個等位靶基因座上的一種多態(tài)型核苷酸。在一些實施例中，與靶標的SNP位點互補的核苷酸堿基可存在于靶特異性探針對的雜構寡核苷酸探針(第一探針)或第二探針的最近端上。當探針組的探針雜交到適當?shù)纳嫌魏拖掠伟袇^(qū)域時，與SNP互補的核苷酸堿基與該靶序列上的SNP堿基配對，雜交的探針可連接起來形成連接產(chǎn)物(圖8)。但是，與SNP互補的核苷酸堿基上的錯配堿基可干擾連接，即使兩個探針完全雜交到它們各自的靶區(qū)域。因此，可區(qū)分出少至僅有一個核苷酸不同的高度相關序列。
圖8顯示代表性連接反應。通過混合含有下述成分的探針組，可區(qū)分雙等位基因座中的兩個潛在的等位基因(1)兩種熒光染料標記的探針，它們的序列僅在其末端的(不論3′還是5′)SNP互補位點(N1和N2)不同；(2)磷?；碾s構寡核苷酸探針，其中波浪線是L型序列部分；和(3)含有靶標的樣品。兩種熒光染料D1和D2是不同的，可經(jīng)光譜相區(qū)別。所有這三種探針將在適當?shù)臈l件下與靶序列雜交，但只有含雜交的SNP互補物的染料標記的探針將與雜交的磷?；s構寡核苷酸探針連接。含有與X(N1)互補的末端核苷的探針連接到5′磷酸酯-雜構寡核苷酸探針，而含有錯配的末端核苷(N2)的探針不連接。例如，如果在樣品中僅有一個等位基因存在，其中所述SNP位點X是G核苷酸，N1是C、N2是T，則僅N1是C的探針將連接形成連接產(chǎn)物?？啥鴮⑦B接產(chǎn)物與未連接的N2探針相分離，或者分別檢測或通過檢測相區(qū)分，然后標記物D1的檢出表明SNP位點是G。如果兩個標記物D1和D2可被檢測到，則可推斷兩個等位基因形式(X＝G和A)存在于雜合個體中。
在一些實施例中，探針組在第一探針或第二探針的末端不含有SNP互補物基因座。而待檢測的靶SNP基因座核苷酸位于5′或3′靶區(qū)域中。待檢測的核苷酸可以位于末端或在中間。具有與其各自靶區(qū)域完全互補的靶特異性部分的探針將在高度嚴謹條件下雜交。相反，在靶特異性部分中具有一個或多個錯配堿基的探針將不與它們各自的靶區(qū)域雜交。雜構寡核苷酸第一探針和第二探針都必然雜交到靶標上，產(chǎn)生連接產(chǎn)物。
在一些實施例中，設計探針組中的雜構寡核苷酸探針和第二探針，使其具有相似的熔點溫度(Tm)。其中，探針包括SNP位點，可將含有該SNP位點互補物的探針的Tm設計成比探針組中其它不含SNP位點互補物的其它探針低約4-6℃。還可將含有SNP位點互補物的探針的Tm設計成具有接近連接溫度。這樣，含有錯配核苷酸的探針在此連接溫度下將更容易從靶標中解離。因此，連接溫度提供區(qū)分如靶標中潛在的多個等位基因的另一種方法。
本發(fā)明的連接劑可含有任何數(shù)量的酶或化學(即，非酶的)試劑。例如，連接酶是酶性的連接劑，它在適當?shù)臈l件下，在DNA或RNA分子中的相鄰核苷酸雜交到互補的序列上時，在它們的3′-OH和5′-磷酸酯間形成磷酸二酯鍵。溫度敏感型的連接酶包括但不限于噬菌體T4連接酶和大腸桿菌連接酶。熱穩(wěn)定性連接酶包括但不限于Taq連接酶、Tth連接酶和Pfu連接酶。熱穩(wěn)定性連接酶可從嗜熱或高度嗜熱的微生物中獲得。
用于偶聯(lián)探針的化學連接劑包括但不限于激活劑、縮合劑和還原劑，如碳二亞胺試劑、溴化氰(BrCN)、N-氰基咪唑、咪唑、1-甲基咪唑/碳二亞胺/胱胺、二硫蘇糖醇(DTT)和紫外光。自動連接，即在缺乏連接劑的情況下的自發(fā)連接也在本發(fā)明的范圍之內。核苷酸間連接鍵可以是磷酸二酯鍵。其它代表性核苷酸間連接鍵包括二硫鍵、氨基磷酸酯、乙?；⒔沽姿狨?，以及在適當?shù)姆磻曰鶊F之間形成的鍵，如α-鹵代?；土虼姿狨セ鶊F之間形成的硫代磷酰基乙?；被鶊F，和硫代磷酸酯與甲苯磺酸酯或碘化物基團之間形成的硫代磷酸酯。關于適當?shù)姆磻曰鶊F的化學連接方法和描述的詳細方案除文中給出的文獻中有記載外，還可參見以下文獻Xu，(1999)Nucleic Acid Res.，27875-81；Gryaznov，(1993)Nucleic Acid Res.211403-08；Gryaznov，(1994)Nucleic Acid Res.222366-69；Kanaya，(1986)Biochemistry 257423-30；Luebke，(1992)Nucleic AcidsRes.203005-09；Sievers，(1994)Nature 369221-24；Liu，(1999)Nucleic Acids Res.263300-04；Wang，(1994)Nucleic Acids Res.222326-33；Purmal，(1992)Nucleic AcidsRes.203713-19；Ashley，(1991)Biochemistry 302927-33；Chu，(1988)Nucleic AcidsRes.163671-91；Sokolova，(1988)FEBS Letters 232153-55Naylor，(1966)Biochemistry 52722-28；and Letsinger，美國專利號5476930。
