本發(fā)明屬于生物技術領域的一種干細胞庫的構建方法，具體涉及的是一種人羊膜上皮干細胞庫的構建方法。

背景技術：

隨著經濟的發(fā)展，人民生活水平的提高，原先威脅人類健康的最大殺手——“傳染病”在逐漸減少，而由于細胞、組織及器官損傷、病變及老化而引起的疾病逐漸增多。這些疾病僅僅靠傳統的藥物和醫(yī)療手段是不能解決的，而干細胞治療將有望成為治療這類疾病的主要手段。干細胞的自我更新和分化多能性的特點使之成為疾病發(fā)病機制研究，藥物篩選以及細胞移植的理想對象和來源。干細胞治療有望治療細胞、組織及器官損傷、病變及老化而引起的疾病。

細胞治療實現產業(yè)化過程步驟包括細胞分離、培養(yǎng)、鑒定、建庫、大量擴增、規(guī)?；a等，構建人羊膜上皮干細胞庫是實現轉化醫(yī)學研究，即臨床細胞治療的重要環(huán)節(jié)之一，建庫是實現規(guī)?；a先決條件。目前，細胞治療需要提供細胞的來源主要為骨髓，但成人骨髓源干細胞數量及增殖分化潛能隨年齡的增大而下降，病毒感染率較高，且供者骨髓細胞的采集須行骨髓穿刺術，來源受到限制。

人羊膜上皮干細胞(human amniotic epithelial stem cells，簡稱 hAESCs)是胎盤羊膜組織靠近胎兒側的單層上皮細胞，來源于胚外外胚層。具有類似胚胎干細胞的多向分化潛能，及更好的外胚層分化潛能。屬于多潛能干細胞，可分化成心肌樣細胞、脂肪細胞和成骨細胞等。hAESCs含量豐富，分化能力強，可在體外進行分離、培養(yǎng)和擴增，且生物性能穩(wěn)定，多次傳代擴增仍能保持旺盛功能，可以為實驗和臨床提供充足的細胞來源；hAESCs不表達MHC-Ⅱ類抗原，僅表達少量的MHC-Ⅰ類抗原，由于其不合成端粒酶，hAESCs植入體內并不形成畸胎瘤，hAESCs可產生許多細胞因子，有利于創(chuàng)傷的修復，適宜于不同個體之間的移植，也是細胞治療的理想靶細胞。在干細胞治療的安全性方面較一般干細胞更具臨床應用潛力。具有比骨髓干細胞更強的擴增能力和免疫原性及成瘤性更低等骨髓干細胞無法比擬的優(yōu)點。因此，構建國內外首個無血清培養(yǎng)細胞的“羊膜上皮干細胞庫”，可為臨床細胞治療提供種子細胞庫。

由于hAESCs來源豐富，成本低廉，取材方便，為非創(chuàng)傷性，無倫理學問題，因此人羊膜上皮干細胞在臨床疾病治療中的作用也已在動物實驗和人類疾病的治療中取得進展和證實。這些疾病包括A1zheimer病(癡呆癥)、脊髓損傷、中風、燒傷、心臟病、糖尿病、骨關節(jié)炎和類風濕性關節(jié)炎等。應用前景十分廣闊。

經專利檢索比對發(fā)現申請專利號CN104480533A 公開“一種胎盤干細胞庫的構建方法及胎盤組織復蘇方法”雖提及人羊膜上皮干細胞，但由于其細胞培養(yǎng)技術手段的局限性，例如在細胞培養(yǎng)基中仍含有異種胎牛血清等實際問題的存在，始終存在著臨床應用生物安全隱患，長期以來一直困擾著人們無法從根本上得以解決，無法在臨床上推廣應用。如何研究發(fā)現用多種細胞因子和氨基酸等細胞營養(yǎng)成分培養(yǎng)基代替含異種胎牛血清的細胞培養(yǎng)hAESCs是非常復雜困難的開辟性工作。需要研究人員作大量反復的科學實驗才有解決。

技術實現要素：

本發(fā)明針對上述現有干細胞來源或者受倫理限制或數量有限的問題，而提供一種來源廣泛、同種異體、不受倫理限制及無免疫原性問題的人羊膜上皮干細胞庫的構建方法。同時，本發(fā)明還解決了以往人羊膜上皮干細胞庫在臨床應用方面所存在的安全隱患等問題，采用無血清培養(yǎng)基，不含異種動物原成分，以滿足臨床應用安全可靠的要求，有利于臨床推廣應用。

