專利名稱：酒曲霉菌中蛋白水解酶的增強表達的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及可增強表達蛋白水解酶的酒曲霉菌的遺傳突變。
領域闡述水解的蛋白，廣泛用于食品工業(yè)，可通過用酸，堿或酶水解蛋白原料得到。多種方法用酒曲霉菌(koji mold)制備食品產(chǎn)品，通過很多種分泌淀粉酶，蛋白酶和肽酶的作用水解。酒曲霉菌傳統(tǒng)把是那些用于生產(chǎn)包括以下種屬的細胞的酒曲培養(yǎng)物(US4308284)，例如，曲霉屬，根酶屬和/或主酶屬的細胞，特別是醬油曲霉，米曲霉，海棗曲霉，黑曲霉，泡盛曲霉，米根霉，寡孢根霉，日本根霉，臺灣根霉，卷枝毛霉，日本毛霉，灰綠青霉，和褐色青霉。根據(jù)International Code ofBotanical Nomenclature(ICBN)，的規(guī)則，曲霉屬(Aspergillus)是風媒屬。這意味著真正的曲霉只通過分身孢子無性繁殖。然而，典型的曲霉分身孢子形態(tài)學可在能通過子囊孢子有性繁殖的真菌中發(fā)現(xiàn)。有些曲霉分類學家引起混亂，由于他們不同意ICBN術語。他們試圖修正分類方案以將米曲霉(米曲霉)包括在此屬內(nèi)，盡管其分類修正名稱是Emericella nidulans (Samson,Aspergillus，生物學和工業(yè)應用，355-390頁，Bennett和klich編，Boston)。
EP417481(Societe des Produits Nestle)這樣描述發(fā)酵的黃豆調(diào)味劑的生產(chǎn)過程，其中通過混合酒曲培養(yǎng)物和蒸煮黃豆和烹熟的小麥的混合物制備酒曲，酒曲接著在酒曲培養(yǎng)物發(fā)酵時產(chǎn)生的酶存在的水懸液中45℃到60℃水解3到8小時，通過在水解的酒曲懸濁液中加入氯化鈉制備moromi,moromi留作發(fā)酵并被擠壓且獲得的溶液用巴氏法消毒并澄清。
EP429760(Societe des Produits Nestle)描述了生產(chǎn)調(diào)味劑的過程，其中制備富含蛋白材料的水懸液，蛋白通過蛋白酶在pH6.0到11.0水解溶液得到，懸液在pH4.5到6.5熱處理，且用酒曲培養(yǎng)物的酶催熟懸液。
類似的，EP96201923.8(Societe des Produits Nestle)描述了生產(chǎn)肉調(diào)味劑的過程，其中制備含有植物蛋白源和植物碳水化合物源的混合物，所述混合物含有至少45％的干物質(zhì)，混合物用酒曲培養(yǎng)物接種且用一種或多種其它傳統(tǒng)肉類發(fā)酵所涉及的微生物，混合物被接種直到形成肉味。
然而，另一方面，酸或堿水解會破壞水解中產(chǎn)生的必需氨基酸降低營養(yǎng)價值，而酶水解很少徹底，這樣水解蛋白便含有確實量的多肽。酒曲過程的優(yōu)化和進一步發(fā)展被關于水解酶本身，其調(diào)節(jié)和任何影響其表達和活性的過程因子(例如溫度，pH，水活性，和鹽濃度)的知識的缺乏所阻礙。
在真菌Emericella nidulans(katz等，基因，150,287-292,1994)中，發(fā)酵活性歸因于至少三條基本控制路線包括碳代謝產(chǎn)物阻遏，氮和硫代謝阻遏。這三條調(diào)節(jié)路線使底物中的氮，碳，和硫源依照其氮，能量，硫供應依次被利用。在Emericella nidulans(Arst等分子基因遺傳，26,111-141,1973)，氮代謝阻遏由areA基因產(chǎn)物實現(xiàn)，或在其它真菌中Neurospora crassa(DAvies等，美國國家科學院院刊，84,3753-3757,1987),Penicillium chrysogenum(Haas等，遺傳學現(xiàn)狀，27,150-158,1995)和啤酒酵母(Minehart等，分子細胞生物學，11,6216-6228,1991)類似基因?qū)嵤╊愃乒δ堋?br> areA基因編碼正調(diào)節(jié)作用DNA結合蛋白(AREA)，屬于轉(zhuǎn)錄因子GATA家族，為在利用除氨和L-谷氨酰胺以外的氮源時所必需。在氮脫阻遏條件下，通過細胞內(nèi)高水平谷氨酰胺的信號，areA表達通過三條機制下調(diào)1)AREA蛋白失活，2)areA轉(zhuǎn)錄終止和3)通過3’非翻譯尾序列(3’-UTS)的功能，areA mRNA降解增強(Platt等，EMBO J,15,2791-2801,1996)。缺乏功能性AREA蛋白時，只有氨和L-谷氨酰胺可用作氮源，同樣的，無功能areA突變只有氨和L-谷氨酰胺可用作氮源(Arst等，1973)。
對酒曲發(fā)酵的觀察提示氮代謝阻遏是酒曲發(fā)酵的主要因素。例如，高水平的L-谷氨酰胺顯示可以負性影響酒曲發(fā)酵的蛋白水解活性。
進一步，還觀察到高水平的蛋白水解活性和谷氨酰胺酶活性是酒曲發(fā)酵中兩個相互排斥的條件(Ushijima等，農(nóng)業(yè)生物化學，51,1051-1057,1997)。例如在含0.1％麥麩的基本生長培養(yǎng)基中加入25mM L-谷氨酰胺減少內(nèi)源蛋白水解酶活性約40-50倍。這一現(xiàn)象可通過假定L-谷氨酰胺是誘導谷氨酰胺酶所必需的來解釋。然而，L-谷氨酰胺也是氮代謝阻遏的效應劑，當谷氨酰胺酶被誘導時蛋白水解酶表達被阻遏。
至于谷氨酰胺酶相應的轉(zhuǎn)化L-谷氨酰胺為谷氨酸的事實，后者是一重要天然調(diào)味劑(見WO95/31114)，有理由需要克服L-谷氨酰胺介導的蛋白水解酶阻遏，允許在酒曲霉菌中同時表達谷氨酰胺酶和蛋白水解酶。
另外，根據(jù)用于蛋白水解的蛋白和酶的性質(zhì)，形成的肽可能具有特別苦的味道且是感官所不期望的。因此需要水解蛋白的方法能導致蛋白高度水解且水解產(chǎn)物具有優(yōu)良的感官特性。
最后，對用酒曲霉菌水解的谷物中，例如麥麩，的殘肽的生化分析，顯示相當量的谷氨酰胺保存于含有脯氨酸的肽中(Adler-Nissen,食物蛋白的酶水解.Elsevier Applied Sciences Publishers LTD,120頁，1986)。因此需要能導致大量L-谷氨酰胺釋放的水解蛋白的方法。
發(fā)明簡述本發(fā)明的目標是一種酒曲霉菌株，在含0.2％大豆果實蛋白的基本培養(yǎng)基中生長時，其每毫升上清中，它能比野生型菌株米曲霉CNCM I-1882表達至少多兩倍的內(nèi)切和外切蛋白酶，特別是至少30mU內(nèi)切蛋白酶活性，至少30mU亮氨酸-氨基-蛋白酶活性和至少10mU脯氨酰-二肽-肽酶活性。
第二方面，本發(fā)明提供了米曲霉(Aspergillus oryzae)的DNA結合蛋白(AREA)，至少具有序列號2的從氨基酸1之氨基酸731或其功能衍生物的氨基酸序列。
第三方面，本發(fā)明提供一DNA分子，含有編碼本發(fā)明DNA結合蛋白的areA基因。
第四方面，本發(fā)明提供了過表達蛋白水解酶的方法，包括在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中在霉菌表達酶的條件下依據(jù)本發(fā)明孵育酒曲霉菌，并以濃縮形式選擇性的分離酶。
另一方面，本發(fā)明提供利用本發(fā)明的酒曲霉菌水解含蛋白的材料。
最后一方面，本發(fā)明提供含有用本發(fā)明的酒曲霉菌發(fā)酵而得的含有蛋白和至少5mML-谷氨酰胺的原料獲得的蛋白水解產(chǎn)物的食物產(chǎn)品。發(fā)明詳述在以下描述中，如非特別說明所給百分數(shù)是重量百分數(shù)。稱作“序列號”的氨基酸或核酸序列通常列于后面的序列表中。一亮氨酸氨基肽酶單位定義為每分鐘37℃以亮氨酸-p-硝基苯(400nm吸收測定；ε=10’500M-1cm-1)為底物產(chǎn)生1μmol p-硝基苯的酶量。一脯氨酰-二肽-肽酶單位定義為每分鐘37℃以丙氨酸-脯氨酸-p-硝基苯(400nm吸收測定；ε=10’500M-1cm-1)為底物產(chǎn)生1μmol p-硝基苯的酶量。一內(nèi)切肽酶單位定義為每分鐘37℃從試鹵靈標記的酪蛋白底物在所述條件下(Boehringer Cat No.1080733；于574nm測定吸收)產(chǎn)生1μmol TCA可溶肽的酶量。
術語“酒曲”定義為用酒曲霉菌培養(yǎng)物發(fā)酵蛋白源和碳水化合物源的混合物所得的產(chǎn)物，特別是豆科植物或蒸煮的油類植物和蒸煮或焙燒的谷類植物的混合物，例如大豆或蒸煮的果實和蒸煮或焙燒的小麥或水稻的混合物。
類似的，“酶的功能衍生物”表述包括所有通過取代，刪除，添加一些氨基酸，例如1-20氨基酸，形成的不同的氨基酸序列，但它們保持原有的活性或功能。功能衍生物的選擇對本領域技術熟練人員是顯而易見的，因為可以很容易的用本領域所熟知的稍微改進的方法獲得截斷的AREA蛋白(見序列號2)的突變體，例如Adams等(EP402450；Genencor)，Dunn等(蛋白工程，2,283-291,1988),Greener等(Strategies,7,32-34,1994)和或Deng等(生化年鑒，200,81,1992)描述的方法。
特別的，如果其序列和該蛋白至少85％相同，優(yōu)選至少90％，特別99％，一種蛋白可以從遺傳上被認為是另一蛋白的衍生物。在本發(fā)明中，通過和截斷的AREA蛋白(序列號2)一致的衍生物序列的氨基酸數(shù)和所述衍生物序列的氨基酸總數(shù)之比來決定一致性。
本發(fā)明涉及任何使蛋白水解酶增強表達，導致高度蛋白水解和具有優(yōu)良的感官特點的水解產(chǎn)物的酒曲霉菌。因此，這些酒曲霉菌表達(1)高水平的內(nèi)肽酶，如這些能從酪蛋白在37℃產(chǎn)生TCA-可溶肽的酶，和(2)高水平的外肽酶如亮氨酸氨基肽酶消除N-末端亮氨酸(Deng等生化年鑒，200,81,1992)和脯氨酰-二肽-肽酶消除N-末端X-脯氨酸二肽，其中X可以是任何氨基酸(Barrett等，哺乳動物蛋白酶術語和書目，N.Y.Acad.Press,2,132頁，1986)。
