專利名稱：脊髓灰質(zhì)炎病毒具有復(fù)制能力的重組體薩賓i型株系的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種可用于開發(fā)活病毒疫苗的載體系統(tǒng)。更具體地說，它涉及脊髓灰質(zhì)炎病毒具有復(fù)制能力的重組體薩賓I型株系，它能用于開發(fā)可引起粘膜免疫的活病毒疫苗。2.現(xiàn)有技術(shù)描述近來報(bào)道，熟知通過血液媒介途徑(如輸血、同性間性交或共用注射器)的多種傳染性病毒疾病也可通過異性間性交傳播。在愛滋病(獲得性免疫缺陷綜合癥)情況下，異性傳播的數(shù)量大大超過血液媒介的例子(Stingl等，美國科學(xué)院皮膚病學(xué)雜志，22，1210，1988)。在韓國，每527名HIV-1陽性病人中有363人是異性戀，而99名是通過同性途徑受到感染(韓國，國家健康研究所，傳染病月報(bào)，1996年4月)。這些報(bào)告極力提示，HIV-1可以不經(jīng)血液媒介，而通過性器官周圍的粘膜組織進(jìn)行傳播。
有些文章報(bào)道，HIV-1的傳染和擴(kuò)散很可能開始于粘膜組織中郎格漢斯細(xì)胞或樹突細(xì)胞(DC)的感染。受感染的細(xì)胞返回淋巴結(jié)以傳送抗原，即熟知的歸巢性，在此發(fā)生病毒復(fù)制，結(jié)果導(dǎo)致病毒血癥和愛滋病發(fā)展。換言之，和感染HIV-1病人異性性交的那些人，其泌尿生殖器官粘膜區(qū)的郎格漢斯細(xì)胞或DC細(xì)胞會(huì)受到HIV-1感染，這些受感染的DC回到淋巴結(jié)，刺激淋巴結(jié)中的CD4＋T-細(xì)胞并增殖HIV，結(jié)果CD4＋-T細(xì)胞衰竭，愛滋病隨之發(fā)展(Tschachler等，皮膚病學(xué)研究雜志，88，238，1987；Langhoff等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，88，7998，1991；Patterson & Knight，普通病毒學(xué)雜志，68，1177，1987；Patterson等，免疫學(xué)，72，361，1991；Cameron等.，科學(xué)，257，383，1992；Embreston等，自然，362，369，1993；Fauci等，科學(xué)，262，1011，1993；Pantleo等，自然，362，355，1993；Adema等，自然，387，713，1997)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果被設(shè)置在恒河猴的活體實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。猴生殖器經(jīng)SIV(猿猴免疫缺陷病毒)處理后受到感染，然后出現(xiàn)了愛滋病癥狀(Miller & Gardner，愛滋病雜志，4，1169，1991；Miller等，病毒學(xué)雜志，63，4277，1989)。此外，多數(shù)傳染性病毒疾病的擴(kuò)散均首先是呼吸，消化和泌尿生殖器官的粘膜組織受到感染，因此，竭力推薦開發(fā)粘膜疫苗以預(yù)防傳染性病毒。尤其是，共同粘膜免疫系統(tǒng)-在活機(jī)體內(nèi)一處免疫能引起其他粘膜區(qū)的相同免疫，這種粘膜免疫的特殊特性鼓舞著許多研究者去開發(fā)粘膜疫苗(Kott，科學(xué)，266，1335，1994；Cease & Verzofsky，免疫學(xué)年度回顧，12，923，1994)。
很久以來，天花病毒一直被推薦用作一種活的病毒疫苗載體。已報(bào)道，通過將疫苗基因引入天花病毒基因組而產(chǎn)生的重組疫苗病毒在免疫過的猴體內(nèi)可誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。但還不允許將它應(yīng)用于人類，因?yàn)楫?dāng)這種疫苗病毒過量繁殖時(shí)可能在免疫個(gè)體內(nèi)引起疫苗綜合癥。為避免這種可能性，一種減毒的疫苗病毒被建議代替毒性株系而作為疫苗載體，但它不能成功引起有效的免疫(Cooney等，Lancet，337，567，1991；Tartaglia等，病毒學(xué)，188，217，1992)。
具有比痘苗病毒更小基因組(34kbp)的腺病毒亦曾被推薦作為疫苗載體(Natuk，等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，89，7777，1992；Gallichar等，傳染病雜志，168，622，1993)。但是重組體腺病毒仍有著側(cè)面影響的局限，如角膜炎或corneitis，若把腺病毒作為粘膜疫苗載體，必須將這種問題加以解決。
脊髓灰質(zhì)炎病毒含有一個(gè)7.4kb核苷酸長的正義單鏈RNA，其編碼一種長多蛋白的單一開放閱讀框(Kitamura等，自然，291，547，1981)。近來，由于它具有眾所周知的誘人優(yōu)點(diǎn)-安全，易于施用，經(jīng)濟(jì)，尤其具有引起終生有效的粘膜免疫的能力(對于一種理想疫苗是很重要的)，因此，幾個(gè)小組正在試圖開發(fā)脊髓灰質(zhì)炎病毒作為一種疫苗載體。
以下是已經(jīng)出版了的與開發(fā)脊髓灰質(zhì)炎病毒作為疫苗載體有關(guān)的疫苗研究工作的概括(1)曾提出用假定的HIV疫苗抗原決定基，如gp41，pND(主要中和域)或gpl20替代VPI(脊髓灰質(zhì)炎病毒主要外殼蛋白)的某些部分。由此遺傳重組產(chǎn)生的嵌合病毒依賴于抗原決定基的特性有效地誘導(dǎo)抗體(Burke等，自然，332，81，1988；Burke等，普通病毒學(xué)雜志，70，2475，1989；Evans等，自然，385，1989；Dedieu等，病毒學(xué)雜志，66，3161，1992；Rose等，普通病毒學(xué)雜志，75，969，1994)。可是，這種嵌合病毒及所引入的疫苗基因的大小均有限。當(dāng)插入的疫苗抗原決定基大于25個(gè)氨基酸殘基時(shí)嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒在受感染細(xì)胞內(nèi)就不能被適當(dāng)?shù)匮b配。
(2)Morrow和他的同事們(Porter等，病毒學(xué)雜志，69，1548，1993；Ansaradi等，腫瘤研究，54，6359，1994；Porter等，病毒學(xué)雜志，70，2643，1996；Porter等，疫苗，15，257，1997)建議利用脊髓灰質(zhì)炎病毒結(jié)構(gòu)基因已被外來序列取代了的脊髓灰質(zhì)炎病毒微小復(fù)制體開發(fā)脊髓灰質(zhì)炎病毒介導(dǎo)的粘膜疫苗。在脊髓灰質(zhì)炎病毒微小復(fù)制體情況下，復(fù)制缺損型重組體病毒基因組必須與可表達(dá)殼體蛋白的其它載體共轉(zhuǎn)染以便對嵌合病毒基因組進(jìn)行包裝(Porter等，病毒學(xué)雜志，69，1548，1995)。此外，必須接種高滴度的微小復(fù)制體以引起有效的粘膜免疫，因?yàn)樗亲鳛閺?fù)制缺損型目標(biāo)特異性免疫原而非活病毒疫苗起作用。
(3)近來，Mattion等，(病毒學(xué)雜志，68，3925，1994)和Andino等，科學(xué)，265，1448，1994)提出了一種新的策略，即在具有復(fù)制能力的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒中表達(dá)外來抗原。他們在脊髓灰質(zhì)炎病毒多蛋白N末端引入了新的多接點(diǎn)區(qū)域和3C-蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。根據(jù)這個(gè)系統(tǒng)，與脊髓灰質(zhì)炎病毒開放閱讀框讀框一致地克隆的外源基因后是一個(gè)人造3C-蛋白酶位點(diǎn)，可使得外來蛋白從脊髓灰質(zhì)炎病毒多蛋白上蛋白水解切割下來。外源性核酸被直接插入到脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組中。病毒復(fù)制期間，該外源序列作為病毒多蛋白的一部分而表達(dá)，繼之由病毒編碼的蛋白酶進(jìn)行加工產(chǎn)生游離抗原和成熟病毒蛋白。外源抗原不被包裹在病毒顆粒中，而是被釋放到細(xì)胞質(zhì)中。本發(fā)明的原理是基于以前出版的脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性3C-蛋白酶的特性。3C-蛋白酶識(shí)別特異的氨基酸序列，然后在Glu(Q)/Gly(G)間的接點(diǎn)處將它斷開(Hanecak等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，79，3793，1982)，在長多蛋白的分子內(nèi)會(huì)發(fā)生這種蛋白水解(Palmenberg & Reuckert，病毒學(xué)雜志，41，244，1982；Hanecax等，細(xì)胞37，1063，1984)。這些現(xiàn)象在小核糖核酸病毒家族內(nèi)比較常見(Palmenberg等，病毒學(xué)雜志，32，770，1979；Palmenberg & Reuckert，病毒學(xué)雜志，41，24，，1982)。已多次證實(shí)Q/G切割位點(diǎn)(AXXQG)P4位置的丙氨酸(A)殘基對于有效識(shí)別和被3C-蛋白酶所切割是必需的(Nicklison等，生物技術(shù)學(xué)4，33，1986；Pallai等，生物化學(xué)雜志，264，9738，1989；Cordingley等，病毒學(xué)雜志，63，5037，1989；Orr等，遺傳病毒學(xué)，70，2931，1989；Petithory t al.，Proc.Natl.Acad，Sci，USA，88，11510，1991；Blair & Sernler，病毒學(xué)雜志，65，6111，1991)?；谶@些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Nattion和他的同事們(病毒學(xué)雜志68，3925，1994)將多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)引入脊髓灰質(zhì)炎病毒薩賓3型株系的N-端，構(gòu)建了表達(dá)輪狀病毒VP7的嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒。Andino和他的同事們(科學(xué)，265，1448，1994)通過將多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)引入脊髓灰質(zhì)炎病毒馬洪芮(Mahoney)株系的長多蛋白N-末端而構(gòu)建了重組體馬洪芮載體(MOV-1.4)。通過將各種HIV-1亞基因組克隆至載體中，他們制備了嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒(科學(xué)，265，1448，1994)。Andino小組已報(bào)道，表達(dá)HIV-1nef基因的這種嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒經(jīng)直腸免疫兩周后在猴體內(nèi)誘導(dǎo)了有效的粘膜免疫(Andino等，科學(xué)，265，1448，1994)。然而，不經(jīng)過進(jìn)一步的去毒步驟，這種重組體馬洪芮脊髓灰質(zhì)炎病毒不能用于人類，因?yàn)榧顾杌屹|(zhì)炎病毒馬洪芮株系是一個(gè)具有致命毒性的親神經(jīng)病毒，它通過對消化器官原發(fā)性感染而感染靈長類中樞神經(jīng)系統(tǒng)，結(jié)果導(dǎo)致麻痹性脊髓灰質(zhì)炎。而，Mueller和Wimmer(病毒學(xué)雜志，72，20-31，1998)報(bào)道通過將綠色螢光蛋白基因(gfp252aa)和HIV-1 gag基因克隆至Andino的馬洪芮1載體而獲得的重組體病毒在傳代時(shí)并不象Andino等人(科學(xué)，265，1448，1994)以前所報(bào)道的那樣遺傳穩(wěn)定。他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果指示，多數(shù)重組體病毒甚至在單代傳代時(shí)就丟失了引入的疫苗基因，在傳代6代后在RT-PCR實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)沒有一個(gè)子代病毒具有完整長度的外源性插入片段。