連接包括至少一個循環(huán)的連接。在一些實施例中，可進行一個或多個循環(huán)，包括(1)使第一探針和第二探針的適合連接的靶特異性部分與它們各自的互補靶區(qū)域雜交；(2)將第一探針的3′端和第二探針的5′端連接，形成連接產(chǎn)物；和(3)使核酸雙鏈體變性，從靶鏈上分離出連接產(chǎn)物?？赏ㄟ^熱循環(huán)連接反應而重復循環(huán)，以線性遞增連接產(chǎn)物的量，也可不重復進行。
連接之后，可將連接產(chǎn)物雜交到“捕獲”寡核苷酸上。捕獲寡核苷酸可固定在固相載體上，并可被制作成可尋址陣列。連接產(chǎn)物的L型核苷酸部分(“標記”)可與固定的寡核苷酸的L型核苷酸序列部分互補。
還包括在本發(fā)明范圍之內的是連接技術，如空隙填充連接(gap-fillingligation)，包括(但不限于)空隙填充OLA和LCR、橋鍵寡核苷酸連接和矯正連接(可參見如Ullman，美國專利號5185243；Backman，EP 320308、EP 439182和WO 90/01069)。
在一些應用中，由于靶標拷貝數(shù)量或檢測敏感性低的緣故，靶序列的檢測可能受到妨礙?？刹捎眠m當?shù)姆椒〝U增靶序列，如聚合酶鏈式反應(PCR)，詳細內容可參見M.Innis，PCR Protocols，Academic出版社，紐約(1990)。在一些實施例中，連接后，可采用PCR用特殊的引物組擴增連接產(chǎn)物(如可參見F.Barany等，WO 97/45559)。
任選地，可采用任何方法純化連接產(chǎn)物，在至少一輪連接循環(huán)之后從連接反應混合物中除去至少一些未連接的探針、靶DNA、酶或附屬的試劑。這些方法包括但不限于分子量/大小排除方法，如凝膠過濾層析或透析、基于序列特異性雜交的洗脫法(pullout method)、親和捕獲技術、沉淀、電泳、層析、吸附或其它核酸純化技術。本領域熟練的技術人員將認識到，在擴增之前純化連接產(chǎn)物可減少擴增連接產(chǎn)物所需引物的量，從而減少檢測靶序列的成本。此外，在擴增前純化連接產(chǎn)物可減少擴增過程中的可能的副反應，并減少雜交過程中未連接探針的競爭。
在一些實施例中，本發(fā)明包括包含引物延伸的方法，其中，雜構寡核苷酸引物雜交到靶多核苷酸，形成雜構寡核苷酸/靶標雜交物。在一些實施例中，雜構寡核苷酸引物包含具有5-50個L-核苷酸的L型序列部分，該L型序列部分通過連接鍵或連接物共價連接于具有5-50個D-核苷酸的D型序列部分。在一些實施例中，該D型序列部分的3′末端核苷酸具有3′羥基。雜交物的標記雜構寡核苷酸鏈的D型序列部分的3′末端被引物延伸試劑延伸。圖2的底部結構顯示雜構寡核苷酸/靶標雜交物的引物延伸，其中，點狀的箭頭表示核酸鏈合成中核苷酸5′三磷酸從雙鏈體的雜構寡核苷酸引物的3′末端摻入。該反應包括聚合酶、一種或多種可酶促摻入的核苷酸5′-三磷酸和緩沖液。采用引物延伸方法可形成一個或多個標記的多核苷酸片段。
本發(fā)明的擴增包括用于擴增核酸序列(線性地或指數(shù)地)的各種技術。這些技術的例子包括但不限于體外轉錄、PCR和其它使用引物延伸步驟的方法。擴增方法可包括熱循環(huán)或可等溫進行。擴增方法通常包括至少一輪擴增循環(huán)，即依次進行以下步驟將引物雜交到連接產(chǎn)物或靶序列的引物特異性部分；使用聚合酶以模板依賴性方式合成核苷酸鏈；使新形成的核酸雙鏈體(復制子)變性，分離兩條鏈?？芍貜瓦M行些循環(huán)，也可不重復進行。
圖5顯示使用雜構寡核苷酸引物的代表性聚合酶鏈式反應。通過雜構寡核苷酸引物的D型序列部分的3′端的引物延伸，在PCR復制子中摻入L型序列部分，作為“標簽(tag)”。由于L型核苷酸不與D型核苷酸形成穩(wěn)定的堿基配對，擴增的靶標部分限制于引物的D型核苷酸。擴增后，所得復制子的一條鏈的5′末端含有L型序列標簽。