鑒于本發(fā)明的酒曲霉菌提供增強的脯氨酰-二肽-肽酶活性的事實，它們可用于釋放含脯氨酸肽中保留的L-谷氨酰胺。
提供以下蛋白水解酶增強表達的酒曲霉菌特別適用于本發(fā)明的目的至少約30mU/ml*，優(yōu)選至少約50mU/ml*內(nèi)肽酶活性；至少約30mU/ml*，優(yōu)選至少約50mU/ml*亮氨酸氨基肽酶活性；和至少10mU/ml*，優(yōu)選至少月15mU/ml*脯氨酰-二肽-肽酶活性(*當于含0.2％大豆果實蛋白的基本培養(yǎng)基中生長的每毫升上清)。
另外，克服L-谷氨酰胺介導的蛋白水解酶阻遏，允許谷氨酰胺酶和蛋白水解酶同時表達的酒曲霉菌，也是本發(fā)明的一部分。這些酒曲霉菌在，例如含0.2％大豆果實蛋白和至少5mML-谷氨酰胺(0.073％w/w)的基本培養(yǎng)基中生長時，可表達上述提到的蛋白水解酶活性。
本發(fā)明的酒曲霉菌可通過隨機U.V和/或化學突變獲得，然后篩選提供所需表型特點的突變酒曲霉菌。
篩選特別是含有不被阻遏的areA基因突變的突變酒曲霉菌，當突變霉菌在含阻遏量的L-谷氨酰胺的基本培養(yǎng)基中生長時，可適合于本發(fā)明的需要。為此，areA突變株可通過經(jīng)典隨機突變選擇(UV，化學的)并在，例如，含約100mM氯化甲基銨和0.2％大豆蛋白的平板上篩選。
已有報道，脯氨酰-二肽-肽酶的活性并非由areA基因表達天然控制，當areA基因脫阻遏后，其活性出人意料的增強。由于脯氨酰-二肽-肽酶活性的表達由肽誘導(未發(fā)表結果)，這種AREA依賴的活性增強可能是有在areA控制下的內(nèi)切蛋白酶的所導致肽釋放的增強引起。
鑒于隨機U.V和/或化學突變費時的事實，用重組技術構建本發(fā)明的酒曲霉菌更合適。因此，本發(fā)明的酒曲霉菌優(yōu)選含有重組的areA基因，它如截斷的AREA蛋白那樣截斷但保留有功能，當霉菌在含阻遏量的L-谷氨酰胺的基本培養(yǎng)基中生長時并不被阻遏。已有報道這種截斷也導致一種對mRNA降解次敏感的areA mRNA。
截斷可通過切除天然areA基因的預定區(qū)實現(xiàn)，及通過引入終止區(qū)以允許截斷的areA mRNA轉(zhuǎn)錄。截斷優(yōu)選在編碼AREA DNA結合區(qū)序列的下游實現(xiàn)，通過17個氨基酸環(huán)結合兩對半胱氨酸殘基很容易識別。更恰好的，截斷可在編碼保守氨基酸結構半胱氨酸-2X-半胱氨酸-17X-半胱氨酸-2X-半胱氨酸序列的下游實現(xiàn)，其中X是任何氨基酸且數(shù)字2和17指氨基酸數(shù)目(Caddick等Antonie vanleeuwenhoek,65,169-177,1994)。此截斷特別可在編碼DNA結合區(qū)的areA序列后100氨基酸進行。
任何有功能的真菌areA基因可用于本發(fā)明中，特別是在嚴格條件下能和具有從序列號1核苷酸1189至核苷酸3846或其依據(jù)遺傳密碼的簡并性所得的功能衍生物的核酸序列的米曲霉的areA基因雜交的有功能的areA基因。
有功能的areA基因可通過用以下實施例中描述的方法從Aspergillus菌株中純化并獲得?；蛘?，一種areA基因可被(1)從其它種屬真菌中用衍生白核苷酸序列1的DNA探針通過嚴格的雜交方法檢測到，并(2)用合適的衍生自序列號1包括areA基因的引物通過熟知的逆轉(zhuǎn)錄-PCR方法獲得。進一方面，areA基因可以體外合成然后利用，例如，聚合酶鏈反應放大。
合適的截斷的areA基因特別包括，例如，序列號1(序列號1含有一內(nèi)含子)核苷酸1189-1604和1704-3480限定的核苷酸序列或依據(jù)遺傳密碼的簡并性獲得的功能性衍生物。此截斷的基因編碼具有序列號2的氨基酸1至氨基酸731的氨基酸序列的米曲霉.的AREADNA蛋白結合區(qū)，這是利用除氨和L-谷氨酰胺以外氫源所必需的。
截斷的areA基因可引入一個載體，例如一可復制質(zhì)?；蛞豢烧檄h(huán)狀或線性非復制質(zhì)粒，并可被連接于在所述生物體中調(diào)節(jié)不同基因的或在其它生物體中調(diào)節(jié)不同基因的調(diào)節(jié)序列(啟動子和或終止子)，例如，天然調(diào)節(jié)序列外的調(diào)節(jié)序列可通過其高效率或期望特性選取，如，啟動子的可誘導性或高表達能力。
如果優(yōu)選異源表達，指本發(fā)明的基因在另一生物而非初始宿主中表達(株，種，種，屬，科，目，綱或門)調(diào)節(jié)序列優(yōu)選衍生白和表達宿主相似或相同的生物。例如，若表達宿主是曲霉屬，調(diào)節(jié)序列將衍生自曲霉屬。持續(xù)表達合適的啟動子，優(yōu)選在真菌宿主中，可以是以下基因的啟動子；例如甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶，磷酸甘油酯激酶，磷酸丙糖異構酶和乙酰胺酶。
適合可誘導表達啟動子，優(yōu)選在真菌宿主中，可以是來自以下基因的啟動子內(nèi)切木聚糖酶IIA，葡糖胺酶A，纖維素二糖水解酶，淀粉酶，轉(zhuǎn)化酶，乙醇脫氫酶和淀粉葡糖苷酶。選擇合適的調(diào)節(jié)序列連接于本發(fā)明的序列并能指導所述核苷酸序列的表達對本領域技術熟練人員是明顯的。
載體也可包括一選擇性標記以從不包含所述重組原料的細胞中辨認已被導入重組DNA材料的宿主細胞。這樣的標記基因是，例如，優(yōu)選真菌表達時熟知的ga-2,pyrG,pyr4,pyrA,trpC,amdS,或argB基因。DNA分子也可包括至少一個合適的復制的起始點。合適的轉(zhuǎn)化方法和具有合適轉(zhuǎn)錄啟動子，合適轉(zhuǎn)錄終止信號和選擇轉(zhuǎn)化細胞的合適標記基因的合適的表達載體對許多生物是文獻中已知的，包括不同的曲霉，根霉和主霉。在需要真菌表達時，EP278355(Novartis)描述的表達系統(tǒng)是特別合適的。
重組酒曲霉菌可通過使外源DNA進入細胞的方法獲得。這樣的方法包括轉(zhuǎn)化，電穿孔，或本領域技術熟練人員所熟知的其它技術。
在本發(fā)明中，酒曲霉菌是傳統(tǒng)用作制備包括真菌，Aspergillus(ICBN分類學)，Rhizopus和Mucor細胞的酒曲培養(yǎng)物。這些當中，以下種可被使用，包括以下菌種，醬油曲霉，米曲霉(ATCC 20386)，海棗曲霉(ATCC 14332)，黑曲霉(ATCC 1004)，泡盛曲霉(ATCC14331)，寡孢根霉(ATCC 22959)，日本根霉(ATCC 8466)，臺灣根霉，卷枝毛霉(ATCC 15242)，日本毛霉，灰綠青霉，和褐色青霉(ATCC 10447)。
帶有ATCC號的菌株可以從American Type Culture Collection,Rockville,Maryland20852,US獲得。本發(fā)明并不被這些描述限制，而是使本領域技術熟練人員能實施本發(fā)明。
本發(fā)明的重組細胞可包括穩(wěn)定整合于染色體或在可復制質(zhì)粒上的截斷的areA基因。在本發(fā)明創(chuàng)造的所有重組細胞中，本發(fā)明特別獲得菌株米曲霉(A.oryzae)CNCM I-1881,CNCM I-1883和CNCM I-1884。
優(yōu)選的只有一個功能性截斷的areA基因被整合入染色體，并在宿主生物天然的調(diào)節(jié)序列控制下。
為穩(wěn)定整合入真核細胞染色體一個功能性截斷的areA基因，它被融合于宿主生物天然的啟動子和終止子。本發(fā)明的DNA分子可通過稍微修改Ruiter-Jacobs等(遺傳學現(xiàn)狀，16,159-163,1989)的方法整合，即(1)通過連接截斷的areA基因制備非復制DNA片段，它被連接于宿主生物天然的啟動子和終止子，于編碼必需基因的核苷酸序列的下游，所述基因通過至少一處突變和/或一處缺失(此必需基因可以是任何涉及RNA合成的基因，如米曲霉中pyrG基因)被失活；(2)選擇含有被另一突變或刪除失活的必需基因的宿主生物；(3)用非復制DNA片段轉(zhuǎn)化所述宿主生物；(4)鑒定整合轉(zhuǎn)化子，其中DNA片段被整合而恢復了必需基因的天然功能；(5)選擇只有一個DNA片段被整合的整合轉(zhuǎn)化子。
AREA DNA結合蛋白的過表達可通過在表達宿主中摻入截斷的areA基因獲得，所述areA基因被可操作的連接于一個或多個調(diào)節(jié)序列，此序列用于增加本發(fā)明的AREA蛋白的表達水平。
過表達可通過引入(復制質(zhì)粒)或整合(基因組整合)多拷貝本發(fā)明功能性截斷的areA基因進一步獲得。如酒曲霉菌實施例中含有多拷貝的功能性截斷的areA基因，轉(zhuǎn)化株米曲霉A(見實施例1)，米曲霉xprD1(見實施例3)和米曲霉NF1含pNFF68(見實施例4)按布達佩斯條約的貯藏，其存放號分別為CNCM I-1881,CNCM I-1883和CNCM I-1884。
本發(fā)明也涉及過表達蛋白水解酶的過程，提供本發(fā)明的酒曲霉菌于合適熟知培養(yǎng)基中，在霉菌表達蛋白水解酶的條件下，以濃縮形式分離酶，例如通過用離心或過濾從發(fā)酵肉湯中去除固體。合適培養(yǎng)基的選擇基于表達宿主的選擇和/或基于DNA重組材料調(diào)節(jié)的要求。這樣的培養(yǎng)基是本領域所熟知的。發(fā)酵后，霉菌可通過離心或過濾從發(fā)酵肉湯中去除。
霉菌在液體系統(tǒng)中水解達到的典型的L-谷氨酰胺濃度可為，例如，0.5-1％ w/w。本酒曲霉菌特別適合于水解含有蛋白的材料，特別是含有大量L-谷氨酰胺(超過5mM)的情況。這些含蛋白材料可以是蛋白源和碳水化合物源的混合物，特別是豆科植物或蒸煮的油類植物和蒸煮或焙燒的谷類植物的混合物，例如大豆和蒸煮或焙燒的小麥或水稻的混合物。