(4)1996年Andino和他的同事們報(bào)道利用同一馬洪芮載體生產(chǎn)了能表達(dá)乙型肝炎病毒Pers(118aa，54aa)核心(155aa)蛋白的重組體馬洪芮病毒(Yim等，病毒學(xué)，218，61，1996)。盡管他們聲稱這些嵌合病毒在傳代過程中直到第6代依然遺傳穩(wěn)定，但他們的RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，持有Pres基因(118aa)的重組體載體數(shù)量在第5代時(shí)顯著減少。另一方面，他們的實(shí)驗(yàn)指示，表達(dá)編碼55個(gè)氨基酸殘基的小pres蛋白的重組體病毒與野生型或其他重組體馬洪芮株系相比其復(fù)制能力明顯下降。結(jié)果表明，重組體嵌合病毒的復(fù)制能力并不象預(yù)期那樣與插入的疫苗基因的大小緊密相關(guān)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果使我們得出結(jié)論，重組體嵌合病毒的生物學(xué)特性取決于幾個(gè)聯(lián)合因素，如基因插入片段的大小、病毒載體的特性，以及所引入的疫苗基因等。
(5)Andino等人承認(rèn)了上面提到有關(guān)他們的馬洪芮載體的問題后，通過將多克隆位點(diǎn)和2A-蛋白酶切割位點(diǎn)插入到馬洪芮多蛋白cDNAP1/P2的連接處而開發(fā)出了一種新的馬洪芮載體(Mov-2.1)(Taup等，病毒學(xué)雜志，71，7841-7850，1997)。這一MOV-2.1載體被用來構(gòu)建表達(dá)SIV gag基因(p17或p27)或env基因(gfp130或gp41)的重組體嵌合病毒。這些重組體嵌合病毒具有與野生型馬洪芮類似的復(fù)制能力，并且有效地表達(dá)所引入的疫苗基因?？墒?，MOV-2.1載體仍然存在遺傳不穩(wěn)定的問題。在3代內(nèi)，99％以上重組體嵌合病毒失去所引入的疫苗基因。他們認(rèn)為傳代期間的序列刪除是由于新引入的多克隆位點(diǎn)處的重復(fù)序列間的同源重組所致。他們在不影響氨基酸序列情況下進(jìn)行沉默突變而改變序列，使MOV-2.1載體的重復(fù)序列的序列同源性降低37％，將它命名為MOV-2.11。通過將SIV-P27基因克隆到被操作過的馬洪芮載體內(nèi)，他們構(gòu)建了重組體嵌合病毒Sp27(MOV-2.11)。對于未經(jīng)沉默突變的重組體病毒[Sp27(MOV-2.1)]，第一代后只有20-30％的噬菌斑保留克隆的疫苗基因，第3代后就沒有攜帶克隆基因的噬菌斑了。另一方面，對于重復(fù)序列有沉默突變的重組體病毒[SP27(MO-2.11)]，90％以上單次傳代噬菌斑保留有克隆基因(gag)，在第3代30-50％的噬菌斑表達(dá)SIV基因產(chǎn)物。但是，馬洪芮載體MOV-2.11在傳代期間仍然存在遺傳穩(wěn)定性問題，盡管他們通過降低序列的同源性對提高馬洪芮載體的遺傳穩(wěn)定性取得了某些進(jìn)展。根據(jù)他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，隨著傳代的進(jìn)行，甚至在三代內(nèi)，保留插入片段的子代病毒群落就已明顯減少第一代(90％)，第二代(50-70％)和第三代(30-50％)。這意味，如果再稍微進(jìn)一步傳代，保留插入片段的重組體嵌合馬洪芮病毒即會(huì)在總?cè)郝渲醒杆俦幌♂尅?br>
考慮到由Andino小組所構(gòu)建的馬洪芮載體的一些局限性，馬洪芮載體不能被允許作為脊髓灰質(zhì)炎病毒介導(dǎo)的粘膜疫苗載體的模型系統(tǒng)。
因此，積極建議為脊髓灰質(zhì)炎病毒介導(dǎo)的粘膜疫苗載體開發(fā)一種新的模型系統(tǒng)，該系統(tǒng)能克服馬洪芮載體所顯示的局限性。為此，新的載體應(yīng)符合下列要求(1)病毒載體對人類必須是安全的；(2)重組體病毒必須是可復(fù)制的，同時(shí)具有與野生型相當(dāng)?shù)膹?fù)制能力；和(3)引入的疫苗基因在病毒傳代期間必須能被穩(wěn)定保留。
發(fā)明概述本發(fā)明目的之一在于提供在粘膜疫苗的開發(fā)中可用作活的病毒疫苗載體的具有復(fù)制能力的重組體薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒載體。
本發(fā)明另一目的在于提供一種可表達(dá)克隆到重組體薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆位點(diǎn)中的幾種疫苗基因的嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒。
本發(fā)明提供一種具有復(fù)制能力的重組體薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒載體，其在薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒cDNA長多蛋白第1和第2氨基酸之間具有編碼多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的非基因組序列。
本發(fā)明進(jìn)一步提供可表達(dá)各種外源性疫苗基因的具有復(fù)制能力的嵌合薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒，以及它們的重組體cDNA質(zhì)粒，所述諸質(zhì)粒分別在上面提到的具有復(fù)制能力的重組體薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒載體的多克隆位點(diǎn)處具有外源性疫苗基因。
通過下述詳細(xì)解釋，上面提到的諸目的和本發(fā)明其他特征及應(yīng)用對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將更為明確。
附圖簡述
圖1圖示了用于完成本發(fā)明的一種重組體質(zhì)粒pTZ-PVS-3m的構(gòu)建。
圖2圖解描述分別衍生自薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒cDNA的具有1個(gè)多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的重組體載體pTZ-PVS-3m和pTZ-PVS-4m。
圖3是顯示野生型和重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒cDNA轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后能產(chǎn)生子代病毒的照片。HeLa細(xì)胞分別被由野生型cDNA合成的RNA轉(zhuǎn)錄物(A)、由重組體質(zhì)粒pTZ-PVS-3m合成的RNA轉(zhuǎn)錄物(B)或由重組體質(zhì)粒pTZ-PVS-4m合成的RNA轉(zhuǎn)錄物(C)轉(zhuǎn)染。
圖4圖解描述通過將HIV-1p24基因插入重組體質(zhì)粒pTZ-PVS-3m的多克隆位點(diǎn)而產(chǎn)生嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24和表達(dá)HIV-1p24蛋白的步驟。
圖5示評價(jià)野生型和重組體薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒復(fù)制能力的一步生長曲線。培養(yǎng)物上清液中病毒滴度每3小時(shí)由TCID50和噬菌斑測定法測定。
圖6為感染了嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24的HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液中表達(dá)的HIV-1p24蛋白的蛋白質(zhì)印跡。
泳道1HIV-1/-tat(tat缺損型HIV-1株系由Dr.Sodroski提供，Dana-Farber Cancer Ins.，USA)泳道2對照(感染野生型薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒的HeLa細(xì)胞裂解物)泳道3感染嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24的HeLa細(xì)胞裂解物泳道4感染嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24的HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液圖7為評價(jià)由嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24表達(dá)的HIV-1p24蛋白的抗原性的放射免疫沉淀結(jié)果泳道1未經(jīng)感染的細(xì)胞裂解物泳道2感染野生型薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒的HeLa細(xì)胞的裂解物泳道3感染嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24的HeLa細(xì)胞的裂解物圖8示克隆在嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒內(nèi)的p24基因直至第12代的PCR分析，以評估在傳代期間嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24的遺傳穩(wěn)定性泳道1感染野生型薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒的HeLa細(xì)胞的PCR產(chǎn)物泳道2感染重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24的HeLa細(xì)胞的PCR產(chǎn)物泳道3感染嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24的HeLa細(xì)胞的PCR產(chǎn)物泳道4感染第2代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24的HeLa細(xì)胞的PCR產(chǎn)物泳道5感染第4代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24的HeLa細(xì)胞的PCR產(chǎn)物泳道6感染第8代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24的HeLa細(xì)胞的PCR產(chǎn)物泳道7感染第12代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24的HeLa細(xì)胞的PCR產(chǎn)物圖9為傳代直至第12代時(shí)嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒表達(dá)的HIV-1p24蛋白的Western印跡結(jié)果，以評價(jià)傳代期間嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24的表達(dá)穩(wěn)定性泳道1HIV-1/-tat泳道2HeLa細(xì)胞裂解物泳道3感染野生型薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒的HeLa細(xì)胞的裂解物泳道4感染第一代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物泳道5感染第三代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物泳道6感染第六代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物泳道7感染第九代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物泳道8感染第十二代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞裂解物圖10為通過將HIV-1包膜糖蛋白基因env(125aa)克隆至重組體質(zhì)粒pTZ-PVS-3m的多克隆位點(diǎn)而構(gòu)建嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24并表達(dá)HIV-1包膜糖蛋白的步驟圖解描述。
