專利名稱：一種改良的米黑根毛霉脂肪酶基因及其在酵母展示中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種能在畢赤巴斯德酵母中高效表達米黑根毛霉脂肪酶的脂肪酶基因序列 和展示有高活力脂肪酶的酵母菌，以及從該重組酵母中得到的基因工程脂肪酶。
背景技術：
脂肪酶(LipaseEC3丄1.3)即三?；视王；饷?，它催化天然底物油脂水解生成脂 肪酸、甘油和甘油單酯或二酯，廣泛應用于油脂加工、食品、醫(yī)藥、日化等工業(yè)，是重要 的工業(yè)酶制劑之一，其催化活性僅僅取決于它的蛋白質結構，因而不同來源的脂肪酶具有 不同的催化特性和催化活力。
米黑根毛霉(i /^o/m/cor /m'e/^')脂肪酶(RML)的工業(yè)應用較廣泛。Brady等人已將該酶 的高級結構闡述清楚，表明其具有優(yōu)良的Sn-l立體特異性，對中長鏈脂肪酸酯較適合，可 用于制造人造黃油和具有不同熔點且不含各式脂肪酸的三甘酯以及一些"重構脂"。天然的 米黑根毛霉脂肪酶產量低下、成分不穩(wěn)定，存在較大的缺陷，使得其應用成本偏高和應用 受到限制。目前，米黑根毛霉脂肪酶的酶學性質研究較深入，如Zacharis等以米黑根毛霉 脂肪酶的轉酯化和酯化反應為模型，針對特定的反應底物、反應介質、酶催化劑，選擇合 適的水合鹽對調控水活度，提高了非水相催化效率。但就如何提高米黑根毛霉脂肪酶產量 和獲得高酶活，國內外鮮有報道，利用傳統(tǒng)發(fā)酵條件優(yōu)化顯著提高RML酶活力已經是無能 為力。
酵母表面展示系統(tǒng)是繼噬菌體展示技術創(chuàng)立后發(fā)展起來的真核展示系統(tǒng)，酵母的蛋白 質折疊和分泌機制與哺乳動物細胞非常相似，對人的蛋白質表達和展示更具優(yōu)越性。在酵 母細胞表面展示的酶，可直接進行活性分析，，避免了在大腸桿菌表達時的復雜純化步驟。 表面展示有酶的酵母，經簡單的離心富集后可作為全細胞催化劑，直接應用于催化反應， 具有固定化酶的優(yōu)點，并且能實現酶的反復利用，大大降低了成本，有利于工業(yè)化生產。 人們早期開發(fā)的是釀酒酵母表面展示系統(tǒng)，而畢赤酵母表面展示系統(tǒng)是近來研發(fā)的。
畢赤酵母具有受甲醇調控的AOX1基因強啟動子，能夠穩(wěn)定展示糖基化和二硫鍵異構 化等修飾的真核蛋白，較釀酒酵母而言，更具有表達量高，胞外表達本底蛋白少等優(yōu)點。畢赤酵母展示與釀酒酵母展示相比，畢赤酵母展示的比酶活有可能比釀酒酵母展示的比酶 活低，但是畢赤酵母更易實現高密度培養(yǎng)，因此一般可獲得高于釀酒酵母的酶產量。目前 報道畢赤酵母表面展示的脂肪酶較少，這與畢赤酵母表面展示系統(tǒng)開發(fā)較晚，載體系統(tǒng)不 成熟，展示能力不穩(wěn)定有關。具體到米黑根毛霉脂肪酶的展示，發(fā)明人已將未修飾的原始 RML基因在釀酒酵母表面展示，酶活力為182U/g干細胞，產量低，大大限制了其作為全 細胞催化劑的應用和米黑根毛霉脂肪酶酶制劑的開發(fā)(Wei-GuoZhang, Shuang-YanHan， et al， Functional display of Rhizomucor miehei lipase on surface of Saccharomyces cerevisiae with higher activity and its practical properties; Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008， 83: 329-335)。因而急需在增加酶的展示量、尋找更合適的展示宿主，以及改良展 示載體等方面的研究完善，為其應用奠定基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種能在畢赤酵母表面高效展示的米黑根毛霉脂肪酶 (RML)的基因序列。
