本發(fā)明涉及發(fā)酵
技術領域：
，具體的，涉及一種高活力毛霉曲的制備方法。
背景技術：
：在毛霉曲擁有豐富的酶系，在傳統(tǒng)發(fā)酵食品領域有著重要應用，主要利用其蛋白酶和脂肪酶來制備腐乳、豆豉、臘八豆等食品，這些食品都含有多種生理活性成分及保健功能，并且風味獨特，深受海內外人民的喜愛。釀造腐乳、豆豉等食品的質量與毛霉曲有著密切關系，然而，毛霉的生長條件要求高，在固-固傳代培養(yǎng)過程中容易產生自我降解和感染雜菌，群體中的某些個體的有關遺傳基因也很容易發(fā)生變異，導致毛霉曲的生產性能也會逐漸下降退化。因此，必須控制菌種的傳代次數(shù)和優(yōu)化傳代方式，并對生產菌種經常進行分離、純化和復壯，以此獲得較高活力的毛霉曲。目前各毛霉曲廠在毛霉曲的生產過程中主要采用傳統(tǒng)的固-固傳代方式，使得菌種衰退快，雜菌率較高，最終造成生產的毛霉曲活力低，性能不穩(wěn)定等情況。技術實現(xiàn)要素：為了解決上述傳統(tǒng)毛霉曲的生產過程中采用固-固傳代方式而使得菌種衰退快、雜菌率高，最終導致生產的毛霉曲活力低、性能不穩(wěn)定的技術問題，本發(fā)明提供一種高活力毛霉曲的制備方法，該高活力毛霉曲的制備方法有效結合了固態(tài)發(fā)酵和純液態(tài)發(fā)酵的特點，使得生產出的毛霉曲具有活力高、雜菌率低且性能穩(wěn)定的優(yōu)點。本發(fā)明提供了一種高活力毛霉曲的制備方法，包括以下步驟：步驟一、菌種的活化：制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基試管斜面，將原始毛霉菌株接種于所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂試管斜面，傳代活化；步驟二、一級菌種的制備：制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，挑取步驟一中已活化好的毛霉菌接種于所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，恒溫培養(yǎng)得一級菌種；步驟三、二級菌種的制備：制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂液體培養(yǎng)基，在無菌環(huán)境下取步驟二中所得的一級菌種接種于所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂液體培養(yǎng)基，恒溫搖床培養(yǎng)，得二級菌種；步驟四、三級菌種的制備：取馬鈴薯去皮切塊，加定量水熬制，過濾得濾液，向所得濾液中補水至原體積，混勻得馬鈴薯汁；取黃豆洗凈，加水浸泡，然后將黃豆取出，加定量水熬制，過濾得濾液，向所得濾液中補水至原體積，混勻得黃豆汁；將所得的馬鈴薯汁和所得的黃豆汁按比例加入發(fā)酵罐中，同時按發(fā)酵罐中所述馬鈴薯汁和所述黃豆汁的總質量加入1%~2%的糖類和0.5~1.0‰消泡劑，滅菌，冷卻備用；將步驟三中所得的二級菌種按比例接種于發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)得三級菌種；步驟五、成曲的制備：取定量麥麩，加水攪拌均勻后放置潤濕，滅菌，冷卻得麥麩培養(yǎng)基，將步驟四中所得的三級菌種接種于所述麥麩培養(yǎng)基中，混勻后置于發(fā)酵房中恒溫恒濕培養(yǎng)40~45小時后得成曲；步驟六、成曲烘干：將步驟五中所得成曲放入烘房，排濕烘干，冷卻即得成品毛霉曲。在本發(fā)明提供的高活力毛霉曲的制備方法的一種較佳實施例中，所述步驟一中原始毛霉菌株的傳代活化次數(shù)為2~3次。在本發(fā)明提供的高活力毛霉曲的制備方法的一種較佳實施例中，所述步驟四中加入的糖類為葡萄糖或者蔗糖。在本發(fā)明提供的高活力毛霉曲的制備方法的一種較佳實施例中，所述步驟四中加入的糖類為蔗糖。在本發(fā)明提供的高活力毛霉曲的制備方法的一種較佳實施例中，所述步驟四中加的消泡劑為大豆油或者棉籽油。在本發(fā)明提供的高活力毛霉曲的制備方法的一種較佳實施例中，所述步驟四中加的消泡劑為大豆油。