本發(fā)明技術方案如下：人羊膜上皮干細胞庫的構建方法，包括以下步驟：

（1）人羊膜的選材嚴格遵循供體符合醫(yī)學標準并建立資料檔案；

（2）人羊膜收集

取供體符合醫(yī)學標準剖腹產或正常分娩的胎膜，在胎膜娩出5～10分鐘內，從胎膜上鈍性分離羊膜；進行ABO/Rh血型檢測及HLA分型檢測和微生物學檢測；用磷酸鹽緩沖液（PBS）或0.9%生理鹽水反復漂洗后剪成膜片；用含1000U/ml慶大霉素和2.5ug/ml二性霉素B的磷酸鹽緩沖液或0.9%生理鹽水浸泡20～30分鐘。

（3）人羊膜上皮干細胞分離及單細胞懸液的制備

取人羊膜10×10cm2，先用終濃度 2.5g/L胰蛋白酶，室溫消化30分鐘～60分鐘，共2～4次，得到細胞懸液；用200目～300目不銹鋼網過濾將消化下來的細胞制成單細胞懸液，1000轉/分鐘～1500轉/分鐘，離心5分鐘～15分鐘，用PH 7.2磷酸緩沖液PBS洗2次；再離心，離心機的轉速為1500轉/分鐘～2500轉/分鐘，時間為15分鐘～35分鐘，棄去上清液，即獲得羊膜上皮干細胞；

（4）人羊膜上皮干細胞的無血清培養(yǎng)、純化及擴增

將第(3)步所得細胞接種于無血清培養(yǎng)基中，置于37℃、飽和濕度、體積分數為5％的C0₂培養(yǎng)箱中進行傳代培養(yǎng)，每24小時～48小時全量換液一次，使人羊膜上皮干細胞通過換液和傳代逐漸得到擴增和純化；

所述人羊膜上皮干細胞無血清培養(yǎng)基，包括：

DMEM／F12（按體積1:1混合）15.0～15.6g/L

表皮細胞生長因子0.005～0.015 mg/L

人轉鐵蛋白1.0～7.0 mg/L

人胰島素5.5～15 mg/L

亞硒酸鈉5.0～7.2×10³ mg/L

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽300～500 mg/L

L-丙氨酸10～25 mg/L

L-天冬酰胺4.9～10.9 mg/L

L-天冬氨酸9.3～17.3 mg/L

L- 谷氨酸10.7～18.7 mg/L

甘氨酸5.5 ～-8.5 mg/L

L-脯氨酸 7.5～15.5 mg/L

L-絲氨酸6.5～11.5 mg/L

在上述第(2)步中，擇優(yōu)選擇將第(1)步所得細胞以2.5×l0⁷ L^-1～2.5×l0¹⁰ L^-1密度接種于上述無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)；

（5）人羊膜上皮干細胞庫的構建

取培養(yǎng)P2～3代人羊膜上皮干細胞保存于無血清培養(yǎng)液加10%二甲基亞砜DMSO中，細胞濃度調整至1×10 ⁵個/ml～1×10 ⁸個/ml,分裝于冷凍管中，標記凍存日期，置液氮冷凍；液氮冷凍溫度為-196 ℃；按其新生兒性別和ABO/Rh分型及HLA分型進行保存，建立可供檢索的細胞信息檔案，即構建出人羊膜上皮干細胞庫；

（6）人羊膜上皮干細胞復蘇

羊膜上皮干細胞復蘇方法 于60 ℃恒溫水浴箱中，0.5～1 min內快速復蘇，按2.5×10³/cm²～2.5×10⁵/cm²接種于塑料培養(yǎng)瓶內，用含DMEM/F12無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按1:3傳代，擴增后獲得大量人羊膜上皮干細胞，備用。

本發(fā)明還包括細胞免疫熒光方法檢測無血清培養(yǎng)人羊膜上皮細胞的表面標志物CK19、波形蛋白的表達的步驟：

1、制備hAECs細胞爬片：將處理好的干凈的蓋片，置入六孔板內，以2×10⁵密度將經誘導分化后的hAECs接種到放入蓋片的六孔板內，置于37℃體積分數為5％的 CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

