本發(fā)明涉及屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)耐熱蛋白酶及蟲草素的蛹蟲草菌株篩選及誘變方法。
背景技術(shù)：
蛹蟲草[Cordyceps militaris (L.) Link]，又名北冬蟲夏草，現(xiàn)代科學(xué)研究表明，蛹蟲草具有豐富的活性物質(zhì)，如蟲草多糖、蟲草素、蟲草酸，氨基酸，蛋白酶等，具有抗腫瘤、抗氧化和衰老、抗炎抗菌、抗疲勞、抑制病毒生長、增強(qiáng)免疫力等多種藥理作用和滋補(bǔ)功能，是具有開發(fā)潛力的一大藥用寶典。在蛹蟲草的活性成分中，蟲草素（cordycepin），是蛹蟲草中（尤其是核苷類）主要活性成分，是第一個(gè)被分離出的核苷類抗生素。蟲草素具有多種生物活性，有抗菌、降血脂、減肥、抗腫瘤和抗癌等作用。蛹蟲草是主要產(chǎn)蟲草素的菌株，但其子實(shí)體生長周期長，產(chǎn)量低，蟲草素的含量也比較低，從子實(shí)體中提取蟲草素成本極高，價(jià)格昂貴，很難滿足臨床的廣泛使用。
另一方面，當(dāng)前，畜牧行業(yè)飼料資源緊張、成本上漲，食品安全問題頻發(fā)，環(huán)境污染日益嚴(yán)重，酶制劑作為一種綠色、安全、無污染的添加劑呈現(xiàn)出越來越明顯的價(jià)值與作用。近年來，蛋白酶在飼料中廣泛添加，對動(dòng)物生產(chǎn)性能、養(yǎng)分消化率以及腸道健康有積極作用。向飼料中添加蛋白酶，可以對飼料中的一些抗?fàn)I養(yǎng)因子以及難以被動(dòng)物消化吸收的如來源于豆粕、菜粕、棉籽粕、玉米、小麥、魚粉、肉骨粉、羽毛粉和血粉等的蛋白質(zhì)有強(qiáng)的降解作用，消除抗?fàn)I養(yǎng)因子的負(fù)面作用，提高蛋白飼料的利用價(jià)值。因此選育能夠產(chǎn)生蛋白酶的菌株對開發(fā)蟲草飼料具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對上述問題，本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)耐熱蛋白酶及蟲草素的蛹蟲草菌株篩選及誘變方法，其目的在于：通過菌株的兩種誘變一輪篩選的誘變方案，使得誘變菌株菌絲生長速度較快且發(fā)酵后生物量增加，遺傳性狀穩(wěn)定。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案：
一種高產(chǎn)耐熱蛋白酶及高產(chǎn)蟲草素的蛹蟲草菌株(Cordyceps militaris) HYCM12，已于2016年11月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC（地址為：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編100101），保藏編號：CGMCC No. 13179。
一、本發(fā)明所述的蛹蟲草菌株(Cordyceps militaris)的篩選方法，包括以下步驟：
步驟一 蛹蟲草(Cordyceps militaris)菌種的分離篩選：
（1）菌株的分離篩選
2015年8月在山東省沂南縣沂蒙山采集野生蛹蟲草，采集地為土質(zhì)疏松、腐殖質(zhì)豐富的樹林中，環(huán)境溫度20~28℃，空氣濕度為70~80%。總共采集到9株野生蟲草菌株，將蟲草從圖層中慢慢剝離，清水反復(fù)沖洗蟲草表面，直到處理干凈為止。再用無菌濾紙吸干蟲草表面水分。再用75%的乙醇或0.1升汞對表面消毒，再次無菌水沖洗。然后，從蛹蟲草子座中小心切出一小塊，置于蟲草活化固體培養(yǎng)基上，22~26℃下靜置培養(yǎng)。待菌絲長出后，每天觀察。選擇無雜菌污染的菌絲進(jìn)一步轉(zhuǎn)接到新的PDA斜面培養(yǎng)基。將得到的所有菌株分別接到蛋白酶篩選固體培養(yǎng)基上，24~28℃靜置培養(yǎng)3~4天，產(chǎn)看菌落周圍是否有水解圈。最后得到產(chǎn)生水解圈的純化蛹蟲草菌株共5株。