在本發(fā)明提供的高活力毛霉曲的制備方法的一種較佳實施例中，所述步驟四中加入發(fā)酵罐中的所述馬鈴薯汁與所述黃豆汁的體積比為2~3:1。在本發(fā)明提供的高活力毛霉曲的制備方法的一種較佳實施例中，所述排濕烘干采用分段設置，第一階段為前12小時烘干溫度為40℃，第二階段為后18~24小時烘干溫度為45℃。相較于現(xiàn)有技術，本發(fā)明提供的高活力毛霉曲的制備方法具有以下有益效果：一、本發(fā)明提供的高活力毛霉曲的制備方法結合了固態(tài)發(fā)酵和純液態(tài)發(fā)酵，能有效抑制雜菌生長，使得生產出的毛霉曲具有活力高、雜菌率低且性能穩(wěn)定的優(yōu)點。二、成曲烘干溫度采用分段設置的方式，能有效控制烘干時間，使成曲烘干效果更好。具體實施方式下面將對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明所使用的原始毛霉菌株現(xiàn)保藏于中國工業(yè)微生物保藏中心湖南分中心，保藏號為HNCC8.005。實施例1步驟一、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PotatoDextroseAgar，PDA）培養(yǎng)基試管斜面及PDA平板的制備：選取新鮮無霉變的馬鈴薯，去皮后稱取200g，切成小塊，加水熬制40min后用8層紗布過濾得濾液，將濾液補水至1L，加入20g葡萄糖和20g瓊脂粉，攪拌均勻，置于滅菌鍋中115℃滅菌25min，分裝至已滅菌烘干的10支試管和10個平板中，冷卻后制得PDA試管斜面和PDA平板；步驟二、原始毛霉菌株的活化：將毛霉菌株從菌株庫中取出，復蘇并接種于PDA試管斜面，傳代培養(yǎng)2次；挑取已活化好的毛霉菌株接種于PDA平板，25℃恒溫培養(yǎng)36h得一級菌種；步驟三、二級菌種的制備：選取新鮮無霉變的馬鈴薯，去皮后稱取200g，切成小塊，加水熬制40min后用8層紗布過濾得濾液，將濾液補水至1L，加入20g葡萄糖，攪拌均勻，115℃高壓滅菌25min，然后分裝于兩個1L容量的三角瓶中，每瓶400ml，再115℃高壓滅菌15min，冷卻得PDA液體培養(yǎng)基；在無菌條件下，用接種環(huán)分別勾取一小束步驟二中所得的一級菌種接種于三角瓶中的PDA液體培養(yǎng)基，再將接種后的三角瓶置于恒溫搖床中25℃、120rpm/min培養(yǎng)36h，得二級菌種；步驟四、三級菌種的制備：選取新鮮無霉變的馬鈴薯，去皮后切小塊，稱取2.4kg土豆塊放入夾層鍋中，加入12L水熬制40min，過濾得濾液，向濾液中補水至12L，攪拌均勻得馬鈴薯汁；取1kg黃豆洗凈，加入6L水浸泡6h，將黃豆撈出放入夾層鍋中，再加入4L水熬制1h，過濾得濾液，向濾液中補水至4L，攪拌均勻得黃豆汁；按體積比馬鈴薯汁：黃豆汁=3:1的比例將所得的馬鈴薯汁和黃豆汁分別加入發(fā)酵罐中，同時按發(fā)酵罐中馬鈴薯汁和黃豆汁的總質量加入1%蔗糖和0.5‰的大豆油，121℃高壓滅菌20min，冷卻備用；通過無菌操作，按5%的接種量將二級菌種接種于冷卻后的發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵罐發(fā)酵條件為發(fā)酵罐攪拌轉速200r/min、罐壓0.8~1.2kg/cm2、通風量0.4（V/V?min）及溫度23~26℃，培養(yǎng)過程中檢測發(fā)酵罐培養(yǎng)液中菌絲體含量、培養(yǎng)液清涼度及氣味等參數(shù)變化，待培養(yǎng)至培養(yǎng)液由渾濁變得清澈透明，培養(yǎng)液中菌絲體含量不再增加并產生毛霉所特有的濃郁曲香味時，即得三級菌種；步驟五、成曲的制備：稱取160kg麥麩，加入88kg水，攪拌均勻，放置潤濕30min后置于121℃高壓滅菌35min，滅菌完成后將麥麩取出自然冷卻至40℃以下，得麥麩培養(yǎng)基；將步驟四中所得的三級菌種全部接種于麥麩培養(yǎng)基中，混勻后送入已消毒的發(fā)酵房中恒溫恒濕培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25℃、濕度75%，培養(yǎng)至曲顏色均勻一致、無雜色并產生毛霉曲特有的曲香味時，即得成曲；步驟六、成曲烘干：將步驟五中所得的成曲放入烘房中進行排濕烘干，排濕烘干溫度采用分段設置，第一階段為前12小時烘干溫度為40℃，第二階段為后18~24小時烘干溫度為45℃，待成曲水分含量降至8~10%時，取出冷卻即得毛霉曲成品。