2、固定：待細胞生長70-80％融合時，棄去培養(yǎng)液，用1×PBS洗2遍，加入4％多聚甲醛溶液固定細胞，室溫固定20分鐘；

3、洗滌：吸凈多聚甲醛，加入1×PBS，50rpm/min洗滌5分鐘，重復3次；

4、封閉：加入封閉液(0.2%Triton-X-100通透，含2.5%驢血清的PBS中)， 室溫封閉30分鐘～50分鐘；

5、一抗孵育：用500μl抗體稀釋緩沖液(1×PBS，1％BSA)1∶200稀釋一抗CK14、CK19、波形蛋白；覆蓋蓋片表面并置入濕盒內，4℃，過夜；

6、洗滌：吸凈多聚甲醛，加入1×PBS 1ml，50rpm/min洗滌5分鐘，重復3次；

7、二抗孵育：用500μl抗體稀釋緩沖液(1×PBS，1％BSA)1∶500

稀釋二抗驢抗小鼠CK19、波形蛋白應用抗小鼠熒光二抗進行雜交，室溫孵育1小時；

8、洗滌：吸凈多聚甲醛，加入1×PBS 1ml，50rpm/min洗滌5分 鐘，重復3次；

9、核染色：用去離子水(ddH2O)按1∶1000的比例稀釋二脒苯基吲哚(DAPI)儲存液，工作液濃度為1μg/ml，染色1分鐘，使用ddH2O 洗3次，每次5分鐘；

10、封片：防淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察。

本發(fā)明還包括檢測在無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)下羊膜上皮細胞的增殖能力的步驟；

無血清培養(yǎng)人羊膜上皮干細胞的增殖，應用MTS增殖檢測分析檢測在無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人羊膜上皮細胞的增殖能力，將P2代人羊膜上皮細胞按8×10³/孔接種于96孔板內，待細胞貼壁后更換培養(yǎng)液，分別于24、48、72和96小時加入20μL MTS/孔（5mg/ml），于37 ℃、5% CO₂的孵箱內孵育1.5～2小時。檢測各孔495nM處吸光值；

本發(fā)明還包括流式細胞儀方法檢測無血清培養(yǎng)人羊膜上皮細胞的表面標志物CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105的表達的步驟：

流式細胞儀檢測無血清培養(yǎng)人羊膜上皮細胞的表面標志物CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105

收集P1代人羊膜上皮細胞，接種于無血清培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)96小時；收取人羊膜上皮細胞，調整細胞密度為1×10⁶/mL。取1mL細胞懸液，冷PBS洗細胞后100uL PBS重懸細胞，加入5uL單克隆抗體，設置未加抗體組作為陰性對照組，4℃避光孵育30min，冷PBS沖洗3次，用流式細胞儀檢測CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105的表達。

本發(fā)明所述的人羊膜上皮干細胞的無血清培養(yǎng)、純化及擴增步驟優(yōu)選如下：在第(3)步開始細胞培養(yǎng)后，培養(yǎng)48小時～72小時，更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁的細胞，根據細胞生長情況，每24小時～48小時全量換液一次，待細胞達到80％～90％融合時，用終濃度2.5g/L胰蛋白酶消化，然后按1：2的比例或l：3 的比例進行傳代接種培養(yǎng)，并記為P1代，傳代培養(yǎng)過程中每24小時～48小時全量換液，直至貼壁細胞彼此融合，鋪滿瓶底，重復上述操作進行傳代培養(yǎng)，并記為P2代，繼續(xù)上述傳代培養(yǎng)過程。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明人羊膜上皮干細胞，采用無血清培養(yǎng)基與用含有胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)人羊膜上皮干細胞相比，具有無動物源性、來源廣泛、不受倫理限制及異種免疫原性等優(yōu)越性。儲存于庫內的羊膜上皮干細胞，經過短期培養(yǎng)可獲得2～3×10¹⁰個/ml大量富有活性人羊膜上皮干細胞，并能長期保存，而不失去活性，操作簡單易行，建庫成本低廉，富有應用前景。

附圖說明

圖1為原代培養(yǎng)hAESCs倒置顯微鏡（× 40）鏡下所見圖。

圖2為細胞免疫熒光方法檢測提取培養(yǎng)原代（P0）代hAESCs中上皮標志物上皮角蛋白CK19（× 100）和間質細胞標志物波形蛋白

（× 100）表達的鏡下所見圖。

圖3為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)P1代hAESCs 培養(yǎng)96小時倒置顯微鏡

（× 40）鏡下所見圖。

圖4為 人羊膜上皮細胞增殖檢測分析示意圖。

圖5為流式細胞分析技術鑒定無血清培養(yǎng)96小時hAESCs中分化抗原簇（cluster of differentiation，簡稱CD）CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105表達圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例詳細描述本發(fā)明：

實施例1

如圖1所示，原代培養(yǎng)hAESCs倒置顯微鏡（× 40）的示意圖。從人羊膜提取的原代羊膜上皮細胞形態(tài)均一，呈鵝卵石樣排列。

如圖2所示，細胞免疫熒光方法檢測鑒定提取的hAESCs表面標志物，原代提取培養(yǎng)的P0代hAESCs中上皮標志物上皮角蛋白CK19（× 100）和間質細胞標志物波形蛋白（× 100）表達的示意圖。上皮細胞標志物上皮角蛋白CK19表達強陽性；間質細胞標志物波形蛋白表達弱陽性。