蟲草活化固體培養(yǎng)基：蔗糖10~20g，蛋白胨2~5g，酵母粉1~2g，20%的馬鈴薯浸提液1000ml，瓊脂粉15g，pH6.0~7.0，121℃滅菌20min。
蛋白酶篩選固體培養(yǎng)基：20%馬鈴薯浸提液200ml，干酪素5~15g，蔗糖10~20g，KH2P04 1~2g，MgS04?7H20 0.5~1g，瓊脂粉15g，pH6.5，補(bǔ)充去離子水至1000ml，121℃滅菌20min。
20%的馬鈴薯浸提液的制備方法：去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水800ml，大火煮沸后改為小火，繼續(xù)煮30min，中間添加去離子水并攪拌，防止鍋底焦糊，冷卻后，過濾，收集濾液，添加去離子水至1000ml，即得到20%的馬鈴薯浸提液。
（2）出草試驗(yàn)：
將分離篩選獲得的5株菌株，進(jìn)行出草試驗(yàn)，檢驗(yàn)菌株是否具有出草能力。接種入裝有40~50g大米、80~120ml營養(yǎng)液的罐頭瓶中。將接種好的罐頭瓶置于人工氣候箱中培養(yǎng)。23~26℃下先進(jìn)行暗培養(yǎng)7～15天，待菌絲長滿培養(yǎng)基后，在罐頭瓶封口膜上打通通氣孔并轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度調(diào)整為16~22℃，光照強(qiáng)度為，300～500Lux，空氣相對濕度60～80％，培養(yǎng)40～60天，子待子實(shí)體不再生長，表面形成粒狀子囊殼、即子座成熟。采收并檢測子實(shí)體產(chǎn)量和成分。得到一株蟲草產(chǎn)量較高的菌株XZCM6，子實(shí)體產(chǎn)量平均鮮重51.6g/瓶。40℃烘干后，每瓶的平均干重9.81g/瓶，生物轉(zhuǎn)化率為103.2%。蟲草素含量達(dá)到2.157mg/g。
營養(yǎng)液配方為葡萄糖8~15g，蛋白胨5~7g，KH2P04 2~3g，酵母膏1~2g，MgS04 0.5~1 g，VBl 5~10mg，20％馬鈴薯浸汁100ml，蠶蛹粉2~8 g，pH5～7，補(bǔ)充自來水至1000 mL。
步驟二、本發(fā)明產(chǎn)耐熱蛋白酶及蟲草素的菌株HYCM12誘變方法如下：
（1）菌株活化培養(yǎng)
將上述步驟二中分離得到的野生菌株XZCM6轉(zhuǎn)接到PDA固體斜面培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，25~28℃恒溫靜置培養(yǎng)4～5天，按照如上方法菌株活化2次。
（2）菌株菌絲體制備
從活化好的菌絲固體平板培養(yǎng)基上取1cm2菌絲塊接種到裝有40 mL PDA菌絲培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，24~28℃，160~200 r/min進(jìn)行恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)3~7天。
菌絲液體培養(yǎng)基配方：葡萄糖20~30g、蛋白胨5~8g、20%馬鈴薯浸出液200ml，(NH4)2S04 3~5g、KH2P04 1~2g、MgS04?7H20 1~2g、酵母粉4~6g，加水定容至lL，pH 6.5~7.0，121℃滅菌20min。
(3) 原生質(zhì)體制備
將MgS04?7H20、甘露醇溶解于雙蒸水中并配制成濃度為0.6 mol/L的滲透壓穩(wěn)定劑溶液，高壓滅菌后備用。以0.6mol/L的滲透壓穩(wěn)定劑配制濃度分別為0.5~0.6%和0.8~1.2%(W/V)的蝸牛酶及纖維素酶溶液，并用0.22nm微孔濾膜過濾，按照2:1的體積比混合備用。用滲透壓穩(wěn)定溶液將無菌濾紙過濾后的菌絲體洗滌3次。按照每100mg制備好的濕菌絲對應(yīng)加入1~1.5mL混合酶液的比例，向菌絲體中加入酶液并置于25~28℃搖床上50r/min緩緩震蕩孵育3~6h。酶解后用無菌棉花柱過濾除去菌絲，濾液3000~4000r/min離心5~8min，溫和地沉淀原生質(zhì)體，棄去上清，將原生質(zhì)體懸于滲透壓穩(wěn)定劑中并適當(dāng)稀釋備用。