含有麥麩的組合物特別適用于本發(fā)明的目的，當麥麩被傳統(tǒng)酒曲培養(yǎng)物水解時大量L-谷氨酰胺在含脯氨酸肽中保留。
在用酒曲霉菌水解過程中或結束后，人們可能嘗試進一步釋放盡可能多的連接于脯氨酸殘基的L-谷氨酰胺，本發(fā)明提供了一方法，其中本發(fā)明的酒曲霉菌結合至少一種酶或提供脯氨酸酶活性的微生物使用，也就是說對X-脯氨酸型二肽有高特異性的酶(Ezespla等，Ap.Env.Microb.,63,314-316,1997；此類酶也可從Sigma獲得E.C.3.4.13.9)。
另外，本發(fā)明的酒曲霉菌特別適合于含有至少5mML-谷氨酰胺的含蛋白材料，允許形成重要的天然味覺增強劑L-谷氨酸和具有優(yōu)良感官特性的蛋白高度水解產(chǎn)物。
另一方面，本發(fā)明涉及含有提供本發(fā)明的酒曲霉菌發(fā)酵從含蛋白材料和至少5mM L-谷氨酰胺中獲得的蛋白水解產(chǎn)物的食物產(chǎn)品。這樣的食物含有大量的L谷氨酸(和/或L-谷氨酸)和有優(yōu)良感官特性的高度蛋白水解產(chǎn)物，可引起非苦味和比未水解蛋白顯著降低的免疫原性。
本發(fā)明的重要的食物產(chǎn)物是嬰兒母乳替代物的成分，或水解植物蛋白成分。乳品替代物可進一步用此類產(chǎn)物的前述文獻描述的方法闡明(EP96202475.8)。
本發(fā)明并不局限于此處描述的特殊實施方案的范圍。事實上，本發(fā)明的不同修飾，除了此處描述的，和前述描述及附圖對本領域技術熟練人員是清楚的。這些修飾被認為在權利要求的范圍內(nèi)。不同的出版物在此全文引用至理解本發(fā)明所需的程度。DNA提取，克隆，和轉(zhuǎn)化細菌細胞，除非特別指出，均按Sambrook等(分子克隆，實驗室手冊，冷泉港實驗室出版，U.S.A.1989)的方法進行。實施例之前是附圖簡述。菌株米曲霉TK3，米曲霉A(實施例1)，米曲霉NF2(實施例2)，米曲霉xprD1(實施例3)和米曲霉NF1含pNFF68(實施例4)安布達佩斯條約，保藏在Collection Nationale de Culture deMicroorganismes(CNCM),25 rue du docteur Roux,75724 ParisFrance,1997,6月24日，它們分別接受保存號CNCM I-1882,CNCMI-1881,CNCM-1885,CNCM I-1884,CNCM I-1883。所有獲得這些保存物的限制一旦本申請或要求先于本申請受益的另一申請被公布將被撤銷。
圖-

圖1顯示含有截斷的E.nidulans areA基因和pkiA啟動子和終止子的pNFF21的限制性圖譜。
-圖2顯示米曲霉TK3(野生型)，包括pyrG基因的pNFF28轉(zhuǎn)化的米曲霉(對照pyr+)，破壞突變米曲霉areA(對照areA-；見實施例2)，和用pNFF28和pNFF21轉(zhuǎn)化的米曲霉NF13突變株的相對Endo,LAPhe DPPIV活性。
-圖3顯示質(zhì)粒pNFF5的4.6kb EcorⅠ-HindⅢ插入的限制性圖譜，彌補了Emericella nidulans G332中的areA19突變；包括編碼區(qū)的兩個外顯子用黑箭頭表示。
-圖4顯示areA破壞構建物pNFF44含有兩個E.nidulans pyrG基因的外顯子(pyr1和pyr2)，米曲霉areA基因的兩個外顯子(areA1和areA2)和細菌卡那霉素抗性基因(kanaR)。
-圖5顯示米曲霉areA基因的位點特異突變；突變引物和野生型areA序列的錯配表示如下終止密碼子(TAA)是斜體，AflⅡ位點下劃雙線且引入的EcoRⅤ位點用粗體標記并下劃線。
-圖6顯示A.oryzaeTK3(野生型)和用脫阻遏的areA擴增產(chǎn)物和pyrG擴增產(chǎn)物共轉(zhuǎn)化的A.oryzae NF1 9突變株，轉(zhuǎn)化株用葡萄糖和谷氨酰胺在MM上篩選，的相對Endo,LAP和DPPIV活性。菌株和質(zhì)粒-E.nidulans G191(pyrG89,fwnA1,pabaA1,yuA1),E.nidulansG353(areA1,biA1)和E.nidulans G332(pabaA1,yA2,xprD1)從GlasgowGenetic Stocj Center通過A.J.Cluterbuck博士獲得。其它野生型Emericella nidulans菌株也可用于以下實施例。
-米曲霉TK3從Nestle菌株保藏中心獲得。
-米曲霉NF1(pyrG1)是米曲霉TK3的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷衍生物，其中pyrG基因，編碼乳清酸核苷5’-磷酸脫羧酶，被定點破壞失活。
-大腸桿菌BZ234(Collection from Biozenter,Basel大學，Basel,瑞士)用作質(zhì)粒繁殖宿主。大腸桿菌株JMl09(endA1,recA1,GyrA96,hsdR17(rk-,mk+),relA1,SupE44,λ-,Δ(lac-proAB),[F’,traD36,proA+B+,lacIqZΔM15])和EM1301(lacZ53,mutS201∷Tn5,ThyA36,rha-5,metB1,deoC,IN(rrnD-rrNE))用于位點特異突變。
-質(zhì)粒pHELP1用于在Emericella nidulans中直接克隆(Gems和Clutterburk，遺傳學現(xiàn)狀，24,520-524,1993；GenBank號X78051)。
-質(zhì)粒pNFF28含有米曲霉TK3pyrG基因(GenBank好Y13811)。
-質(zhì)粒pFNBY182，含有作為在黑曲霉pkiA啟動子和終止子控制下EcoRⅰ-XbaⅠ片段的pepB基因，通過Gabor Jarai博士獲得自Novartis，瑞士，(GenBank號S38698)。
-質(zhì)粒pNEB193(New Englang Biolabs),pALterl(Promega),pBluescriptSK-(Stratagene),pHSS19和pGEM-T(Promega)，和pK18(genBank號M17626)用于亞克隆。培養(yǎng)基真菌氮源(FNB)包括無氨基酸1×Yeast Nitrogen Base(YNB)和(NH4)2SO4(Difco)和50mM葡萄糖作碳源和10mMNaNO3作氮源。對于E.nidulansG353(areA1,biA1),10mM谷氨酰胺加入作為氮源。生長實驗在MM(含1.5gKH2PO4,0.5gMgSO4.7H2O,0.5gKcl,potecorvo,1953)上進行，10mM NaNO3作為單一氮源。蛋白酶培養(yǎng)皿測定在含0.2％大豆蛋白作為單一碳源和氮源的MM上測定。對定量研究，250ml燒瓶裝80ml含0.2％大豆蛋白，作為單一碳源和氮源，的MM，接種106分身孢子/ml并在30℃不振搖孵育5天。實施例1 E.nidulans截斷的areA基因的過表達為測定通過調(diào)節(jié)areA表達增加蛋白水解酶表達的可能性，我們決定在米曲霉中過表達Emericella nidulans基因。
為此，擴增Emericella nidulans G191的areA基因的編碼區(qū)并通過以下將PCR產(chǎn)物克隆入表達載體pFBY182用寡核苷酸序列號3和序列號4，擴增Emericella nidulans G191的基因組DNA中含有areA編碼區(qū)的2009-4168,2.174bp的片段。同時在5’末端加入EcoRⅠ位點并在3’末端加入XbaⅠ位點，并定向克隆入EcoRⅰ-XbaⅠ消化的真菌表達載體pFBY182中以產(chǎn)生pNFF21(見圖1)。在pNFF21中，areA轉(zhuǎn)錄在A.niger pkiA啟動子和終止子控制下(Graaff，遺傳學現(xiàn)狀，22,21-27,1992)，由此在阻遏條件下通過天然3’UTS作用阻遏下調(diào)。
pNFF21通過和含有A.oryzae pyrG基因的pNFF28共轉(zhuǎn)化進入米曲霉NF1(pyrG1)。然后米曲霉NF1在含0.1％酵母抽提物(Difco),50mM葡萄糖和5mM谷氨酰胺的MM中生長。菌絲體通過無菌過濾收獲，用無菌雙蒸水和K0.8MC(20mM MES-HCl pH5.8,0.8M KCl,50mMCaCl2)各洗一遍。1.5克菌絲體重懸于20ml過濾除菌的5mg/mlNovozyme234的K0.8MC溶液中。菌絲體懸液在30℃輕搖(120rpm)孵育2小時。通過用滴管輕輕吸打使原生質(zhì)體從菌絲體中釋放，用20mlS1.0TC(10m MTris-HCl pH7.5,1M山梨醇，50mMCaCl2)洗兩遍并以終濃度108/ml重懸于S1.0TC。20ml DNA和200μl原生質(zhì)體混合并加入50μl 25％PEG6000的10mM Tris-HCl pH7.5,50mMCaCl2溶液，在冰上孵育20分鐘。在此混合物中加入2ml含25％PEG6000(BDH)的10mM Tris-HCl pH7.5,50mMCaCl2溶液，輕輕混合并在室溫孵育5分鐘。加入4ml S1.0TC且1ml等份和5ml 2％OFNB(滲透壓穩(wěn)定的真菌氮源)中的低熔點瓊脂糖混合(Sigma)并鋪于含50mM葡萄糖和10mM NaNO3的OFNB瓊脂上(Difco)。米曲霉NF1轉(zhuǎn)化物鋪于含1M蔗糖，50mM葡萄糖和5mM谷氨酰胺的MM瓊脂上。
所得轉(zhuǎn)化物在含2％大豆蛋白的MM上篩選。在篩選的20轉(zhuǎn)化物中，通過30℃孵育36小時后克隆周圍的暈的大小判斷，三個顯示增強的蛋白酶分泌活性(轉(zhuǎn)化子A,B和C)。這三個轉(zhuǎn)化子在含2％大豆蛋白的MM液體培養(yǎng)物中30℃孵育5天并用合適對照分析蛋白水解活性。
