專利名稱：蛋白質(zhì)激酶及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼鈣依賴性蛋白質(zhì)激酶的核酸、從該核酸所生成的多肽及表達(dá)該核酸的轉(zhuǎn)基因植物。
背景技術(shù)：
在植物中，對真菌性、細(xì)菌性和病毒性病原體的疾病抗性與稱為過敏性反應(yīng)(HR)的植物反應(yīng)相關(guān)。在HR中，植物內(nèi)潛在的植物病原體侵入位點(diǎn)經(jīng)歷局部細(xì)胞死亡，假定這種局部的植物細(xì)胞死亡含有侵入的微生物或病毒，則保護(hù)了植物的剩余部分。其它的植物防御反應(yīng)包括植物抗毒素的生成，能防止病原體內(nèi)移的裂解酶的生成和修飾細(xì)胞壁以加強(qiáng)其對物理及/或酶性攻擊的抵抗力。
植物的HR可包括作為對入侵微生物的部分反應(yīng)的植物抗毒素的生成。例如，作為對微生物侵入者，例如黃瓜角斑病假單胞菌的反應(yīng)，煙草(Nicotina tabacum)產(chǎn)生倍半萜類。
多種組合物可用作植物中植物抗毒素合成的誘導(dǎo)劑。其中包括一種或多種毒性離子，例如，汞離子、其它化學(xué)上確定的組合物、代謝抑制劑、細(xì)胞壁聚糖、某些糖蛋白、某些酶、真菌孢子、脫乙酰殼多糖、某些脂肪酸和來自植物細(xì)胞壁的某些寡糖。參見，例如，Sequeira,L.(1983)微生物學(xué)年鑒，37:51-79及本文引用的參考文獻(xiàn)。某些疫霉屬類的細(xì)胞壁片斷和來自綠色木霉的纖維素酶而不是日本曲霉的溶果膠酶也可誘導(dǎo)HR。其它植物病原體或無毒性的相關(guān)菌株的攻擊也可誘導(dǎo)HR。
誘導(dǎo)素是由植物病原體和潛在的植物病原體產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。誘導(dǎo)素可誘導(dǎo)植物中的HR。一般來說(但未必如此)，局部細(xì)胞死亡是被感染(或被攻擊)的植物組織中誘導(dǎo)素誘導(dǎo)的反應(yīng)導(dǎo)致的。這些反應(yīng)介導(dǎo)了對侵入的、潛在的植物病原微生物的破壞性感染的全部或部分抗性。已公開了寄生疫霉誘導(dǎo)素的氨基酸和核苷酸編碼序列。Kamoun等(1993)，分子植物-微生物相互作用，6:573-581。
包括但不限于煙草花葉病毒的植物致病性病毒在被感染植物中誘導(dǎo)HR。感染植物的細(xì)菌也可誘導(dǎo)HR從而產(chǎn)生疾病抗性；誘導(dǎo)HR的代表性細(xì)菌包括，例如，黃單胞菌屬種類和丁香假單胞菌。植物致病性真菌在攻擊宿主植物后(例如，寄生疫霉和煙草霜霉對煙草宿主的攻擊)，一般不誘導(dǎo)HR反應(yīng)，但在攻擊非宿主植物后可誘導(dǎo)HR。
涉及疾病抗性表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制正在研究之中，而且，一些遺傳和生化特征已被列出。例如，參見Staskawicz等，科學(xué)，268:661=667(1995)。然而，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的許多方面和許多特定成分的作用尚不十分清楚。
長期以來，在本領(lǐng)域一直需要保護(hù)植物，特別是莊稼植物免遭植物病原體感染的方法。從經(jīng)濟(jì)和環(huán)境方面的觀點(diǎn)出發(fā)，尤其重要的是生物學(xué)或“自然”方法而不是依靠對莊稼植物施用化學(xué)藥品。在本領(lǐng)域中還需要增強(qiáng)及/或提高植物中疾病抗性的植物多核苷酸序列。
發(fā)明要旨本發(fā)明的核酸以新的鈣依賴性蛋白質(zhì)激酶(CDPK)基因和其相應(yīng)的蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)。這些新CDPK基困表達(dá)的誘導(dǎo)驚人的迅速，即，在誘導(dǎo)劑介導(dǎo)的誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)30分鐘后即可觀察到這些基因的mRNA轉(zhuǎn)錄。因此，本文公開的新基因?qū)儆谠趯︼@示入侵植物病原體的信號做出反應(yīng)中，最快被誘導(dǎo)的那些基因。
本文公開了一種分離的多核苷酸，它包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列和其互補(bǔ)序列，以及SEQ ID NO:1的RNA類似物或其互補(bǔ)序列。該多核苷酸也可以是長度為至少20個核苷酸，并可在嚴(yán)格條件下與編碼圖3多肽的基因組DNA雜交的上述序列的核酸片斷。該多核苷酸可包括，例如，圖2中核苷酸1至170，核苷酸160至560，或核苷酸550至920。
本文所公開的核酸構(gòu)建體包括本發(fā)明的多核苷酸。在該構(gòu)建體中，本發(fā)明的多核苷酸可與一個或多個調(diào)節(jié)該多核苷酸轉(zhuǎn)錄的元件(例如為了響應(yīng)諸如本文所述真菌(例如，疫霉屬)，細(xì)菌(例如，假單胞菌屬)，或病毒(例如，煙草花葉病毒)的植物病原體而被誘導(dǎo)的元件)有效連接。在其它實(shí)施方案中，這種誘導(dǎo)由誘導(dǎo)劑(例如，由真菌性和細(xì)菌性誘導(dǎo)劑)來介導(dǎo)。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容是轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，植物組織和已經(jīng)遺傳改造而含有并表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸(例如，編碼序列或反義序列)的植物。該構(gòu)建體可進(jìn)一步含有有效連接到該多核苷酸上的調(diào)節(jié)元件，例如，可誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)元件。該植物可以是雙子葉植物，例如，茄科的成員，如煙草。該植物也可以是單子葉植物，裸子植物，或松柏類植物。
本文公開的轉(zhuǎn)基因植物含有一種多核苷酸，它可表達(dá)具有大約250至大約550個氨基酸的多肽。該多肽含有與圖3的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。
本文公開了一種使用多核苷酸的方法。該方法包括將上述多核苷酸與來自植物的DNA或RNA雜交的步驟。該方法可進(jìn)一步包括鑒定與該多核苷酸具有大約70％以上序列相同性的植物DNA或RNA片斷的多個步驟，以及克隆至少一部分所述DNA或RNA片斷的步驟。被克隆部分可進(jìn)一步包含具有70％以上序列相同性的該片斷兩側(cè)的DNA另一方面，本發(fā)明包括一種改變植物的疾病抗性的方法。該方法包括將本發(fā)明的多核苷酸導(dǎo)入植物細(xì)胞；并從該植物細(xì)胞得到含有該多核苷酸的植物。該多核苷酸的表達(dá)改變了植物的疾病抗性。例如，所述的核酸構(gòu)建體可進(jìn)一步含有與該多核苷酸有效連接的可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)元件，且當(dāng)該植物與誘導(dǎo)劑或植物病原體接觸時可由該調(diào)節(jié)元件誘導(dǎo)表達(dá)。
在另一方面，本發(fā)明包括一種分離的多肽，它具有大約250至大約500個氨基酸，且具有與圖3基本上相同的氨基酸序列。
可誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)元件是能夠調(diào)節(jié)與之有效連接的多核苷酸的表達(dá)的DNA序列。例如，可將與植物防御反應(yīng)(例如，過敏反應(yīng))相關(guān)的CDPK基因產(chǎn)物與發(fā)育調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)元件有效連接。該術(shù)語還包括足以在響應(yīng)與疾病相關(guān)的外部信號或試劑(例如，病原體或誘導(dǎo)劑類誘導(dǎo)信號和本文所述的試劑)時使得可誘導(dǎo)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)元件。該術(shù)語中還包括那些在新COPK基因兩側(cè)且涉及該新基因轉(zhuǎn)錄被迅速誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)元件。一般來說，防御反應(yīng)調(diào)節(jié)元件位于基因編碼區(qū)5’端，但不限于此。
“組織特異性”是指與在另一組織(例如，韌皮部)相比，在某組織(例如，木質(zhì)部組織)中能優(yōu)先增強(qiáng)基因產(chǎn)物(例如，rnRNA分子或多肽)的表達(dá)?！凹?xì)胞特異性”是指與在另一細(xì)胞(例如，表皮細(xì)胞)相比，在一種細(xì)胞(例如，薄壁組織細(xì)胞)中能優(yōu)先增強(qiáng)基因產(chǎn)物(例如，mRNA分子或多肽)的表達(dá)。
“病原體”指一種感染活植物組織細(xì)胞或與其相接觸時可引起疾病的生物?！罢T導(dǎo)劑”是能引發(fā)植物防御反應(yīng)的任何分子。誘導(dǎo)劑的例子包括但不限于一種或多種毒性離子(例如，汞離子)，其它化學(xué)上確定的組合物、代謝抑制劑、細(xì)胞壁聚糖、某些糖蛋白、某些酶、真菌孢子、脫乙酰殼多糖、某些脂肪酸和來自植物細(xì)胞壁的某些寡糖，還有誘導(dǎo)素(例如，harpin、cryptogein和parasiticein)。