在一些實施例中，本發(fā)明的方法包括監(jiān)測感興趣mRNA的相對濃度的方法和試驗?？蓮臉悠啡缃M織中分離出mRNA群，然后用反轉錄酶將其轉變成更穩(wěn)定的cDNA。復制mRNA或cDNA序列的一個方法是利用mRNA的3′端的聚-A尾和含有聚-A和聚-T的引物?；蛘?，可使用基因特異性引物復制(如擴增)感興趣的具體cDNA。復制mRNA和cDNA的方法包括PCR、滾動循環(huán)擴增和體外轉錄(IVT)。在一些實施例中，使用含有多種不同序列特異性標簽的陣列檢測或定量mRNA種類。
雜構寡核苷酸引物還可用于IVT(體外轉錄)中，其中，引物序列包括5′端的T7 RNA聚合酶啟動子序列?？蓮母鱟DNA分子轉錄獲得RNA(cRNA)的多個拷貝。例如，可通過標記的核糖核苷酸5′-三磷酸直接將標記物摻入，或者在第二反轉錄酶反應中摻入，以產(chǎn)生標記的cDNA。標記的cDNA和cRNA可雜交到它們的固定在固相載體上的互補序列。在一些實施例中，由雜構寡核苷酸引物的引物延伸得到的cDNA的L型序列部分可雜交到固定于載體上的互補寡核苷酸的互補L型序列部分上。
陣列和制備它們的方法如上所述是周知的，例如，在WO 02/02823和本文所引用的文獻中，以及在如Microarry Biochip Technology，M.Schena編輯，Eaton出版，BioTechniques Books Division，Natick，MA 01760。在一些實施例中，將通用的L-DNA陣列點樣到固定于96孔微滴定板底部的孔狀膜上，該膜由親水的PTFE(Multiscreen Resist-Rl，Milipore)、聚丙烯(Acro Well Plate，Pall)或尼龍(Cuno-white，Cuno)制成。例如，在一些實施例中，每4.5mm直徑的孔中固定有大約1-15納摩爾的寡核苷酸。
可將許多固定的寡核苷酸排列在可尋址的位置上(圖6)。可在各位置固定含有不同L型序列的寡核苷酸。如果cDNA被標記，可根據(jù)可檢測信號的存在和缺乏，推斷任何具體位置上是L型序列。各種不同的標記取向是可行的(圖9)。標記的對照位置可建立基線、背景值和提供信號的歸一化(圖10)。
本發(fā)明還包括基因表達分析方法，其中，靶多核苷酸是cDNA，通過使雜構寡核苷酸引物與RNA靶多核苷酸雜交，形成引物/靶標雜交物，然后使用引物延伸試劑延伸該引物/靶標雜交物的3′，形成cDNA轉錄子，從而形成cDNA轉錄物。引物延伸反應包括至少一種反轉錄酶、一種或多種核苷酸5′-三磷酸和緩沖液。可標記一種或多種核苷酸5′-三磷酸，以產(chǎn)生多個標記的轉錄子cDNA，各含有L型DNA部分(圖3d)?；蛘?，可標記雜構寡核苷酸。圖3b顯示D型部分含有標記物的一個例子。圖3c顯示雜構寡核苷酸雜交到含有幾個檢測標記物的互補多核苷酸的例子。然后可在水解條件下(如高pH、RNA酶切割和/或某些鹽如Mg+2和Zn+2)水解該RNA。然后采用旋轉柱方法(spin column method，Qiagen)、硅膠處理、超濾(Microcon)或沉淀方法純化所得的標記的cDNA，去除過量的引物和核苷酸。
在一些實施例中，本發(fā)明還包括用于分析許多mRNA序列的高通量試驗?？稍O計和合成基因特異性反轉錄酶引物，它可進行選擇性復制和擴增。各特異性序列可是雜構寡核苷酸的部分或全部D型序列部分。各基因特異性序列可標記有雜構寡核苷酸中的特殊L型序列部分。與雜構寡核苷酸中的該特殊的L型序列部分互補的L型互補物可包含于固定的寡核苷酸中。當待檢測有限量的mRNA序列(如100)時，這個數(shù)量的固定的寡核苷酸構成了可用于任何樣品的陣列。通過適當?shù)淖冃韵礈焱緩?，L型的陣列可重復使用多次，或者可使用它們一次然后丟棄。
在D型固定的寡核苷酸通過序列特異性雜交而“捕獲”D型核酸分析物(如cDNA)的陣列中，可能會發(fā)生交叉雜交的問題。檢測信號時可能或出現(xiàn)假陽性結果，這是因為D型核酸分析物與不互補的且含有一個或多個錯配堿基的D型固定核苷酸發(fā)生非特異性結合。除了假陽性外，持續(xù)的和高水平的背景信號也可能限制檢測能力、靈敏性和產(chǎn)生模糊的結果。本發(fā)明提供不與D型序列(甚至是那些以Watson-Crick或Hoogsteen堿基配對方式互補的D型序列)發(fā)生有效雜交的L型序列。換言之，L-DNA不能有效地與D-DNA發(fā)生交叉雜交。因此，L型結合基序提供正交性，即，核酸的分子識別性能中的另一特異性尺度。此外，因為L型核酸不是核酸酶降解的底物，該通用陣列具有更大穩(wěn)定性、耐久性、持久性和存儲期等優(yōu)點。