實施例2步驟一、PDA培養(yǎng)基試管斜面及PDA平板的制備：選取新鮮無霉變的馬鈴薯，去皮后稱取200g，切成小塊，加水熬制40min后用8層紗布過濾得濾液，將濾液補水至1L，加入20g葡萄糖和20g瓊脂粉，攪拌均勻，置于滅菌鍋中115℃滅菌25min，分裝至已滅菌烘干的10支試管和10個平板中，冷卻后制得PDA試管斜面和PDA平板；步驟二、原始毛霉菌株的活化：將毛霉菌株從菌株庫中取出，復蘇并接種于PDA試管斜面，傳代培養(yǎng)3次；挑取已活化好的毛霉菌株接種于PDA平板，25℃恒溫培養(yǎng)36h得一級菌種；步驟三、二級菌種的制備：選取新鮮無霉變的馬鈴薯，去皮后稱取200g，切成小塊，加水熬制40min后用8層紗布過濾得濾液，將濾液補水至1L，加入20g葡萄糖，攪拌均勻，115℃高壓滅菌25min，然后分裝于兩個1L容量的三角瓶中，每瓶400ml，再115℃高壓滅菌15min，冷卻得PDA液體培養(yǎng)基；在無菌條件下，用接種環(huán)分別勾取一小束步驟二中所得的一級菌種接種于三角瓶中的PDA液體培養(yǎng)基，再將接種后的三角瓶置于恒溫搖床中25℃、120rpm/min培養(yǎng)36h，得二級菌種；步驟四、三級菌種的制備：選取新鮮無霉變的馬鈴薯，去皮后切小塊，稱取2.4kg土豆塊放入夾層鍋中，加入12L水熬制50min，過濾得濾液，向濾液中補水至12L，攪拌均勻得馬鈴薯汁；取1.5kg黃豆洗凈，加入6L水浸泡7h，將黃豆撈出放入夾層鍋中，再加入6L水熬制1h，過濾得濾液，向濾液中補水至6L，攪拌均勻得黃豆汁；按體積比馬鈴薯汁：黃豆汁=2:1的比例將所得的馬鈴薯汁和黃豆汁分別加入發(fā)酵罐中，同時按發(fā)酵罐中馬鈴薯汁和黃豆汁的總質量加入1.5%蔗糖和0.7‰的大豆油，121℃高壓滅菌20min，冷卻備用；通過無菌操作，按5%的接種量將二級菌種接種于冷卻后的發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵罐發(fā)酵條件為發(fā)酵罐攪拌轉速200r/min、罐壓0.8~1.2kg/cm2、通風量0.4（V/V?min）及溫度23~26℃，培養(yǎng)過程中檢測發(fā)酵罐培養(yǎng)液中菌絲體含量、培養(yǎng)液清涼度及氣味等參數(shù)變化，待培養(yǎng)至培養(yǎng)液由渾濁變得清澈透明，培養(yǎng)液中菌絲體含量不再增加并產生毛霉所特有的濃郁曲香味時，即得三級菌種；步驟五、成曲的制備：稱取180kg麥麩，加入99kg水，攪拌均勻，放置潤濕30min后置于121℃高壓滅菌35min，滅菌完成后將麥麩取出自然冷卻至40℃以下，得麥麩培養(yǎng)基；將步驟四中所得的三級菌種全部接種于麥麩培養(yǎng)基中，混勻后送入已消毒的發(fā)酵房中恒溫恒濕培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25℃、濕度75%，培養(yǎng)至曲顏色均勻一致、無雜色并產生毛霉曲特有的曲香味時，即得成曲；步驟六、成曲烘干：將步驟五中所得的成曲放入烘房中進行排濕烘干，排濕烘干溫度采用分段設置，第一階段為前12小時烘干溫度為40℃，第二階段為后18~24小時烘干溫度為45℃，待成曲水分含量降至8~10%時，取出冷卻即得毛霉曲成品。