本發(fā)明涉及微生物學和植物病害生防技術領域，具體地說，涉及一株地衣芽孢桿菌Y16及其在防治作物土傳病害中的應用。
背景技術：
隨著作物產(chǎn)量水平的提高和設施農(nóng)業(yè)發(fā)展，土傳病害與連作障礙問題日趨突出，土壤病原微生物不斷增加，引發(fā)作物減產(chǎn)甚至絕收。土傳病害與連作障礙已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)安全生產(chǎn)發(fā)展的瓶頸。作物連作3年，產(chǎn)量降低10％～20％,連作4～5年作物減產(chǎn)40～50％。設施蔬菜、馬鈴薯、大蒜、向日葵、油菜、棉花、大豆、水稻、小麥、甜菜土傳病害時常發(fā)生，減產(chǎn)日益嚴重，影響農(nóng)民增產(chǎn)增收。我國遭受嚴重土傳病害、連作障礙危害的面積高達5億畝。
由于土傳病害加重，我國每年使用的農(nóng)藥量超過130萬噸，農(nóng)藥使用量普遍超標，平均每畝施用931.3g，比發(fā)達國家高出一倍。全國受農(nóng)藥污染的農(nóng)田約1600萬公頃，主要農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留超標率高達20％。土傳病害防治技術沒有得到有效的解決，生物防治土傳病害是替代化學農(nóng)藥的最佳選擇。
土傳病害生物防治的菌種多為木霉菌、鏈霉菌、寡雄腐霉菌、芽孢菌等為佳。防治土傳病害的微生物菌劑產(chǎn)品，己商品化的產(chǎn)品如澳大利亞的K84，放射形龍桿菌菌株K84在1973年就被大規(guī)模生產(chǎn)，用來防治根癌??；1988年Gustafson公司在美國注冊生產(chǎn)A13產(chǎn)品Kodiak，成為作物生防菌商業(yè)化生產(chǎn)的拓疆者。利用熒光假單胞菌(P.fluorescens CHA0)生產(chǎn)的殺真菌制劑Yield能夠防治土壤真菌病害。普利茅斯沙雷氏菌(Serratia plymuthica HRO-C48)生產(chǎn)的產(chǎn)品和放線菌(Streptomyces sp.HRO-71)生產(chǎn)的防治草莓和土豆生物黃萎病(Verticillium dahliae)。Trichoderma reesei G1和Trichoderma viride G3防治立枯病效果顯著。
美國研制的Topshield(哈茨木霉T22)和以色列研制的Trichodex(哈茨木霉T39)均是用于防治真菌病害如灰霉病以及以色列Mycontrol公司開發(fā)的商品制劑Trichoderma2000主要用于防治立枯絲核菌、齊整小核菌、疫霉等；盾殼霉也是研究較多的一種生防菌，盾殼霉對核盤菌屬及蔥白腐小菌核菌引起的多種植物病害均有很強的抑制作用。現(xiàn)在國外已有商品化產(chǎn)品出現(xiàn)，如前蘇聯(lián)開發(fā)的商品制劑Coniothyrin可以用于防治向日葵的菌核病，德國開發(fā)的商品制劑ntansWG可用于防治萵苣的核盤菌菌核病等。此外還有針對粘帚霉(Gliocladium virens)，由美國研制成功的SoilGard，用于防治猝倒病和根腐等，意大利研制的BiofoxC專用于防治鐮刀菌屬病害等。我國商品化的木霉菌殺菌劑(生菌消，又名滅菌靈)，主要用于防治各種作物的霜霉病，我國開發(fā)的5406抗生菌為鏈霉菌屬，定名為涇陽鏈霉菌，對黃萎病菌、枯萎病菌、立枯病菌、猝倒病菌等多種植物病害具有抗性，并且可促進植物生長。