試劑盒通過將標準的引物對和探針制成試劑盒，并由機器人分配到容器中(如試管、孔、陣列位置和點)，可進行用于描繪單核苷酸多態(tài)型(SNP)、等位基因區(qū)分或疾病相關基因分析的高通量試驗。
實施例已描述了本發(fā)明，以闡述性方式而非限制性方式提供下述實施例。
實施例1雜構寡核苷酸的合成從ChemGenes(Ashland Technology Centre，200 Homer Avenue，Ashland，MA 01721)購得L-DNA亞磷酰胺。在ABI 394 DNA/RNA合成儀上，使用0.2μmolDNA循環(huán)、接著進行標準的合成循環(huán)，合成了L-DNA-D-DNA寡核苷酸〔ABI3948，《核酸合成和純化系統(tǒng)》，Perkin Elmer公司，1995，第4章自動化學〕。將標準的DNA酰胺(amidite)放置到位置1-4，將L-DNA酰胺放置在位置5-8。在合成后，用氫氧化銨從載體上切下寡聚物，55℃過夜去保護。除去氨，將沉淀物溶解在水中。采用UV分光光度法測定樣品的濃度，并以ddH2O制備100mM的原液。
實施例2L-DNA結合到陣列上圖12顯示實驗的結果，其中，制得8個不同的探針(各有6份重復)的8×6陣列〔固定探針PNA-ZIP32(非互補對照)、D-LNA、D-DNA、PNA-NH2、L-DNA、PNANHAc、PNANHAcSH和PNANH2SH〕，接著與含有四種寡聚物X-SM03205bCF(L-DNA，“cf”)、寡聚物X-SM032 04b CF(D-DNA，“cf”)、寡聚物X-SM032 02b TF(L-DNA，“tita”)或寡聚物X-SM032 01 TF(D-DNA，“tita”)之一的不同寡核苷酸溶液雜交。前兩種探針含有與固定探針序列互補的序列(如果忽視構型的話)。接著的兩種探針含有不與任一固定的探針互補的序列。
從圖12可以看出，“cf”L-DNA探針可與互補的L-DNA和最后三種PNA探針雜交，但不與其它探針雜交。“cf”D-DNA探針與互補的D-DNA和最后三種PNA探針雜交，但不與其它探針雜交。D和L“tita”探針都不顯著地結合于任一種固定的探針，這是由于沒有序列互補性。
本說明書中提及的所有的出版物、專利和專利申請都以相同的程度納入本發(fā)明作為參考，即使各單獨的出版物、專利或專利申請被具體或單獨地指出它們被納入作為參考。
現(xiàn)已完全描述了本發(fā)明，本領域技術人員將理解，在不偏離本發(fā)明精神或范圍的情況下可對本發(fā)明進行許多修改和改變。
權利要求
1.多核苷酸組合物，其特征在于，它含有含D型多核苷酸序列部分和與該D型多核苷酸序列部分共價連接的L型多核苷酸序列部分的雜構多核苷酸。
2.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有5-50個L-核苷酸。
3.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有5-50個D-核苷酸。
4.如權利要求3所述的組合物，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有5-50個L-核苷酸。
5.如前述任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有至少一個L型2′-4′LNA核苷酸。
6.如權利要求1-4中任一項所述的組合物，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有至少一個為1′-α-端基異構核苷酸或4′-α-端基異構核苷酸的L型核苷酸。
7.如權利要求1-4中任一項所述的組合物，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有至少一個含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-β端基異構構型。
8.如權利要求1-4中任一項所述的組合物，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有至少一個含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-α端基異構構型。