圖11示克隆在嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒內(nèi)的HIV-1env基因直至第12代的PCR分析，用于評價(jià)傳代期間嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env的遺傳穩(wěn)定性泳道1感染野生型薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒的HeLa細(xì)胞的PCR產(chǎn)物泳道2感染重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m的HeLa細(xì)胞的PCR產(chǎn)物泳道3感染第3代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env的HeLa細(xì)胞的PCR產(chǎn)物泳道4感染第6代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env的HeLa細(xì)胞的PCR產(chǎn)物泳道5感染第9代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env的HeLa細(xì)胞的PCR產(chǎn)物泳道6感染第12代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env的HeLa細(xì)胞的PCR產(chǎn)物圖12為由不超過第12代的嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒表達(dá)的HIV-1env蛋白的Western印跡，目的在于評價(jià)傳代期間嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env的表達(dá)穩(wěn)定性泳道1HeLa細(xì)胞的裂解物泳道2感染重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m的HeLa細(xì)胞的裂解物泳道3感染第3代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物泳道4感染第6代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物泳道5感染第9代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞裂解物泳道6感染第12嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物圖13為圖解描述通過將HCV核心蛋白基因克隆至重組體質(zhì)粒pTZ-PVS-3m的多克隆位點(diǎn)而構(gòu)建嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc表達(dá)HCV核心蛋白的步驟。
圖14示評價(jià)嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc復(fù)制能力的一步生長曲線。培養(yǎng)物上清液中病毒滴度每3小時(shí)由TCID50和噬菌斑測定法測定。
圖15為檢驗(yàn)HeLa細(xì)胞感染嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc時(shí)HCV核心蛋白表達(dá)模式的HCV核心蛋白Western印跡泳道1HeLa細(xì)胞裂解物泳道2感染野生薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒的HeLa細(xì)胞的裂解物泳道3感染嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的HeLa細(xì)胞的裂解物泳道4嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的沉淀泳道5無病毒的HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液濃縮物泳道6感染嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc之HeLa細(xì)胞的裂解物的沉淀泳道7感染嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc之HeLa細(xì)胞的裂解物的上清液圖16示克隆在嵌合病毒內(nèi)的HCV核心蛋白基因直至第12代的PCR分析，用于評價(jià)傳代期間嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的遺傳穩(wěn)定性泳道1感染野生型薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒的HeLa細(xì)胞的PCR產(chǎn)蝴泳道2感染重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m的HeLa細(xì)胞的PCR產(chǎn)物泳道3感染第3代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的HeLa細(xì)胞的PCR產(chǎn)物泳道4感染第6代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的HeLa細(xì)胞的PCR產(chǎn)物泳道5感染第9代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的HeLa細(xì)胞的PCR產(chǎn)物泳道6感染第12代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的HeLa細(xì)胞的PCR產(chǎn)物圖17為由不超過第12代的嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒表達(dá)的HCV核心蛋白的Western印跡，以評價(jià)傳代期間嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的表達(dá)穩(wěn)定性。
泳道1感染第1代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物泳道2感染第3代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物泳道3感染第6代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物泳道4感染第9代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物泳道5感染第12代嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物發(fā)明詳述脊髓灰質(zhì)炎病毒屬小RNA病毒科，它是一種因感染及毀壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脊髓灰質(zhì)炎引發(fā)劑(Bodian & Howe，1955Couderc等，1989)。應(yīng)用滅活了的或活的減毒疫苗可有效地控制脊髓灰質(zhì)炎。通過在猴組織體內(nèi)和體外對野生型株系多次傳代后已經(jīng)篩選出三種血清型減毒株系(Sabin & Boulger，J.Biol.Stand.，114，1973)。這些株系(薩賓1，2和3)能在靈長類腸道內(nèi)復(fù)制并誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)大粘膜和全身性免疫力，它們顯現(xiàn)良好的安全記錄。然而有報(bào)道說，在美國，每年經(jīng)口服脊髓灰質(zhì)炎病毒(OPV)后仍有5-10例與疫苗相關(guān)的脊髓灰質(zhì)炎病(VAP)發(fā)生(Ogra & Faden，J.Pediatr.，108，1031，1986；Nkowane等，JAMA，257，1335，1987)。VAP可能是薩賓株系基因變異的結(jié)果，如重組(Furione等，病毒學(xué)，196，199，1993)或點(diǎn)突變(Guillot等，疫苗，12，503，1994)。在健康免疫者的腸道和VAP病人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中確實(shí)發(fā)現(xiàn)了疫苗派生的神經(jīng)毒性株系(Georgescu等，病素學(xué)雜志，68，8089，1994；Friedrich，病毒學(xué)學(xué)報(bào)，40，157，1996)。可是已報(bào)道VAP通常與薩賓2型，3型有關(guān)，而與薩賓1型卻很少相關(guān)(furione等，病毒學(xué)，196，199，1993；Otelea等，Dev.Biol.Stand.，78，33，1992)。薩賓1型較大數(shù)目的減毒突變可能反映出這種株系比2型和3型株系具有更高的安全性。因此，當(dāng)期望粘膜免疫防御傳染病時(shí)，脊髓灰質(zhì)炎病毒薩賓I型株系是用于傳送外源抗原到腸道中的活病毒載體最佳候選者。
本發(fā)明就是基于薩賓I型株系這些優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明者致力于利用脊髓灰質(zhì)炎病毒薩賓I型株系作為粘膜疫苗載體。他們通過將一個(gè)多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)引入薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒cDNA的N末端而構(gòu)建了一種重組體質(zhì)粒pTZ-PVS-3m。由該質(zhì)粒合成的RNA轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞時(shí)具傳染力，結(jié)果產(chǎn)生重組體子代病毒(PVS-3m)。重組體病毒的復(fù)制能力略為降低，較野生型薩賓株系約低1-10倍。不過，通過在將各種疫苗基因克隆至載體pTZ-PVS-3m中后，如上述轉(zhuǎn)染得到的嵌合薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒可以維持外源基因的穩(wěn)定表達(dá)至少連續(xù)12代。