本發(fā)明的第二個目的是提供上述基因序列克隆的載體。
本發(fā)明的第三個目的是提供指導脂肪酶展示表達在畢赤酵母細胞表面的重組質粒載體。
本發(fā)明的第四個目的是提供具有上述基因序列的能展示高活力脂肪酶的畢赤酵母工程菌。
本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現
(1) 能在畢赤酵母中高效表達的改良的米黑根毛霉脂肪酶基因米黑根毛霉脂肪酶的
氨基酸序列為SEQ.ID.NOl,利用畢赤巴斯德酵母菌的偏好密碼子置換出原米黑根毛霉脂肪 酶基因中酵母不常用的密碼子，具體序列如SEQ.ID.N02。接著通過PCR合成的方法來獲 得基因片段。具體方法首先根據已設計好的脂肪酶基因設計46條引物，均以阿拉伯數字 命名，其中1、 3、 5……45等單數為正向引物，2、 4、 6……46為反向引物，如SEQ.ID.N03 所示。將不同的引物采用二步PCR法(DNA聚合酶鏈式反應法)擴增獲得全長改良脂肪 酶基因。
本發(fā)明中引物的合成、PCR法合成改良脂肪酶基因工作可以通過專門的生物技術公司 或機構來完成。
(2) 具有上述基因序列克隆的載體的構建 利用Taq酶能夠在PCR產物的3'末端加上一個非模板依賴的A，而T載體是一種帶
4有3， T突出端的載體，將獲得的改良脂肪酶基因PCR產物與T載體在連接酶作用下實現 體外連接，轉化大腸桿菌感受態(tài)，涂平板培養(yǎng)過夜，進行藍白斑篩選，挑選的陽性克隆提 質粒經測序驗證?？寺≈久富蛴玫腡載體可以是市售通用的任意T載體，如pUCm-T Vector、 pGEM-T載體、PMD18-T、 PMD19-T等。我們選用了 PMD18-T，獲得了攜帶改良 脂肪酶基因的質粒載體pMD18-T-i M丄。
本發(fā)明所述基因的重組載體PMD18-T-y #Z，其中y #Z是指脂肪酶基因序列；攜帶該質 粒的菌株大腸桿菌T0P10F/PMD18-T-RML Escherichia coli T0P10F/pMD18-T-RML于2008 年9月24日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCCN0: M 208136。保藏地址 為湖北省武漢市武漢大學(430072)。
(3)脂肪酶展示表達到酵母細胞外的重組質粒載體的構建
為實現改良脂肪酶基因在畢赤巴斯德酵母中的展示表達，采用pKFS (已申請專利，申 請?zhí)?00810028631.9， 此展示載體在pPIC9K (Invitrogen公司真核表達載體)的基礎上 利用限制性內切酶和#"1將原載體上的信號肽部分基因切除，在此基礎上用來源于 釀酒酵母的絮凝素基因FS替換。該質粒主要包含5MOW、 3M6 J、 FS(絮凝素基因)、#Z54， 以及力歷p+、《朋+等元件，同時包含可用來克隆脂肪酶基因的多克隆位點，包括限制性內切 醇醇切位點MmI、 j/ al、 i&cl1、五coRI、爿wll、 〃"I)為克隆表達載體。去除了i M丄上游 編碼自身信號肽的24個氨基酸對應的序列，以利用pKFS的絮凝素基因FS展示外源蛋白。 根據GenBank中已報道的米黑根毛霉脂肪酶RML前體序列(P19515， GI:417256)，設計 引物克隆成熟的米黑根毛霉脂肪酶基因，上游引物RMLpl : 5 '-5'-GCAGGCGAATTCGTTCCAATTAAGAGACAATCTAAC國3，，含五coRI酶切位點(以下劃 線示出)以及保護堿基；下游引物 RMLp2 : 5 '-GCCAGCe￡I4aQAGTACACAAACCAGTGTTAATACC-3，，含AvrII酶切位點(以下 劃線示出)以及保護堿基。