（4）原生質(zhì)體亞硝基胍（NTG）與紫外線復(fù)合誘變
用丙酮試劑將亞硝基胍溶液配制成終濃度為1~2 mg/mL。取1 mL NTG處理液與稀釋成一定濃度的1 mL原生質(zhì)體懸液混合，于旋轉(zhuǎn)式搖床，轉(zhuǎn)速50~80r/min，26℃處理10~60min后，將處理液3000~4000r/min離心5~10min，棄去上清，用pH6.5，0.1 mol/L的無菌磷酸緩沖液洗滌菌體2~3次，終止反應(yīng)。然后將洗滌后的原生質(zhì)體稀釋后取懸浮液4mL在30W紫外燈下，照射距離30cm條件下，緩緩磁力攪拌下照射20s~60s，接著原生質(zhì)體再生培養(yǎng)。
（5）原生質(zhì)體再生培養(yǎng)
經(jīng)亞硝基胍和紫外線誘變后的原生質(zhì)體系列稀釋后，吸取150~200μL涂布于再生固體培養(yǎng)基平板做再生培養(yǎng)。
原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基配方為：20%的馬鈴薯浸提液200ml，葡萄糖20~30g，蛋白胨4~8g，酵母粉4~6g，KH2P04 1~2g，MgS04?7H20 0.5~1g，瓊脂粉15g，維生素B1 0.02g，補(bǔ)充去離子水至1000 mL，pH6.5~7.0，121℃滅菌20min；培養(yǎng)條件為：25~28℃避光恒溫培養(yǎng)5~8天。將生長較快的菌落再次接到新的再生培養(yǎng)基上，相同條件下培養(yǎng)，得到第一代誘變菌株。按照以上條件培養(yǎng)三次，得到第三代誘變菌株。將獲得的第三代菌株接到蛋白酶篩選固體培養(yǎng)基上，25~28℃，培養(yǎng)3~7天，挑選水解圈大菌株保藏，進(jìn)一步復(fù)篩。
蛋白酶篩選固體培養(yǎng)基配方：20%馬鈴薯浸提液200ml，干酪素5~15g，蔗糖10~20g，KH2P04 1~2g，MgS04?7H20 0.5~1g，瓊脂粉15g，pH6.5，補(bǔ)充去離子水至1000ml，121℃滅菌20min。培養(yǎng)基滅菌后充分搖勻，隨著搖動(dòng)，在60~70℃下倒入平板中。
（6）發(fā)酵復(fù)篩培養(yǎng)
將在蛋白酶固態(tài)篩選培養(yǎng)基上水解圈大的菌株分別接種到裝有30~50mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，24~28℃，160~200r/min搖床震蕩培養(yǎng)3~6天。
液體種子培養(yǎng)基配方：20%的馬鈴薯浸提液200ml，葡萄糖20~30g，蛋白胨4~8g，酵母粉4~6g，KH2P04 1~2g，MgS04?7H20 0.5~1g，補(bǔ)充去離子水至1000 mL，pH6.5~7.0，121℃滅菌20min。然后按照6~10%的接種量以上培養(yǎng)好的種子液到裝有100~200ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基的1000ml三角瓶中。過濾，測定發(fā)酵液中蟲草素含量及蛋白酶活力。通過篩選得到一株蟲草素含量和蛋白酶活力較高的菌株，命名為HYCM12。將該菌株保藏備用。
液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方：可溶性淀粉20~30g、葡萄糖10~20g、大豆蛋白胨10~15、硫酸銨5~8g、酵母提取物5~8g、KH2P04 1~2g、MgS04?7H20 0.5~1g、ZnS04?7H20 0.05~0.1 g、FeS04?7H20 0.02~0.05g、VB1 0.1~0.5g，加水定容至1L，pH 6.5~7.0，121℃溫度下滅菌20min，23~26℃ 160~180r/min震蕩培養(yǎng)4~8天。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
1）本發(fā)明在篩選蛹蟲草野生菌株時(shí)，使用了蛋白酶固態(tài)篩選平板，可以根據(jù)水解圈情況篩選到能夠高產(chǎn)蛋白酶的菌株，水解圈清晰可見，成本低，篩選效率高。