為此，這三株分身孢子(106/ml)用于接種含0.2％大豆蛋白為單一氮源和碳源的80ml液體MM中。此培養(yǎng)物不振搖在30℃培養(yǎng)5天。過濾去除菌絲體后，培養(yǎng)基測定內(nèi)切蛋白酶活性(Endo)，亮氨酸氨基肽酶活性(Lap)，脯氨酰-二肽-肽酶活性(DPPIV)。內(nèi)切肽酶活性測定用試鹵靈標記的酪蛋白根據(jù)Boehringer法所述及其底物(試鹵靈標記的酪蛋白，Cat No.1080733)測定。亮氨酸氨基肽酶及二肽-肽酶Ⅳ活性用UV分光光度計通過合成底物亮氨酸-pNa和丙氨酸-脯氨酸-pNa(Bachem，瑞士)，分別根據(jù)Sarath等(蛋白水解酶的蛋白酶測定方法實驗方法，Beynon R.J.,Bond J.S.,編，IRL Press,Oxford)測定。二甲基亞砜(DMSO)中的10mM底物儲存液用100mM磷酸鈉緩沖液，pH7.0稀釋至終濃度0.5mM。加入20-100μ培養(yǎng)基懸液且反應在37℃進行60分鐘。對照用空白底物和空白上清平行測定。釋放的顯色基團4-硝基苯(ε=10’500M-1cm-1)在400nm處測定且活性用mU/ml(nmol/min/ml)表示。
相對蛋白水解活性在圖2中顯示。在areA破壞突變株中，內(nèi)切蛋白酶活性(Endo)和亮氨酸氨基肽酶活性(Lap)比TK3和pyr+對照菌株明顯減低，而脯氨酰-二肽-肽酶活性(DPPIV)不受影響。顯然，脯氨酰二肽肽酶表達不受areA控制。多拷貝pkiA表達信號控制下的E.nidulansareA導入米曲霉NF1導致內(nèi)切蛋白酶，亮氨酸氨基肽酶和脯氨酰-二肽-肽酶活性的過表達。實施例2在米曲霉中過表達截斷的areA基因1)米曲霉areA基因的克隆通過用瞬時文庫法補充E.nidulans的相應areA基因克隆米曲霉areA基因(Gems等1993)。
首先，根據(jù)Raeder和Broda(let.appl.microbiol.,1,17-20,1985)描述的方法的改進程序分離基因組DNA。過濾收集菌絲體，立即在液氮中速凍并凍干。接著用研缽研為粉末。200mg粉末菌絲體重懸于2.5ml浸出緩沖液(200mM Tris-HCl pH 8.5 150mM NaCl,25mMEDTA,0.5％SDS)且溶液用1.75ml浸出緩沖液平衡的酚和0.75ml的氯仿/異戊醇(24∶1 v/v)抽提?；旌衔镫x心(20分鐘，3000g)。水相回收并用125μlRNAse A(Boehringer)溶液(10mg/ml)37℃孵育10分鐘。加入1.25ml 2-丙醇(Merck).沉淀用70％乙醇洗并最后重懸于500TE緩沖液(10mM Tris-HCl pH8.0,1mMEDTA)。向樣品中加入500ml 2×QBT(1.5M NaCl,100mM Mops,30％乙醇，pH7.0)接著用于“Genomic-tip 100”(Qiagen)，按廠商推薦吸附并洗脫。
通過混合40μg BamHⅠ消化的pHELP1和100μg BamHⅠ消化或100μg Sau3A部分消化的米曲霉TK3基因組DNA獲得補充克隆?；蛘?，40μg KpnⅠ消化的pHELP1和100μgKpnⅠ消化的米曲霉TK3基因組DNA。所有三種DNA混合物導入E.nidulansG332并在NaNo3作為單一氮源的滲透穩(wěn)定的FNB培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。
用Sau3A部分消化的米曲霉TK3 DNA的轉(zhuǎn)化實驗不產(chǎn)生融合轉(zhuǎn)化子。而用BamHⅠ和KpnⅠ消化的米曲霉TK3 DNA分別產(chǎn)生14和3個轉(zhuǎn)化子。這些轉(zhuǎn)化子顯示不規(guī)律的生長，提示補充基因定位于自主復制質(zhì)粒。在一單獨實驗中40μg KpnⅠ消化的pHELP1和100μgKpnⅠ消化的E.nidulansG332(xprD1)基因組DNA共轉(zhuǎn)化并得到一個轉(zhuǎn)化子。
從三個BamHⅠ來源轉(zhuǎn)化子和一個KpnⅠ來源轉(zhuǎn)化子中通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得質(zhì)粒。從來自xprD1轉(zhuǎn)化子中未分離到質(zhì)粒。從單個E.nidulans BamHⅠareA+轉(zhuǎn)化子中可分離得到幾個質(zhì)粒。這些質(zhì)粒的限制性分析表明它們是含有其它限制性片段的pHELP1衍生物，但并非所有這些插入都有末端BamHⅠ位點。類似的，從KpnⅠareA+轉(zhuǎn)化子可獲得數(shù)個pHELP1衍生物，其中沒有一個有末端KpnⅠ位點插入。這些過程表明質(zhì)粒的不穩(wěn)定性。
一個BamHⅠ(pNFF3)和一個KpnⅠ(pNFF4)pHELP1衍生物選作進一步分析。兩個克隆的插入片段都和E.nidulans areA基因的編碼區(qū)雜交。這兩個克隆的詳細分析顯示在pNFF3中，整個areA基因定位于一4.6kb的EcoRⅠ-HindⅢ片段(圖3)。此4.6kb的EcoRⅠ-HindⅢ片段被亞克隆入pHSS19產(chǎn)生pNFF5。重導入E.nidulansG323,pNFF5恢復了其以NaNO3作為單一氮源生長能力，顯示此質(zhì)粒含有功能性areA基因(數(shù)據(jù)未顯示)。
2)米曲霉areA基因的確定pNFF5中EcoRⅠ-HindⅢ插入的完整核苷酸序列通過部分重疊亞克隆分析兩條鏈測定。核苷酸序列在Licor 4000型自動測序儀上測定。IRD41標記引物通過Sanger等(美國國家科學院院刊74,5463-5467,1977)的雙脫氧法用作雙鏈部分覆蓋亞克隆測序。DNA序列分析用GCG計算機程序進行(Devereux等核酸研究，12,387-395,1987)。
結果顯示米曲霉areA基因編碼一853氨基酸殘基蛋白，推測分子量為92.5kDa(見序列號2)。米曲霉areA和E.nidulans areA基因在蛋白水平具有83％且在DNA水平79％相似性。
進一步，在推測的啟動子區(qū)和E.nidulans的整體DNA同源性降至43％。然而，DNA5到13bp長的七核苷酸伸展顯示100％序列一致性且占據(jù)兩個啟動子幾乎一致的位置。這些序列可代表順式作用元件。另外，5’非翻譯區(qū)含有幾個推測的AREA-結合位點(GATA或TATC；Fu和Marzluf，美國國家科學院院刊，87,5351-5355,1990)，其中兩個占據(jù)和E.nidulans中兩個功能性AREA結合位點相同的位置。
3)米曲霉areA基因的破壞為闡明areA在蛋白酶編碼基因表達中的作用，通過基因破壞產(chǎn)生areA無效突變。為構建這樣的areA無效等位基因，兩個內(nèi)部SmaⅠ片段(圖3)從pNFF5移去產(chǎn)生pNFF10。為此，通過用SmaⅠ消化含有米曲霉areA基因的pNFF5并自身連接含有片段的載體產(chǎn)生pNFF10。這樣從pNFF5的areA基因的第二外顯子刪除了內(nèi)部0.5和0.2kb SmaⅠ片段。
作為選擇標記，包括E.nidulans pyrG基因的PCR產(chǎn)物，插入pNFF10單一的SmaⅠ位點產(chǎn)生pNFF44(圖4)。同樣，用寡核苷酸序列號5和序列號6擴增E.nidulans G332的pyrG基因且1.851bp PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-T(Promega)以產(chǎn)生pNFF38和pNFF39。包含pyrG基因的EcoRⅠ片段從pNFF39中切出，用T4 DNA聚合酶補平并克隆入pNFF10的SmaⅠ位點。
此pNFF44構建物，用EcoRⅠ和NheⅠ線性化，用于轉(zhuǎn)化米曲酶NF1，在含葡萄糖和谷氨酰胺分別作為碳源和氮源的滲透穩(wěn)定的MM上篩選轉(zhuǎn)化子。所有pyrG+轉(zhuǎn)化子進一步檢測其利用硝酸鹽和大豆蛋白作為單一氮源的能力。四個pyrG+轉(zhuǎn)化子顯示在硝酸鹽MM上大大減緩或不生長且三個在含0.2％大豆蛋白作為單一氮源和碳源的MM上生長兩天未形成暈(數(shù)據(jù)未顯示)。這四個SmaⅠ消化的基因組DNA和其它六個pyrG+轉(zhuǎn)化子用SmaⅠ消化并用4.6kb pNFF5的EcoRⅠ-HindⅢ插入片段作探針進行Southern印跡。只有一個轉(zhuǎn)化子中areA基因的兩內(nèi)部SmaⅠ片段被刪除，表明此轉(zhuǎn)化子為areA無效突變。此areA破壞突變稱為NF2。
areA突變NF2在含0.2％大豆蛋白的80mlMM中不振搖30℃生長5天。areA突變株在含0.2％大豆蛋白的MM中生長緩慢。分析培養(yǎng)肉湯顯示與米曲霉TK3(WT)對照(圖2)相比總內(nèi)切蛋白水解活性降低75％和亮氨酸氨基肽酶活性降低60％。相比較，areA突變株中脯氨酰二肽肽酶活性與野生型對照無顯著不同(圖2)。
4)組成型areA等位基因的構建用pNFF5共轉(zhuǎn)化實驗，包括野生型areA基因，不產(chǎn)生過表達蛋白酶的共轉(zhuǎn)化株(數(shù)據(jù)未顯示)。這提示米曲霉areA基因的緊密調(diào)節(jié)。
為允許蛋白水解酶組成型表達(即，有谷氨酰胺存在)，得到areA基因的截斷。通過位點突變，一個終止密碼子(TAA)，一個AflⅡ和一個EcoRⅤ位點引入4.6kb EcoRⅠ-HindⅢ areA片段，在氨基酸殘基752后截斷AREA蛋白(見圖5)。