以質粒PMD18-T-及MZ為模板，及MZpl和i MZp2為引物進行PCR擴增。將PCR產物 和pKFS質粒都用￡coi /和雙酶切，體外連接構建重組質粒pKFS-i M丄。
")提供具有上述基因序列的能表達高活力脂肪酶的畢赤酵母工程菌
以LiCl法將I線性化的重組質粒pKFS-i MZ轉化畢赤巴斯德酵母宿主菌GS115或 KM71,轉化物涂布于MD平板，培養(yǎng)2—3d。將MD平板上的轉化子分別接種于含不同濃 度的G418抗性YPD平板上，培養(yǎng)3—5d。將高濃度G418-YPD平板上出現的轉化子挑取 其對應的單克隆，按Invitrogen操作指南提取酵母基因組DNA作為模板，進行酵母基因組PCR鑒定，獲得重組轉化子。
重組轉化子先接種于BMGY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD6oo到2-6。離心收集菌體，再將其 懸浮于BMMY培養(yǎng)基中，稀釋至OD柳為1,繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔24h向BMMY培養(yǎng)基 中補加甲醇至終濃度為1.0%進行誘導表達，發(fā)酵上清液中脂肪酶活力高達468.8U/g酵母 干細胞。
相對于現有技術，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和有益效果
本發(fā)明采用酵母表面展示系統(tǒng)表達酶，在保持酶高活力、高催化性能的同時，相比游 離酶或固定化酶省略了純化分離的繁瑣步驟，更具有固定化酶的優(yōu)點，可以反復使用，操 作穩(wěn)定性強。同其他表達系統(tǒng)一樣，酵母表達非同種、非同屬的外源基因時，也表現出來 了產量不高，表達能力降低的問題。本發(fā)明針對酵母表達系統(tǒng)合成適合其表達的RML基因， 有效了解決了上述問題，實現了酶的高表達，表達活力高達468.8U/g酵母干細胞，為現有 報道的最高水平。


圖1是經PCR拼接合成基因的引物示意圖； 圖2是米黑根毛霉脂肪酶基因的PCR合成鑒定電泳圖； 圖3是pMD18-T-i M丄送上海生工生物工程有限公司測序圖；
具體實施例方式
下面結合幅圖與實施例對本發(fā)明做進一步的說明，但本發(fā)明要求保護的范圍并不局限 于實施例表述的范圍。
實施例l:改良米黑根毛霉脂肪酶基因的合成
現有的米黑根毛霉脂肪酶基因如SEQ.ID.N04所示，該基因來源為米黑根毛霉，與酵 母不同屬，這可能是該基因在畢赤酵母中的表達量不高的主要原因。
本發(fā)明是在米黑根毛霉脂肪酶(RML)氨基酸序列(SEQ.ID.NOl)的基礎上，釆用畢赤 巴斯德酵母偏好的密碼子替換i M丄在酵母中使用頻率低的密碼子，設計出在畢赤巴斯德酵 母中使用頻率高的基因序列，形成以下具體的基因序列，如SEQ.ID,N02，從而提高米黑根 毛霉脂肪酶在酵母中的表達量。
本發(fā)明設計的基因可以通過PCR人工合成，步驟如下
首先合成46條引物，弓l物如SEQ.ID.N03所示。如圖1所示，弓l物包括正向引物23 條(奇數序，正向箭頭)，反向引物23條(偶數序，反相箭頭)，正向引物與反相引物彼此 配對互補。將46條寡核苷酸(引物)以200 nmol/L的終濃度加入PCR反應體系，反應
6體系中加入10XTaq DNA聚合酶buffer 5 n L， 2. 5 mmo1/ L dNTPs 4 u L， Taq DNA聚合酶 0.5uL，無菌雙蒸水補充至50uL，進行第一輪PCR反應94。C變性10s ，50 。C退火30s ， 72 。C延伸45s ，共35cycles。將此PCR產物稀釋100倍后取2uL作為模板，加入上下 游兩末端的核苷酸(即Pl和P22)至終濃度200 nrno1/， PCR體系同上。94 。C變性5 min后， 94。C變性45s， 50'C退火lmin, 72。C延伸2min，共30個循環(huán)；第30個循環(huán)72°(3延伸10min， 將第二輪PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，如圖2所示。由圖可知道，二次PCR產物在 對應DNA Marker分子量為1000的位置上出現了明顯的特異性擴增帶，同設計的片 段大小相符。初步證實獲得了改良的及Mi:基因。 實施例2:
PMD18-T-i ML質粒的構建
上步獲得的全長PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳，切取約1092bp大小的目的條帶， 按QIAGEN的PCR凝膠回收試劑盒說明書純化目的產物，取回收產物25.5 u L，加入25 mM濃度的dATP 1 n L， 10XPCRbuffer3 u L， Taq酶0.5 u L， 72。C保溫30 min。
加A后的產物(A是腺嘌呤)，用pMD18-T simple vector試劑盒進行TA克隆，按照 說明書進行操作。10 u L體積反應體系如下T載體1 !i L (50ng)，加入加A后的PCR產物 3 u L，含ATP的10XBuffer 1 u L， T4 DNA連接酶1 u L，用ddH20補足至10 u L 。稍 加離心，16"C水浴連接夜。連接產物轉化Eco/z'DH5a ，然后涂布到含0.5mM IPTG， 40 yg/ml X-Gal指示平板上，過夜培養(yǎng)，挑選白斑提取質粒酶切鑒定后，將重組質粒 PMD18-T-i M丄送上海生工生物工程有限公司測序，測序結果如圖3所示，表明克隆的基因 與我們設計基因一致。
實施例3:
重組質粒pKFS-及Afi的構建
以質粒PMD18-T-及MZ為模板，i M￡pl和及MZp2為引物進行PCR擴增。體系為模板 lpL; 10xTa《DNA聚合酶buffer 5pL(含Mg2+); 2.5附附o〃L dNTP化L; 20nMmol/L的上下 游引物各lpL; r呵DNA聚合酶0.75nL，加無菌水至總體積為50nL。反應條件為:94t:預 變性5min; 94。C變性45s， 45。C退火45s， 72。C延伸2min，共30個循環(huán)；第30個循環(huán)72°C 延伸10min， PCR產物進行0.8。/。瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收純化。
將PCR產物和pKFS質粒都用五coi /禾n 雙酶切，構建重組質粒pKFS-i M丄后用 CaCl2轉化法轉入五.co/!'ToplOF，在Amp+LB (50mg/mL)平板上涂板，過夜培養(yǎng)。提取陽 性轉化子質粒進行Ecoi /和^rlI雙酶切鑒定。鑒定正確后，同樣委托上海生工生物工程有限公司進行測序。 實施例4
表達高活力脂肪酶的畢赤酵母工程菌的培養(yǎng)
以LiCl法將Sail線性化的重組質粒pKFS-RML轉化宿主菌GS115，轉化物涂布于MD 平板，30。C培養(yǎng)2d。將MD平板上的轉化子分別接種于含G418 0.5 mg/mL， 1.0 mg/mL， 1.5mg/mL, 2.0mg/mL， 3.0 mg/mL的YPD平板上，3(TC培養(yǎng)3d。將高濃度G418-YPD平 板(3.0 mg/mL)上出現的轉化子挑取單克隆。按Invitrogen操作指南提取酵母基因組DNA作 為模板，利用目的基因序列的PCR引物進行酵母基因組PCR鑒定，總反應體積為20pL， Taq酶量為2U，取2pLPCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