拮抗細菌(Bacillus subtilis)大面積示范推廣試驗證明，拮抗菌在水稻植株上定植能力較強，繁殖較快，對紋枯病防效達75％～85％，對稻曲病防效達63.8％～85.7％。拮抗木霉菌和拮抗細菌混合發(fā)酵制成粉劑，成功地防治了保護地蔬菜和甜瓜的苗期病害。其它報道的細菌殺菌劑用來防治黃瓜及煙草炭疽病菌的地衣芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌防治甘蔗黑腐病，放射假單孢桿菌防治小麥全蝕病等。木霉菌厚垣孢子制劑對新疆棉花黃萎病大面積試驗防效達到60％，增產(chǎn)50％，棉絨長度增加10％，表現(xiàn)出了良好的應用前景。
向日葵具有耐鹽堿、耐瘠薄、抗干旱適應性強等特性,籽實含油率高,油質優(yōu)良,現(xiàn)已成為世界第4大油料作物。2002年全球向日葵種植面積為2600萬hm2，葵花籽產(chǎn)量為2400萬t。據(jù)報道，2014、2015年度全球葵花籽產(chǎn)量1551.9萬t。2004年我國向日葵面積為113.1萬hm2，總產(chǎn)為194.6萬t，2007年我國向日葵播種面積102萬hm2，總產(chǎn)量為192.8萬t，單產(chǎn)1889.3kg/ha。
向日葵連作導致土壤養(yǎng)分特別是鉀元素過度消耗，地力難以恢復。向日葵病害如菌核病、銹病、褐斑病、霜霉病、葉枯病，以及葵螟、蠐螬、小地老虎等，都會因連作而危害加劇。向日葵菌核病，又稱白腐病、爛盤病，對向日葵的產(chǎn)量和品質影響很大。
向日葵菌核病發(fā)生很廣泛，發(fā)病較重，可造成向日葵莖折、花盤及種仁腐爛，對向日葵生產(chǎn)造成嚴重威脅。常見的有根腐型、莖腐型、葉腐型、花腐型4種類型，其中根腐型、花腐型受害重。花腐型病害表現(xiàn)為花盤受害后，盤背面出現(xiàn)水浸狀病斑。
目前主要是藥劑防治:①用40％紋枯利800～1000倍液；②用50％托布津可濕性粉劑1000倍液；③用50％速克靈500～1000倍液。防治效果并不十分理想，防治效果僅為80％左右，因此，研發(fā)防治土傳病害與連作障礙的生物肥料非常重要。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對我國向日葵連作導致菌核病和銹病頻繁發(fā)生、減產(chǎn)嚴重甚至絕收的生產(chǎn)問題，提供一株高效防治向日葵菌核病和銹病的芽孢桿菌Y16及其制備的微生物菌劑。
本發(fā)明的另一目的是提供所述地衣芽孢桿菌Y16在防治作物土傳病害中的應用。
為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明從吉林省公主嶺市農(nóng)田土壤中分離并純化獲得一株高效防治向日葵菌核病和銹病的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)Y16，現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏編號CGMCC NO.13512，保藏日期2016年12月28日。
地衣芽孢桿菌Y16的菌學特征如下：
形態(tài)特征：桿狀，運動，周生鞭毛，有芽孢，格蘭氏陽性，二等分裂。
培養(yǎng)特征：菌落白色，無光澤，邊緣不整齊，液體培養(yǎng)生長迅速，明膠穿刺培養(yǎng)陽性。
生理生化特征：化能異養(yǎng)，需氧，無需光照；在30℃～55℃溫度范圍內(nèi)均能生長，5℃～10℃和65℃不能生長；在pH5.7～6.8內(nèi)均能生長；在2％、5％、7％NaCl中生長；可利用檸檬酸鹽、丙二酸鹽，不能利用尿素鹽；可利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇；接觸酶陽性。結合16S rDNA測序結果，進一步確定菌株Y16為地衣芽孢桿菌。