“有效連接”是指兩個多核苷酸的連接方式使得這兩個多核苷酸實(shí)現(xiàn)所需的功能活性，例如，將可誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)序列與編碼序列連接，從而在存在合適的誘導(dǎo)劑分子時獲得基因的表達(dá)。
除非另有說明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語其意義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同。盡管在本發(fā)明的實(shí)施或試驗(yàn)中可使用相似于或相當(dāng)于本文的那些方法和材料，但合適的方法和材料如下文所述。本文提及的所有出版物、專利中請、專利和其它參考文獻(xiàn)以其全文作為參考文獻(xiàn)引用。如有抵觸，本說明書(包括定義)將會解決。另外，材料、方法和實(shí)施例僅僅是說明性的而不是限定性的。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)通過下面對其優(yōu)選實(shí)施方案的描述及其后的權(quán)利要求書而變得顯而易見。
附圖簡述

圖1表示引物FokinB和RecalⅣ的核苷酸序列。
圖2表示由煙草品種KYI4外植體產(chǎn)生的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物在誘導(dǎo)素parasiticein存在下生長后，從中分離的部分cDNA克隆的DNA序列(SEQ IDNO:1)。
圖3表示從圖2的DNA序列推斷的氨基酸序列，使用標(biāo)準(zhǔn)單字母氨基酸代碼。
圖4是圖3的氨基酸序列與大豆CDPK的氨基酸序列的比較圖示本發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明涉及在植物細(xì)胞內(nèi)在響應(yīng)潛在植物病原體的侵入和/或用誘導(dǎo)劑或模擬誘導(dǎo)劑類化學(xué)信號處理時被誘導(dǎo)的分離的多核苷酸(核酸)。該核酸總是編碼鈣依賴性蛋白質(zhì)激酶(CDPK)多肽或CDPK相關(guān)性多肽。本文公開的新多核苷酸的誘導(dǎo)在時間上與植物防御反應(yīng)基因的相對應(yīng)，而其它CDPK基因的誘導(dǎo)似乎并不如此迅速。該新基因的表達(dá)的誘導(dǎo)比植物內(nèi)涉及發(fā)育調(diào)節(jié)過程(例如，諸如花發(fā)育之類發(fā)育調(diào)節(jié)過程)基因的表達(dá)誘導(dǎo)更迅速。本文公開的新CDPK基因的誘導(dǎo)也比涉及應(yīng)激反應(yīng)(例如鹽或水應(yīng)激)的許多基因的誘導(dǎo)更迅速。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式的，包括cDNA，合成DNA或基因組DNA。所述的DNA可以是雙鏈或單鏈的，如果是單鏈，可以是編碼鏈或非編碼鏈。SEQ ID NO:1的RNA類似物可以是，例如，mRNA或是核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸的組合物。
本發(fā)明的多核苷酸可編碼含有與圖3的氨基酸序列基本上相似或相同的氨基酸序列的多肽。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸可以是SEQ ID NO:1所示核酸的變體，例如，可因遺傳密碼子的簡并性具有不同的核苷酸序但編碼與圖3多肽相同的氨基酸序列。
本發(fā)明的多核苷酸可進(jìn)一步包括其它核酸序列。例如，編碼分泌或前導(dǎo)氨基酸序列的核酸片斷可在讀碼框內(nèi)融合至含有圖3氨基酸序列的多肽的氨基末端。本領(lǐng)域已知還有其它的核酸片段，可用于在閱讀碼框內(nèi)融合到本文公開的CDPK多肽上。參見，例如美國專利5,629,193。多核苷酸可進(jìn)一步包括有效連接到本文公開的CDPK多核苷酸上的一個和多個調(diào)節(jié)元件。
本發(fā)明也包括選擇性地與本文公開的CDPK多核苷酸序列雜交的多核苷酸。雜交可使用Southern分析(Southern印跡)，該方法鑒定靶核酸混合物中DNA序列的存在是通過其與標(biāo)記的寡核苷酸或DNA片斷探針的雜交。Southern分析總是包括DNA消化產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的電泳分離，在電電泳分離后的DNA變性以及將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素、尼龍或其它合適的膜支持物上，以便如Sambrook等，(1989)分子克隆，第2版，第9.37-9.52章節(jié)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室，Plainview,NY.)所述，以放射標(biāo)記、生物素標(biāo)記或酶標(biāo)記的探針來進(jìn)行分析。
多核苷酸可在中等嚴(yán)格條件或在高度嚴(yán)格條件下與本文公開的多核苷酸雜交。高度嚴(yán)格條件用于鑒定與探針具有高度同源性或序列相同性的核酸。高度嚴(yán)格條什包括在雜交中使用諸如甲酰胺的變性劑，例如，50％的甲酰胺與0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM pH6.5的磷酸鈉緩沖液(內(nèi)含750mM NaCl和75mM檸檬酸鈉)，42℃。另一例子使用42℃,50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl,0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH6.8)、0.1％焦磷酸鈉、5×Denhardt氏溶液、超聲處理的魚精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS，和10％的硫酸葡聚糖，在42℃下以0.2×的SSC和0.1％SDS洗滌。或者，也可采用低離子強(qiáng)度和高溫來洗滌，例如，0.015M NaCl/0.0015M檸檬酸鈉(0.1×的SSC)；0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS),65℃下進(jìn)行。
中等嚴(yán)格條件是用于鑒定與在高度嚴(yán)格條件下鑒定的核酸相比與探針的同源性或相同性較小的核酸的雜交條件。中等嚴(yán)格條件可包括使用與用與高度嚴(yán)格雜交所用的的離子強(qiáng)度和溫度相比，更高的離子強(qiáng)度和/或更低的溫度來洗滌雜交膜，例如，可在50℃下使用含有0.060MNaCl/0.0060M檸撩酸鈉(4×SSC)和0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)的洗滌溶液，最后在1x的SSC中，于65℃洗滌一次?；蛘?，可在37℃下，在用1xSSC中進(jìn)行雜交洗滌。
雜交也可用Northern分析(Northern印跡)進(jìn)行，該方法用于鑒定與探針雜交的RNA。探針以放射性同位素(例如32P)標(biāo)記，以生物素標(biāo)記或以酶標(biāo)記。待分析的RNA可在瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠上經(jīng)電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素，尼龍或其它合適的膜上，然后使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(諸如Sambrook等，同上，第7.39-7.52章節(jié)中所述)與探針雜交。
一般來說，優(yōu)選使用至少長約20個核苷酸的探針，以至少長約50個核苷酸的為佳，至少長約100個核甘酸的更好。如果要使用相對較短的探針，所述探針的核苷酸序列宜避免植物CDPK基因中的保守區(qū)域(蛋白質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域和鈣結(jié)合區(qū))，以便更容易將本文公開的迅速誘導(dǎo)的CDPK基因與誘導(dǎo)遲緩的CDPK基因、組成型CDPK基因或低水平的組成型CDPK基因相區(qū)分。然而，只有在探針中存在足夠的對本文公開的新多核苷酸具有更大特異性的非保守性區(qū)域時，才能使用含該保守區(qū)域的探針。
本發(fā)明多核苷酸與SEQ ID NO:1具有至少約70％的序列相同性，以至少約80％的序列相同性為佳，至少約90％的序列相同性更好。序列相同性可被測定，例如，通過設(shè)計(jì)來完成單個和多個序列排列對齊的計(jì)算機(jī)程序來測定。在本發(fā)明中包括與SEQ ID NO:1多核苷酸具有至少約70％核苷酸序列相同性的多核苷酸，而且它們可經(jīng)過在中等嚴(yán)格條件下雜交來鑒定。與SEQ ID NO:1的多核苷酸具有至少約80％序列相同性，或至少約90％序列相同性，或至少約95％序列相同性的多核苷酸可經(jīng)過高度嚴(yán)格雜交來鑒定。