鑒定正確的重組轉化子GS115/ pKPS-i Mi:接種于20mLBMGY培養(yǎng)基中，30°C， 200r/min振蕩培養(yǎng)160h至0D6W)到3。離心收集菌體，再將其懸浮于BMMY培養(yǎng)基中，稀 釋至OD600為1，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔24h向BMMY培養(yǎng)基中補加甲醇至終濃度為1.0% 進行誘導表達，發(fā)酵4天。發(fā)酵液在7000rpm、 4。C離心10分鐘，棄上清，用去離子水洗 滌菌體三次，重懸菌體經真空冷凍干燥24h，得菌體凍干粉。利用橄欖油做底物進行NaOH 法滴定測定脂肪酶水解活力，結果顯示該脂肪酶活力高達468.8U/g酵母干細胞，比現有技 術(Functional display of Rhizomucor miehei lipase on surface of Saccharomyces cerevisiae with higher activity and its practical properties)報道的釀酒酵母展示的米黑根毛霉脂肪酶的酶活力 182U/g酵母干細胞提高近3倍。
在一定的反應條件下，每克重組脂肪酶干細胞每分鐘與底物反應生成lRmol對硝基苯 酚(游離脂肪酸)定義為1個酶活單位(U)。
實施例5脂肪酸甲酯的合成
采用大豆油(或三油酸甘油酯)和甲醇為原料，使用有機溶劑，在畢赤酵母細胞表面
展示的米黑根毛霉脂肪酶作用下發(fā)生轉酯化反應，得到脂肪酸甲酯產品。
有機溶劑石油醚預先用3A分子篩充分除水。取約2.5mL底物(其中大豆油0.965g，甲 醇0.035g，石油醚2.5ml，醇油摩爾比為1: 1)混合物于25 mL具塞三角瓶中，在40度下 預熱20min，然后加入0.2§(約17.29611)實施例4的畢赤酵母工程菌菌體凍干粉，反應溫度 40°C，然后于180rpm下振蕩反應，在反應24 h和48h后分別加入0.035g甲醇(最終醇油 摩爾比為3: 1)，反應72h，反應完成后離心取上清，然后上氣相色譜分析(氣相色譜安 捷倫7890C;檢測器氫離子檢測器；柱子DB-FFAP毛細管柱)，最終脂肪酸甲酯的含量 為1.5036g。實施例6非水相酯化反應制備己酸乙酯
試劑都預先用3A分子篩充分除水。將無水乙醇和正己酸加入正庚烷中。加入后，無水 乙醇的濃度為0.3mol/L，正己酸的濃度為0.2mol/L。取5 mL底物(其中正己酸125n L， 無7jC乙醇87.6uL,正庚烷4787.4uL，酸醇摩爾比為1: 1. 5)混合物于50mL具塞三角瓶 中，加入含量為40g/ L的實施例4的畢赤酵母工程菌菌體凍干粉，反應溫度4(TC，然后 于200rpm下振蕩反應，0.5 h后加入0.5g分子篩，5h后加入0.3g分子篩，反應12h，己酸 的轉化率能達到98%。在上述條件下反應后，離心回收菌體，經溶劑正庚烷洗滌，去除產 物和殘余的微量底物，再加入到含有新鮮底物的反應體系中催化酯化反應，經過10批次的 連續(xù)使用，畢赤酵母展示CALB仍然在每批次中使己酸的轉化率保持在95%以上。
由實施例5、 6可見，應用實施例4制備的畢赤酵母工程菌菌體凍干粉均能有效催化脂 肪酸甲酯和己酸乙酯的合成，由于該菌體凍干粉作為催化劑，與游離酶和固定化酶相比， 省去了分離純化的繁瑣步驟，易于制備，生產周期短，操作穩(wěn)定性強，有利于降低生產成 本，并實現規(guī)?；瘧?。序列列表 SEQ.ID.NOl:
1 MVLKQRANYL GFLIVFFTAF LVEAVPIKRQ SNSTVDSLPP LIPSRTSAPS SSPSTTDPEA 61 121SEQ.ID,NQ3:
1ATGGTTTTGAAGCAAAGAGCTAACTACTTGGGT 33bp
51 bp
3 TTTTTGATTGTXTTTTXTACTGCTTTTTTGGTTGAAGCTGTTCCAATTAAGA 52 bp