如圖3所示，羊膜上皮細胞增殖檢測分析示意圖：取第2代的hAESCs按2×10³細胞/孔接種于24孔板內，每隔24小時消化3個孔，收集細胞，并用0.4%苔盼藍染色后計數活細胞，取5次結果的平均值，繪制生長曲線。

如圖4所示，無血清培養(yǎng)基對P1代 hAESCs 進行培養(yǎng)96小時倒置顯微鏡圖（×40）。鏡下細胞形態(tài)均一，細胞呈鵝卵石樣排列。

如圖5所示，流式細胞分析技術鑒定無血清培養(yǎng)96小時hAESCs中分化抗原簇（cluster of differentiation，簡稱CD）CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105表達圖。hAESCs 陽性表達CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90和CD105。

本發(fā)明人羊膜上皮干細胞庫的構建方法，包括以下步驟：

（1）人羊膜的選材嚴格遵循供體符合醫(yī)學標準并建立資料檔案；

（2）人羊膜收集

取供體符合醫(yī)學標準剖腹產或正常分娩的胎膜，在胎膜娩出5分鐘內，從胎膜上鈍性分離羊膜；進行ABO/Rh血型檢測及HLA分型檢測和微生物學檢測；用磷酸鹽緩沖液（PBS）反復漂洗后剪成膜片；用含1000U/ml慶大霉素和2.5ug/ml二性霉素B的磷酸鹽緩沖液浸泡20分鐘；

（3）人羊膜上皮干細胞的分離及單細胞懸液的制備

在無菌條件下取正常足月剖腹產后廢棄的羊膜；進行ABO/Rh血型檢測及HLA分型檢測和微生物學檢測；檢測甲型肝炎抗體、乙型肝炎病毒表面抗原、乙型肝炎病毒表面抗體、乙型肝炎病毒e抗原、乙型肝炎病毒e抗體、乙型肝炎核心抗體IgM、丙型肝炎抗體、戊型肝炎抗體、艾滋病病毒抗體、梅毒螺旋體抗體等其他相關傳染性指標均呈陰性；在無菌超凈臺上鈍性分離胎盤臍帶面的羊膜5×5cm²，用PH7.2磷酸緩沖液(PBS)充分沖洗，將羊膜置于含0.1萬U/ml慶大霉素和2.5ug/ml兩性霉素B的生理鹽水中，浸泡20分鐘；將羊膜盡可能的剪碎，按每克組織加入終濃度2.5g/L胰蛋白酶5m1，攪拌使之與羊膜充分混和，置入37℃溫箱消化30分鐘后取消化液1000rpm，離心5min，棄上清液；如此共3次，得細胞懸液；用200目不銹鋼網過濾將消化下來的細胞制成單細胞懸液，1000rpm 離心5分鐘，用PBS洗2次，用臺盼蘭染色，計數活細胞，以2.5×l0⁸ L^-1的密度將所得細胞接種于25cm²培養(yǎng)瓶內；在接種時的細胞密度可采用2.5×l0⁷ L^-1；

（4）人羊膜上皮干細胞的無血清培養(yǎng)、純化及擴增

將上述人羊膜上皮細胞接種在25cm²培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，內含15ml無血清培養(yǎng)液，包括：

基礎培養(yǎng)基DMEM／F12（按體積1:1混合）15.0g/L

表皮細胞生長因子0.01mg/L

人轉鐵蛋白5.5 mg/L

人胰島素 10 mg/L

亞硒酸鈉6.7×10³ mg/L

氯化鈉8.5×10³mg/L

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽 434.4mg/L

L-丙氨酸15 mg/L

L-天冬酰胺-水合物8.9 mg/L

L-天冬氨酸13.3 mg/L

L-左旋谷氨酸14.7 mg/L

甘氨酸7.5 mg/L

L-脯氨酸11.5 mg/L

L-絲氨酸10.5 mg/L

接種時的細胞密度采用2.5×l0⁷ L^-1；

置于37℃體積分數為5%的CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48小時～72小時后，更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁的細胞，根據細胞生長情況，每24小時～48小時全量換液一次；待細胞達到80％～90％融合時，用2.5g／L胰蛋白酶消化，然后按1：2或1：3的比例的比例進行傳代接種培養(yǎng)，并記為P1代。傳代培養(yǎng)過程中每2天全量換液，直至貼壁細胞彼此融合，鋪滿瓶底，再重復上述操作進行傳代，此傳代培養(yǎng)記為P2代，然后繼續(xù)上述傳代培養(yǎng)過程。hAESCs呈鵝卵石樣排列，隨著傳代的進行，hAESCs的胞體逐漸增大，出現部分寬大扁平的細胞，失去增殖和分化能力，而大部分細胞仍然維持細長的梭形，保持增生和分化能力；體外培養(yǎng)5代以后，細胞的增殖速度明顯減慢，細胞出現老化現象。