本發(fā)明的多核苷酸可經(jīng)過化學(xué)合成、從植物基因組DNA中分離并克隆，或本領(lǐng)域已知的其它方法(包括使用與SEQ ID NO:1某些部分對應(yīng)的寡核苷酸進(jìn)行的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù))來獲得。PCR指這樣一種過程或技術(shù)，在其中，靶核酸序列以類似于美國專利號4,683,95(本文引用以供參考)所述的方式，以及后來對其中所述程序的修改被擴(kuò)增。一般來說，采用來自感興趣區(qū)域的兩端或之外的序列信息來設(shè)計(jì)與待擴(kuò)增的模板的相反鏈序列相同或相似的寡核苷酸引物。PCR可用于從總基因DNA、和從總細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄的cDNA、噬菌體或質(zhì)粒序列等中擴(kuò)增特異性RNA序列、特異性DNA序列?；蛘?，預(yù)期，可使用來白圖3所示CDPK序列內(nèi)親水區(qū)的肽序列制備CDPK特異性抗體，用所述抗體和本領(lǐng)域已知的技術(shù)來篩選cDNA文庫(在表達(dá)載體內(nèi))。
幾乎可在所有植物中發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的新多核苷酸，包括豆科的成員(例如，大豆)、茄科的成員(例如，煙草)、蕓苔科的成員(例如，擬南芥)和禾本科(Graminaceae)的成員(例如，玉米)。優(yōu)造的是，本發(fā)明的多核苷酸選自茄科。
在一些實(shí)施方案中，根據(jù)核苷酸序列同源性，以及根據(jù)在經(jīng)誘導(dǎo)劑或病原體處理后表達(dá)的迅速被誘導(dǎo)，從植物中鑒定并分離得到本發(fā)明的多核苷酸。例如，在中等至高度嚴(yán)格條件下，使用本文公開的多核苷酸探針進(jìn)行的DNA:DNA雜交可從其它植物種類鑒定到相應(yīng)的基因。使用在誘導(dǎo)防御反應(yīng)后較短時間內(nèi)從某組織制備的靶核酸(例如，cDNA)有利于分離出本文公開的新多核苷酸，因?yàn)樵摱嗪塑账嵋话惚绕渌麮DPK基因更迅速地被誘導(dǎo)。
核酸構(gòu)建體體包含本文公開的多核苷酸，并且一般與另一不同的多核苷酸相連。例如，全長CDPK編碼序列可在讀碼框中有效連接到一核酸片斷上，該核酸片段編碼先導(dǎo)序列、分泌序列或其它可有效連接到多肽和肽片斷上的其它氨基酸序列。
在一些實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體包括以有義或反義方向有效連接到至少一個合適的調(diào)節(jié)序列上的本發(fā)明多核苷酸。調(diào)節(jié)序列本身一般不編碼基因產(chǎn)物。但是，調(diào)節(jié)序列影響編碼序列的表達(dá)水平。調(diào)節(jié)序列的例子在本領(lǐng)域是已知的，且包括但不限于最小啟動子和響應(yīng)誘導(dǎo)劑而被誘導(dǎo)的基因的啟動子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地分離得到本文公開的多核苷酸序列的天然調(diào)節(jié)并用于本發(fā)明的構(gòu)建體中。合適的調(diào)節(jié)序列的其它例子包括增強(qiáng)子或增強(qiáng)子類元件、內(nèi)含子、諸如聚A列的3’端非編碼區(qū)，以及本文討論的其它調(diào)節(jié)序列。用于制備這類嵌合基因分子的生物學(xué)技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的。
本發(fā)明的多肽具有約250至約500個氨基酸，例如，約300個氨基酸至約508個氨基酸，或約308個氨基酸至約500個氨基酸。本發(fā)明的多肽一般含有蛋白質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域以及鈣結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域包括，例如，圖3的氨基酸2至7、42至49、191至202、227至238、264至274以及297至307。
所述多肽的氨基酸序列可包括圖3的推斷氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包括與圖3氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，例如，約80％以上的序列相同性，或約90％以上的序列相同性，或約95％以上的序列相同性。一般來說，可保守性氨基酸取代或似氨基酸取代是可以耐受相，并不影響蛋白質(zhì)能。相似氨基酸指那些大小或帶電特征相似的氨基酸。例如，異亮氨酸和纈氨酸是相似氨基酸。在本領(lǐng)域中已經(jīng)以許多方式評價了氨基酸對之間的相似性。例如，Dayhoff等(1978)在，蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖表集，Vol.5，增刊3,pp.345-352中提供了可用作衡量氨基酸相似性的氨基酸取代頻率表。蛋白質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域和鈣結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域可通過保守性取代而改變，但一般予以保留而不改變其氨基酸序列。
“分離的”多肽以不同于該多肽天然表達(dá)和生成的方式和環(huán)境而表達(dá)和生成。例如，當(dāng)某多肽在細(xì)菌或真菌中表達(dá)和生成時，該多肽是分離的。同樣的，當(dāng)某多肽的編碼基因有效連接到嵌合調(diào)節(jié)元件上并在不會天然表達(dá)該多肽的組織或種類中表達(dá)時，該多肽是分離的。另外，當(dāng)某多肽的編碼基因有效連接到嵌合調(diào)節(jié)元件上并在天然表達(dá)該多肽的組織中以更高的水平表達(dá)時，該多肽是分離的。本發(fā)明的多肽也可用標(biāo)準(zhǔn)純化方法分離獲得，使其具有約80％以上的純度，或約90％以上的純度，或約95％以上的純度。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是含有圖3推斷氨基酸序列的多肽的類似物或變異體。該類似物或變異體包括基本上不改變該多肽功能的例如天然存在的等位變異體、非天然存在的等位變異體、缺失變異體和插入變異體。
本發(fā)明的多肽可包含圖3所示的序列以及側(cè)翼氨基末端和羧基末端序列，編碼氨基末端和羧基末端序列的基因與含有SEQ ID NO:1核苷酸序列的基因相同?；蛘?，嵌合多肽可如此來生成，該基因?qū)⒌谝籆DPK基因5’區(qū)的核苷酸與第二CDPK基因3’區(qū)的核苷酸在讀碼框中連接，從而形成編碼嵌合多肽的嵌合基因。嵌合CDPK多肽的一個說明性的例子是由如下多核苷酸表達(dá)的多肽，該多核苷酸編碼大豆CDPK基因氨基末端區(qū)氨基酸1至156(圖4)，后接圖3的氨基酸序列，再后接同一大豆CDPK基因羧基末端區(qū)氨基酸465至508(以上全部以讀碼框內(nèi)形式融合)。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物含有本文所述的核酸構(gòu)建體。該構(gòu)建體被導(dǎo)入植物細(xì)胞并獲得至少一種轉(zhuǎn)基因植物。從該轉(zhuǎn)基因植物得到的種子可生長并自花授粉(或異型雜交或自花授粉)以獲得該構(gòu)建體純合的植物?？煞治龇N子以鑒定具有所需構(gòu)建體表達(dá)的那些純合子。轉(zhuǎn)基因植物可列入育種計(jì)劃，例如，以增加種子，將新構(gòu)建體漸滲入其它品系或種類，或用于進(jìn)一步選擇其它所需特性?；蛘?，轉(zhuǎn)基因植物可通過對轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖來獲得，當(dāng)然，這僅對于那些適用于該技術(shù)的種類而言。
本文的轉(zhuǎn)基因植物也指起始轉(zhuǎn)基因植物后代。后代包括特定植物或植物品系的后代，例如，在瞬間植物(instant plant)上形成的種子。瞬間植物(instant plant)的后代也包括在F1、F2、F3、及其子代植物上形成的種子，或在BC1、BC2、BC3及子代植物上形成的種子。
在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物含有一個構(gòu)建體，該構(gòu)建體含有以有義方向有效速接到合適調(diào)節(jié)元件上的本發(fā)明的多核苷酸，從而產(chǎn)生有義mRNA。如果需要，為了有利于鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織，可將可選擇的標(biāo)記基因插入該構(gòu)建體中。
在植物中抑制新的CDPK基因也是有用的。例如，在種子莊稼收獲前不久抑制CDPK基因表達(dá)可使植物病原體更容易侵入植物營養(yǎng)組織，從而減少對獲取種子的機(jī)制造成干擾的植物生物量。CDPK基因表達(dá)的受控抑制可通過將本發(fā)明的多核苷酸以反義方向有效連接到合適的可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)序列上來實(shí)現(xiàn)。參見，例如，美國專利5,453,566的。通過共抑制可實(shí)現(xiàn)同樣的效果，即，新CDPK基因整個和部分編碼序列在以有義方向表達(dá)可抑制相應(yīng)的內(nèi)源性CDPK基因。例如，參見，WO94/11516。