4 AGAATCAACAGTAGAGTTAGATTGTCTCTTAATTGGAACAGCTTCAACC 49 bp
5 GACAATCTAACTCTACTGTTGATTCTTTGCCACCATTGATTCCATCT 47 bp 6AAGAAGATGGAGCAGAAGTTCTAGATGGAATCAATGGTGGCAA 43 bp
7 AGAACTTCTGCTCCATCTTCTTCTCCATCTACTACTGATCCAGAAG 46 bp
8 CCGTTTCTAGACATAGCTGGAGCTTCTGGATCAGTAGTAGATGGAG 46 bp
9 CTCCAGCTATGTCTAGAAACGGTCCATTGCCATCTGATGTTGA 43 bp
10 TCAAAGCCATACCGTACTTAGTTTCAACATCAGATGGCAATGGA 44 bp
11 AACTAAGTACGGTATGGCTTTGAACGCTACTTCTTACCCAGATAC 45 bp
12 ATC A ATAGAC ATAGCTTGAACA AC AGTATCTGGGTAAGA AGTAGCGT 47 bp
13 TGTTGTTCAAGCTATGTCTATTGATGGTGGTATTAGAGCTGCTACT 46 bp
14 GTAAGTCAATTCGTTAATTTCTTGAGAAGTAGCAGCTCTAATACCACC 48 bp
15 TCTCAAGAAATTAACGAATTGACTTACTACACTACTTTGTCTGCTAACTCTT 52 bp
16 ACCTGGAATAACAGTTCTACAGTAAGAGTTAGCAGACAAAGTAGTGTA 48 bp
17 ACTGTAGAACTGTTATTCCAGGTGCTACTTGGGGTTGTATTCATTG 46 bp
18 AATCTTCAAATCTTCAGTAGCATCACAATGAATACAACCCCAAGTAGC 48 bp
19 TGATGCTACTGAAGATTTGAAGATTATTAAGACTTGGTCTACTTTGATTTAC 52 bp
20 CTAGCAACCATAGCGTTAGTATCGTAAATCAAAGTAGACCAAGTCTTAAT 50 bp
21 G ATACTAACGCTATGGTTGCTAG AGGTG ATTCTGA A AAGACTATTTACA 49 bp
23 TTGTTTTTAGAGGTTCTTCTTCTATTAGAAACTGGATTGCTGATTTGACTTT 52 bp
24 GGTGGGTAAGAAACTGGAACAAAAGTCAAATCAGCAATCCAGTT 44 bp
25 TGTTCCAGTTTCTTACCCACCAGTTTCTGGTACTAAGGTTCATAAG 46 bp
26 TCACCGTAAGAATCCAAAAAACCCTTATGAACCTTAGTACCAGAAACT 48 bp
27 GGTTTTTTGGATTCTTACGGTGAAGTTCAAAACGAATTGGTTGCT 45 bp
28 ATTGCTTAAATTGATCCAAAACAGTAGCAACCAATTCGTTTTGAACT 47 bp
29 ACTGTTTTGGATCAATTTAAGCAATACCCATCTTACAAGGTTGCTG 46 bp
55 bp30 CCACCCAAAGAATGACCAGTAACAGCAACCTTGTAAGATGGGT 43 bp
31 TTACTGGTCATTCTTTGGGTGGTGCTACTGCTTTGTTGTGTG 42 bp
32 TCTTCTCTTTGGTACAAATCCAAAGCACACAACAAAGCAGTAGCA 45 bp
33 CTTTGGATTTGTACCAAAGAGAAGAAGGTTTGTCTTCTTCTAACTTGTTT 50 bp