（5）細胞免疫熒光方法檢測無血清培養(yǎng)人羊膜上皮細胞的表面標志物CK19、波形蛋白的表達

制備hAESCs細胞爬片：將處理好的干凈的蓋片，置入六孔板內，以2×10⁵密度將經誘導分化后的hAESCs接種到放入蓋片的六孔板內，置于37℃體積分數為5％的 CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；固定：待細胞生長70-80％融合時，棄去培養(yǎng)液，用1×PBS洗2遍，加入4％多聚甲醛溶液固定細胞，室溫固定20分鐘；洗滌：吸凈多聚甲醛，加入1×PBS，50rpm/min洗滌5分鐘，重復3次；封閉：加入封閉液(0.2%Triton-X-100通透，含2.5%驢血清的PBS中)， 室溫封閉30分鐘～50分鐘；一抗孵育：用500μl抗體稀釋緩沖液(1×PBS，1％BSA)1∶200稀釋一抗CK19、波形蛋白；覆蓋蓋片表面并置入濕盒內，4℃，過夜；洗滌：吸凈多聚甲醛，加入1×PBS 1ml，50rpm/min洗滌5分鐘，重復3次；二抗孵育：用500μl抗體稀釋緩沖液(1×PBS，1％BSA)1∶500稀釋二抗驢抗小鼠CK19、波形蛋白應用抗小鼠熒光二抗進行雜交，室溫孵育1小時；洗滌：吸凈多聚甲醛，加入1×PBS 1ml，50rpm/min洗滌5分 鐘，重復3次；核染色：用去離子水(ddH2O)按1∶1000的比例稀釋二脒苯基吲哚(DAPI)儲存液，工作液濃度為1μg/ml，染色1分鐘，使用ddH2O 洗3次，每次5分鐘；封片：防淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察。

（6）無血清培養(yǎng)人羊膜上皮干細胞的細胞增殖

應用MTS增殖檢測分析檢測無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)下人羊膜上皮細胞的增殖能力。將P2代人羊膜上皮細胞按8×10³/孔接種于96孔板內。待細胞貼壁后更換培養(yǎng)液。分別于24、48、72和96小時加入20μL MTS/孔（5mg/ml），于37 ℃、5% CO2的孵箱內孵育2小時。檢測各孔495nM處吸光值。

（7）無血清培養(yǎng)人羊膜上皮細胞的干細胞標記

收集P1代人羊膜上皮細胞，接種于無血清培養(yǎng)基（含DMEM／F12（按體積1:1混合）15.0g/L，表皮細胞生長因子0.01mg/L、人轉鐵蛋白5.5 mg/L、人胰島素 10mg/L、亞硒酸鈉6.7×10³mg/L、氯化鈉8.5×10³mg/L、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽 434.4mg/L、L-丙氨酸15 mg/L、L-天冬酰胺-水合物8.9 mg/L、L-天冬氨酸13.3 mg/L、L-左旋谷氨酸14.7 mg/L、甘氨酸7.5 mg/L、L-脯氨酸11.5 mg/L和L-絲氨酸10.5 mg/L的DMEM/F12培養(yǎng)基）中，連續(xù)培養(yǎng)96小時。

收集P1代人羊膜上皮細胞，接種于無血清培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)96小時；收取人羊膜上皮細胞，調整細胞密度為1×10⁶/mL。取1mL細胞懸液，冷PBS洗細胞后100uL PBS重懸細胞，加入5uL單克隆抗體，設置未加抗體組作為陰性對照組，4℃避光孵育30min，冷PBS沖洗3次，用流式細胞儀檢測CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105的表達；

（8）人羊膜上皮干細胞庫的構建

取P2～3代羊膜上皮干細胞，保存于上述無血清培養(yǎng)液加冷凍保

護液10%二甲基亞砜（DMSO）中，細胞濃度調整至1×10 ⁷個/ml,分裝于標記凍存日期的冷凍管中，置液氮冷凍。液氮冷凍溫度為-196 ℃；按其新生兒性別和ABO/Rh分型及HLA分型進行保存，建立可供檢索的細胞信息檔案，將其具體信息包括供者姓名，供者父母姓名、地址、聯系方式，干細胞的配型信息等輸入電腦數據庫，建立完善的數據檔案備查詢。即構建出人羊膜上皮干細胞庫。