脊髓灰質(zhì)炎病毒薩賓I型株系是薩賓和他的同事們在1961年開發(fā)的。他們通過在猴腎細(xì)胞已建立的細(xì)胞系中連續(xù)傳代野生型馬洪芮(Mahoney)株系而開發(fā)了一種減毒、神經(jīng)毒性較小、免疫原性更強(qiáng)的脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗株系，稱為薩賓1型脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗株系。薩賓I型與野生型馬洪芮株系相比有57個(gè)核苷酸取代，其中21個(gè)引起氨基酸置換。薩賓I型株系的核苷酸序列用SEQ.ID.No.1表示。導(dǎo)致編碼結(jié)果改變的所有變化集中在VP1主要衣殼蛋白N末端半?yún)^(qū)(Kitamura等，自然，291，547-553，1981；Nomoto等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，79，5793-5797，1982)。薩賓I型株系的復(fù)制能力較野生型馬洪芮株系低2-3個(gè)對數(shù)。由于它在傳代期間已失去了親神經(jīng)性，因此不引起靈長類麻痹性脊髓灰質(zhì)炎。不過，它仍保持了親腸能力，足以引起有效的粘膜和全身免疫。在美國，1961年它開始被批準(zhǔn)為一種口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗(OPV)，1963年得到普遍使用(Ogra等，傳染病回顧2，352-369，1980)。
為了本發(fā)明，通過位點(diǎn)特異性插入實(shí)驗(yàn)，新近將多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)引入薩賓I型長多蛋白cDNA第1和第2氨基酸之間，構(gòu)建了重組體質(zhì)粒pTZ-PCV-3m(圖1)。這個(gè)多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)為具有3個(gè)限制性位點(diǎn)SstII，HpaI和EagI。
在脊髓灰質(zhì)炎病毒的不同部位含有外源性多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的一些重組體質(zhì)粒中，當(dāng)用其RNA轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)錄單層HeLa細(xì)胞時(shí)，重組體質(zhì)粒pTZ-PVS-3m能最為有效地生產(chǎn)重組體子代毒(圖3)。通過TCID50和噬菌斑測定法測定病毒滴度繪制的一步生長曲線揭示重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒PCV-3m的復(fù)制能力比野生型薩賓I型株系至多低一個(gè)對數(shù)；在各種嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒中屬最高(圖5)。
在本發(fā)明中，三種外源性疫苗基因HIV-1p24(16qaa)，HIV-1env(125aa)和HCV核心蛋白基因(100aa)被成功地引入pTZ-PCV-3m的多克隆位點(diǎn)，當(dāng)它們的RNA轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中時(shí)，結(jié)果分別產(chǎn)生了嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PCV-3m/p24，PCV-3m/env和PCV-3m/HCVc(圖4，圖10和圖13)。
這些嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒在HeLa細(xì)胞中的復(fù)制期間有效地表達(dá)外源性蛋白質(zhì)(圖6和圖15)，所表達(dá)的蛋白質(zhì)保留著最初的抗原性(圖7)。此外，這些嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒在系列傳代期間是遺傳穩(wěn)定的(圖8，圖11和圖16)，并且在傳代期間外源基因的表達(dá)不遭到破壞(圖9，圖12和圖17)。
這些結(jié)果有力地提示重組體質(zhì)粒pTZ-PCV-3m可以作為一種用效的疫苗載體而用于開發(fā)防御一些傳染病的一些粘膜疫苗。本發(fā)明的重組體質(zhì)粒pTZ-PCV-3m已于1997年8月6日保藏在韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所(KRIBB)，位于大田，登記號(hào)為KCTC-0365BP。
能被引入本發(fā)明重組體質(zhì)粒pTZ-PCV-3m的多克隆位點(diǎn)的外源性疫苗基因可包括衍生自各種傳染性病毒(如HIV，HBV，HCV，人乳頭瘤病毒，輪狀病毒等)的那些基因，但不限于此。
可通過已知方法將含有幾種外源性疫苗基因的重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞(如HeLa細(xì)胞)以獲得嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒，可用作口服疫苗。序列表中的獨(dú)立注解SEQ.ID.No.2是一種人工序列，它是一種用于DNA擴(kuò)增的具有多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的合成測序引物；SEQ.ID.No.3是一種人工序列，它是由SEQ.ID.No.2編碼的肽；
SEQ.ID.No.4是一種人工序列，它是用于DNA擴(kuò)增的具有多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的引物；SEQ.ID.No.5是一種人工序列，它是由SEQ.ID.No.4編碼的肽；SEQ.ID.No.6是一種人工序列，它是用于DNA擴(kuò)增的、具有多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的引物；SEQ.ID.No.7是一種人工序列，它是用于DNA擴(kuò)增的、具有多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的引物。
SEQ.ID.No.8是一種人工序列，它是由SEQ ID No.7編碼的肽；SEQ.ID.No.9是一種人工序列，它是用于DNA擴(kuò)增的、具有多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的引物；SEQ.ID.No.10是一種人工序列，它是由SEQ.ID.No.9編碼的肽；SEQ.ID.No.11是一種人工序列，它是用于DNA擴(kuò)增的、具有多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的SstII有義引物；SEQ.ID.No.12是一種人工序列，它是用于DNA擴(kuò)增的、具有多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的EagI反義引物；SEQ.ID.No.13是一種人工序列，它是一種cDNA合成引物；SEQ.ID.No.14是一種人工序列，它是用于DNA擴(kuò)增的、具有多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的有義引物；SEQ.ID.No.15是一種人工序列，它是用于DNA擴(kuò)增的、覆蓋薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒第797-814位核苷酸的反義引物；SEQ.ID.No.16是一種人工序列，它是用于PCR擴(kuò)增的SstII有義引物裂解物SEQ.ID.No.17是一種人工序列，它是用于DNA擴(kuò)增的EagI反義引物；SEQ.ID.No.18是一種人工序列，它是用于DNA擴(kuò)增的有義引物；SEQ.ID.No.19是一種人工序列，它是用于DNA擴(kuò)增的反義引物；SEQ.ID.No.20是具有多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的一種人工序列。實(shí)施例通過各實(shí)施例詳盡地描述本發(fā)明，但不應(yīng)理解這些實(shí)施例會(huì)限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1重組體質(zhì)粒pTZ-PCV-3m的構(gòu)建質(zhì)粒pVS(1)IC-(O)T(脊髓灰質(zhì)炎病毒薩賓I型cDNA質(zhì)粒；得自東京大學(xué)Dr.Nomoto)經(jīng)限制性酶EcoRI消化，分離cDNA。將該cDNA克隆至質(zhì)粒pTZ-18/R(Pharmacia)中而構(gòu)建質(zhì)粒pTZ-PVS(1)。
質(zhì)粒pTZ-PVS(1)經(jīng)限制酶PstI消化以減小cDNA部分的大小，使其自連接產(chǎn)生具有脊髓灰質(zhì)炎病毒cDNA核苷酸序列1-1813的質(zhì)粒亞克隆pTZ-PVS(1)/5。
將質(zhì)粒pTZ-PVS(1)/5轉(zhuǎn)化至E.coli CJ236(dut-，ung-，Cmr)在補(bǔ)加了0.25μg/ml尿嘧啶核苷的LB-amp氯霉素培養(yǎng)基(LB，40μg/ml氨芐青霉素，30μg/ml氯霉素)中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體。當(dāng)培養(yǎng)物的OD600nm達(dá)到約0.5-0.6時(shí)，細(xì)胞被多于10moi/細(xì)菌的M13K07輔助噬菌體(Pharmacia)超感染，然后在添加有卡那霉素，胸腺嘧啶核苷和尿嘧啶核苷的LB-amp氯霉素培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)約8個(gè)小時(shí)以獲得摻入了尿嘧啶的單鏈?zhǔn)删！?br>
噬菌粒經(jīng)PEG/NaCl(重蒸水中的20％PEG和2.5M NaCl)沉淀并經(jīng)酚/三氯甲烷抽提，獲得SS-DNA。
將1μgSSDNA和5pmole具有SEQ.ID.No.2序列的誘變引物加入10μl緩沖液(20mM Tris-HCl，pH7.4中的2mM MgCl2，50mM NaCl)，在70℃水浴中保溫10分鐘，隨后逐步冷卻至30℃而進(jìn)行退火。
再加入1μl 10X合成緩沖液(每種dNTP各5mM，10mM rATP，100mM Tris-HClpH7.4，50mM MgCl2，20mM DTT)，3個(gè)單位T4DNA連接酶(Bio-Rad)和1個(gè)單位T4 DNA聚合酶(Bio-Rad)，使其依次在冰上反應(yīng)5分鐘，在25℃反應(yīng)5分鐘，然后在37℃90分鐘。
將合成的dsDNA轉(zhuǎn)化至E.coli MV1190(dut+，ung+，Cmr)，通過用SstII，HpaI和EagI這些酶進(jìn)行消化而篩選出具有SstII，HpaI和EagI限制位點(diǎn)的那些轉(zhuǎn)化體。將通過應(yīng)用PstI消化質(zhì)粒pTZ-PVS(1)獲得的cDNA片段(覆蓋核苷酸1814-7440)連接至加工過的質(zhì)粒pTZ-PVS(5)的相應(yīng)PstI位點(diǎn)而產(chǎn)生重組體質(zhì)粒pTZ-PVS-3m。重組體載體pTZ-PVS-3m在脊髓灰質(zhì)炎病毒薩賓I型cDNA長多蛋白第1和第2氨基酸之間接點(diǎn)處具有3C-蛋白酶切割位點(diǎn)(AXFQ/G)(Dougherty & Semler，微生物學(xué)回顧，57，781-822，1993)和多克隆位點(diǎn)(SstII-HpaI-EagI)。新插入的區(qū)域具有SEQ.ID.No.3的氨基酸序列。比較實(shí)施例1重組體載體pTZ-PVS-m的構(gòu)建除使用具有SEQ.ID.No.4序列的不同誘變引物外，按實(shí)施例1的相同步驟構(gòu)建了重組體質(zhì)粒pTZ-PVS-m。