2）本發(fā)明采用了兩種誘變一輪篩選的誘變方案，兩次誘變是對原生質(zhì)體進(jìn)行的亞硝基胍-紫外線復(fù)合誘變，原生質(zhì)體輻射誘變技術(shù)是一種行之有效的微生物育種新方法，原生質(zhì)體對輻射敏感性更強(qiáng)，更容易獲得優(yōu)良性狀的菌株，誘變后進(jìn)行了一次篩選。誘變效率高的前提下，而篩選過程只有一次，大大減少了工作量。
3）本發(fā)明得到的誘變菌株菌絲生長速度較快且發(fā)酵后生物量增加，遺傳性狀穩(wěn)定。
4）經(jīng)過誘變后，獲得的高產(chǎn)菌株蛹蟲草蟲草素及耐熱蛋白酶含量大幅度提高；誘變菌株發(fā)酵液中蟲草素含量與原始出發(fā)菌株相比均有顯著提高，其中，發(fā)酵液上清中蟲草素含量為2.89g/L，為出發(fā)原始菌株的4.5倍；耐熱蛋白酶含量為5326U/ml,是野生菌株的3.4倍。誘變效果明顯。
5）誘變獲得的高產(chǎn)菌株經(jīng)過10次以上的連續(xù)傳代培養(yǎng)，每代液體發(fā)酵培養(yǎng)，均測定有蟲草素及耐熱蛋白酶含量。誘變菌株性狀穩(wěn)定，活性成分產(chǎn)量不退化，具較好的遺傳穩(wěn)定性；
6）本發(fā)明獲得的誘變菌株可以以廉價(jià)的農(nóng)副產(chǎn)品作為培養(yǎng)基，能夠大幅度降低培養(yǎng)基成本；液體發(fā)酵時(shí)間周期縮短，發(fā)酵條件更易于發(fā)酵控制，解決了固體發(fā)酵培養(yǎng)勞動(dòng)強(qiáng)度大、發(fā)酵周期長的缺點(diǎn)，具備優(yōu)異的工業(yè)化生產(chǎn)前景。
具體實(shí)施方式
下面通過實(shí)施例來對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
1、菌株的分離篩選
2015年8月在山東省沂南縣沂蒙山采集野生蛹蟲草，采集地為土質(zhì)疏松、腐殖質(zhì)豐富的樹林中，環(huán)境溫度20~28℃，空氣濕度為70~80%?？偣膊杉?株野生蟲草菌株，將蟲草從圖層中慢慢剝離，清水反復(fù)沖洗蟲草表面，直到處理干凈為止。再用無菌濾紙吸干蟲草表面水分。再用75%的乙醇或0.1升汞對表面消毒，再次無菌水沖洗。然后，從蛹蟲草子座中小心切出一小塊，置于蟲草活化固體培養(yǎng)基上，22~26℃下靜置培養(yǎng)。待菌絲長出后，每天觀察。選擇無雜菌污染的菌絲進(jìn)一步轉(zhuǎn)接到新的PDA斜面培養(yǎng)基。將得到的所有菌株分別接到蛋白酶篩選固體培養(yǎng)基上，24~28℃靜置培養(yǎng)3~4天，產(chǎn)看菌落周圍是否有水解圈。最后得到產(chǎn)生水解圈的純化蛹蟲草菌株共5株。
蟲草活化固體培養(yǎng)基：蔗糖10~20g，蛋白胨2~5g，酵母粉1~2g，20%的馬鈴薯浸提液1000ml，瓊脂粉15g，pH6.0~7.0，121℃滅菌20min。
蛋白酶篩選固體培養(yǎng)基：20%馬鈴薯浸提液200ml，干酪素5~15g，蔗糖10~20g，KH2P04 1~2g，MgS04?7H20 0.5~1g，瓊脂粉15g，pH6.5，補(bǔ)充去離子水至1000ml，121℃滅菌20min。
20%的馬鈴薯浸提液的制備方法：去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水800ml，大火煮沸后改為小火，繼續(xù)煮30min，中間添加去離子水并攪拌，防止鍋底焦糊，冷卻后，過濾，收集濾液，添加去離子水至1000ml。
、出草試驗(yàn)：
將分離篩選獲得的5株菌株，進(jìn)行出草試驗(yàn)，檢驗(yàn)菌株是否具有出草能力。接種入裝有40~50g大米、80~120ml營養(yǎng)液的罐頭瓶中。將接種好的罐頭瓶置于人工氣候箱中培養(yǎng)。23~26℃下先進(jìn)行暗培養(yǎng)7～15天，待菌絲長滿培養(yǎng)基后，在罐頭瓶封口膜上打通通氣孔并轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度調(diào)整為16~22℃，光照強(qiáng)度為，300～500Lux，空氣相對濕度60～80％，培養(yǎng)40～60天，子待子實(shí)體不再生長，表面形成粒狀子囊殼、即子座成熟。采收并檢測子實(shí)體產(chǎn)量和成分。得到一株蟲草產(chǎn)量較高的菌株XZCM6，子實(shí)體產(chǎn)量平均鮮重51.6g/瓶。40℃烘干后，每瓶的平均干重9.81g/瓶，生物轉(zhuǎn)化率為103.2%。蟲草素含量達(dá)到2.157mg/g。