在一些安施方案中，核酸構(gòu)建體包括有效連按到最小啟動子上的本文公開的多核苷酸。當(dāng)該構(gòu)建體被導(dǎo)入植物并在其中表達(dá)時，該構(gòu)建體可提供多核苷酸低水平的組成型表達(dá)，導(dǎo)致植物的系統(tǒng)防御反應(yīng)增強(qiáng)。最小啟動子含有RNA聚合酶結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起動所必須的DNA序列信號。一般來說，在植物組織內(nèi)，最小啟動子指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄較少，且不對環(huán)境或發(fā)育性信號發(fā)生陽性或陰性的反應(yīng)。適用于植物的最小啟動子的例子是截短的CaMV35S啟動子，它含35S轉(zhuǎn)錄單元的-90到+8區(qū)域。
可用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列來控制懸浮培養(yǎng)物中的基因表達(dá)。例如，含有轉(zhuǎn)錄起始信號、可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件的EAS4啟動子可用來在轉(zhuǎn)基因植物或懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物中介導(dǎo)本發(fā)明所公開的編碼序列的誘導(dǎo)型表達(dá)。參見美國專利申請系列號08/577,483。需要時，感興趣的編碼序列的表達(dá)可通過應(yīng)用誘導(dǎo)劑或其它誘導(dǎo)信號來誘導(dǎo)。
用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因技術(shù)包括但不限于土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、電穿孔和粒子槍轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化技術(shù)的說明性例子可參見美國專利5,204,253(粒子槍)和美國專利5,188,958(土壤桿菌)。利用土壤桿菌種類的Ti和Ri質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方法通常使用雙重型載體。Walkerpeach,C.等，植物分子生物學(xué)手冊，S.Gelvin和R.Schilperoort編輯，Kluwei Dordrecht,C1:1-19(1994)。
在一些實(shí)施方案中，可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可偶聯(lián)到在植物中有功能的啟動子序列上，兩者都與本發(fā)明的多核苷酸有效連接。當(dāng)，所述的調(diào)節(jié)元件偶聯(lián)到啟動子上時，通常使用載短的(或最小)啟動子，例如，花椰菜花葉病毒(CaMV)d截短的S3啟動子。也可使用其它組成型啟動子的截短式，例如，根癌土壤桿菌T-DNA基因(如，nos、cos)。
將DNA導(dǎo)入單子葉和雙子葉植物的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，培養(yǎng)這些植物組織和再生這些組織的技術(shù)也是如此。已成功轉(zhuǎn)化和再生的單子葉植物包括小麥、玉米、黑麥、水稻和蘆筍。參見，例如，美國專利5,484,956和5,550,318。已制備了轉(zhuǎn)基因白楊(aspen)組織且再生了轉(zhuǎn)基植物。并已轉(zhuǎn)化了白楊(poplar)。處理，轉(zhuǎn)化和再生裸子植物的技術(shù)也是已知的。參見，例如，美國專利號5,122,466和5,041,382。
根據(jù)本發(fā)明的方法包括將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞，并從這種被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生成植物。存在于構(gòu)建體內(nèi)的多核苷酸的表達(dá)改變了植物的疾病抗性表型，例如，賦予植物新的疾病抗性表型或增強(qiáng)已有的疾病抗性表型。
疾病抗性表型涉及轉(zhuǎn)基因植物中宿主防御反應(yīng)的水平和時間。表明疾病抗性的試驗(yàn)已被改變成一般包括對轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)用可常規(guī)誘導(dǎo)防御反應(yīng)的化合物，以及平行地給對照植物應(yīng)用相同化合物。對照植物一般與導(dǎo)入新核酸構(gòu)建體的植物來自相同的親本品系。當(dāng)轉(zhuǎn)基因植物中的抗性水平高于對照植物中的相應(yīng)抗性時，本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)增強(qiáng)了或賦予了植物疾病抗性。參考具體病原體，例如，疫霉屬種類，可測量疾病抗性。也可參考數(shù)種病原體類測量疾病抗性以鑒定系統(tǒng)防御反應(yīng)的增強(qiáng)。
如果需要誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)與誘導(dǎo)介導(dǎo)的調(diào)節(jié)元件有效連接的CDPK編碼序列，誘導(dǎo)劑一般必須穿透植物的外皮以產(chǎn)生誘導(dǎo)效果?？墒怪参锝M織受傷來利于或允許誘導(dǎo)劑被吸收進(jìn)植物組織。許多種類的誘導(dǎo)組合物，包括誘導(dǎo)劑和其它化學(xué)信號(例如乙烯和茉莉酮酸甲醋的組合物)可有效用于誘導(dǎo)表達(dá)。
使用本發(fā)明的多核苷酸的方法包括將該多核苷酸與來自植物的DNA或RNA雜交的步驟。雜交可如前文所述進(jìn)行。該方法可進(jìn)一步包含鑒定與該多核苷酸具有顯著程度的序列相同性(例如，70％的序列相同性，以80％序列相同性、90％妁序列相同性或95％的序列相同性為佳)的植物DNA或RNA片斷的步驟。通過電泳分離植物DNA或RNA，并使用經(jīng)標(biāo)記的多核苷酸探針，導(dǎo)致在同源片斷位置產(chǎn)生可見帶，如此可鑒定該片斷。片斷可通過例如物理剪切或經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶消化來產(chǎn)生。片斷長度可短至100bp(核苷酸)，但典型的片斷至少為1000bp,且可以是10,000bp以上。
該方法可進(jìn)一步包括克隆至少部分DNA或RNA片斷的步驟(包括但不限于同源片斷的側(cè)翼DNA)。該側(cè)翼DNA可包括啟動子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件和聚A序列。側(cè)翼DNA可以在同源片斷的5’末端或者3’末端，且宜包括編碼序列前的300或600，或1000bp的DNA，因?yàn)檎{(diào)節(jié)元件一般存在于這一范圍內(nèi)。
本文公開的新多核苷酸側(cè)翼的啟動子和其它誘導(dǎo)劑或病原體反應(yīng)性調(diào)節(jié)元件特別有用，因?yàn)樵谟貌≡w和誘導(dǎo)劑處理后，這些元件非常迅速地誘導(dǎo)基因的表達(dá)。這些調(diào)節(jié)元件可有效連接到有用的基因上，從而迅速生成所需的化合物。例如，該調(diào)節(jié)元件可用于啟動編碼抗體、血液凝集因子、抗原肽、病毒復(fù)制酶或衣殼蛋白，和涉及次級代謝物合成(例如類異戊二烯的生物合成)的酶的基因的表達(dá)。參見，例如，美國專利5612487美國專利杓5484719；和1995年12月22日申請的美國專利08/577483。
將具有誘導(dǎo)劑或病原體反應(yīng)元件的嵌合基因?qū)胫参锖?，可用合適的病原體或誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)嵌合基因產(chǎn)物的表達(dá)。于是，迅速生成所需的基因產(chǎn)物(或其酶促終產(chǎn)物)，然后可獲得所需產(chǎn)物。
下面的實(shí)施例將進(jìn)一步描述本發(fā)明，但它不會限制權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明范圍。
實(shí)施例下面的實(shí)施例在植物組織重組DNA的操作中，在轉(zhuǎn)基因植物的培養(yǎng)和再生中使用了許多分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知且理解的技術(shù)。酶從商業(yè)來源獲得并根據(jù)制造商的建議或本領(lǐng)域已知的其它變化使用。試劑、緩沖液和培養(yǎng)條件也是本領(lǐng)域已知的。所用的縮寫和命名在本領(lǐng)域是標(biāo)準(zhǔn)的，且常用于專業(yè)雜志中，例如本文所引用的那些雜志中。
實(shí)施例1煙草CDPK cDNA的克隆通過在大腸桿茵細(xì)胞中表達(dá)疫霉屬parA1基因和從壁膜間隙分離基因產(chǎn)物制備誘導(dǎo)劑parasiticein。
基本上按照Xu,J.等，遺傳學(xué)動態(tài)10:226-227(1994)所述，從菌絲體分離疫霉屬O族的基因組DNA。剪切DNA并用作PCR擴(kuò)增parA1基因的模板，使用根據(jù)Kamoun,S.等，分子植物-微生物相互作用，6:573-581(1993)報(bào)導(dǎo)的parA1序列設(shè)計(jì)的引物。將parA1 PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)pBluescript(Stratagene,San Diego,CA)，并使用雙脫鏈終止法經(jīng)過雙鏈DNA測序確定該產(chǎn)物的序列。