實施例2

本發(fā)明人羊膜上皮干細胞庫的構建方法，包括以下步驟：

（1）人羊膜的選材嚴格遵循供體符合醫(yī)學標準并建立資料檔案；

（2）人羊膜收集

取供體符合醫(yī)學標準剖腹產或正常分娩的胎膜，在胎膜娩出10分鐘內，從胎膜上鈍性分離羊膜；進行ABO/Rh血型檢測及HLA分型檢測和微生物學檢測；用0.9%生理鹽水反復漂洗后剪成膜片；用含1000U/ml慶大霉素和2.5ug/ml二性霉素B的磷酸鹽緩沖液浸泡30分鐘；

（3）人羊膜上皮干細胞的分離及單細胞懸液的制備

在無菌條件下取正常足月剖腹產后廢棄的羊膜；進行ABO/Rh血型檢測及HLA分型檢測和微生物學檢測；檢測甲型肝炎抗體、乙型肝炎病毒表面抗原、乙型肝炎病毒表面抗體、乙型肝炎病毒e抗原、乙型肝炎病毒e抗體、乙型肝炎核心抗體IgM、丙型肝炎抗體、戊型肝炎抗體、艾滋病病毒抗體、梅毒螺旋體抗體等其他相關傳染性指標均呈陰性；在無菌超凈臺上鈍性分離胎盤臍帶面的羊膜5×5cm²，用PH7.2磷酸緩沖液(PBS)充分沖洗，將羊膜置于含0.1萬U/ml慶大霉素和2.5ug/ml兩性霉素B的生理鹽水中，浸泡20分鐘；將羊膜盡可能的剪碎，按每克組織加入終濃度2.5g/L胰蛋白酶5m1，攪拌使之與羊膜充分混和，置入37℃溫箱消化30分鐘后取消化液 1000rpm 離心5min，棄上清液；如此共3次，獲得細胞懸液；用200目不銹鋼網過濾將消化下來的細胞制成單細胞懸液，1000rpm，離心5分鐘～10分鐘，用PBS洗2次，用臺盼蘭染色，計數活細胞，以2.5×l0⁸ L^-1的密度將所得細胞接種于25cm²培養(yǎng)瓶內；在接種時的細胞密度可采用2.5×l0⁹ L^-1；

（4）人羊膜上皮干細胞的無血清培養(yǎng)、純化及擴增

將上述人羊膜上皮細胞接種在25cm²培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，內含10ml無血清培養(yǎng)液，包括：

基礎培養(yǎng)基DMEM／F12（按體積1:1混合）15.0g/L

表皮細胞生長因子0.01mg/L

人轉鐵蛋白5.5 mg/L

人胰島素 10mg/L

亞硒酸鈉6.7×10³ mg/L

氯化鈉8.5×10³mg/L

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽 434.4mg/L

L-丙氨酸15 mg/L

L-天冬酰胺-水合物8.9 mg/L

L-天冬氨酸13.3 mg/L

L-左旋谷氨酸14.7 mg/L

甘氨酸7.5 mg/L

L-脯氨酸11.5 mg/L

L-絲氨酸10.5 mg/L

接種時的細胞密度采用2.5×l0⁷ L^-1；

置于37℃體積分數為5%的CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)72小時后，更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁的細胞，根據細胞生長情況，每24 48小時全量換液一次；待細胞達到90％融合時，用2.5g/L胰蛋白酶消化，然后按1：3的比例的比例進行傳代接種培養(yǎng)，并記為P1代。傳代培養(yǎng)過程中每2天全量換液，直至貼壁細胞彼此融合，鋪滿瓶底，再重復上述操作進行傳代，此傳代培養(yǎng)記為P2代，然后繼續(xù)上述傳代培養(yǎng)過程；hAESCs呈鵝卵石樣排列。隨著傳代的進行，hAESCs的胞體逐漸增大，失去增殖和分化能力，而大部分細胞仍然維持呈鵝卵石樣排列，保持增生和分化能力；體外培養(yǎng)6代以后，細胞的增殖速度明顯減慢，細胞出現老化現象。

