專利名稱：反義表達(dá)水稻OsPDCD5基因在改良水稻產(chǎn)量性狀方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種改良水稻產(chǎn)量性狀方法。
背景技術(shù)：
水稻是世界上重要的糧食作物之一，全世界有約2/3的人口以水稻為主食。為了滿足日益增長的人口對糧食的需求，提高水稻生產(chǎn)力具有重要意義。產(chǎn)量性狀是描述水稻生產(chǎn)力的重要農(nóng)藝性狀，主要由有效穗數(shù)、每穗谷粒數(shù)和千粒重幾部分組成。這些產(chǎn)量性狀都屬于數(shù)量性狀WTL)，由許多效應(yīng)不同的基因所控制。目前國內(nèi)外利用轉(zhuǎn)基因改良農(nóng)作物經(jīng)濟(jì)性狀的技術(shù)主要是根據(jù)已知的功能基因與表型性狀的關(guān)系，采用組成型表達(dá)載體或組織專一性表達(dá)載體將目的基因?qū)肽繕?biāo)植物，以期獲得作物特定經(jīng)濟(jì)性狀或抗逆性性狀的改良。程序性細(xì)胞死亡(P⑶)是一種自身調(diào)控的主動死亡形式，是多細(xì)胞生物正常生命活動的一部分，是植物發(fā)育過程中及環(huán)境脅迫情況下自身啟動的重要程序。《s/^O^基因是水稻中的一個程序性細(xì)胞死亡基因。0sPDCD5在成熟組織中的表達(dá)水平明顯高于幼嫩組織，且0sPDCD5的過表達(dá)會導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因再生植株的死亡。葉片是水稻最重要的器官，有研究表明水稻抽穗后灌漿所需營養(yǎng)物質(zhì)的60%_80% 來自葉片的光合作用。水稻葉片在結(jié)實(shí)期間衰老的快慢直接影響水稻的產(chǎn)量，有研究則表明葉片每推遲衰老一天，產(chǎn)量可提高1%左右。葉片衰老最明顯的表現(xiàn)就是葉綠素逐漸消失，并出現(xiàn)黃化脫落現(xiàn)象，葉片的衰老程度越嚴(yán)重，葉綠素的含量就越低。然而，植物中存在著一種“持綠”現(xiàn)象，持綠是指葉片在植物生長后期的較長時間內(nèi)仍保持綠色的一種表型特征。水稻轉(zhuǎn)基因研究表明將抗衰老基因?qū)胨灸軌蜓泳徣~片衰老從而使產(chǎn)量得以提高。葉片衰老過程中有一些基因受到抑制而低水平表達(dá)，甚至完全不表達(dá)；而另一些基因則被激活，從而增強(qiáng)表達(dá)。前一類基因被稱為衰老下調(diào)基因(senescence down-regulation genes, SDk)，如編碼與光合過程有關(guān)的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本豐度隨葉片的衰老而急劇下降； 后一類則被稱為衰老相關(guān)基因(senescence-associated genes, SAGs)。SAGs又可分為兩類一類僅在衰老階段才表達(dá)，被稱為衰老特定基因(senescence-specific genes, SSk)，如SAG12、SAG13 ；另一類在葉片生長初期就可檢測到有低水平表達(dá)，在衰老開始后表達(dá)量迅速上升。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出水稻中反義表達(dá)水稻fls/^O^基因在改良水稻產(chǎn)量性狀方面的應(yīng)用。本發(fā)明利用反義表達(dá)水稻程序性死亡基因fls/^O^及其同源基因的載體轉(zhuǎn)化水稻的秈稻亞種，用以改良水稻的產(chǎn)量性狀；
實(shí)施例中，本發(fā)明將反義表達(dá)水稻《s/^O^基因的載體轉(zhuǎn)化秈稻品種金23B，使秈稻金23B的產(chǎn)量性狀發(fā)生明顯改善。即采用秈稻金23B為轉(zhuǎn)基因受體，構(gòu)建fls/^O^基因的反義表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明還提供一種fls/^O^基因反義表達(dá)載體，該載體采用pCAMBIA1304為表達(dá)載體，將秈稻品種珍汕97的fls/^O^基因反向插入到pCAMBIA1304載體35S組成型啟動子下游而獲得。本發(fā)明還利用反義表達(dá)水稻程序性死亡基因《s/^O^及其同源基因的載體轉(zhuǎn)化包括玉米，小麥，高粱和其它谷類作物，用于產(chǎn)量性狀的改良。本發(fā)明還利用反義表達(dá)水稻程序性死亡基因《s/^O^及其同源基因的載體轉(zhuǎn)化雙子葉作物，用于產(chǎn)量性狀的改良。所述產(chǎn)量性狀的改良，包括增加分枝數(shù)、籽粒和果實(shí)數(shù)，提高籽粒和果實(shí)體積與重量。本發(fā)明還包括水稻程序性死亡基因0sPDCD5的分離、克隆與轉(zhuǎn)基因功能研究等。1) 0sPDCD5基因與蛋白結(jié)構(gòu)組成
采用SSH技術(shù)，從分化的水稻愈傷組織中分離與克隆到一段與人類細(xì)胞程序性死亡基因TFAR19相關(guān)的EST。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)已發(fā)表登錄的國際數(shù)據(jù)庫中的EST及水稻基因組數(shù)據(jù)，設(shè)計PCR引物，從水稻秈稻品種珍汕97幼苗中克隆到了 TFAR19同源基因的全長cDNA， 命名為0sPDCD5。此外在水稻幼苗組織中還分離到6(5/ ^基因兩個可變剪接的cDNA。這三個cDNA已經(jīng)登錄到國際數(shù)據(jù)庫NCBI，登錄號分別為AY327105，AY749431和AY749431。 6(5/ ^基因的全長cDNA由7個外顯子組成。正常編碼的cDNA長416 bp，序列如SEQ. ID N01.所示，編碼1 個氨基酸，序列如SEQ. ID N02.所示。該基因的結(jié)構(gòu)與其編碼的蛋白質(zhì)組成如下