重組體載體pTZ-PVS-m在脊髓灰質(zhì)炎病毒薩賓I型cDNAN-末端第3和第4氨基酸接點(diǎn)處具有3C-蛋白酶切割位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn)(SstII-HpaI-EagI)。新插入的區(qū)域具有SEQ.ID.No.5的氨基酸序列。這個(gè)載體被設(shè)計(jì)為具有以GG…開始的病毒多蛋白N端，期望在3c蛋白酶介導(dǎo)的加工中能保持肉豆蔻酰化位點(diǎn)。比較實(shí)施例2重組體載體pTZ-PVS-2m的構(gòu)建除使用具有SEC.ID.No.6序列的不同誘變引物外，按實(shí)施例1的相同步驟構(gòu)建了重組體載體pTZ-PVS-2m。
重組體載體pTZ-PVS-2m與比較實(shí)施例1中的pTZ-PVS-m相似，只是前者在3c蛋白酶介導(dǎo)的加工中在病毒多蛋白N末端僅具1個(gè)鳥嘌呤而不是2個(gè)。比較實(shí)施例3重組體質(zhì)粒pTZ-PVS-2m/l的構(gòu)建按實(shí)施例1的相同步驟構(gòu)建重組體質(zhì)粒pTZ-PVS-2m/1，只是其中有兩點(diǎn)不同，即比較實(shí)施例2的重組體質(zhì)粒pTZ-PVS-2m被用作誘變模板，使用具有SEQ.ID.No.7序列的不同誘變引物。
通過應(yīng)用A/T替換某些G/C部分，將重組體質(zhì)粒pTZ-PVS-2m/l設(shè)計(jì)為其多克隆位點(diǎn)具有比比較實(shí)施例1的質(zhì)粒pTZ-PVS-m或比較實(shí)施例2的質(zhì)粒pTZ-PVS-2m更低的G/C含量。同時(shí)，多克隆位點(diǎn)變?yōu)镾stII-HpaI-XhoI，新插入?yún)^(qū)域具有SEQ.ID.No.8的氨基酸序列。比較例4 重組體載體pTZ-PVS-4m的構(gòu)建除使用不同的誘變模板和具有SEQ.ID.No.9序列的不同誘變引物外，按實(shí)施例1中的相同步驟構(gòu)建重組體載體pTZ-PVS-4m。
重組體載體pTZ-PVS-4m在薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒cDNA長多蛋白VP3和VP4之間的接點(diǎn)處具有3C-蛋白酶切割位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn)(ApaI-HpaI-XhoI)。新插入的外源區(qū)域具有SEQ.ID.No.10的氨基酸序列。實(shí)施例2由重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒質(zhì)粒合成的RNA轉(zhuǎn)錄物的感染性如前所述(Bae等，核酸研究，21，2703，1993)，實(shí)施例1和比較例1-4的質(zhì)粒經(jīng)SalI消化而線性化后，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄以合成RNA轉(zhuǎn)錄物。
將RNA轉(zhuǎn)錄物(0.1μg)通過DEAE-Dextran方法根據(jù)Vender’s方案(Stratagene Kit)轉(zhuǎn)染至單層HeLa細(xì)胞中，該細(xì)胞生長在添加了10％FCS(胎牛血清)的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO/BRL)中。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在甲基纖維素-DMEM(添加了10％FCS的DMEM中加1.2％甲基纖維素而制得)中于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。為觀察噬斑，細(xì)胞經(jīng)0.1％結(jié)晶紫染色。表1中所示的噬斑數(shù)目表示每種RNA轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)染能力。圖3顯示由重組體質(zhì)粒合成的每種RNA轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的噬斑圖象。
表1
表1顯示質(zhì)粒pTZ-PVS-3m的RNA轉(zhuǎn)錄物在除野生型株系外的所有重組體質(zhì)粒中，具有最強(qiáng)的轉(zhuǎn)染能力。于1997年8月6日將重組體質(zhì)粒pTZ-PVS-3m保藏于韓國典型培養(yǎng)物保藏中心，登記號(hào)為KCTC-0365BP。實(shí)施例3嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒質(zhì)粒pTZ-PVS-3m/p24的構(gòu)建和嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24的生產(chǎn)利用2個(gè)p24特異性PCR引物基于Terwilliger等，(美國國家科學(xué)院院報(bào)，86，3857，1989)出版的有關(guān)序列信息的SstII-p24有義引物(SEQ.ID.No.11)和EagI-p24反義引物(SEQ.ID.No.12)，通過PCR從HIV-1cDNA(HXB2，來自NIH愛滋病研究和參考試劑計(jì)劃，USA)擴(kuò)增覆蓋HIV-1p24 N末端169個(gè)氨基酸殘基的cDNA片段。如圖4所示，從瓊脂糖凝膠中提取PCR片段，經(jīng)SstII和EagI消化，然后引入至實(shí)施例1中質(zhì)粒pTZ-PVS-3m的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建成重組體質(zhì)粒pTZ-PVS-3m/p24。
如實(shí)施例2所述，將從重組體質(zhì)粒pTZ-PVS-3m/p24合成的RNA轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染至單層HeLa細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞在37℃CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)一步培養(yǎng)直至單層細(xì)胞上出現(xiàn)完全細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。收獲培養(yǎng)物上清液作為嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24的來源。實(shí)施例4嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24的一步生長曲線為了評價(jià)表達(dá)HIV-1p24蛋白的嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒的復(fù)制能力，通過在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定培養(yǎng)物上清液中的病毒滴度而確定一步生長曲線。
在室溫將野生型薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒(PVS)或PVS-3m，PVS-4m，PVS-3m/p24或PVS-4m/p24的重組體或嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒以10moi接種在60mm平板中的HeLa細(xì)胞內(nèi)(4.8×105個(gè)細(xì)胞)一小時(shí)以使病毒能吸附在細(xì)胞上。細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌，然后換入3mlDMEM，繼續(xù)在37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。感染后，每3小時(shí)取培養(yǎng)物上清液，通過噬斑測定法或《病毒學(xué)-一種實(shí)用方法》(13頁，主編BWJ Mahy，IRL出版，1985)中描述的TCID50法對每份樣品作病毒滴度測定。結(jié)果顯示在圖5中。
如圖5所示，重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m最多比野生型薩賓I型(PVS)的復(fù)制能力低1個(gè)對數(shù)，而嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24顯示出與重組體嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m類似的復(fù)制能力。然而，重組體嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-4m顯示比野生型薩賓I型(PVS)的復(fù)制能力低2個(gè)對數(shù)以上，整合了p24的質(zhì)粒pTZ-PVS-4m/p24不太可能產(chǎn)生具有復(fù)制能力的嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-4m/p24。實(shí)施例5嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24復(fù)制期間外源性p24蛋白的表達(dá)模式為了確定嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24在復(fù)制期間能否表達(dá)HIV-1p24蛋白，將嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24以10moi濃度接種于HeLa細(xì)胞中。6小時(shí)后收獲細(xì)胞，用PBS洗滌2次，將細(xì)胞重懸于裂解緩沖液(80mM NaCl，5mM MgCl2，10mM Tris-ClpH7.4，1mM DTT，0.5％NP-40)中，將其置于冰上5分鐘，然后離心以除去細(xì)胞核和細(xì)胞碎片。將上清液和等體積的2X樣品緩沖液(50mMTrispH6.8，1％β-巰基乙醇，10％甘油，0.03％溴酚蘭)混合，煮沸3分鐘，然后在10％SDS-PAGE上分離。將分離的樣品用半干印跡轉(zhuǎn)移器(Bio-Rad)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Millipore)上，然后用愛滋病病人的血清篩查。結(jié)果顯示在圖6中。
在Western印跡實(shí)驗(yàn)中，在比野生型p24(24KDa)條帶更低的條帶處(18.4KDa)檢測到重組體p24蛋白(169aa)，這意味著重組體p24是由于嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒感染而產(chǎn)生的，而不是由于野生型p24的污染所致。因此，圖6中所示結(jié)果清楚說明本發(fā)明的嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24能有效地表達(dá)整合的HIV-1p24蛋白。實(shí)施例6嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒表達(dá)的外源性疫苗蛋白抗原性的保留為了確定由實(shí)施例4中嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24產(chǎn)生的HIV-1p24蛋白能否保留野生型p24的抗原性，應(yīng)用抗p24的抗體進(jìn)行放射免疫沉淀試驗(yàn)。
將嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24以10moi接種于HeLa細(xì)胞中。感染5小時(shí)后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到不含甲硫氨酸/半胱氨酸的新鮮DMEM(GIBCO/BRL)中。饑餓1小時(shí)后，將同位素標(biāo)記的甲硫氨酸/半胱氨酸[(L-35S)-Met/Cys，比活性＞1000Ci/mmole；Amersham]加入至培養(yǎng)基中至終濃度為50μCi/mmole，然后繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)。通過胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌2次，后用500μl放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)緩沖液(150mM NaCl，1％NP-40，0.5％DOC，0.1％SDS，50mM Tris-HCl，pH8.0)在冰上裂解細(xì)胞10分鐘。離心除去細(xì)胞核和細(xì)胞碎片后，向上清液中加入3μl兔抗p24抗血清，混合物在4℃反應(yīng)12小時(shí)。將于PBS中的80μl10％蛋白A-瓊脂糖加入至反應(yīng)混合物中，使其在室溫下與抗體反應(yīng)1小時(shí)，隨后離心回收瓊脂糖珠。抗原珠復(fù)合物用RIPA緩沖液洗滌3次，重懸于50μl 1X樣品緩沖液中，煮沸3分鐘，在10％SDS-PAGE上分離，然后通過放射自顯影確定已感染細(xì)胞裂解產(chǎn)物中有抗體反應(yīng)性的抗原。結(jié)果顯示在圖7中。
圖7中的結(jié)果清楚表明本發(fā)明的嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24產(chǎn)生的HIV-1p24蛋白具有與野生型HIV-1p24類似的抗原性。實(shí)施例7嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24的遺傳穩(wěn)定性為了評價(jià)實(shí)施例4中嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24的遺傳穩(wěn)定性，將PVS-3m/p24的嵌合子代病毒在HeLa細(xì)胞內(nèi)連續(xù)傳代，應(yīng)用對每代病毒中提取的病毒RNA進(jìn)行RT-PCR確定克隆基因的完整性。病毒顆粒經(jīng)添加PEG/NaCl至終濃度分別為5％/0.125M而加以沉淀。放置室溫下30分鐘，通過離心10分鐘而沉淀混合物。經(jīng)酚-三氯甲烷抽提和乙醇沉淀獲得病毒RNA。
將提取的RNA(10μg)與cDNA合成引物(SEQ.ID.No.13)(1μg)混合。混合物在70℃變性10分鐘。將混合物迅速移至冰上，然后加入逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)液(50mM Tris-HClpH8.3，65mM KCl，3mM MgCl2，10mM DTT，1mM dNTP混合物，20單位RNAsin)和200單位MMLV(Moloney Murine Leukemia病毒；GIBCO/BRL)逆轉(zhuǎn)錄酶，再在42℃反應(yīng)60分鐘。將反應(yīng)混合物在100℃保溫3分鐘使酶失活。
利用薩賓I型有義引物(SEQ.ID.No.14)和薩賓I型反義引物(SEQ.ID.No.15)進(jìn)行RT-PCR以擴(kuò)增含有已克隆的外源性基因的加工區(qū)域。使用Taq聚合酶(Bionear，韓國)，完成RT-PCR 25個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)為94℃1分鐘，45℃30秒，72℃45秒。結(jié)果示于圖8。
圖8中，666bp處顯示的條帶是由已克隆的p24基因(504bp，169aa)及克隆位點(diǎn)周圍的部分脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組組成。而，270bp處的條帶提示，在轉(zhuǎn)染的諸步驟及重組嵌合病毒傳代期間，克隆的p24基因中存在某些內(nèi)部缺失。然而，如圖8所示，666bp處條帶亮度并不隨傳代的進(jìn)行而減弱，這有力地提示，本發(fā)明的嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24攜帶克隆的外源性基因在12代后仍很穩(wěn)定。嵌合病毒的遺傳穩(wěn)定性亦被對傳代期間嵌合病毒表達(dá)p24的模式的分析所證實(shí)。
在嵌合病毒傳代期間可以觀察到HIV-1p24的表達(dá)模式。每代嵌合子代病毒均以10moi濃度接種于HeLa細(xì)胞中。感染8小時(shí)后收獲細(xì)胞，對裂解產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨后與兔抗p24抗血清進(jìn)行Western印跡雜交。結(jié)果顯示在圖9中。
圖9中的結(jié)果證實(shí)了脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24傳代12代以上時(shí)仍穩(wěn)定不變地表達(dá)克隆的p24蛋白，表明在傳代期間整合的外源基因被有效保留。
這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)由將HIV-1p24基因(169aa)引入重組體載體pTZ-PVS-3m的多克隆位點(diǎn)獲得的本發(fā)明嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24能有效表達(dá)克隆的p24蛋白，該蛋白質(zhì)具有與野生型HIV-1p24蛋白類似的抗原性。此外，嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24保留了克隆的p24基因的序列，并在12代后仍保持良好的p24蛋白表達(dá)水平，表明嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24遺傳學(xué)足夠穩(wěn)定，可以用作為克隆。
考慮到被用作本發(fā)明起始載體的脊髓灰質(zhì)炎病毒薩賓I型株系至今從未見有關(guān)引起人任何負(fù)作用的報(bào)道，Walker和他的同事們(科學(xué)，280，825，1998；Rosenberg等，科學(xué)，278，1447，1997)建議本發(fā)明的嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24十分有希望成為一種強(qiáng)有力的抗愛滋病CTL誘導(dǎo)型粘膜疫苗候選者。
為了本發(fā)明，評價(jià)了重組體質(zhì)粒pTZ-PVS-3m作為表達(dá)HIV-1包膜糖蛋白gp120，特別是V3區(qū)域的一種有用疫苗載體的可能性。這樣，將編碼覆蓋HIV-1gp120 V3環(huán)區(qū)125個(gè)氨基酸殘基的基因引入重組體質(zhì)粒pTZ-PVS-3m的多克隆位點(diǎn)，隨后產(chǎn)生嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env。評價(jià)克隆的外源性env基因的表達(dá)和嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env的遺傳穩(wěn)定性。實(shí)施例8重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒質(zhì)粒pTZ-PVS-3m/env的構(gòu)建和嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env的生產(chǎn)如圖10中所述，應(yīng)用PCR擴(kuò)增編碼包括HIV-1gp120的V3環(huán)區(qū)在內(nèi)的125個(gè)氨基酸殘基(env蛋白第251-375位氨基酸序列)的cDNA片段(375bp)，并將其引入重組體載體pTZ-PVS-3m的多克隆位點(diǎn)。
利用分別在5’端和3’端具有限制酶SstII和EagI識(shí)別位點(diǎn)的兩種引物SstII-env有義引物(SEQ.ID.No.15)和EagI-env反義引物(SEQ.ID.No.16)，通過PCR從HXB2(從NIH愛滋病研究及參考試劑計(jì)劃，US獲得)擴(kuò)增env(125aa)基因的預(yù)定區(qū)域。
PCR產(chǎn)物經(jīng)SstII和EagI消化，將375bp的基因片段引入實(shí)施例1的載體pTZ-PVS-3m中相應(yīng)的SstII和EagI位點(diǎn)，產(chǎn)生重組體質(zhì)粒pTZ-PVS-3m/env(圖10)。
按實(shí)施例2中的步驟，對質(zhì)粒pTZ-PVS-3m/p24進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，將RNA轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染至60mm培養(yǎng)平板上的單層HeLa細(xì)胞中。在補(bǔ)加了10％FCS的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)已轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞2天。當(dāng)觀察到完全CPE時(shí)，收集培養(yǎng)物上清液作為嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env的來源。實(shí)施例9嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env的一步生長曲線為了評價(jià)表達(dá)HIV-1env蛋白的嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒的復(fù)制能力，按實(shí)施例4中描述的步驟測定每一時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)物上清液中的病毒滴度，確定了一步生長曲線。試驗(yàn)重復(fù)4次，其平均值示于表2中。
表2
如表2所示，嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env的復(fù)制能力最多比野生型薩賓I型(PVS)低1個(gè)對數(shù)，但與PVS-3m的復(fù)制能力類似。實(shí)施例10嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env復(fù)制期間外源性env蛋白的表達(dá)模式確定嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env在其生長期間是否表達(dá)克隆的env蛋白。將嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env以10moi濃度接種于HeLa細(xì)胞中。感染8小時(shí)后收獲已感染細(xì)胞，對其進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳。然后，用愛滋病病人血清進(jìn)行Western印跡雜交，結(jié)果示于圖11中。圖11中顯示的結(jié)果證實(shí)了本發(fā)明嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env能有效地表達(dá)HIV-1env蛋白(125aa，15KDa)。實(shí)施例11嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env的遺傳穩(wěn)定性為了評價(jià)實(shí)施例8的嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env的遺傳穩(wěn)定性，將PVS-3m/env的嵌合子代病毒在HeLa細(xì)胞中連續(xù)傳代，按實(shí)施例7中描述的相同步驟進(jìn)行RT-PCR而確定克隆基因(375bp)的完整性。結(jié)果示于圖11中。圖11中顯示的結(jié)果說明本發(fā)明的嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env在傳至第12代以上時(shí)仍穩(wěn)定地?cái)y帶外源性基因。