9.如權利要求1-4中任一項所述的組合物，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有至少一種含核糖、2′-脫氧核糖、2′，3′-雙脫氧核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖或2′-O-甲基核糖的L型多核苷酸。
10.如前述任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有至少一個D型2′-4′LNA核苷酸。
11.如前述任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有至少一個為1′-α-端基異構核苷酸或4′-α-端基異構核苷酸的L型核苷酸。
12.如權利要求1-9中任一項所述的組合物，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有至少一個含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-β端基異構構型。
13.如權利要求1-9中任一項所述的組合物，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有至少一個含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-α端基異構構型。
14.如前述任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有至少一種含核糖、2′-脫氧核糖、2′，3′-雙脫氧核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖或2′-O-甲基核糖的L型多核苷酸。
15.如前述任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，至少一個D型多核苷酸序列部分和L型多核苷酸序列部分含有選自2-氨乙基甘氨酸、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯和氨基磷酸酯的核苷酸間連接鍵。
16.如前述任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述雜構多核苷酸含有選自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、7-脫氮腺嘌呤、鳥嘌呤和7-脫氮鳥苷的核苷酸堿基。
17.如權利要求1-15中任一項所述的組合物，其特征在于，所述雜構多核苷酸含有選自2，6-二氨基嘌呤、次黃嘌呤、假尿苷、C-5-丙炔、異胞嘧啶、異鳥嘌呤和2-硫代嘧啶的核苷酸堿基。
18.如前述任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，該組合物含有與所述L型多核苷酸序列部分雜交的第一互補多核苷酸。
19.如權利要求18所述的組合物，其特征在于，所述第一互補多核苷酸含有至少一個L型多核苷酸。
20.如權利要求18所述的組合物，其特征在于，所述第一互補多核苷酸含有至少一個L型2′脫氧核糖或2′-4′LNA核苷酸。
21.如權利要求18所述的組合物，其特征在于，所述第一互補多核苷酸含有至少兩個肽核酸亞單元。
22.如權利要求18-21中任一項所述的組合物，其特征在于，所述第一互補多核苷酸連接于固相載體。
23.如權利要求22所述的組合物，其特征在于，所述固相載體包括聚苯乙烯、玻璃、硅膠、硅石、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、羥乙基甲基丙烯酸酯、聚酰胺、聚乙烯、聚乙烯氧基或尼龍。
24.如權利要求22或23所述的組合物，其特征在于，所述固相載體包括小顆粒、珠、膜、玻璃料、載玻片、平板、顯微機械加工芯片、鏈烷硫醇-金層、無孔表面、可尋址陣列或凝膠。
25.如權利要求24所述的組合物，其特征在于，所述固相載體是珠。
26.如權利要求25所述的組合物，其特征在于，所述固相載體是聚苯乙烯珠。
27.如權利要求23所述的組合物，其特征在于，所述固相載體是尼龍膜。
28.如權利要求24所述的組合物，其特征在于，所述固相載體是選自納米顆粒、微球體或脂質體的小顆粒。
29.如權利要求22所述的組合物，其特征在于，所述固相載體是玻璃。