營養(yǎng)液配方為：葡萄糖8~15g，蛋白胨5~7g，KH2P04 2~3g，酵母膏1~2g，MgS04 0.5~1 g，VBl 5~10mg，20％馬鈴薯浸汁100ml，蠶蛹粉2~8 g，pH5～7，補(bǔ)充自來水至1000 mL。
、菌株鑒定
菌株XZCM6形態(tài)特征鑒定：菌株的特征如下：
形態(tài)特征： 在黑暗條件下PDA培養(yǎng)基上24~26℃培養(yǎng)6~8天 后，整個(gè)菌落呈純白色的絨毛狀、菌落直徑為17~32mm，菌絲生長旺盛、粗壯、菌絲致密，有光澤。顯微鏡下觀察，菌絲細(xì)胞多核、菌絲體頂端形成分生孢子梗，孢子梗頂端不膨大，無分枝，分生孢子以鏈狀方式著生。孢子呈橢圓狀。整體形狀與蛹草擬青霉極為相似，初步鑒定該菌株無性型為擬青霉屬(Paecilomyces militaris)的一個(gè)種。
在栽培大米培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌絲長滿后，將栽培瓶移入出草室內(nèi)，在薄膜中央扎4～6個(gè)孔，保持相對濕度60%～90%和足夠的散射光，5～7天后培養(yǎng)料表面或四周有桔黃色色素形成，進(jìn)一步光照培養(yǎng)后，長出子實(shí)體，子實(shí)體橘黃色，柄粗壯，頭部膨大呈球形，出草整齊均勻，出草率高。子實(shí)體高1~4cm、直徑5~7mm。
菌株XZCM6的分子鑒定：
提取菌株XZCM6基因組，依據(jù)真菌ITS序列中最保守的序列設(shè)計(jì)引物，引物如下：ITS 1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS 4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。引物由上海英俊生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系為(20 μL): ddH2O 12.7 μL，，10×PCR buffer 2.0 μL，dNTP mix (2.5 mmol/L) 2.0 μL，正向引物(10 μmol/L) 1.0 μL，反向引物(10 μmol/L) 1.0 μL，TaqFlexiPolymerase (5 U/μL) 0.3 μL， 模板 1.0 μL。熱循環(huán)參數(shù)94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，56℃退火60s，72℃延伸2min，循環(huán)30次，72℃延伸10min。用pGM-T載體克隆測序。測得序列與從NCBI中比對獲得的相近菌株的ITS序列采用ClustalX1.83進(jìn)行多序列比對。
其測定結(jié)果如下：
1 AAGTAAAAGT CGTAACAAGG TCTCCGTTGG TGAACCAGCG GAGGGATCAT TAACGAGTTT
61 TCCAACTCCC AACCCTTTGT GAACATACCT ATCGTTGCTT CGGCGGACTC GCCCAGCGCC
121 TGGACGCGGG CCTGGGCGGC GGCCGTCGGG GGCCCCAAAC ACTGTATCTA CCAGTTTTTC
181 TGAATCCGCC GCAAGGCAAA ACAAATGAAT CAAAACTTTC AACAACGGAT CTCTTGGCTC
241 TGGCATCGAT GAAGAACGCA GCGAACTGCG ATAAGTAATG TGAATTGCAG AATTCAGTGA