此外，嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒的遺傳穩(wěn)定性同樣通過對傳代期間嵌合病毒env表達(dá)模式的分析所證實(shí)。
除使用愛滋病病人血清進(jìn)行Western印跡雜交外，嵌合病毒按實(shí)施例7中描述的相同步驟確定傳代期間HIV-1env蛋白的表達(dá)模式。結(jié)果顯示于圖12中。圖12中結(jié)果證實(shí)了嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env在傳代12代以上時(shí)仍不變地表達(dá)克隆的env蛋白(125aa)，表明該已克隆的外源性基因在傳代期間有效地保留著。
這些試驗(yàn)結(jié)果證明，通過將HIV-1env基因(125aa)引入重組體載體pTZ-PVS-3m的多克隆位點(diǎn)得到的本發(fā)明嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env能有效地表達(dá)克隆的env基因。此外，嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env在12代以上時(shí)仍保存了克隆的env基因的完整序列，并仍保持良好的env蛋白表達(dá)水平，顯示嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env在遺傳學(xué)上足夠穩(wěn)定，可用作疫苗候選者的克隆。
考慮到用作本發(fā)明起始載體的脊髓灰質(zhì)炎病毒薩賓I型株系到目前為止未見有對人類任何負(fù)作用的報(bào)道，本發(fā)明的嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/env很有希望可用作抗愛滋病的強(qiáng)有力的口服粘膜疫苗。
如上所示，本發(fā)明的重組體載體pTZ-PVS-3m具有多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)，使之易于將各種外源性疫苗基因引入重組體薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒中，同時(shí)汲取了薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒的優(yōu)點(diǎn)，因而有利于產(chǎn)生遺傳穩(wěn)定的、可用作抗一些傳染性病毒疾病的口服疫苗的嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒。
為了本發(fā)明，為評價(jià)重組體載體pTZ-PVS-3m作為疫苗載體用于愛滋病以外的其他傳染性病毒疾病的可能性，將丙型肝炎病毒的核心蛋白編碼基因(HCVc)克隆至重組體載體pTZ-PVS-3m中。如此，將編碼N末端100個(gè)氨基酸殘基的核心基因一部分引入重組體載體pTZ-PVS-3m的多克隆位點(diǎn)，隨后產(chǎn)生嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc。評價(jià)克隆的外源性HCVc基因的表達(dá)和嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的遺傳穩(wěn)定性。實(shí)施例12嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒pTZ-PVS-3m/HCVc的構(gòu)建和嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的生產(chǎn)通過PCR擴(kuò)增編碼N末端核心100個(gè)氨基酸殘基的HCVc基因，如圖13中所述將擴(kuò)增產(chǎn)物引入重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒質(zhì)粒pTZ-PVS-3m中。
利用兩種引物SstII-HCVc有義引物(SEQ.ID.No.17)和EagI-HCVc反義引物(SEQ.ID.No.18)，通過PCR從pcDNA/Neo-HCV核心質(zhì)粒模板(承蒙Sung博士贈(zèng)與，韓國，Postech)擴(kuò)增HCV核心基因(300bp，100aa)的設(shè)定區(qū)域。
PCR產(chǎn)物用SstII和EagI消化，將300bp的基因片段引入實(shí)施例1的質(zhì)粒pTZ-PVS-3m中相應(yīng)的SstII和EagI位點(diǎn)以生產(chǎn)重組質(zhì)粒pTZ-PVS-3m/HCVc(圖13)。
按實(shí)施例2中的步驟，對質(zhì)粒pTZ-PVS-3m/HCVc進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，將RNA轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染至60mm培養(yǎng)平板中的單層HeLa細(xì)胞內(nèi)。將已轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)加了10％FCS的DMEM培養(yǎng)基中于37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2天。當(dāng)觀察到完全CPE時(shí)，收集培養(yǎng)物上清液，用作嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的來源。實(shí)施例13嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的一步生長曲線為了評價(jià)表達(dá)HCV核心蛋白的嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒的復(fù)制能力，按實(shí)施例4中描述的步驟，測定每一時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)物上清液的病毒滴度，從而確定一步生長曲線。結(jié)果示于表3和圖14中。表3中的數(shù)值為4次重復(fù)試驗(yàn)的平均值表3
<p>如表3和圖14所示，嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc在感染12小時(shí)后顯示出比野生型(PVS)的復(fù)制能力最多低10倍。嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的平均復(fù)制能力比野生型薩賓I型低約5倍，比重組脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m低3倍。實(shí)施例14嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的RNA合成實(shí)驗(yàn)按以前的報(bào)道(Mattion等，病毒學(xué)雜志，68，3925，1994)完成。對生長在24孔平板上的HeLa細(xì)胞用10moi濃度的野生型和嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc進(jìn)行模擬感染或感染。室溫下吸附1小時(shí)后，細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌，在含放線菌素D(5μg/ml，Difco)的DMEM中培養(yǎng)。37℃培養(yǎng)1小時(shí)后，添加25μci/ml的[5，6-3H]-尿苷(Amersham；比活性45ci/mmole)。細(xì)胞每3小時(shí)收獲一次，用PBS洗滌3次，然后加0.5ml裂解緩沖液(80mM NaCl，5mM MgCl2，10mMTris-HClpH8.2，1mM DTT，10mM氧釩核糖核酸酶復(fù)合物和0.5％NP-40)在冰上裂解5分鐘。向裂解產(chǎn)物中加入三氯乙酸至終濃度為20％，并將裂解產(chǎn)物在冰上保溫30分鐘。樣品用玻璃纖維濾膜(Whatsman，GF-C-濾膜)過濾，通過閃爍計(jì)數(shù)器(Hewlett Packard)確定放射活性，結(jié)果示于表4中。
表4
如表4所示，在感染的HeLa細(xì)胞中，嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的RNA合成動(dòng)力學(xué)與野生型(PVS)或重組體脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m類似，只是在感染后6小時(shí)的水平有些不同。結(jié)果提示，實(shí)施例13的嵌合病毒較低的復(fù)制能力(約低5倍)不是由于RNA合成降低的緣故，而似乎是由于嵌合病毒在裝配步驟中低效率的蛋白加工所致。
總而言之，考慮到這樣一個(gè)事實(shí)，即嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc具有與野生型或重組體病毒類似的RNA合成能力，因此嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/p24有所降低的復(fù)制能力(比野生型PVS約低5倍)對于利用該嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒作為口服疫苗可能沒有負(fù)作用。實(shí)施例15嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc復(fù)制期間外源性HCVc蛋白的表達(dá)模式為了確定嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc在其生長期間是否表達(dá)HCV核心蛋白，將嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc以10moi接種于單層HeLa細(xì)胞中1小時(shí)，除去未被吸收的病毒。受感染細(xì)胞在37℃CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)一步培養(yǎng)。感染8小時(shí)后收獲細(xì)胞，并對其進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳。利用兔抗血清(蒙Hwang博士贈(zèng)與，Hallim大學(xué)，韓國)或抗HCV核心蛋白的單克隆抗體(Cio-penesis，Sandown，NH，USA)進(jìn)行Western印跡雜交，結(jié)果顯示在圖15中。圖15中的Western印跡信號(hào)(泳道3)說明本發(fā)明的嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc有效地表達(dá)了克隆的HCV核心蛋白(100aa，12KDa)。