本發(fā)明還提供含有所述地衣芽孢桿菌Y16的微生物菌劑。
本發(fā)明所述菌劑中還含有添加劑和保護劑。
其中，所述添加劑為二氧化硅、輕質碳酸鈣、高嶺土、膨潤土、稻殼粉、麥殼粉、秸稈粉等中的至少一種。
所述保護劑為甘油、脫脂奶、植物油、海藻酸鈉、殼聚糖等中的至少一種。
本發(fā)明提供的菌劑由如下重量份的組分組成：
地衣芽孢桿菌Y16發(fā)酵液 1份；
添加劑 0.5-3份；
保護劑 0.01-0.05份；
所述菌劑中地衣芽孢桿菌Y16活菌數(shù)為2×108-5×109cfu/g。優(yōu)選5×108cfu/g。
本發(fā)明還提供所述地衣芽孢桿菌Y16或所述菌劑在防治作物土傳病害(向日葵菌核菌病、向日葵銹病、大棚蔬菜連作障礙)中的應用。
所述土傳病害的病原菌包括核盤菌、向日葵柄銹菌、尖鐮孢菌。
本發(fā)明還提供所述地衣芽孢桿菌Y16或所述菌劑在提高作物產(chǎn)量中的應用。
所述作物包括大棚蔬菜。優(yōu)選地，所述作物包括向日葵、大蒜、甜瓜、西紅柿等。
本發(fā)明還提供所述地衣芽孢桿菌Y16或所述菌劑在制備農(nóng)用復混肥中的應用。
本發(fā)明還提供一種農(nóng)用復混肥，由有效成分為地衣芽孢桿菌Y16的菌劑與氮肥、磷肥、鉀肥或復合肥組成。
本發(fā)明提供的有效成分為地衣芽孢桿菌Y16的微生物菌劑對于田間向日葵的促生增產(chǎn)效果明顯，且其作用效果不受田間土壤條件、化肥使用的抑制，可以在輕度鹽堿農(nóng)田中，與化肥一起施用。該菌劑對向日葵核盤引發(fā)的爛盤病防治效果達到95％以上，銹病防治效果達100％，向日葵增產(chǎn)20％-30％，大棚蔬菜增產(chǎn)20％以上。該微生物菌劑對我國農(nóng)田土傳病害和連作障礙防治，糧食持續(xù)增產(chǎn)和保護農(nóng)田生態(tài)環(huán)境具有重要意義。
附圖說明
圖1為本發(fā)明實施例5中Y16菌株平板抑制尖鐮孢菌的效果；其中，A、B分別表示Y16抑制尖鐮孢菌的PDYA平板的正面和反面。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
實施例1地衣芽孢桿菌Y16菌劑的制備
1.地衣芽孢桿菌Y16的分離及純化
從吉林省公主嶺市農(nóng)田土壤中分離并純化獲得一株高效防治向日葵菌核病和銹病的菌株Y16。
根據(jù)菌株Y16的菌學特征及16S rDNA測序結果，確定菌株Y16為地衣芽孢桿菌。
2.地衣芽孢桿菌Y16的培養(yǎng)
(1)培養(yǎng)基的組成(kg/t發(fā)酵液)
可溶性淀粉10kg，黃豆餅粉10kg，玉米粉5kg，葡萄糖1kg，蔗糖10kg，酵母粉5kg，(NH4)2SO4 3kg，K2HPO4 0.2kg，NaCl 2.5kg，MgSO4·7H2O 0.1kg，CaCO3 0.5kg，F(xiàn)eSO40.001kg，硼酸(1％)1L，pH7.0，以水配制。
(2)發(fā)酵培養(yǎng)過程
將地衣芽孢桿菌Y16接種于土豆蔗糖(PDA)培養(yǎng)基上，25～28℃培養(yǎng)3d。將地衣芽孢桿菌Y16轉接入1000mL三角瓶，26-28℃，220r/min下液體發(fā)酵培養(yǎng)36h。然后按1％接種量接入50L種子罐，在200r/min、pH7.0、通氣量0.7vvm條件下，培養(yǎng)36h后，再按10v/v％接種量轉入500L發(fā)酵罐，在220r/min，pH7.0，通氣量0.7～1.0vvm下，培養(yǎng)3d。