為此，pNFF5的EcoRⅠ-HindⅢ插入片段被連入pALTER1并導入大腸桿菌JM109以產(chǎn)生pNFF49。通過用輔助噬菌體M13KO7感染，從pNFF49產(chǎn)生單鏈DNA用于利用Altered Sites Ⅱ試劑盒(Promega)定點突變程序。接著0.05pmol單鏈pNFF49和0.25pmol氨芐修復的寡核苷酸序列號7,0.25pmol四環(huán)素剔除的寡核苷酸序列號8和1.25pmolareA/xprD1突變寡核苷酸序列號9，在20ml 20mM Tris-HCl pH7.5,10mM MgCl2和50mMNACl在Perkin Elmer Thermocycler中退火，程序為加熱退火混合物至75℃ 5分鐘接著以1℃/分鐘的速度降至45℃。從45℃至20℃的冷卻速度為1.5℃/分鐘。接著加入3ml 100mMTris-HCl pH7.5,5mM dNTPs,10mM ATP和20mMDTT?；旌衔镌?7℃和5U T4聚合酶及1UT4 DNA連接酶孵育90分鐘。3ml反應混合物的液體通過電穿孔導入大腸桿菌ES1301且轉(zhuǎn)化株在含125mg/ml氨芐的LB中篩選。突變質(zhì)粒從ES1301中復蘇并導入BZ234。
3.5kb EcoRⅠ-EcoRⅤ片段進一步克隆入pBLUESKIPT以產(chǎn)生pNFF58。為功能性實驗PNFF58導入米曲霉NF2(見上)且轉(zhuǎn)化株在含NaNO3作為單一氮源的OFNB上篩選。pNFF58，獲得1.5轉(zhuǎn)化子/μg，而對照pNFF5為6轉(zhuǎn)化子/μg。這些數(shù)據(jù)證明pNFF58仍含有功能性areA基因。pNFF58轉(zhuǎn)化子在含0.2％大豆蛋白的MM上和含0.2％大豆蛋白與10mM谷氨酰胺的MM上篩選。在0.2％大豆蛋白上幾個轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生比野生型對照(A.orzae TK3)大的暈，提示過表達導致增強的蛋白水解酶分泌。多數(shù)轉(zhuǎn)化子在兩種培養(yǎng)基上產(chǎn)生暈，提示蛋白水解酶的脫阻遏表達(數(shù)據(jù)未顯示)。實施例3蛋白酶過表達酒曲霉菌株的構建。
為產(chǎn)生潛在生產(chǎn)性酒曲霉菌菌株，至少一個脫阻遏areA等位基因的附加拷貝需導入米曲霉TK3衍生NF1。由于合理原因，進行時不能帶入細菌序列，特別是抗生素抗性基因。為此，pNFF28和pNFF58的插入?yún)^(qū)通過PCR用pfuⅠ DNA聚合酶和磷酸化的寡核苷酸序列號10和序列號11擴增。擴增產(chǎn)物自連并純化。10μg pNFF58擴增產(chǎn)物和10μgpNFF28擴增產(chǎn)物被導入米曲霉NF1轉(zhuǎn)化子，在含50mM葡萄糖和5mM谷氨酰胺的滲透穩(wěn)定的MM上篩選。10μg pNFF28導入作為對照。質(zhì)粒pNFF28產(chǎn)生30轉(zhuǎn)化子/μg，pNFF28PCR產(chǎn)生6轉(zhuǎn)化子/μg且pNFF28/pNFF58PCR產(chǎn)生16轉(zhuǎn)化子/μg。
潛在的共轉(zhuǎn)化用于在含0.2％大豆蛋白的MM和含0.2％大豆蛋白和10mM L-谷氨酰胺的MM上篩選增強的蛋白酶活性。通過其產(chǎn)生的增大的暈表明十二個轉(zhuǎn)化子在兩種培養(yǎng)基上產(chǎn)生更多的蛋白酶活性。為定量過表達，其中9株在80ml含0.2％大豆蛋白的MM中30℃不振搖培養(yǎng)5天。培養(yǎng)基測定蛋白水解活性(圖6)。
對在A.niger pkiA表達信號(圖2)控制下的E.nidulan areA基因，測定的所有三類蛋白水解比米曲霉TK3野生型和米曲霉NF1的pyrG+衍生株活性高。蛋白酶過表達菌株的Southern分析表明所有的共轉(zhuǎn)化含有2到4個脫阻遏areA基因功能性整合拷貝的。
比較觀察到的蛋白酶過表達水平和脫阻遏areA基因功能性整合拷貝數(shù)，未觀察到明顯的聯(lián)系。轉(zhuǎn)化株xprD1產(chǎn)生最高水平的蛋白水解活性并含有多拷貝的功能性整合xorD1.然而，轉(zhuǎn)化株xprD12含有少的多的功能性整合xorD1拷貝但卻具有幾乎和轉(zhuǎn)化株xprD1類似的活性。進一步，xprD6和xprD7的雜交方式很相似，但xprD6過表達所有檢測的活性1.5倍而xprD7只過表達脯氨酰二肽肽酶。實施例4具有米曲霉dppⅣ基因啟動子和終止子的米曲xprD1等位基因的表達實施例2的共轉(zhuǎn)化實驗導致有多拷貝整合于基因組的pNFF58的菌株并比野生型TK3菌株過表達2至3倍的蛋白水解活性。作為對照，有單拷貝pNFF21(實施例1)的菌株，其中E.nidulasn areA在強糖酵解啟動子控制下導致6倍的過表達。這些結果提示天然areA啟動子是弱啟動子且功能性截斷的areA在強啟動子控制下表達有更好結果。
為此，米曲霉TK3的dppⅣ基因通過PCR用pfuⅠ DNA聚合酶和磷酸化的寡核苷酸序列號12和序列號13擴增。PCR產(chǎn)物用ApaⅠ和EcoRⅤ酶消化。消化的ApaⅠ-EcoRⅤ 4.8kb片段亞克隆入pALTER1(Promega)以產(chǎn)生pNFF61。接著pNFF61根據(jù)Deng等過得方法(生化年鑒，200,81,1992)進行位點特異的突變得到pNFF62，利用5’磷酸化的突變寡核苷酸序列號14和序列號15根據(jù)Altered Sites Ⅱ試劑盒(Promega)的說明進行。利用聚合酶PfuⅠ和寡核苷酸序列號16和序列號17，從含米曲霉xprD1等位基因的pNFF58中通過PCR擴增xprD1等位基因，為一3.4kb EcoRⅠ-EcorⅤ片段。2294bp xprD1擴增產(chǎn)物磷酸化并克隆入SmaⅠ消化的pK19(Pridmore等，基因，56,309-312,1987)以產(chǎn)生pNFF64。最后pNFF64的NotⅠ-EclⅠ36Ⅲ片段被插入pNFF62 BotⅠ-HpaⅠ產(chǎn)生含有融合于dppⅣ啟動子和終止子的xprD1等位基因的pNFF68。
通過和pNFF28共轉(zhuǎn)化，pNFF68被導入米曲霉NF1，并在含0.2％大豆蛋白的MM上篩選具有增強蛋白酶活性的初始轉(zhuǎn)化株。35個轉(zhuǎn)化子中的5個顯示比米曲霉TK3增大的暈。在選得的5轉(zhuǎn)化株中，一個儲存于CNCM的Budapest Treaty，獲得的儲存號為CNCM I-1883。
將共轉(zhuǎn)化過表達蛋白酶和野生型對照鋪于含0.2％大豆蛋白和5mML-谷氨酰胺的MM培養(yǎng)皿上。所有選擇的共轉(zhuǎn)化株在5mM谷氨酰胺存在下仍產(chǎn)生暈，而野生型沒有，表明蛋白水解活性的脫阻遏表達。
為定量過表達，轉(zhuǎn)化株在含0.2％大豆蛋白的80ml MM中不振搖30℃培養(yǎng)5天。培養(yǎng)基測定蛋白水解活性。結果顯示比野生型TK3菌株過表達至少6倍蛋白水解活性。實施例5為制備發(fā)酵大豆調(diào)味劑，通過混合米曲霉CNCM I-1883酒曲培養(yǎng)物和蒸煮大豆或焙燒小麥的混合物制備酒曲，酒曲在水懸液中被米曲霉CNCM I-1培養(yǎng)物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶45℃到60℃水解3到8小時，通過在水解酒曲懸液中加入適量的氯化鈉制備moromi,moromi留作發(fā)酵并被擠壓且所得的液體用巴氏法消毒并被澄清。實施例6為產(chǎn)生調(diào)味劑，制備蒸煮大豆和焙燒小麥的混合物的水懸液，通過用蛋白酶在pH6.0到11.0水解懸液使蛋白溶解，懸液在pH4.6至6.5加熱處理，且懸液用Sigema的氨基酰脯氨酸肽酶和分離自米曲霉CNCM I-1881發(fā)酵的液體培養(yǎng)基的蛋白水解酶使之成熟。
序列列表(1)一般信息(ⅰ)申請者(ⅱ)(A)姓名SOCIETE DES PRODUITS NESTLE(B)街道AVENUE NESTLE 55(C)城市VEVEY(D)STATE:VAUD(E)國家SWITZERLAND(F)郵政編碼(ZIP):1500(ⅱ)發(fā)明題目酒曲霉菌中蛋白水解酶的增強表達(ⅲ)序列數(shù)目17(ⅳ)計算機可讀類型(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)(D)軟件(2)SEQ ID NO:1信息(ⅰ)序列特征(A)長度4657堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型雙鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特征(A)名字/關鍵詞外顯子(B)位置1189-1604