（5）細胞免疫熒光方法檢測無血清培養(yǎng)人羊膜上皮細胞的表面標志物CK19、波形蛋白的表達

制備hAESCs細胞爬片：將處理好的干凈的蓋片，置入六孔板內，以2×10⁵密度將經誘導分化后的hAESCs接種到放入蓋片的六孔板內，置于37℃體積分數為5％的 CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；固定：待細胞生長70-80％融合時，棄去培養(yǎng)液，用1×PBS洗2遍，加入4％多聚甲醛溶液固定細胞，室溫固定20分鐘；洗滌：吸凈多聚甲醛，加入1×PBS，50rpm/min洗滌5分鐘，重復3次；封閉：加入封閉液(0.2%Triton-X-100通透，含2.5%驢血清的PBS中)， 室溫封閉30分鐘～50分鐘；一抗孵育：用500μl抗體稀釋緩沖液(1×PBS，1％BSA)1∶200稀釋一抗CK19、波形蛋白；覆蓋蓋片表面并置入濕盒內，4℃，過夜；洗滌：吸凈多聚甲醛，加入1×PBS 1ml，50rpm/min洗滌5分鐘，重復3次；二抗孵育：用500μl抗體稀釋緩沖液(1×PBS，1％BSA)1∶500稀釋二抗驢抗小鼠CK19、波形蛋白應用抗小鼠熒光二抗進行雜交，室溫孵育1小時；洗滌：吸凈多聚甲醛，加入1×PBS 1ml，50rpm/min洗滌5分 鐘，重復3次；核染色：用去離子水(ddH2O)按1∶1000的比例稀釋二脒苯基吲哚(DAPI)儲存液，工作液濃度為1μg/ml，染色1分鐘，使用ddH2O 洗3次，每次5分鐘；封片：防淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察。

（6）無血清培養(yǎng)人羊膜上皮干細胞的增殖

應用MTS增殖檢測分析檢測無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)下人羊膜上皮細胞的增殖能力。將P2代人羊膜上皮細胞按8×10³/孔接種于96孔板內。待細胞貼壁后更換培養(yǎng)液。分別于24、48、72和96小時加入20μL MTS/孔（5mg/ml），于37 ℃、5% CO₂的孵箱內孵育2小時。檢測各孔495nM處吸光值。

（7）無血清培養(yǎng)人羊膜上皮細胞的干細胞標記

收集P1代人羊膜上皮細胞，接種于無血清培養(yǎng)基（含DMEM／F12（按體積1:1混合）15.0g/L，表皮細胞生長因子0.01mg/L、人轉鐵蛋白5.5 mg/L、人胰島素 10mg/L、亞硒酸鈉6.7×10³mg/L、氯化鈉8.5×10³mg/L、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽 434.4mg/L、L-丙氨酸15 mg/L、L-天冬酰胺-水合物8.9 mg/L、L-天冬氨酸13.3 mg/L、L-左旋谷氨酸14.7 mg/L、甘氨酸7.5 mg/L、L-脯氨酸11.5 mg/L和L-絲氨酸10.5 mg/L的DMEM/F12培養(yǎng)基）中，連續(xù)培養(yǎng)96小時。

收集P1代人羊膜上皮細胞，接種于無血清培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)96小時；收取人羊膜上皮細胞，調整細胞密度為1×10⁶/mL。取1mL細胞懸液，冷PBS洗細胞后100uL PBS重懸細胞，加入5uL單克隆抗體，設置未加抗體組作為陰性對照組，4℃避光孵育30min，冷PBS沖洗3次，用流式細胞儀檢測CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105的表達；

（8）人羊膜上皮干細胞庫的構建

取P2～3代羊膜上皮干細胞，保存于DMEM／F12（按體積1:1混合）15.0g/L、表皮細胞生長因子0.01mg/L、人轉鐵蛋白5.5 mg/L、人胰島素 10mg/L、亞硒酸鈉6.7×10³ mg/L、氯化鈉8.5×10³mg/L、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽 434.4mg/L、L-丙氨酸15 mg/L、L-天冬酰胺-水合物8.9 mg/L、L-天冬氨酸13.3 mg/L、L-左旋谷氨酸14.7 mg/L、甘氨酸7.5 mg/L、L-脯氨酸11.5 mg/L、L-絲氨酸10.5 mg/L等無血清培養(yǎng)液加冷凍保護液10%二甲基亞砜（DMSO）中，細胞濃度調整至1×10⁷個/ml,分裝于標記凍存日期的冷凍管中，置液氮冷凍。液氮冷凍溫度為-196 ℃；按其新生兒性別和ABO/Rh分型及HLA分型進行保存，建立可供檢索的細胞信息檔案，將其具體信息包括供者姓名，供者父母姓名、地址、聯系方式，干細胞的配型信息等輸入電腦數據庫，建立完善的數據檔案備查詢，即構建出人羊膜上皮干細胞庫。