利用PCR擴(kuò)增pBluescript內(nèi)的parA1插入片段，該P(yáng)CR使用產(chǎn)生N端組氨酸標(biāo)記和基因5’末端的蛋白質(zhì)位點(diǎn)的引物。將PCR產(chǎn)物連接到表達(dá)載體pET28b(Novagen,Madison,WI)中，在證實(shí)parA1融合物的DNA序列后，將pET28b構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21內(nèi)。
含有parA1融合物的BL21培養(yǎng)物在卡那霉素存在下，于37℃生長至OD600值達(dá)0.3。加入IPTG(1mM)，培養(yǎng)物再在27℃培養(yǎng)5小時。
基本上按照Ausubel,P.等在分子生物學(xué)常用方法，John Wiley&Sons,NewYork(1989)所述，利用滲透休克制備周質(zhì)蛋白。離心收獲細(xì)胞(1.5ml)，重懸于500μl的50mM Tris-HCl,pH8.0,20％蔗糖、1mM EDTA中，并在室溫下振蕩培養(yǎng)10分鐘。離心后，沉淀重懸于200μl冰冷的MgSO4中，并在4℃振蕩培養(yǎng)10分鐘。離心混合物，所得上清液(含周質(zhì)蛋白質(zhì))上樣在Ni++柱上。根據(jù)廠家說明書，從柱中純化parA1蛋白質(zhì)。以Bradford方法測定parA1提取物中的蛋白質(zhì)濃度。
在迅速生長期，以2μg/ml終濃度的parasiticein處理煙草變種(Nicotianatabacum L.cv.)KY14細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物，以誘導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)基因。未用parasiticein處理的平行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物用作對照。加入誘導(dǎo)劑后0、30、60和120秒后經(jīng)溫和的真空抽濾收集細(xì)胞。
從處理的和未處理的煙草細(xì)胞分離總RNA，并用作靶向區(qū)別展示逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(TDDR-PCR)的模板。用來自Invitrogen的cDNA循環(huán)試劑盒(San Diego,CA)產(chǎn)生第一鏈cDNA。然后將第一鏈cDNA用作PCR的模板。除使用58℃的退火溫度外，使用在PCR方法方法和應(yīng)用指南，Innis,M.,Gelfand,D.,Sminsky,J.和White,T.編輯，學(xué)術(shù)出版公司，San Diego,CA(1990)中所述的典型條件進(jìn)行PC反應(yīng)。PCR引物為FokinB(GTTGACTCCCTACCCTCTT)RecalⅣ(GGTACTTAGGAAGTGTTACGGG)。參見圖1。在1％(w/w)瓊脂糖凝膠上電泳分離PCR產(chǎn)物，從處理了60分鐘的培養(yǎng)物中得到的大于約800堿基對(bp)的產(chǎn)物經(jīng)電洗脫到DE-81濾紙(Whatman)上而被純化。用Klenow聚合酶補(bǔ)齊純化的PCR產(chǎn)物末端，連接到pBluescript中的EcoRV位點(diǎn)，并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌TBl。
篩選氨芐青霉素抗性的TBl菌落，確認(rèn)存在插入pBluescript內(nèi)的≥800bp的DNA片斷。根據(jù)Sanger等，(1977)美國科學(xué)院學(xué)報(bào)，74:8073-8077所述的雙脫氧核苷酸鏈終止法，用來自美國生化公司(Cleveland,OH)的Sequennase試劑盒或自動熒光基礎(chǔ)系統(tǒng)(應(yīng)用生物系統(tǒng)，F(xiàn)oster City,CA)，確定了一段這類插入片段的序列。在兩條鏈上測定了載體中插入片的序列。含有該插入片斷的質(zhì)粒命名為pCDPK-1。
pCDPK-1中插入片斷的核苷酸序列顯示在圖2中，該插入片斷的推斷氨基酸序列顯示在圖3中。將推斷氨基酸序列與GenBank,EMBL和瑞士Prot數(shù)據(jù)庫中的植物基因的氨基酸序列進(jìn)行了比較。發(fā)現(xiàn)與植物CDPK多肽(包括來自櫓豆、擬南芥、Vigna radiaia、玉米和西葫蘆的多肽具有同源性。
使用BLASTP程序和BLOSUM62計(jì)分模板，在多肽的氨基末端部分鑒定了與絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域同源的兩個區(qū)域，在多肽的羧基末端部分鑒定了與Ca++結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源的四個區(qū)域。圖4顯示了圖3的氨基酸序列與大豆CDPK氨基酸序列(Genbank登記號NO:M64987)的比較。煙草鈣結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸序列與大豆CDPK中相應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸序列相似。然而，在該序列的其它部分有明顯的區(qū)別。比較顯示，大豆CDPK和CDPK-1之間存在約伯75％的總序列相同性。
BLASTN程序用于比較pCDPK-1核苷酸序列與各種數(shù)據(jù)庫中的核酸序列。根據(jù)其它植物CDPK基因的核酸序列和由其編碼的多肽長度，估計(jì)存在于pCDPK-1內(nèi)的核酸插入片斷缺少約560bp的5bp的CDPK-15’端編碼序列和約130bp的CDPK-13’端編碼序列。
實(shí)施例2分離全長cDNA克隆為了獲得全長克隆，使用RACE(cDNA末端快速擴(kuò)增法)方案，用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后從煙草細(xì)胞制備的聚A+RNA作為模板。按實(shí)施例1該制備聚A+RNA。
具有序列GAC AAG GAC GGG AGT GGG TAT(引物A,CDPK-1內(nèi)部)的引物和具有序列GAC TCG AGT CGA CAT CGA TTT TTT TTT TTT TTTTT(dT17銜接引物)的引物用于擴(kuò)增CDPK編碼序列的3’末端。逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)在含2μl 10XRTC緩沖液、10單位RNA酶蛋白抑制劑(RNasin)(Promega Biotech)、0.5μgdT17銜接引物和10單位AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(生命科學(xué))在3.5μl的總體積中進(jìn)行，如Frohman,M.，在PCR方法方法和應(yīng)用指南(出處同上)，pp.28-38中所述。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在5μl 10XPCR緩沖液、5μl DMSO、5μl 10X dNTPs(各為15mM)、30μl H2O、1μl銜接引物(25pmol,GAC TCG AGT CGA CAT CG)、1μl引物A和1-5μl cDNA中進(jìn)行。循環(huán)次數(shù)如Frohman(出處同上)同所述。
使用10pmol引物B(AGG GGC TAC GTA GTA AGG ACT)代替dT17銜接引物，按上文所述進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄來克隆CDPK偏碼序列的5’端。按Frohman(出處同上)所述，使用末端轉(zhuǎn)移酶和dATP延伸cDNA產(chǎn)物，然后用1pmole dT17銜按引物、10pmole銜接引物和10pmole引物C(ATT CTC AGG CTT AAG GTC CCT)按上文所述通過PCR來浙增。在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行PCR(Back等，(1994)生物化學(xué)和生物物理學(xué)集刊(Arch.Biochem.Biophys.)315:523-532)。擴(kuò)增的3’端和5’端產(chǎn)物經(jīng)平端克隆進(jìn)Bluescript SK(Stratagene)，并使用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)與pCDPK-1插入片斷組合以形成煙草CDPK編碼序列的全長cDNA。
按實(shí)施例1所述，以雙脫氧核苷酸鏈終止法測定全長cDNA的DNA序列。