(ⅸ)特征(A)名字/關鍵詞內(nèi)含子(B)位置1605-1703(ⅸ)特征(A)名字/關鍵詞外顯子(B)位置1704-3846(ⅸ)特征(A)名字/關鍵詞misc-feature(B)位置1189-3480(D)其它信息/標記=截斷的AREA/注釋=“AREA是截斷的編碼一DNA結合區(qū)的下游序列”(ⅹⅰ)序列的詳細情況SEQ ID NO:1:GAATTCTCGA CACCCTTAGT ATTGTGGTCC TTGGACTTGG TGCTGCTATA TATTAGCTAA 60TACACTAGTT AGACTCACAG AAACTTACGC AGCTCGCTTG CGCTTCTTGG TAGGAGTCGG 120GGTTGGGAGA ACAGTGCCTT CAAACAAGCC TTCATACCAT GCTACTTGAC TAGTCAGGGA 180CTAGTCACCA AGTAATCTAG ATAGGACTTG CCTTTGGCCT CCATCAGTTC CTTCATAGTG 240GGAGGTCCAT TGTGCAATGT AAACTCCATG CCGTGGGAGT TCTTGTCCTT CAAGTGCTTG 300ACCAATATGT TTCTGTTGGC AGAGGGAACC TGTCAACTAG TTAATAACTA GTCAGAAACT 360AGTATAGCAG TAGACTCACT GTACGCTTGA GGCCCCTCTC TCTCTTTGCA CTGACTGTCA 420GCCATACCAT AGTATCATCC CGGAATTAAG AAAAAAAAAA AAAAAAAGAA AAAGAAATTA 480TTCTACCCCC GATCTGGACA AATTATAACC AGGAGAAAAT CAAGCGAAAG AGGGGCAAAG 540GAGGAGACAC CATTAAAATT GGGTCTGGCT TGATTCATGA CATACATTCG TCGTCTTGAA 600TTTCAATAGG TACGGACTGA TGCATTCCAC TCGAGCCTTT TTAGCTGCGT GTCCGTCTCC 660AATCGCACTT CTTTTCTTAT TTCCTTGTGG GATAAATTGA TTATTTACCG TTTCGTTTTC 720TCTATATTGC GGTGGTGGTG CGACCCATCC AACTATTATT ATTATAATTG GAATTTGATT 780TGGATTTTGA TTCCTGTGAC GGATCTCAGA CCAAGTGCCT AAACTATAAC TGACTTGGAC 840CCCCTTCAGA TCCTAGCTTC CCGATTCTTT TCCACCACTG CTGCATCCTC TTCCTGCACG 900CAGCGTTCGT TTAGGGCGGG TAGACTGGAA TTTATTCCTT GCGCCACGGA CCAATCGCTC 960CCTCGACGCT CTCATTCCTG CGTCGAGCTC TTTTTCCCTC GACTCTCATT GCTTGCTGGG1020CTGGTTCTTG AACCTCTTCA ATCGTCCTTA TCTCTTTCCC CCCATCCGGC CTGTGATTCC1080TATCTTTCCT TTTTTTCTTC CCTTTCTTGT TTGATCCCCC CTCCTCCCCG TCTTATCGCC1140TACTATCGTG ATCCCCGCCC TTCCCAATAA AGAGTAGGGC GTGTGAACAT GTCCGGGTTA1200ACCCTCGGGC GAGGCCCTGG GGGCGTGCGA CCGACTCAAA CCGCAACTTT TACCACCCAC1260CACCCGTCCG CCGATGCTGA CCGCCCAAAC AACCTCCCCC CTACCTCCTC GCAGCTGTCC1320GATGACTTTT CTTTCGGTTC CCCTCTGAGC CCCGCCGACT CACAGGCCCA TGACGGCCTA1380CTTCAGGACT CCCTCTTCCC TGAATGGGGG TCTGGTGCGC CTCGACCCGG CATTGACAGT1440CCGGATGAGA TGCAGAGGCA AGATCCGTTA GCGACTCAAA TATGGAAGCT CTATTCTAGG1500ACCAAGGCCC AGTTGCCCAA CCAGGAGCGT ATGGAAAACC TGACCTGGCG GATGATGGCG1560ATGAGTTTGA AACGTAAGGA GCGGGAACGT GCTCAACAGT CCATGTAGGT GTTCTCCCTC1620TGTAGAGGAA CGGCTGGACC CGCTCATCAT TAATTTTTTT TTGTCTGTGA AGGTTTCCTG1680CGAGACGCGG TAGCTGGCCC CAGTGGTATC GCTCAACTGC GCATTTCCGA CCCGCCCGTT1740GCCACCGGTA ACCCTCAGTC AACCGACCTG ACCGCCGACC CTATGAACCT CGACGATTTC1800ATCGTGCCCT TCGAATCTCC TTCGGACCAC CCCTCGCCCA GTGCCGTCAA GATTTCCGAC1860TCCACGGCGT CCGCGGCCAT TCCCATCAAG TCCCGGAAAG ACCAGCTGAG AGATTCTACC1920CCGGTGCCGG CCTCGTTCCA CCATCCGGCT CAGGATCAAC GGAAGAACAG TGAATTTGGC1980TACGTCCCCC GTCGCGTGCG CAAGACGAGT ATCGACGAGC GTCAATTTTT CTCACTGCAG2040GTGCCGACCC GAAAGCGACC GGCCGAATCC TCGCCCCAGG TACCCCCCGT TTCCAACTCG2100ATGTTGGCCC ACGATCCGGA CCTCGCTTCC GGCGTGCCCG ATTATGCCTT GGACGCCCCG2160TCCTCGGCCT TTGGCTTCCA TCAAGGTAAC CACCATCCGG TCAATCATCA CAACCACACC2220TCCCCCGGGG CACCGTTTGG CTTGGATACG TTCGGCCTGG GAGATGATCC AATCTTGCCC2280TCCGCGGGCC CCTACCAGTC GCAATTCACC TTCTCACCCA GCGAGTCTCC GATGGCCTCC2340GGTCATCCGT TTGCGAACCT CTATTCGCAT ACCCCGGTGG CTTCGTCCCT CAACTCGACG2400GATTTCTTCT CTCCACCGCC ATCAGGCTAC CAGTCCACGG CATCCACGCC GCAGCCCACC2460TACGACGGGG ACCATTCCGT TTATTTCGAT ATGCCGTCGG GCGACGCGCG CACCCAGCGC2520CGCATTCCGA ACTATATTTC GCATCGGTCC AACTTGTCTG CTTCGCTGCA GCCTCGGTAT2580ATGTTCAACC AGAACAACCA TGAACAGGCC AGTTCGTCGA CGGTGCATTC GCCGAGCTAC2640CCCATTCCCC AGCCGCAACA TGTGGACCCC ACTCAGGTGT TGAACGCCAC CAATTACTCG2700ACCGGCAACT CCCACCATAC CGGCGCCATG TTTTCATTTG GAGCCGATTC AGATAACGAG2760GATGGCGATG GTCATCAGCT GTCCGAGCGG GCTGGTCTGG CGATGCCGAC TGAATATGGG2820GACGAGGACG GGTTCTCGTC GGGCATGCAG TGGGATGGGC AGTTCCCGGG CTCCTTCCAT2880TCGCTGCCGG GCTTTGGCCC TCAACATCGC AAGCATGTTA CCATCGGGTC CACGGACATG2940ATGGACACCC CCGAGGAGTG GAATCACGGT GGCAGTTTGG GTCGGACTCA TGGGTCGGTG3000GCTTCGGTCA GTGAGGTGCG CAACCGAGAG CAGGACCCTC GCCGGCAGAA GATTGCGCGC3060ACCACGTCCA CCCCCAATAC GGCCCAGCTG TTGCGCCAAA GCATGCACTC TAATAACAAT3120ACGTCTCATA CCTCCCCTAA TACGCCGCCC GAGTCCGCCC TGAGCAGCGC AGTTCCGTCC3180CGCCCGGCCA GTCCCGGGGG CAGCAAGAAC GGCGACCAAG GCAGCAACGG ACCGACCACC3240TGCACGAACT GCTTCACTCA AACCACTCCG CTGTGGCGTC GGAACCCAGA GGGCCAGCCA3300CTGTGCAATG CCTGCGGGTT GTTTTTGAAA TTGCACGGTG TCGTGCGCCC TCTGTCCCTG3360AAAACGGACG TTATCAAAAA GCGCAACCGT AGCAGTGCCA ACAGCTTGGC GGTTGGGACC3420TCCCGTGCGT CGAAGAAGAC AGCCCGCAAG AACTCGGTGC AGCAAGCATC CGTCACGACT3480CCGACATCAA GCCGCGCTCA GAATGGGACT TCCGAATCCC CGCCCGCCGG CTTTAGTGCT3540GCCGCGGGAC GGTCGAATGG GGTGGTACCC ATTGCCGCCG CTCCTCCGAA GGCAGCTCCC3600TCCGCAGCCG CCTCCCCTAG CACGGGCCAG ACCCGCAACC CGATCCAGGC TGCCCCGAAA3660CGTCAACGAC GGCTGGAAAA GGCCACGGAG ATGGAAACGG ACGAGGCTAA CAAGTCCGCG3720GGAGGCCGAT CCAAGGTGGT GCCTCTGGCA CCCGCCATGC CACCGGCAGC AGCCAATCCG3780GCGAACCATA GTATTGCCGG AGGCCAAGGG GCTAGTCAGG AATGGGAGTG GTTGACGATG3840AGTCTGTAAT TGCCGCGCTT ACCTCTCTAC TTCTCTACAC TCGTTTCTTA ATATCTTTCT3900TGAACCCCCC CTTATATTTT CCCACCGTTG ATGCTACGCC ATGACCGATA GAGATGATGA3960ATACTGCAAC CAATGGAATC TCGCTAGACG AGAGGTGTTA GATGACGTGG CCCGCGATGC4020ACTTAATGAG ATACGAGGAG GTGCAATGCG TTGGTTACGC TAGTTTAATG GTAACATGAC4080GAGGGATATT CGCTCTGTTA TTTCGGGCTT TGATCTGTTT