301 ATCATCGAAT CTTTGAACGC ACATTGCGCC CGCCAGCATT CTGGCGGGCA TGCCTGTTCG
361 AGCGTCATTT CAACCCTCGA CGTCCCATGG GGGATGTCGG CGTTGGGGAC CGGCAGCACA
421 CCGCCGCCCC CGAAATGAAG TGGCGGCCCG TCCGCGGCGA CCTCTGCGTA GTACTCCAAC
481 TCGCACCGGG AACCCGACGT GGCCACGCCG TAAAACGCCC AACTCTGAAC GTTGACCTCG
541 GATCAGGTAG GAATACCCGC TGAACTTAAG CATAT
對所測ITS序列與GenBank中的ITS序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明菌株XZCM6的ITS基因序列與序列數(shù)據(jù)庫中所有Cordyceps militaris系列菌株的序列相似度均達(dá)到了99.2％。根據(jù)ITS序列鑒定特點(diǎn)，序列相似性>99％時(shí)，可判斷為相同種。結(jié)合前面的菌絲結(jié)構(gòu)及分生孢子的產(chǎn)孢類型和栽培特性，可以確定所測菌株XZCM6是蛹蟲草（Cordyceps militaris）。
、蛹蟲草菌株的復(fù)合誘變和選育方法
（1）菌株活化培養(yǎng)
將上述分離得到的野生菌株XZCM6轉(zhuǎn)接到PDA固體斜面培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，25~28℃恒溫靜置培養(yǎng)4～5天。按照如上方法菌株活化2次。
（2）菌株菌絲體制備
從活化好的菌絲固體平板培養(yǎng)基上取1cm2菌絲塊接種到裝有40 mL PDA菌絲培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，24~28℃，160~200 r/min進(jìn)行恒溫震蕩培養(yǎng)3~7天。菌絲液體培養(yǎng)基配方：葡萄糖20~30g、蛋白胨5~8g、20%馬鈴薯浸出液200ml，(NH4)2S04 3~5g、KH2P04 1~2g、MgS04?7H20 1~2g、酵母粉4~6g，加水定容至lL，pH 6.5~7.0，121℃滅菌20min。
(3) 原生質(zhì)體制備
將MgS04?7H20、甘露醇溶解于雙蒸水中并配制成濃度為0.6 mol/L的滲透壓穩(wěn)定劑溶液，高壓滅菌后備用。以0.6mol/L的滲透壓穩(wěn)定劑配制濃度分別為0.5~0.6%和0.8~1.2%(W/V)的蝸牛酶及纖維素酶溶液，并用0.22nm微孔濾膜過濾，按照2:1的體積比混合備用。用滲透壓穩(wěn)定溶液將無菌濾紙過濾后的菌絲體洗滌3次。按照每100mg制備好的濕菌絲對應(yīng)加入1~1.5mL混合酶液的比例，向菌絲體中加入酶液并置于25~28℃搖床上50r/min緩緩震蕩孵育3~6h。酶解后用無菌棉花柱過濾除去菌絲，濾液3000~4000r/min離心5~8min，溫和地沉淀原生質(zhì)體，棄去上清，將原生質(zhì)體懸于滲透壓穩(wěn)定劑中并適當(dāng)稀釋備用。
（4）原生質(zhì)體亞硝基胍（NTG）與紫外線復(fù)合誘變
用丙酮試劑將亞硝基胍溶液配制成終濃度為1~2 mg/mL。取1 mL NTG處理液與稀釋成一定濃度的1 mL原生質(zhì)體懸液混合，于旋轉(zhuǎn)式搖床，轉(zhuǎn)速50~80r/min，26℃處理10~60min后，將處理液3000~4000r/min離心5~10min，棄去上清，用pH6.5，0.1M的無菌磷酸緩沖液洗滌菌體2~3次，終止反應(yīng)。然后將洗滌后的原生質(zhì)體稀釋后取懸浮液4mL在30W紫外燈下，照射距離30cm條件下，緩緩磁力攪拌下照射20s~60s。接著原生質(zhì)體再生培養(yǎng)。
（5）原生質(zhì)體再生培養(yǎng)