實(shí)施例3在煙草懸浮培養(yǎng)物中誘導(dǎo)CDPK同源性RNA將pCDPK-1中的DNA插入片斷用作探針，以跟蹤響應(yīng)誘導(dǎo)劑的基因表達(dá)的誘導(dǎo)。按實(shí)施例1所述，用parasiticein處理煙草變種(Nicotiana tabacum L.cv.)KY14細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物0、1/2、1、2、6和12小時.分離總RNA并在1％瓊脂糖凝膠上電泳。以隨機(jī)引物法放射性標(biāo)記pCDPK-1插入片斷，并如Sambrook,J.等所述(出處同上)與凝膠分離的RNA雜交。在誘導(dǎo)劑處理前檢測不到與CDPK-1雜交的mRNA，而在誘導(dǎo)劑處理后1/2、1和2小時可容易地檢測到與CDPK-1雜交的mRNA。在誘導(dǎo)劑處理后6和12小時不能檢測到與CDPK-1雜交的mRNA，表明到大約6小時時，CDPK-1)基因的表達(dá)已降低到檢測不到的水平。
實(shí)施例4嵌合CDPK基因的構(gòu)建用化學(xué)合成的編碼圖6大豆CDPK氨基酸1至156的DNA，化學(xué)合成的編碼圖6大豆CDPK氨基酸465-508d DNA，和pCDPK-1的CDPK插入片斷構(gòu)建一CDPK基因。以常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)連接這三段DNA以形成一嵌合CDPK編碼序列，該序列在氨基末端具有大豆CDPK氨基酸1至156，在讀碼框內(nèi)融合到煙草CDPK氨基酸1至307(圖3)，后者再在讀碼框內(nèi)融合到在大豆CDPK羧基末端的氨基酸465至508上。
將嵌合編碼序列以有義方向插入含有最小35S和EA34可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)元件的土壤桿菌雙重載體中。通過測定連接區(qū)的DNA序列和在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)來證實(shí)調(diào)節(jié)元件、啟動子和編碼序列的有效連接。
實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)使用改良的根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化方案生產(chǎn)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系。制備含有實(shí)施例3的全長CDPK cDNA或?qū)嵤├?的嵌合CDPK編碼序列的核酸構(gòu)建體。含有待導(dǎo)入植物的序列的重組構(gòu)建體經(jīng)過與大腸桿菌TBl(pRK201)進(jìn)行三親雜交轉(zhuǎn)移進(jìn)根癌土壤桿菌茵株GV3850中。將各生長階段的煙草葉切成1cm2的小片并浸入土壤桿菌細(xì)胞懸液(約104至105個細(xì)胞/ml)中。3至10分鐘后，在無菌水中洗滌葉片以去掉多余的細(xì)菌細(xì)胞，并減少因多余的細(xì)菌在經(jīng)處理葉片上生長而產(chǎn)生的問題。經(jīng)過短時間(30至60秒)干燥后，將處理過的葉片放入無抗生素的植物組織培養(yǎng)基的表面以促進(jìn)組織感染和DNA從細(xì)菌到植物組織的轉(zhuǎn)移。每升植物組織培養(yǎng)基含有4.31g Murashige和Skoog基礎(chǔ)鹽混合物(Sigma化學(xué)公司，St.Louis,MO)、2.5mg芐氨基嘌呤(溶于1N的NaOH內(nèi))、10ml的1mg/ml吲哚乙酸溶液、30g蔗糖、2ml Gamborg氏維生素溶液(Sigma化學(xué)公司，St.Louis,MO)和8g瓊脂。用NaOH將pH調(diào)至5.5至5.9之間。2天后，將葉片轉(zhuǎn)移進(jìn)含300μg/ml卡那霉素、500μg/ml頭孢西丁(Merck,Rahu,ay,NJ)的植物組織培養(yǎng)基中?？敲顾剡x擇轉(zhuǎn)化的植物組織，頭孢西丁送擇抗土壤桿菌的植物組織。
如果使用病原體誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)元件，在轉(zhuǎn)化程序期間必須盡可能減少外植體組織與土壤桿菌細(xì)胞的接觸，因?yàn)樵趯?dǎo)入植物細(xì)胞后土壤桿菌細(xì)胞本身可誘導(dǎo)該元件。因此，用于在可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件調(diào)節(jié)控制下導(dǎo)入含有細(xì)胞自殺基因的DNA的生物傾向(biolistic)技術(shù)是一種有用的可選擇的轉(zhuǎn)化技術(shù)，因?yàn)樗槐厥褂猛寥罈U菌細(xì)胞或真菌細(xì)胞壁消化醣(對于產(chǎn)生用于電穿孔的原生質(zhì)體是必需的)，兩種酶都可在所述的調(diào)節(jié)元件控制下誘導(dǎo)編碼序列。
基本上按Horsch等，(1985)科學(xué)227:1229-1231所述再生轉(zhuǎn)基因植物。
實(shí)施例6轉(zhuǎn)基因煙草中嵌合CDPK基因由誘導(dǎo)劑和病原體誘導(dǎo)的表達(dá)在用誘導(dǎo)劑或病原體處理的轉(zhuǎn)基因煙草植物中測量實(shí)施例7的CDPK構(gòu)建體的活性。作為對照，生產(chǎn)了在花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子控制下表達(dá)GUS報(bào)道基因的轉(zhuǎn)基因煙草植物。來自再生的轉(zhuǎn)基因煙草植物的F1種子在含100mg/K卡那霉素的培養(yǎng)基上發(fā)芽。隨后將所得抗卡那霉素植物轉(zhuǎn)移進(jìn)土壤并在溫室中生長。在誘導(dǎo)條件下(例如通過對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞間施用誘導(dǎo)劑或纖維素酶)，對半數(shù)植物檢測了其CDPK基因的表達(dá)。誘導(dǎo)劑或纖維素酶用機(jī)械移液器施用。作為對照，用無纖維素酶或誘導(dǎo)劑的溶液模擬處埋其余植物。在有些實(shí)驗(yàn)中用解剖刀刺傷煙草組織以利于與誘導(dǎo)化合物接觸。
實(shí)施例7CDPK同源序列的鑒定按Murray和Thompson(1980)在核酸研究8:4321-4325中所述分離煙草葉基因組DNA。用所需限制性內(nèi)切醣消化等分試樣后，經(jīng)消化的DNA樣品在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳，將大小分離的DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。DNA印跡與經(jīng)隨機(jī)引物法放射性標(biāo)記的實(shí)施例1的900bp CDPKcDNA插入片斷雜交。雜交在66℃，0.25M磷酸鈉緩沖液、pH8.0、0.7％SDS、1％牛血清白蛋白和1mMEDTA中進(jìn)行。然后在45℃用2X的SSC、0.1％SDS洗滌印跡兩次，并用0.2X的SSC、0.1％0SDS(1X的SSC是0.15M的NaCl,0.015M檸檬酸鈉，pH7..0)洗滌兩次。用圖象測密計(jì)(video densitometer)(MilliGen/Biosearch,Ann Arbor,MI)從反射自顯影圖上估計(jì)膜上各帶的相對雜交強(qiáng)度。
為了鑒定與煙草CDPK具有同源序列的多核苷酸，且為了確定每個基因組中這些序列的表觀拷貝數(shù)，使用分離自其它植物種類的靶DNA和煙草CDPK探針進(jìn)行Southern雜交實(shí)驗(yàn)。被限制性核酸內(nèi)切醣消化的各種植物種類的基因組DNA通過瓊脂糖凝膠電泳(0.8％瓊脂糖)分離，然后轉(zhuǎn)移到Hybond-N+膜(AmershamCorp.,Arlington Heights,IL)上。含有pCDPK-1編碼序列的放射性標(biāo)記的探針片斷與消化的基因組DNA雜交，基本上按照Sambrook等(i989)(出處同上)所述。使用中等嚴(yán)格條件(在4X的SSC、65℃下雜交，最后一次洗滌在1X的SSC,65℃下進(jìn)行)。
或者，使用靶基因組DNA作模板和來自pCDPK-1編碼序列高度保守區(qū)的引物進(jìn)行PCR。
實(shí)施例8CDPK編碼序列側(cè)翼的基因組DNA將實(shí)施例1所述的cDNA克隆用作雜交探針來篩選在λEMBL3載體(Clontech,Palo Alto,CA)中的N.tabacum cv.NK326基因組文庫。與實(shí)施例1的煙草CDPK具有70％以上序列相同性的基因組DNA克隆使用常規(guī)亞克隆方法來鑒定。使用常規(guī)DNA測序方法測定克隆的核酸插入片斷的核苷酸序列。
一個基因組DNA克隆具有包含實(shí)施例1煙草CDPK編碼序列的全長編碼序列。該克隆還含有與實(shí)施例1的編碼序列5’端毗鄰的DNA。檢查該克隆中5’端側(cè)翼DNA的核苷酸序列揭示了嚴(yán)格推斷ATG起始密碼子以及一個或多個推斷的在起始岔碼子上游約1000bp內(nèi)的調(diào)節(jié)元件。
其它實(shí)施方案應(yīng)該理解，盡管結(jié)合其詳細(xì)描述已描述了本發(fā)明，但上面的描述是用于說明而不是限制本發(fā)明的范圍的，木發(fā)明的范圍油所附請權(quán)利要求書的范圍來限定。其它方面，優(yōu)點(diǎn)和修改均屬于權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人肯塔基大學(xué)研究基金會(ⅱ)發(fā)明名稱蛋白質(zhì)激酶及其用途(ⅲ)序列數(shù)目11(ⅳ)通訊地址(A)地址Fish&Richardson P.C.,P.A.