CAGTCTGCGA TTTAACAGCG4140ACTGATCCTC TGCTGTGACA ATACACAGCT TGTCTTGTGG TTCTGTTGTG GCTTTCTGTT4200TGTTTGGCTG ATTTGATTTA TGCTTGATAC AATCGCGTCT GTCCGGACCC CGGCCTTTGT4260TTTGTTTTCA GTTCTGATTC TTCACTGTTT CTGATTCTCT TGTTCATGTT TTTGATTTGT4320TCAAGGCTTG GGGCCGGGCA GAAGTGCGCA TCTCTGCTTT GTGTTTTCCG TCACCGTGCA4380TAGACGCTGT ATGTATATGC TACAGCAAGA TTCTACTTAT CCAGTCTGAG CCTGTATTCA4440TTGAAGTGTA GCCAGCTGTC GAATGAGCTT TTTGACGATA TTGTTTTGTT GAGTAGTCAA4500CAAGTAGTAT CTGTATATTC CGGAGTCTAA GTAAGACACT TGAGAATAAT GTGGAGCTTC4560TCGCCCTGTC ATATATCTGA ACGCTAGCCC GTAGGCCGTG AACAAGGGTG ATAAGGATAT4620ACTAGCCTAA TGAATTGACG TCATAGCATA TAAGCTT 4657(2)SEQ ID NO:2信息(ⅰ)序列特征(A)長度853氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅸ)特征(A)名字/關鍵詞結合位點(B)位置652-676(D)其它信息/注釋=“DNA結合位點”(ⅸ)特征(A)名字/關鍵詞區(qū)(B)位置1-731(D)其它信息/注釋=“截斷的AREA仍有活性但不被L-Gln阻遏…”(xⅰ)序列的詳細情況SEQ ID NO:2:Met Ser Gly Leu Thr Leu Gly Arg Gly Pro Gly Gly Val Arg Pro Thr1 5 10 15Gln Thr Ala Thr Phe Thr Thr His His Pro Ser Ala Asp Ala Asp Arg20 25 30Pro Asn Asn Leu Pro Pro Thr Ser Ser Gln Leu Ser Asp Asp Phe Ser35 40 45Phe Gly Ser Pro Leu Ser Pro Ala Asp Ser Gln Ala His Asp Gly Leu50 55 60Leu Gln Asp Ser Leu Phe Pro Glu Trp Gly Ser Gly Ala Pro Arg Pro65 70 75 80Gly Ile Asp Ser Pro Asp Glu Met Gln Arg Gln Asp Pro Leu Ala Thr85 90 95Gln Ile Trp Lys Leu Tyr Sar Arg Thr Lys Ala Gln Leu Pro Asn Gln100 105 110Glu Arg Met Glu Asn Leu Thr Trp Arg Met Met Ala Met Ser Leu Lys115 120 125Arg Lys Glu Arg Glu Arg Ala Gln Gin Ser Ile Gly Ile Ala Gln Leu130 135 140Arg lle Ser Asp Pro Pro Val Ala Thr Gly Asn Pro Gln Ser Thr Asp145 150 155 160Leu Thr Ala Asp Pro Met Asn Leu Asp Asp Phe Ile Val Pro Phe Glu165 170 175Ser Pro Ser Asp His Pro Ser Pro Ser Ala Val Lys Ile Ser Asp Ser180 185 190Thr Ala Ser Ala Ala Ile Pro Ile Lys Ser Arg Lys Asp Gln Leu Arg195 200 205Asp Ser Thr Pro Val Pro Ala Ser Phe His His Pro Ala Gln Asp Gln210 215 220Arg Lys Asn Ser Glu Phe Gly Tyr Val Pro Arg Arg Val Arg Lys Thr225 230 235 240Ser Ile Asp Glu Arg Gln Phe Phe Ser Leu Gln Val Pro Thr Arg Lys245 250 255Arg Pro Ala Glu Ser Ser Pro Gln Val Pro Pro Val Ser Asn Ser Met260 265 270Leu Ala His Asp Pro Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Tyr Ala Leu275 280 285Asp Ala Pro Ser Ser Ala Phe Gly Phe His Gln Gly Asn His His Pro290 295 300Val Asn His His Asn His Thr Ser Pro Gly Ala Pro Phe Gly Leu Asp305 310 315 320Thr Phe Gly Leu Gly Asp Asp Pro Ile Leu Pro Ser Ala Gly Pro Tyr325 330 335Gln Ser Gln Phe Thr Phe Ser Pro Ser Glu Ser Pro Met Ala Ser Gly340 345 350His Pro Phe Ala Asn Leu Tyr Ser His Thr Pro Val Ala Sar Sar Leu355 360 365Asn Ser Thr Asp Phe Phe Ser Pro Pro Pro Ser Gly Tyr Gln Ser Thr370 375 380Ala Ser Thr Pro Gln Pro Thr Tyr Asp Gly Asp His Ser Val Tyr Phe385 390 395 400Asp Met Pro Ser Gly Asp Ala Arg Thr Gln Arg Arg Ile Pro Asn Tyr405 410 415Ile Ser His Arg Ser Asn Leu Ser Ala Ser Leu Gln Pro Arg Tyr Met420 425 430Phe Asn Gln Asn Asn His Glu Gln Ala Ser Ser Ser Thr Val His Ser435 440 445Pro Ser Tyr Pro Ile Pro Gln Pro Gln His Val Asp Pro Thr Gln Val450 455 460Leu Asn Ala Thr Asn Tyr Ser Thr Gly Asn Ser His His Thr Gly Ala465 470 475 480Met Phe Ser Phe Gly Ala Asp Ser Asp Asn Glu Asp Gly Asp Gly His485 490 495Gln Leu Sar Glu Arg Ala Gly Leu Ala Met Pro Thr Glu Tyr Gly Asp500 505 510Glu Asp Gly Phe Ser Ser Gly Met Gln Trp Asp Gly Gln Phe Pro Gly515 520 525Ser Pha His Ser Leu Pro Gly Phe Gly Pro Gln His Arg Lys His Val530 535 540Thr Ile Gly Ser Thr Asp Met Met Asp Thr Pro Glu Glu Trp Asn His545 550 555 560Gly Gly Ser Leu Gly Ar9 TAr His Gly Ser Val Ala Ser Val Ser Glu565 570 575Val Arg Asn Arg Glu Gln Asp Pro Arg Arg Gln Lys Ile Ala Arg Thr580 585 590Thr Ser Thr Pro Asn Thr Ala Gln Leu Leu Arg Gln Ser Met His Ser595 600 605Asn Asn Asn Thr Ser His Thr Ser Pro Asn Thr Pro Pro Glu Ser Ala610 615 620Leu Ser Ser Ala Val Pro Ser Arg Pro Ala Ser Pro Gly Gly Ser Lys625 630 635 640Asn Gly Asp Gln Gly Ser Asn Gly Pro Thr Thr Cys Thr Asn Cys Phe645 650 655Thr Gln Thr Thr Pro Leu Trp Arg Arg Asn Pro Glu Gly Gln Pro Leu660 665 670Cys Asn Ala Cys Gly Leu Phe Leu Lys Leu His Gly Val Val Arg Pro675 680 685Leu Ser Leu Lys Thr Asp Val Ile Lys Lys Arg Asn Arg Ser Ser Ala690 695 700Asn Ser Leu Ala Val Gly Thr Ser Arg Ala Ser Lys Lys Thr Ala Arg705 710 715 720Lys Asn Ser Val Gln Gln Ala Sar Val Thr Thr Pro Thr Ser Ser Arg725 730 735Ala Gln Asn Gly Thr Ser Glu Ser Pro Pro Ala