34 TGGTTGACCTTGAGTGTACAAAAACAAGTTAGAAGAAGACAAACCT 46 bp
35 TTGTACACTCAAGGTCAACCAAGAGTTGGTGATCCAGCTTTT 42 bp
36 CCAGTAGAAACAACGTAGTTAGCAAAAGCTGGATCACCAACTCT 44 bp
37 GCTAACTACGTTGTTTCTACTGGTATTCCATACAGAAGAACTGTTAACG 49 bp
38 GCAAATGTGGAACAATATCTCTTTCGTTAACAGTTCTTCTGTATGGAATA 50 bp
39 AAAGAGATATTGTTCCACATTTGCCACCAGCTGCTTTTGGTTTTT 45 bp
40 AGTATTCTTCACCAGCATGCAAAAAACCAAAAGCAGCTGGTG 42 bp
41 TGCATGCTGGTGAAGAATACTGGATTACTGATAACTCTCCAGAAAC 46 bp
42 CAAATCAGAAGTACAAACTTGAACAGTTTCTGGAGAGTTATCAGTAATCC 50 bp
45TTCCATTTACTTCTGTTTTGGATCATTTGTCTTACTTTGGTATTAACACTG 51 bp 46 TTAAGTACACAAACCAGTGTTAATACCAAAGTAAGACAAA 40 bp
SEQ.ID.N04:
1
12<formula>formula see original document page 13</formula>
權利要求
1、一種改良的米黑根毛霉脂肪酶基因，其特征在于，其完整全基因序列為SEQ.ID.NO2。
2、 一種含有權利要求1所述基因的重組載體pMD18-T-Z ifc，其中^1￡是指權利要求1 所述的脂肪酶基因序列；攜帶該質粒的菌株^sc力en'c力ia T0P10/pMD18-T-RML保藏號 為CCTCC M 208136。
3、 一種含有權利要求l所述基因序列的重組載體沐FS-^fc，其中y ifc是指權利要求l 所述的脂肪酶基因；以質粒PMD18-T-i M丄為模板，及Attpl和及ikttp2分別為上、下游引物， 進行PCR擴增；將PCR產物和pKFS質粒都用和雙酶切，體外連接構建重組 質粒pKFS-i ML;上游弓I物RMLpl: 5 '隱5'陽GCAGGCGAATTCGTTCCAATTAAGAGACAATCTAAC-3 ，； 下游引物RMLp2: 5 '墨GCCAGCCCTAGGAGTACACAAACCAGTGTTAATACC-3 ，。
4、 一種由權利要求2所述的重組載體所轉化的畢赤酵母菌，其特征在于，將表達載體 pKFS-i Mi轉化入畢赤巴斯德酵母。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種改良的米黑根毛霉脂肪酶基因及其在酵母展示中的應用。改良的米黑根毛霉脂肪酶基因序列為SEQ.ID.No2。含有所述基因的重組載體pMD18-T-RML，RML是指脂肪酶基因；攜帶該質粒的菌株Escherichia coli TOP10/pMD18-T-RML保藏號為CCTCC M208136。本發(fā)明將該基因轉入到畢赤酵母宿主菌中，實現米黑根毛霉脂肪酶在畢赤酵母中的展示表達，提供的畢赤酵母菌能有效展示米黑根毛霉脂肪酶，該脂肪酶能廣泛應用于制造脂肪酸甲酯、己酸乙酯、具有不同熔點且不含各式脂肪酸的三甘酯以及一些“重構脂”等。
文檔編號C12N15/55GK101481695SQ200810198949
公開日2009年7月15日 申請日期2008年10月7日 優(yōu)先權日2008年10月7日
發(fā)明者影 林, 王小寧, 鄭穗平, 韓雙艷, 韓振林, 黃登峰 申請人:華南理工大學