經(jīng)亞硝基胍和紫外線誘變后的原生質(zhì)體系列稀釋后，吸取150~200μL涂布于再生固體培養(yǎng)基平板做再生培養(yǎng)。原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基配方為：20%的馬鈴薯浸提液200ml，葡萄糖20~30g，蛋白胨4~8g，酵母粉4~6g，KH2P04 1~2g，MgS04?7H20 0.5~1g，瓊脂粉15g，維生素B1 0.02g，補(bǔ)充去離子水至1000 mL，pH6.5~7.0，121℃滅菌20min；培養(yǎng)條件為：25~28℃避光恒溫培養(yǎng)5~8天。將生長較快的菌落再次接到新的再生培養(yǎng)基上，相同條件下培養(yǎng)，得到第一代誘變菌株。按照以上條件培養(yǎng)三次，得到第三代誘變菌株。將獲得的第三代菌株接到蛋白酶篩選固體培養(yǎng)基上，25~28℃，培養(yǎng)3~7天，挑選水解圈大菌株保藏，進(jìn)一步復(fù)篩。蛋白酶篩選固體培養(yǎng)基配方：20%馬鈴薯浸提液200ml，干酪素5~15g，蔗糖10~20g，KH2P04 1~2g，MgS04?7H20 0.5~1g，瓊脂粉15g，pH6.5，補(bǔ)充去離子水至1000ml，121℃滅菌20min。培養(yǎng)基滅菌后充分搖勻，隨著搖動(dòng)，在60~70℃下倒入平板中。
（6）發(fā)酵復(fù)篩培養(yǎng)
將在蛋白酶固態(tài)篩選培養(yǎng)基上水解圈大的菌株分別接種到裝有30~50mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，24~28℃ 160~200r/min震蕩培養(yǎng)3~6天。液體種子培養(yǎng)基配方：20%的馬鈴薯浸提液200ml，葡萄糖20~30g，蛋白胨4~8g，酵母粉4~6g，KH2P04 1~2g，MgS04?7H20 0.5~1g，補(bǔ)充去離子水至1000 mL，pH6.5~7.0，121℃滅菌20min。然后按照6~10%的接種量以上培養(yǎng)好的種子液到裝有100~200ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基的1000ml三角瓶中。溫度為26～32℃，搖床轉(zhuǎn)速調(diào)整為180～210 r/min，發(fā)酵3~5天。過濾，測定發(fā)酵液中蟲草素含量及蛋白酶活力。通過篩選得到一株蟲草素含量和蛋白酶活力較高的菌株，命名為HYCM12，將該菌株保藏備用。該菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，蟲草素含量達(dá)到最大值2.89g/L。其產(chǎn)耐熱性蛋白酶活力達(dá)到5326U/ml。蟲草素含量為誘變前野生菌株產(chǎn)量的4.5倍，耐熱蛋白酶活力是野生菌株的3.4倍。誘變效果明顯。
液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方：可溶性淀粉20~30g、葡萄糖10~20g、大豆蛋白胨10~15、硫酸銨5~8g、酵母提取物5~8g、KH2P04 1~2g、MgS04?7H20 0.5~1g、ZnS04?7H20 0.05~0.1 g、FeS04?7H20 0.02~0.05g、VB1 0.1~0.5g，加水定容至1L，pH 6.5~7.0，121℃滅菌20min），23~26℃ 160~180r/min震蕩培養(yǎng)4~8天。
（7）菌株遺傳穩(wěn)定性測定
以上復(fù)篩后將產(chǎn)量較高的HYCM12菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性考察。連傳10代，每代均先接入種子液，每株菌每代培養(yǎng)3個(gè)液體搖瓶，以種子液按照6-10%的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，23-26℃，發(fā)酵4-8d。發(fā)酵結(jié)束，菌株顯示穩(wěn)定的發(fā)酵性能。將誘變菌株HYCM12保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 13179。
綜上，本發(fā)明達(dá)到預(yù)期目的。