實施例3步驟一、PDA培養(yǎng)基試管斜面及PDA平板的制備：選取新鮮無霉變的馬鈴薯，去皮后稱取200g，切成小塊，加水熬制40min后用8層紗布過濾得濾液，將濾液補水至1L，加入20g葡萄糖和20g瓊脂粉，攪拌均勻，置于滅菌鍋中115℃滅菌25min，分裝至已滅菌烘干的10支試管和10個平板中，冷卻后制得PDA試管斜面和PDA平板；步驟二、原始毛霉菌株的活化：將毛霉菌株從菌株庫中取出，復蘇并接種于PDA試管斜面，傳代培養(yǎng)3次；挑取已活化好的毛霉菌株接種于PDA平板，25℃恒溫培養(yǎng)36h得一級菌種；步驟三、二級菌種的制備：選取新鮮無霉變的馬鈴薯，去皮后稱取200g，切成小塊，加水熬制40min后用8層紗布過濾得濾液，將濾液補水至1L，加入20g葡萄糖，攪拌均勻，115℃高壓滅菌25min，然后分裝于兩個1L容量的三角瓶中，每瓶400ml，再115℃高壓滅菌15min，冷卻得PDA液體培養(yǎng)基；在無菌條件下，用接種環(huán)分別勾取一小束步驟二中所得的一級菌種接種于三角瓶中的PDA液體培養(yǎng)基，再將接種后的三角瓶置于恒溫搖床中25℃、120rpm/min培養(yǎng)36h，得二級菌種；步驟四、三級菌種的制備：選取新鮮無霉變的馬鈴薯，去皮后切小塊，稱取2.4kg土豆塊放入夾層鍋中，加入12L水熬制60min，過濾得濾液，向濾液中補水至12L，攪拌均勻得馬鈴薯汁；取1.5kg黃豆洗凈，加入6L水浸泡7h，將黃豆撈出放入夾層鍋中，再加入6L水熬制1.5h，過濾得濾液，向濾液中補水至6L，攪拌均勻得黃豆汁；按體積比馬鈴薯汁：黃豆汁=2:1的比例將所得的馬鈴薯汁和黃豆汁分別加入發(fā)酵罐中，同時按發(fā)酵罐中馬鈴薯汁和黃豆汁的總質量加入2%蔗糖和1‰的大豆油，121℃高壓滅菌20min，冷卻備用；通過無菌操作，按5%的接種量將二級菌種接種于冷卻后的發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵罐發(fā)酵條件為發(fā)酵罐攪拌轉速200r/min、罐壓0.8~1.2kg/cm2、通風量0.4（V/V?min）及溫度23~26℃，培養(yǎng)過程中檢測發(fā)酵罐培養(yǎng)液中菌絲體含量、培養(yǎng)液清涼度及氣味等參數(shù)變化，待培養(yǎng)至培養(yǎng)液由渾濁變得清澈透明，培養(yǎng)液中菌絲體含量不再增加并產生毛霉所特有的濃郁曲香味時，即得三級菌種；步驟五、成曲的制備：稱取180kg麥麩，加入99kg水，攪拌均勻，放置潤濕30min后置于121℃高壓滅菌35min，滅菌完成后將麥麩取出自然冷卻至40℃以下，得麥麩培養(yǎng)基；將步驟四中所得的三級菌種全部接種于麥麩培養(yǎng)基中，混勻后送入已消毒的發(fā)酵房中恒溫恒濕培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25℃、濕度75%，培養(yǎng)至曲顏色均勻一致、無雜色并產生毛霉曲特有的曲香味時，即得成曲；步驟六、成曲烘干：將步驟五中所得的成曲放入烘房中進行排濕烘干，排濕烘干溫度采用分段設置，第一階段為前12小時烘干溫度為40℃，第二階段為后18~24小時烘干溫度為45℃，待成曲水分含量降至8~10%時，取出冷卻即得毛霉曲成品。設對照試驗，以傳統(tǒng)工藝制得的毛霉曲為A組，以實施例1、實施例2及實施例3制得的毛霉曲分別為B組、C組及D組，采用福林酚法分別對A組、B組、C組及D組測定總酶活力，每組設置5次重復實驗，實驗結果取平均值。酶活定義為：在40℃，pH7.5條件下，1min內水解酪蛋白產生1μg酪氨酸所需的酶量為1個蛋白酶活力單位。實驗結果如下表所示：A組B組C組D組總蛋白酶活力（U/g干曲）971.31109.31140.11135.6從表中可以看出，采用本發(fā)明提供的高活力毛霉曲的制備方法制備的毛霉曲與傳統(tǒng)工藝制備的毛霉曲相比，總蛋白酶活力有了大幅度提升，且質量穩(wěn)定。本發(fā)明提供的高活力毛霉曲的制備方法具有以下有益效果：一、本發(fā)明提供的高活力毛霉曲的制備方法結合了固態(tài)發(fā)酵和純液態(tài)發(fā)酵，能有效抑制雜菌生長，使得生產出的毛霉曲具有活力高、雜菌率低且性能穩(wěn)定的優(yōu)點。二、成曲烘干溫度采用分段設置的方式，能有效控制烘干時間，使成曲烘干效果更好。以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其它相關的
技術領域：
，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內。當前第1頁1 2 3