（9）、人羊膜上皮干細胞復蘇

羊膜上皮干細胞復蘇方法 于60 ℃恒溫水浴箱中，0.5min內快速復蘇，按2.5×10⁵/cm²接種于塑料培養(yǎng)瓶內，用無血清培養(yǎng)基，即 DMEM／F12（按體積1:1混合）15.0g/L、表皮細胞生長因子0.01mg/L、人轉鐵蛋白5.5 mg/L、人胰島素 10mg/L、亞硒酸鈉6.7×10³ mg/L、氯化鈉8.5×10³mg/L、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽 434.4mg/L、L-丙氨酸15 mg/L、L-天冬酰胺-水合物8.9 mg/L、L-天冬氨酸13.3 mg/L、L-左旋谷氨酸14.7 mg/L、甘氨酸7.5 mg/L、L-脯氨酸11.5 mg/L、L-絲氨酸10.5 mg/L中培養(yǎng)，按1:3傳代，擴增后獲得大量人羊膜上皮干細胞，備用。

實施例3

本發(fā)明人羊膜上皮干細胞庫的構建方法，其特征是包括下述步驟：

（1）人羊膜的選材嚴格遵循供體符合醫(yī)學標準并建立資料檔案；

（2）人羊膜收集及檢測

取供體符合醫(yī)學標準剖腹產或正常分娩的胎膜，在胎膜娩出8分鐘內，從胎膜上鈍性分離羊膜；進行ABO/Rh血型檢測及HLA分型檢測和微生物學檢測，用磷酸鹽緩沖液PBS反復漂洗后剪碎；用含0.9%生理鹽水浸泡30分鐘；

（3）人羊膜上皮干細胞分離及單細胞懸液的制備

取人羊膜先用終濃度 2.5g/L胰蛋白酶，室溫消化40分鐘，共3次，得到細胞懸液；用200目不銹鋼網過濾將消化下來的細胞制成單細胞懸液，1200轉/分鐘，離心8分鐘，用PH 7.2磷酸緩沖液PBS洗2次；再離心，離心機的轉速為1800轉/分鐘，時間為20分鐘，棄去上清液，即獲得羊膜上皮干細胞；

（4）人羊膜上皮干細胞的無血清培養(yǎng)、純化及擴增

將第(1)步所得細胞以2.5×l0⁸ L^-1密度接種于無血清培養(yǎng)基中，置于37℃、飽和濕度、體積分數為5％的CO₂培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，根據細胞生長情況，每30小時全量換液一次，待細胞達到85％融合時，用終濃度2.5g/L胰蛋白酶消化，然后按1：2的比例或l：3的比例進行傳代接種培養(yǎng)，并記為P1代，傳代培養(yǎng)過程中每30小時全量換液，直至貼壁細胞彼此融合，鋪滿瓶底，重復上述操作進行傳代培養(yǎng)，并記為P2代，繼續(xù)上述傳代培養(yǎng)過程使人羊膜上皮干細胞逐漸得到擴增和純化；

所述無血清培養(yǎng)基采用

DMEM／F12按體積1:1混合15.3g/L

表皮細胞生長因子0.010 mg/L

人轉鐵蛋白4.0 mg/L

人胰島素10 mg/L

亞硒酸鈉6.2×10³ mg/L

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽400 mg/L

L-丙氨酸15 mg/L

L-天冬酰胺7.9 mg/L

L-天冬氨酸12.3 mg/L

L-谷氨酸13.7 mg/L

甘氨酸6.5 mg/L

L-脯氨酸 10.5 mg/L

L-絲氨酸9.5 mg/L

在上述第(4)步中，擇優(yōu)選擇將第(3)步所得細胞以2.5×l0⁸ L^-1密度接種于上述無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)；

（5）人羊膜上皮干細胞庫的構建

取培養(yǎng)P2代人羊膜上皮干細胞保存于無血清培養(yǎng)液加10%二甲基亞砜DMSO中，細胞濃度調整至1×10 ⁶個/ml,分裝于冷凍管中，標記凍存日期，置液氮冷凍；液氮冷凍溫度為-196 ℃；按其新生兒性別和ABO/Rh分型及HLA分型進行保存，建立可供檢索的細胞信息檔案，即構建出人羊膜上皮干細胞庫；

（6）人羊膜上皮干細胞復蘇

羊膜上皮干細胞復蘇方法 于60 ℃恒溫水浴箱中，0.8 min內快速復蘇，按2.5×10⁴/cm²接種于塑料培養(yǎng)瓶內，用含DMEM/F12無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按1:3傳代，擴增后獲得大量人羊膜上皮干細胞，備用。