(B)街道60 South Sixth Street,Suite 3300(C)城市Minneapolis(D)州MN(E)國家USA(F)郵編55402(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQ for Windows Version 2.0(ⅵ)當(dāng)前申請信息(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(ⅶ)在先申請信息(A)申請?zhí)朠CT/US98/14109(B)申請日07-JUL-1998(ⅷ)在先申請信息(A)申請?zhí)?8/889,655(B)申請日08-JUL-1997(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Lundquist,Ronald C(B)注冊編號37,875(C)參考文獻(xiàn)/檔案編號07678/020CN1(ⅸ)電訊信息(A)電話612-335-5050(B)傳真612-288-9696(C)電傳(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度921堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:AGGGACCTTA AGCCTGAGAA TTTCCTTTTC AGTGCCGACG ACTTCATGGT AAAGAGTAAG 60GCCACCGACT TCGGGCTTAG TGTATTCTAT AAGCCTGGGC AAAAGTTCAC GGACATAGTA 120GGGAGTCCTT ACTACGTAGC CCCTGAGGTA CTTAGGAAGT GTTACGGGCC TGGGAGTGAC 180GTATGGAGTG CCGGGGTAAT ACTTTACACC CTTCTTTGTG GGGCCCCTCC TTTCATGGCC 240GACAGTGAGC CTGGGGTAGC CCTTCAAATA CTTCATGGGG ACCTTGACTT CAAGAGTGAC 300CCTTGGCCTA CCATAAGTGA GAGTGCCAAG GACCTTATAA GGAAGATGCT TGAGCAAGAC 360CCTAAGAGGA GGCTTACCGC CCATGAGGTA CTTAGGCATC CTTGGATAGT AGACGAGAAT 420ATAGCCCCTG ACAAGCCTCT TGGGCCTGCC GTACTTAGTA GGCTTAAGCA ATTCAGTGCC 480ATGAATAAGA TAAAGAAGAT GGCCCTTAGG GTAATAGCCG AGAGGCTTAG TGAGGAGGAG 540ATAGTAGGGC TTAAGGAGAT GTTCAAGATG GACACCGACA ATAGTGGGAC CGTAACCTTC 600TTCCATCTTA AGCAAGGGCT TAAGAGGGTA GGGAGTCAAC TTGGGGAGAG TGAGATAAAG 660GACCTTATGG ACGCCGCCGA CGTAGACAAT AGTGGGACCA TAGACTATGG GGAGTTCGTA 720ACCGCCGCCA TGCATCTTAA TAAGATAAAG AGGGAGGACC ATCTTGTAAG TGCCTTCAGT 780TATCATGACA AGGACGGGAG TGGGTATATA GAGGTAGACG AGCTTAGGCA AGCCCTTGAG 840GAGTTCGGGG TACCTGACAC CAGTCTTGAG GACATGATAA AGGAGGTAGA CACCGACAAT 900GATGGGCAAA TAGATTATGG G 921(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度307氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Phe Leu Phe Ser Ala Asp Asp Phe Met1 510 15Val Lys Ser Lys Ala Thr Asp Phe Gly Leu Ser Val Phe Tyr Lys Pro20 25 30Gly Gln Lys Phe Thr Asp Ile Val Gly Ser Pro Tyr Tyr Val Ala Pro35 40 45Glu Val Leu Arg Lys Cys Tyr Gly Pro Gly Ser Asp Val Trp Ser Ala50 55 60Gly Val Ile Leu Tyr Thr Leu Leu Cys Gly Ala Pro Pro Phe Met Ala65 70 75 80Asp Ser Glu Pro Gly Val Ala Leu Gln Ile Leu His Gly Asp Leu Asp8590 95Phe Lys Ser Asp Pro Trp Pro Thr Ile Ser Glu Ser Ala Lys Asp Leu100 105 110Ile Arg Lys Met Leu Glu Gln Asp Pro Lys Arg Arg Leu Thr Ala His115 120 125Glu Val Leu Arg His Pro Trp Ile Val Asp Glu Asn Ile Ala Pro Asp130 135 140Lys Pro Leu Gly Pro Ala Val Leu Ser Arg Leu Lys Gln Phe Ser Ala145 150 155 160Met Asn Lys Ile Lys Lys Met Ala Leu Arg Val Ile Ala Glu Arg Leu165 170 175Ser Glu Glu Glu Ile Val Gly Leu Lys Glu Met Phe Lys Met Asp Thr180 185 190Asp Asn Ser Gly Thr Val Thr Phe Phe His Leu Lys Gln Gly Leu Lys195 200205Arg Val Gly Ser Gln Leu Gly Glu Ser Glu Ile Lys Asp Leu Met Asp210 215220Ala Ala Asp Val Asp Asn Ser Gly Thr Ile Asp Tyr Gly Glu Phe Val225 230 235240Thr Ala Ala Met His Leu Asn Lys Ile Lys Arg Glu Asp His Leu Val245 250 255Ser Ala Phe Ser Tyr His Asp Lys Asp Gly Ser Gly Tyr Ile Glu Val260 265 270Asp Glu Leu Arg Gln Ala Leu Glu Glu Phe Gly Val Pro Asp Thr Ser275 280 285Leu Glu Asp Met Ile Lys Glu Val Asp Thr Asp Asn Asp Gly Gln Ile290 295 300Asp Tyr Gly305(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:GGTACTTAGG AAGTGTTACG GG 22(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:GTTGACTCCC TACCCTCTT 19(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度512氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:Met Ala Ala Lys Ser Ser Ser Ser Ser Thr Thr Thr Asn Val Val Thr1 5 10 15Leu Lys Ala Ala Trp Val Leu Pro Gln Arg Thr Gln Asn Ile Arg Glu20 25 30Val Tyr Glu Val Gly Arg Lys Leu Gly Gln Gly Gln Phe Gly Thr Thr35 40 45Phe Glu Cys Thr Arg Arg Ala Ser Gly Gly Lys Phe Ala Cys Lys Ser50 55 60Ile Pro Lys Arg Lys Leu Leu Cys Lys Glu Asp Tyr Glu Asp Val Trp65 70 75 80Arg Glu Ile Gln I1e Met His His Leu Ser Glu His Ala Asn Val Val85 90 95Arg Ile Glu Gly Thr Tyr Glu Asp Ser Thr Ala Val His Leu Val Met100 105 110Glu Leu Cys Glu Gly Gly Glu Leu Phe Asp Arg Ile Val Gln Lys Gly115120 125His Tyr Ser Glu Arg Gln Ala Ala Arg Leu Ile Lys Thr Ile Val Glu130 135 140Val Val Glu Ala Cys His Ser Leu Gly Val Met His Arg Asp Leu Lys145 150 155 160Pro Glu Asn Phe Leu Phe Asp Thr Ile Asp Glu Asp Ala Lys Leu Lys165 170 175Ala Thr Asp Phe Gly Leu Ser Val Phe Tyr Lys Pro Gly Glu Ser Phe180 185 190Cys Asp Val Val Gly Ser Pro Tyr Tyr Val Ala Pro Glu Val Leu Arg195 200 205Lys Leu Tyr Gly Pro Glu Ser Asp Val Trp Ser Ala Gly Val Ile Leu210 215 220Tyr Ile Leu Leu Ser Gly Val Pro Pro Phe Trp Ala Glu Ser Glu Pro225 230 235 240Gly Ile Phe Arg Gln Ile Leu Leu Gly Lys Leu Asp Phe His Ser Glu245 250 255Pro Trp Pro Ser Ile Ser Asp Ser Ala Lys Asp Leu Ile Arg Lys Met260 265 270Leu Asp Gln Asn Pro Lys Thr Arg Leu Thr Ala His Glu Val Leu Arg275 28O 285His Pro Trp Ile Val Asp Asp Asn Ile Ala Pro Asp Lys Pro Leu Asp290 295 300Ser Ala Val Leu Ser Arg Leu Lys Gln Phe Ser Ala Met Asn Lys Leu305 310 315 320Lys Lys Met Ala Leu Arg Val Ile Ala Glu Arg Leu Ser Glu Glu Glu325 330 335Ile Gly Gly Leu Lys Glu Leu Phe Lys Met Ile Asp Thr Asp Asn Ser340 345 350Gly Thr Ile Thr Phe Asp Glu Leu Lys Asp Gly Leu Lys Asp Gly Leu355 360 365Lys Arg Val Gly Ser Glu Leu Met Glu Ser Glu Ile Lys Asp Leu Met370 375 380Asp Ala Ala Asp Ile Asp Lys Ser Gly Thr Ile Asp Tyr Gly Glu Phe385 390 395 400Ile Ala Ala Thr Val His Leu Asn Lys Leu Glu Arg Glu Glu Asn Leu405 410 415Val Ser Ala Phe Ser Tyr Phe Asp Lys Asp Gly Ser Gly Tyr Ile Thr420 425 430Leu Asp Glu Ile Gln Gln Ala Cys Lys Asp Phe Gly Leu Asp Asp Ile435 440 445His Ile Asp Asp Met Ile Lys Glu Ile Asp Gln Asp Asn Asp Gly Gln450 455 460Ile Asp Tyr Gly Glu Phe Ala Ala Met Met Arg Lys Gly Asn Gly Gly465 470 475 480Ile Gly Arg Arg Thr Met Arg Lys Thr Leu Asn Leu Arg Asp Ala Leu485 490 495Gly Leu Val Asp Asn Gly Ser Asn Gln Val Ile Glu Gly Tyr Phe Lys500 505 510