30.如權利要求22-29中任一項所述的組合物，其特征在于，所述第一互補多核苷酸通過可切割的連接物連接于所述載體。
31.如權利要求30所述的組合物，其特征在于，所述可切割的連接物含有羰基，所述第一互補多核苷酸通過該羰基連接于所述載體。
32.如前述任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有與所述D型多核苷酸序列部分雜交的第二互補多核苷酸。
33.如前述任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有可檢測的標記物。
34.如權利要求33所述的組合物，其特征在于，所述標記物包括熒光染料、熒光猝滅劑、能量轉移對、量子點或化學發(fā)光前體。
35.如權利要求34所述的組合物，其特征在于，所述標記物包括熒光素、羅丹明或花青。
36.如權利要求33-35中任一項所述的組合物，其特征在于，所述標記物連接于與所述D型多核苷酸序列部分雜交的第二互補多核苷酸。
37.一種形成多核苷酸雜交物的方法，其特征在于，所述方法包括提供含有D型多核苷酸序列部分和連接于該D型多核苷酸序列部分的L型多核苷酸序列部分的雜構多核苷酸，使該雜構多核苷酸與第一互補多核苷酸雜交，形成該第一互補多核苷酸和該L型多核苷酸序列部分之間的雙鏈體。
38.如權利要求37所述的方法，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有5-50個L-核苷酸。
39.如權利要求37所述的方法，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有5-50個D-核苷酸。
40.如權利要求39所述的方法，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有5-50個L-核苷酸。
41.如權利要求37-40任一項所述的方法，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有至少一個L型2′-4′LNA核苷酸。
42.如權利要求37-40任一項所述的方法，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有至少一個為1′-α-端基異構核苷酸或4′-α-端基異構核苷酸的L型核苷酸。
43.如權利要求37-40中任一項所述的方法，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有至少一個含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-β端基異構構型。
44.如權利要求37-40中任一項所述的方法，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有至少一個含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-α端基異構構型。
45.如權利要求37-40中任一項所述的方法，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有至少一種含核糖、2′-脫氧核糖、2′，3′-雙脫氧核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖或2′-O-甲基核糖的L型多核苷酸。
46.如權利要求37-45中任一項所述的方法，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有至少一個D型2′-4′LNA核苷酸。
47.如權利要求37-45中任一項所述的方法，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有至少一個為1′-α-端基異構核苷酸或4′-α-端基異構核苷酸的L型核苷酸。
48.如權利要求37-45中任一項所述的方法，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有至少一個含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-β端基異構構型。