3.地衣芽孢桿菌Y16菌劑的制備
發(fā)酵后加入保護劑海藻酸鈉，地衣芽孢桿菌Y16以輕質碳酸鈣吸附。
4.地衣芽孢桿菌Y16菌劑造粒
向以上吸附、混合好的菌劑中加入適量稻殼粉、秸稈粉和膨潤土粘結造粒，根據(jù)生產(chǎn)需要造粒形成適合向日葵的顆粒菌劑(活菌數(shù)為5×108cfu/g)，與向日葵種子播種機一起施入土壤；或者利用造粒機形成與尿素、磷酸二銨、鉀肥、復合肥粒徑近似的顆粒生物肥料，其生物肥料與尿素、磷酸二銨、鉀肥、復合肥一起機械施入土壤。
實施例2 Y16菌劑對盆栽向日葵促生效果的影響
1.Y16菌劑對非鹽堿土壤盆栽向日葵的促生效果
在溫室條件下進行了Y16菌劑的接種試驗，土壤來自于內(nèi)蒙烏拉特古前期農(nóng)田土壤，連年種植向日葵，菌核病和銹病異常嚴重，2014年絕收。盆栽條件下種植向日葵，分別接種3種生物肥料菌劑。試驗結果顯示，所有微生物菌劑都能夠提高向日葵的生物量(表1)。Y16菌劑生物量最高，比對照提高88.16％；DSM 8785菌劑低于Y16，比對照提高41.89％；DSM 1732菌劑生物量最低，比對照(不施用微生物菌劑)提高27.85％。表明Y16菌劑促進向日葵生長效果顯著。
表1盆栽條件下生物肥料對非鹽堿土壤向日葵生物量的影響
注：a、b、c、d表示處理組之間差異顯著。
2.在溫室條件下進行了Y16菌劑的接種試驗，試驗土壤來自于內(nèi)蒙烏拉特古前期，輕度鹽堿，連年種植向日葵，菌核病和銹病異常嚴重，2014年絕收。盆栽條件下向日葵分別接種5種生物肥料菌劑，分別是Y16、DSM19095、DSM40006、DSM10690和AS1.1216菌劑。試驗結果顯示，所有微生物菌劑都能夠提高向日葵的生物量，Y16菌劑生物量最高，比對照提高38.56％；菌劑19095、40006、10690和1.1216的向日葵生物量分別比對照提高21.41％、20.1％、18.14％和15.69％，所有菌劑的生物量都低于Y16菌劑。充分說明Y16菌劑促進向日葵生長的效果顯著，其生物量并不顯著低于非鹽堿土(表2)。
表2盆栽條件下生物肥料對輕度鹽堿土向日葵生物量的影響
注：a、b、c表示處理組之間差異顯著。
實施例3 Y16菌劑對田間向日葵的增產(chǎn)作用效果
1. 2015年在內(nèi)蒙古巴彥淖爾市進行了不同微生物菌劑防治菌核病、柄銹菌病害的試驗研究。田間試驗在內(nèi)蒙古烏拉特前旗進行，作物為向日葵，品種為LDS009。微生物菌劑使用量為50kg/畝，撒施播種壟行的地表，耕翻20cm，然后采用機械使用化肥和播種，同時覆蓋地膜，氮磷鉀復合肥(15:15:15)顆粒用量為60kg/畝。結果表明，整個生長期間向日葵沒有任何病害發(fā)生，既沒有菌核菌病害，也沒有柄銹菌病害發(fā)生。地衣芽孢桿菌Y16菌劑產(chǎn)量最高，畝產(chǎn)量226.6公斤，增產(chǎn)達33.33％；促生菌E-5-1(本實驗室分離)菌劑增產(chǎn)率略低于Y16，畝產(chǎn)量達到197.4公斤，增產(chǎn)16.2％；放線菌DSM40127菌劑畝產(chǎn)196.9公斤，增產(chǎn)達13.9％；DSM40033菌劑畝產(chǎn)向日葵籽粒183.0公斤，增產(chǎn)6.4％。表明地衣芽孢桿菌Y16菌劑具有提高產(chǎn)量、抑制病害的效果，展示了良好的應用潛力(表3)。
表3不同生物肥料對向日葵產(chǎn)量的影響(內(nèi)蒙古，2015)