水稻fls/^O^基因結(jié)構(gòu)見

圖1所示，蛋白結(jié)構(gòu)見圖2所示。2)反義表達(dá)0sPDCD5基因的表達(dá)載體的構(gòu)建
大多數(shù)基因工程都是將基因的核苷酸編碼序列正向插入載體，而本發(fā)明是將《s/^O^ 反向插入載體。本發(fā)明實(shí)施例中使用的《s/^O^反向序列如SEQ. ID N03.所示。采用 pCAMBIA1304 ( Center for the Application of Molecular Biology of International Agriculture, Canberra, ACT, Australia )為表達(dá)載體，利用酶切位點(diǎn)勒·/ II和分e I將0sPDCD5反向序列插入到pCAMBIA1304載體35S組成型啟動子下游，得到反義表達(dá) 0sPDCD5的表達(dá)載體。其結(jié)構(gòu)圖如圖3所示。3) 0sPDCD5反向序列基因轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
采用金2 為轉(zhuǎn)基因受體，構(gòu)建反義表達(dá)《s/^O^基因的轉(zhuǎn)基因植株。將金2 成熟種子去殼消毒后接種在脫分化植物組織培育基上誘導(dǎo)愈傷組織。在愈傷組織誘導(dǎo)2-3周后， 采用基因槍微彈轟擊法，將含0sPDCD5反向序列的經(jīng)純化的pCAMBIA1304質(zhì)粒DNA導(dǎo)入金 23B愈傷組織細(xì)胞。在添加30ppm潮霉素的MS培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)3_4周篩選抗性細(xì)胞系， 然后將篩選的細(xì)胞系轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)長芽和生根。4)轉(zhuǎn)化處理試管苗移栽及轉(zhuǎn)化植株后代的分子檢測
、將0sPDCD5反向序列轉(zhuǎn)化處理的金2 試管苗移栽田間，并采用PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測候選的抗性植株，于2008年夏獲得陽性TO代植株。2008年冬，在海南島加代繁殖，獲得轉(zhuǎn)基因Tl代，共計5個株系。
5) 0sPDCD5反向序列轉(zhuǎn)金2!3B植株的實(shí)時定量PCR (RealTime PCR)檢測基因0sPDCD5檢2 轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量比野生型植株降低。見圖4所示。6) 0sPDCD5反向序列轉(zhuǎn)基因T2代群體產(chǎn)量性狀的調(diào)查與統(tǒng)計
將0sPDCD5反向序列轉(zhuǎn)基因T2代于2009年春播種，四葉期將3個轉(zhuǎn)基因T2代株系種植在復(fù)旦大學(xué)試驗(yàn)田，每個株系各種植20株，行株距為6寸χ 6寸，重復(fù)三次，同時設(shè)立秈稻金2 親本對照。在成熟期統(tǒng)計各株系20個單株的有效穗數(shù)，主穗穗長，主穗一次枝梗及二次枝梗數(shù)，主穗總粒數(shù)和千粒重，計算平均值，統(tǒng)計結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.水稻《s/^O^基因及其同源基因在改良水稻產(chǎn)量性狀方面的應(yīng)用，其特征在于利用反義表達(dá)水稻程序性死亡基因《s/^O^及其同源基因的載體轉(zhuǎn)化水稻的秈稻亞種，以改良水稻的產(chǎn)量性狀。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于采用秈稻金23B為轉(zhuǎn)基因受體，構(gòu)建 0sPDCD5基因的反義表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。
3.一種fls/^O^基因反義表達(dá)載體，其特征在于采用pCAMBIA1304為表達(dá)載體，將秈稻品種珍汕97的fls/^O^基因反向插入到pCAMBIA1304載體35S組成型啟動子下游而獲得。
4.水稻基因《s/^O^及其同源基因的載體在轉(zhuǎn)化包括玉米，小麥，高粱和其它谷類作物，改良其產(chǎn)量性狀方面的應(yīng)用。
5.水稻基因《s/^O^及其同源基因的載體在轉(zhuǎn)化雙子葉作物，改良其產(chǎn)量性狀方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體為反義表達(dá)水稻OsPDCD5基因在改良水稻產(chǎn)量性狀方面的應(yīng)用。本發(fā)明利用反義表達(dá)水稻程序性死亡基因OsPDCD5及其同源基因的載體轉(zhuǎn)化水稻的秈稻亞種，用以改良水稻的產(chǎn)量性狀；此外，還在玉米，小麥，高粱和其它谷類作物中反義表達(dá)水稻程序性死亡基因OsPDCD5及其同源基因，用于改良谷類作物的產(chǎn)量性狀。進(jìn)一步還在雙子葉作物中反義表達(dá)水稻程序性死亡基因OsPDCD5及其同源基因，用于改良雙子葉作物產(chǎn)量性狀，包括增加分枝數(shù)，籽粒和果實(shí)數(shù)，提高籽粒和果實(shí)體積與重量。
文檔編號C12N15/82GK102181477SQ20111007516
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月28日
發(fā)明者孫凡, 楊金水 申請人:復(fù)旦大學(xué)