(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:GACAAGGACG GGAGTGGGTA T 21(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度35堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:GACTCGAGTC GACATCGATT TTTTTTTTTT TTTTT 35(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:GACTCGAGTC GACATCG 17(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:AGGGGCTACG TAGTAAGGAC T 21(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:ATTCTCAGGC TTAAGGTCCC T 21(2)SEQ ID NO:11的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度308氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Phe Leu Phe Ser Ala Asp Asp Phe Met1 5 10 15Val Lys Ser Lys Ala Thr Asp Phe Gly Leu Ser Val Phe Tyr Lys Pro20 25 30Gly Gln Lys Phe Thr Asp Ile Val Gly Ser Pro Tyr Tyr Val Ala Pro35 40 45Glu Val Leu Arg Lys Cys Tyr Gly Pro Gly Ser Asp Val Trp Ser Ala50 55 60Gly Val Ile Leu Tyr Thr Leu Leu Cys Gly Ala Pro Pro Phe Met Ala65 70 75 80Asp Ser Glu Pro Gly Val Ala Leu Gln Ile Leu His Gly Asp Leu Asp85 90 95Phe Lys Ser Asp Pro Trp Pro Thr Ile Ser Glu Ser Ala Lys Asp Leu100 105 110Ile Arg Lys Met Leu Glu Gln Asp Pro Lys Arg Arg Leu Thr Ala His115 120 125Glu Val Leu Arg His Pro Trp Ile Val Asp Glu Asn Ile Ala Pro Asp130 135 140Lys Pro Leu Gly Pro Ala Val Leu Ser Arg Leu Lys Gln Phe Ser Ala145 150 155 160Met Asn Lys Ile Lys Lys Met Ala Leu Arg Val Ile Ala Glu Arg Leu165 170 175Ser Glu Glu Glu Ile Val Gly Leu Lys Glu Met Phe Lys Met Ile Asp180 185 190Thr Asp Asn Ser Gly Thr Val Thr Phe Phe His Leu Lys Asp Gly Leu195 200 205Lys Arg Val Gly Ser Gln Leu Gly Glu Ser Glu Ile Lys Asp Leu Met210 215 220Asp Ala Ala Asp Val Asp Asn Ser Gly Thr Ile Asp Tyr Gly Glu Phe225 230 235 240Val Thr Ala Ala Met His Leu Asn Lys Ile Lys Arg Glu Asp His Leu245 250 255Val Ser Ala Phe Ser Tyr His Asp Lys Asp Gly Ser Gly Tyr Ile Glu260 265 270Val Asp Glu Ile Arg Gln Ala Leu Glu Glu Phe Gly Val Pro Asp Thr275 280 285Ser Leu Glu Asp Met Ile Lys Glu Val Asp Thr Asp Asn Asp Gly Gln290 295 300Ile Asp Tyr Gly30權(quán)利要求
1．一種分離的多核苷酸，該多核菅酸含有a)核苷酸序列SEQ ID NO:1；b)SEQ ID NO:1的RNA類似物；c)含有與a)或b)互補(bǔ)的核酸序列的多核苷酸；或d)長度為至少20個核苷酸且在嚴(yán)格條件下與編碼圖3多肽的基因組DNA雜交的a)、b)或c)的核酸片斷。
2．如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中該多核苷酸含有圖2中的核苷酸1至170。
3．如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中該多核苷酸含有圖2中的核苷酸160至560。
4．如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中該多核苷酸含有圖2中的核苷酸550至920。
5．一種含有如權(quán)利要求1所述的多核苷酸的核酸構(gòu)建體。
6．如權(quán)利要求5所述的核酸構(gòu)建體，進(jìn)一步包括有效連接到該多核苷酸上的調(diào)節(jié)元件。
7．如權(quán)利要求6所述的核酸構(gòu)建體，其中該調(diào)節(jié)元件是可誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)元件。
8．如權(quán)利要求7所述的核酸構(gòu)建體，其中該調(diào)節(jié)元件在響應(yīng)植物病原體時被誘導(dǎo)。
9．一種轉(zhuǎn)基因植物，包含含有如權(quán)利要求1所述的多核苷酸的核酸構(gòu)建體。
10．如權(quán)利要求9所述的植物，其中的構(gòu)建體進(jìn)一步包括有效連接到所述多核苷酸上的調(diào)節(jié)元件。
11．如權(quán)利要求10所述的植物，其中的調(diào)節(jié)元件是可誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)元件。
12．如權(quán)利要求11所述的植物，其中所述的調(diào)節(jié)元件在響應(yīng)植物病原體時被誘導(dǎo)。
13．如權(quán)利要求11所述的植物，其中所述的調(diào)節(jié)元件在響應(yīng)誘導(dǎo)劑時被誘導(dǎo)。
14．如權(quán)利要求9所述的植物，其中的植物是雙子葉植物。
15．如權(quán)利要求14所述的植物，其中的植物屬于茄科。
16．如權(quán)利要求15所述的植物，其中的植物是煙草屬植物。
17．如權(quán)利要求16所述的植物，其中的植物是煙草。
18．一種轉(zhuǎn)基因植物，它含有表達(dá)一種具有250到550個氨基酸的多肽的多核苷酸，該多肽含有與圖3的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。
19．如權(quán)利要求18所述的植物，其中的多肽含有圖3的氨基酸序列。
20．如權(quán)利要求18所述的植物，其中的植物是雙子葉植物。
21．如權(quán)利要求20所述的植物，其中的植物屬于茄科。
22．一種使用多核苷酸的方法，包含將如權(quán)利要求1所述的多核苷酸與來自植物的DNA或RN4雜交的步驟。
23．如權(quán)利要求22所述的方法，進(jìn)一步包含鑒定與所述多核苷酸具有大約70％以上序列相同性的所述植物DNA或RNA片斷的步驟。
24．如權(quán)利要求23所述的方法，進(jìn)一步包括克隆至少一部分所述DNA或RNA片斷的步驟。
25．如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的被克隆部分進(jìn)一步包含具有70％以上序列相同性的該片斷兩側(cè)的DNA。
26．一種改變植物中疾病抗性的方法，該方法包括下列步驟(a)將如權(quán)利要求5所述的核酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞；和(b)從所述細(xì)胞生成含有該多核苷酸的植物，其中所述多核苷酸的表達(dá)改變了該植物的疾病抗性。
27．如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的核酸構(gòu)建體進(jìn)一步含有與該多核苷酸有效連接的可誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)元件，且通過所的述調(diào)節(jié)元件調(diào)節(jié)所述的表達(dá)。
28．如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的表達(dá)在所述植物與誘導(dǎo)劑或植物病原體接觸時通過所述調(diào)節(jié)元件被誘導(dǎo)。
29．一種具有250至550個氨基酸的分離的多肽，所述的多肽含有與圖3基本上相同的氨基酸序列。
30．如權(quán)利要求29所述的多肽，其中所述多肽含有圖3的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提出一種在病原體侵入或誘導(dǎo)劑處理時被誘導(dǎo)的核酸分子。該分子在植物、植物組織和植物細(xì)胞中對于可誘導(dǎo)基因的表達(dá)和改變植物的疾病抗性表型發(fā)揮功能。該分子是鈣依賴性蛋白質(zhì)激酶基因的序列或與其相關(guān)。本發(fā)明還公開了獲得含有該核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物的方法和使用該分子的方法。本文也公開了由該核酸編碼的多肽。
文檔編號C12N15/82GK1234831SQ98800943
公開日1999年11月10日 申請日期1998年7月7日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月8日
發(fā)明者M·F·G·呂松, J·查普爾 申請人:肯塔基大學(xué)研究基金會