注：a、b、c、d表示處理組之間差異顯著。
2.微生物菌劑田間試驗
試驗結果表明，除了試驗區(qū)內(nèi)沒有發(fā)生向日葵銹病和爛盤病害之外，菌株Y6接種向日葵的產(chǎn)量最高，畝產(chǎn)量達到310.2公斤，增產(chǎn)67.6％；菌株DSM40033畝產(chǎn)量達到278.9公斤，增產(chǎn)率50.7％％；菌株ACCC11079的畝產(chǎn)量為254.5公斤，增產(chǎn)率37.5％?？梢钥闯觯M管菌株ACCC1079和DSM40033增產(chǎn)效果明顯，但低于菌株Y16。Y16表現(xiàn)顯著的防病和增產(chǎn)作用(表4)。
表4不同菌株制備的生物菌劑對向日葵的作用效果(2015年)
注：a、b、c、d表示處理組之間差異顯著。
實施例4 Y16菌劑大棚西紅柿產(chǎn)量的作用效果
1.促生抗病生物肥料的西紅柿田間試驗效果
在化肥、有機肥大量使用條件下，對4種芽孢菌生物肥料不同用量的作用效果進行了研究。以J15(本實驗室分離，鑒定為嗜麥芽窄食單胞菌屬Stenotrophomonas sp.、JK24(本實驗室分離，鑒定為巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium)、JK8(本實驗室分離，鑒定為中間短波單胞菌Brevundimonas intermedia)三個菌株制備菌劑，與菌株Y16一起進行了田間試驗。以滅菌草炭為載體制備的生物肥料用量110kg/畝，氮磷鉀復合肥(15:15:15)用量83kg/畝，有機肥(雞糞)用量7t/畝。第一次收獲結果顯示，以生物肥料Y16、JK24、J15的西紅柿增產(chǎn)效果顯著，分別比對照增加483.2、349.5、308.4kg/畝，分別提高29.0％、21.0％、18.5％，Y16菌劑的作用效果最好(表5)。
表5不同生物肥料菌劑對西紅柿產(chǎn)量的影響(第1次收獲)
注：a、b、c表示處理組之間差異顯著，ab表示該處理組與a、b處理組間差異不顯著。
2.在化肥、有機肥大量使用條件下，對4種生物肥料的作用效果進行了研究。本實驗與表6為同一個試驗。第二次收獲產(chǎn)量結果顯示，大棚西紅柿接種生物肥料顯著增產(chǎn)，以生物肥料Y16、J15的西紅柿增產(chǎn)效果好，分別比對照增產(chǎn)1380.3kg/畝和741.6kg/畝，分別增產(chǎn)55.8％和30.0％，JK8菌劑僅增產(chǎn)212.9kg/畝。所有處理中，Y16菌劑的增產(chǎn)效果仍然最好(表6)。
表6不同生物肥料菌劑對西紅柿產(chǎn)量的影響(第2次收獲)
注：a、b、c、d表示處理組之間差異顯著，cd表示該處理組與c、d處理組間差異不顯著。
實施例5 Y16菌株平板抑制尖鐮孢菌的效果
為了驗證Y16拮抗病原真菌的能力，將尖鐮孢病原真菌(ACCC36241)接種在PDYA培養(yǎng)基平板中央，在病原菌周圍均勻劃分為4個點，其中3個點接種Y16菌，另一點不接種Y16，作為對照。結果顯示，接種Y16的3個點病原菌受到抑制，而不接種Y16的尖鐮孢菌菌落生長較快。證明Y16具有抑制尖鐮孢病原真菌生長的能力。(圖1)
本發(fā)明對拮抗向日葵菌核病和銹病、防治大棚蔬菜連作障礙的高效拮抗菌Y16及其微生物菌劑進行了多方面研究，該菌劑能夠防治向日葵菌核病和銹病、防治大棚蔬菜連作障礙，提高作物產(chǎn)量。開發(fā)的抗病增產(chǎn)的Y16微生物菌劑，展示出巨大的應用前景。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。