Gly Phe Ser Ala Ala740 745 750Ala Gly Arg Ser Asn Gly Val Val Pro Ile Ala Ala Ala Pro Pro Lys755 760 765Ala Ala Pro Sar Ala Ala Ala Ser Pro Ser Thr Gly Gln Thr Arg Asn770 775 780Pro Ile Gln Ala Ala Pro Lys Arg Gln Arg Arg Leu Glu Lys Ala Thr785 790 795 800Glu Met Glu Thr Asp Glu Ala Asn Lys Ser Ala Gly Gly Arg Ser Lys805 810 815Val Val Pro Leu Ala Pro Ala Met Pro Pro Ala Ala Ala Asn Pro Ala820 825 830Asn His Ser Ile Ala Gly Gly Gln Gly Ala Ser Gln Giu Trp Glu Trp835 840 845Leu Thr Met Ser Leu850(2)SEQ ID NO:3信息(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的詳細情況SEQ ID NO:3:GGAATTCATG AGTGGCATCG C(2)SEQ ID NO:4信息(ⅰ)序列特征(A)長度22堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(xⅰ)序列的詳細情況SEQ ID NO:4:TCTAGACTAC AAACTCATCG TC(2)SEQ ID NO:5信息(ⅰ)序列特征(A)長度23堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”
(xⅰ)序列的詳細情況SEO ID NO:5:GAATTCCATG GTGTCCTCGT CGG(2)SEQ ID NO:6信息(ⅰ)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的詳細情況SEQ ID NO:6:GAATTCGAGC CGTCAGTGAG GCTC(2)SEQ ID NO:7信息(ⅰ)序列特征(A)長度27堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的詳細情況SEQ ID NO:7:GTTGCCATTG CTGCAGGCAT CGTGGTG(2)SEQ ID NO:8信息(ⅰ)序列特征(A)長度27堿基對(B)類核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓撲學線性
(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的詳細情況SEQ ID NO:8:GCCGGGCCTC TTGCGGGCGT CCATTCC(2)SEQ ID NO:9信息(ⅰ)序列特征(A)長度32堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的詳細情況SEQ ID NO:9:CATCCGTCAC GACTTAAGAT ATCAAGCCGC GC(2)SEQ ID NO:10信息(ⅰ)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的詳細情況SEQ ID NO:10:CACAGGAAAC AGTCACGAC(2)SEQ ID NO:11信息(ⅰ)序列特征(A)長度18堿基對
(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的詳細情況SEQ ID NO:11:CGTTTTCCCA GTCACGAC(2)SEQ ID NO:12信息(ⅰ)序列特征(A)長度22堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的詳細情況SEQ ID NO:12:GGGCCCGGTA CCCAATTCGC CC(2)SEQ ID NO:13信息(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的詳細情況SEQ ID NO:13:GATATCGGTT TATTGTGGCC G(2)SEQ ID NO:14信息(ⅰ)序列特征(A)長度38堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的詳細情況SEQ ID NO:14:GGTTTTTTCC ACCATGCGGC CGCAAGGTAC GTCAATTC(2)SEQ ID NO:15信息(ⅰ)序列特征(A)長度32堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的詳細情況SEQ ID NO:15:GACTTGGAGG AGTAGTTAAC GGCACATCAT TC(2)SEQ ID NO:16信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓撲學線性
(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的詳細情況SEQ ID NO:16:ATGCGGCCGC TAACCCTCGG GCGAGGCCC(2)SEQ ID NO:17信息(ⅰ)序列特征(A)長度22堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列的詳細情況SEQ ID NO:17:TTAAGTCGTG ACGGATGCTT GC
權利要求
1．一種酒曲霉菌，能表達至少比野生型米曲霉CNCM I-1882多2倍的內(nèi)和外肽酶。
2．權利要求1的酒曲霉菌，其在含0.2％大豆果實蛋白的基本培養(yǎng)基中生長時，每ml上清表達至少30mU內(nèi)切肽酶活性，至少30mU亮氨酸-氨基-肽酶活性和至少10mU脯氨酰-二肽-肽酶活性。
3．權利要求1的酒曲霉菌，在5mML-谷氨酰胺存在下能表達蛋白水解活性。
4．權利要求1的酒曲霉菌，含有areA基因當霉菌在含阻遏量的L-谷氨酰胺的基本培養(yǎng)基中生長時不被阻遏。
5．權利要求4的酒曲霉菌，其中areA基因被截斷導致C-末端截斷的AREA蛋白保持功能，但當霉菌在含阻遏量的L-谷氨酰胺的基本培養(yǎng)基中生長時不被阻遏。
6．權利要求4的酒曲霉菌，含有整合的多拷貝areA基因。
7．權利要求5的酒曲霉菌，其中areA基因可操作的連接于至少一個能指導areA基因過表達的調(diào)節(jié)序列。
8．權利要求5或6的酒曲霉菌，其中areA基因具有有序列號11189-1604和1704-3480核苷酸或其依據(jù)遺傳密碼的簡并性產(chǎn)生的功能性衍生物限定的核苷酸序列。
9．上述權利要求1-8的任何一條的酒曲霉菌，選自曲霉(Aspergillus)，根霉(Rhizopus)或毛霉(Mucor)屬。
10．權利要求9的酒曲霉菌，選自菌株米曲霉CNCM I-1881,CNCM I-1883和CNCM I-1884。
11．米曲霉的一個DNA結合蛋白(AREA)，至少具有序列號2的從氨基酸1到氨基酸731或其功能衍生物的氨基酸序列。
12．含有areA基因編碼權利要求11的蛋白的DNA分子。
13．權利要求12的DNA分子，是含有areA基因的載體。
14．權利要求12的DNA分子，其中areA基因可操作的連接于至少一個能指導所述基因表達的調(diào)節(jié)序列。
15．權利要求12的DNA分子，其中areA基因至少具有序列號11189-1604和1704-3480核苷酸或其依據(jù)遺傳密碼的簡并性產(chǎn)生的功能性衍生物限定的核苷酸序列。
16．過量產(chǎn)生蛋白水解酶的方法，包括在合適的生長培養(yǎng)基中在合適條件下培養(yǎng)權利要求1-10的酒曲霉菌使霉菌表達酶，并以濃縮形式任意地分離酶。
17．利用權利要求1-10的酒曲霉菌在水解含蛋白材料中的應用。
18．權利要求17的用途，與酶和/或提供氨酰基脯氨酸酶活性的微生物相結合。
19．權利要求17或18的用途，其中含蛋白材料包括至少5mM L-谷氨酰胺。
20．包括用權利要求1-10的酒曲霉菌發(fā)酵含有蛋白和至少5mM L-谷氨酰胺的材料得到的蛋白水解產(chǎn)物的食物產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明為獲得一種酒曲霉菌,能表達至少比野生型米曲霉CNCMI－1882多2倍的內(nèi)切和外切肽酶,特別是在含0.2%大豆果實蛋白的基本培養(yǎng)基中生長時,每ml上清表達至少30mU內(nèi)切肽酶活性,至少30mU亮氨酸－氨基－肽酶活性和至少10mU脯氨酰－二肽－肽酶活性。本發(fā)明也提供一種米曲霉的DNA結合蛋白(AREA),具有至少序列號2的從氨基酸1到氨基酸731或其功能衍生物的氨基酸序列。本發(fā)明包括含有編碼本發(fā)明的DNA結合蛋白的areA基因的DNA分子。第四方面,本發(fā)明提供過量產(chǎn)生蛋白水解酶的方法,包括在合適的生長培養(yǎng)基中在合適條件下培養(yǎng)本發(fā)明的酒曲霉菌使霉菌表達酶,并以濃縮形式選擇分離酶。另一方面,本發(fā)明提供利用本發(fā)明的酒曲霉菌水解含蛋白材料。最后一方面,本發(fā)明提供包括用權利要求1－10的酒曲霉菌發(fā)酵含有蛋白和至少5mM L－谷氨酰胺的材料得到的蛋白水解產(chǎn)物的食物產(chǎn)品。
文檔編號C12N1/14GK1237205SQ98801287
公開日1999年12月1日 申請日期1998年5月1日 優(yōu)先權日1997年7月5日
發(fā)明者P·范登布勒克, M·阿福爾特 申請人:雀巢制品公司