49.如權利要求37-45中任一項所述的方法，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有至少一個含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-α端基異構構型。
50.如權利要求37-49中任一項所述的方法，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有至少一種含核糖、2′-脫氧核糖、2′，3′-雙脫氧核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖或2′-O-甲基核糖的L型多核苷酸。
51.如權利要求37-50中任一項所述的方法，其特征在于，至少一個D型多核苷酸序列部分和L型多核苷酸序列部分含有選自2-氨乙基甘氨酸、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯和氨基磷酸酯的核苷酸間連接鍵。
52.如權利要求37-52中任一項所述的方法，其特征在于，所述第一互補多核苷酸含有至少一個L型核苷酸。
53.如權利要求37-52中任一項所述的方法，其特征在于，所述第一互補多核苷酸含有至少一個L型2′脫氧核糖或2′-4′LNA核苷酸。
54.如權利要求37-52中任一項所述的方法，其特征在于，所述第一互補多核苷酸含有至少兩個肽核酸亞單元。
55.如權利要求37-52中任一項所述的方法，其特征在于，將未雜交的第一互補多核苷酸與所述雜交物分離。
56.如權利要求55所述的方法，其特征在于，所述方法還包括檢測雜交物。
57.如權利要求37-56中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括對所述雜構多核苷酸進行引物延伸。
58.如權利要求37-56中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括用核酸酶切割所述雜構多核苷酸。
59.如權利要求37-56中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括使所述雜構多核苷酸連接于與其末端毗鄰處雜交的多核苷酸。
60.如權利要求37-59中任一項所述的方法，其特征在于，所述雜交物固定在固相載體上。
61.一種試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括如權利要求1-17中任一項所述的雜構多核苷酸；固相載體，其上連接有至少一種含L型多核苷酸序列部分的多核苷酸，該L型多核苷酸序列部分與所述雜構多核苷酸中的L型多核苷酸序列部分互補。
62.如權利要求61所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括許多固相載體，各載體連接有雜構多核苷酸，該雜構多核苷酸含有L型多核苷酸序列部分，該L型多核苷酸序列部分含有與所述許多固相載體中其它固相載體上的L型多核苷酸序列部分的序列不同的獨特序列。
63.如權利要求61所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有處于不同位置的雜構多核苷酸的可尋址陣列，各多核苷酸含有L型雜構多核苷酸序列部分，該L型雜構多核苷酸序列部分含有與所述陣列其它位置上的雜構多核苷酸中的L型多核苷酸序列部分的序列不同的獨特序列。
64.如權利要求61-63中任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括至少10種不同的雜構多核苷酸，各雜構多核苷酸含有與其它雜構多核苷酸中的L型多核苷酸序列部分不同的獨特序列。
65.如權利要求64所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括至少100種不同的雜構多核苷酸，各雜構多核苷酸含有與其它雜構多核苷酸中的L型多核苷酸序列部分不同的獨特序列。
全文摘要
公開了利用含有D型多核苷酸序列部分和與該D型多核苷酸序列部分共價連接的L型多核苷酸序列部分的雜構多核苷酸的方法、組合物和試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK1982325SQ20061014253
公開日2007年6月20日 申請日期2002年12月23日 優(yōu)先權日2001年12月21日
發(fā)明者S·M·馬蒂斯克, B·V·施羅德, R·S·維納亞克, L·L·格林菲爾德 申請人:阿普里拉股份有限公司