圖15中，有數(shù)條帶而非僅有期望的12KDa處的條帶，推測這是由于HCV核心蛋白在其N末端通過疏水性殘基而與疏水性細(xì)胞器融合之故。為證實(shí)這一假設(shè)，使用同一抗血清通過Western印跡雜交對重組體病毒沉淀(泳道4)，無病毒的培養(yǎng)物上清液濃縮物(泳道5)，或感染了嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞裂解產(chǎn)物的沉淀(泳道6)或細(xì)胞裂解產(chǎn)物的上清液(泳道7)進(jìn)行分析。細(xì)胞裂解物的沉淀(泳道6)和上清液(泳道7)是通過用1％NP-40處理受感染細(xì)胞而獲得的。如圖15中所示，在用特異性抗血清篩查時(shí)，僅有受感染HeLa細(xì)胞的裂解物的沉淀(泳道6)和上清液(泳道7)顯示出抗原條帶的信號(hào)，提示這些信號(hào)并不是由于抗血清的非特異性反應(yīng)。此外，沉淀部分(泳道6)在12KDa處顯示一條更清晰，更集中的條帶，這一事實(shí)使得這個(gè)假設(shè)更為可信。這些結(jié)果和以前的報(bào)道部分相符，即HCV的組裝是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)而不是在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行的，并形成膜結(jié)合性小泡(Dubission等，1994)。假如HCV核心蛋白-細(xì)胞器復(fù)合物不影響重組體病毒復(fù)制的話，這一復(fù)合物將可更為有效地引起抗HCV的CTL免疫與體液免疫。實(shí)施例16嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的遺傳穩(wěn)定性為了評價(jià)實(shí)施例12的嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc的遺傳穩(wěn)定性，對PVS-3m/HCVc的子代病毒在HeLa細(xì)胞內(nèi)連續(xù)傳代，按實(shí)施例7中描述的同一方法通過RT-PCR確定克隆基因(300bp)的完整性。
結(jié)果示于圖16中，其中無論哪一代的每一份樣品在459bp處均出現(xiàn)1條明顯的強(qiáng)帶。在傳代過程中未檢測到由于內(nèi)部缺失(如PVS-3m/p24中所示)或插入而產(chǎn)生的其它條帶。
因此，圖16中的結(jié)果說明本發(fā)明的嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCV在12代以后仍非常穩(wěn)定地?cái)y帶該外源性基因。
此外，通過對傳代期間嵌合病毒HCVc表達(dá)模式進(jìn)行分析也證實(shí)了該嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒的遺傳穩(wěn)定性。
除在Western印跡雜交中使用抗HCV核心蛋白的單克隆抗體(Bio-penesis，Sandown，NH，USA)外，按照與實(shí)施例7中描述的相同步驟確定重組體病毒傳代期間HCV核心蛋白的表達(dá)模式。結(jié)果示于圖17中。圖17中顯示的結(jié)果證實(shí)了嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc在12代后仍不變地表達(dá)HCV核心蛋白(100aa)。
這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明通過將HCV核心基因(100aa)引入重組體載體pTZ-PVS-3m的多克隆位點(diǎn)獲得的本發(fā)明嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc能有效地表達(dá)克隆的HCV核心基因。此外，它保留了克隆的HCV核心基因的完整序列，并在12代后仍以很好的水平表達(dá)HCV核心蛋白，說明嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc在遺傳上足夠穩(wěn)定，可用作HCV疫苗的候選者。
考慮到用作本發(fā)明起始載體的嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒薩賓I型株系至今未見有關(guān)對人類引起任何負(fù)作用的報(bào)道，因此本發(fā)明的嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒PVS-3m/HCVc很有希望能用作抗HCV的強(qiáng)有力的口服粘膜疫苗。
如上所述，本發(fā)明的重組體載體pTZ-PVS-3m具有多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)，因而使之易于將各種外源性疫苗基因引入重組體薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒中，并容易產(chǎn)生遺傳穩(wěn)定的嵌合脊髓灰質(zhì)炎病毒，由于汲取了薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒的優(yōu)點(diǎn)，該嵌合病毒可被用作為抗一些傳染性病毒疾病的口服疫苗。
盡管在上文中已詳細(xì)地描述了本發(fā)明諸優(yōu)選實(shí)施方案，但應(yīng)明確這樣一點(diǎn)，即本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的對本發(fā)明內(nèi)容的各種改變和/或修飾均落入由后附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明精神和范圍之內(nèi)。
序列表<110>Altwell Biotech.Inc.<120>脊髓灰質(zhì)炎病毒具有復(fù)制能力的重組體薩賓I型株系<130>PCT-980807<140><141><150>KR 97-37812<151>1997-08-07<160>20<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>7441<212>DNA<213>A脊髓灰質(zhì)炎病毒1型<300><303>美國國家科學(xué)院院報(bào)<304>79<305>19<306>5793-5797<307>1982<400>1ttaaaacagc tctggggttg cacccgcccc agaggcccac gtggcggcta gtactccggt 60attgcggtac ccttgtacgc ctgttttata ctcccttccc gtaacttaga cgcacaaaac 120caagttcaat agaagggggt acaaaccagt accaccacga acaagcactt ctgtttcccc 180ggtgatgttg tatagactgc ttgcgtggtt gaaagcgacg gatccgttat ccgcttatgt 240acttcgagaa gcccagtacc acctcggaat cttcgatgcg ttgcgctcag cactcaaccc 300cagagtgtag cttaggctga tgagtctgga catccctcac cggtgacggt ggtctaggct 360gcgttggcgg cctacctatg gctaacgcca tgggacgcta gttgtgaaca aggtgtgaag 420agcctattga gctacataag aatcctccgg cccctgaatg cggctaatcc caacctcggg 480gcaggtggtc acaaaccagt gattggcctg tcgtaacgcg caagtccgtg gcggaaccga 540ctactttggg tgtccgtgtt tccttttatt ttattgtggc tgcttatggt gacaatcaca 600gattgttatc ataaagcgaa ttggattggc catccggtga aagtgagatt cattatctat 660ctgtttgctg gattcgctcc attgagtgtg tttactctaa gtacaatttc aacagttatt 720tcaatcagac aattgtatca taatgggtgc tcaggtttca tcacagaaag tgggcgcaca 780tgaaaactca aatagagcgt atggtggttc taccattaat tacaccacca ttaattatta 840tagagattca gctagtaacg cggcttcgaa acaggacttc tctcaagacc cttccaagtt 900caccgagccc atcaaggatg tcctgataaa aacatcccca atgctaaact cgccaaacat 960agaggcttgc gggtatagcg atagagtact gcaattaaca ctgggaaact ccactataac 1020cacacaggag gcggctaatt cagtagtcgc ttatgggcgt tggcctgaat atctgaggga 1080cagcgaagcc aatccagtgg accagccgac agaaccagac gtcgctgcat gcaggtttta 1140tacgctagac accgtgtctt ggacgaaaga gtcgcgaggg tggtggtgga agttgcctga 1200tgcactgcgg gacatgggac tctttggcca aaatatgtac taccactacc taggtaggtc 1260cgggtacacc gtgcatgtac agtgtaacgc ctccaaattc caccaggggg cactaggggt 1320attcgccgta ccagagatgt gtctggccgg ggatagcaac accactacca tgcacaccag 1380ctatcaaaat gccaatcctg gcgagaaagg aggcactttc acgggtacgt tcactcctga 1440cgacaaccag acatcacctg cccgtaggtt ctgcccggtg gattacctct ttggaaatgg 1500cacgttattg gggaatgcct ttgtgttccc gcaccagata ataaacctac ggaccaacaa 1560ctgtgctaca ctggtactcc cttacgtgaa ctccctctcg atagatagta tggtaaagca 1620caataattgg ggaattgcaa tattaccatt ggccccatta aattttgcta gtgagtcctc 1680cccagagatt ccaatcacct tgaccatagc ccctatgtgc tgtgagttca atggattaag 1740aaacattacc ctgccacgct tacagggcct gccggtcatg aacacccctg gtagcaatca 1800atatcttact gcagacaact tccagtcacc gtgtgcgctg cctgaatttg atgtgacccc 1860acctattgac atacccggtg aagttaagaa catgatggaa ttggcagaaa tcgacaccat 1920gattcccttt gacttaagtg caaaaaaaaa gaacaccatg gaaatgtata gggttcggtt 1980aagtgacaaa ccacatacag acgatcccat actctgcctg tcactctctc cagcttcaga 2040tcctaggttg tcacatacta tgcttggaga aatcctaaat tactacacac actgggcagg 2100atccctgaag ttcacgtttc tgttctgtgg atccatgatg gcaactggca aactgttggt 2160gtcatacgcg cctcctggag ccgacccacc aaagaagcgt aaggaggcga tgttgggaac 2220acatgtgatc tgggacatag gactgcagtc ctcatgtact atggtagtgc catggattag 2280caacaccacg tatcggcaaa ccatagatga tagtttcacc gaaggcggat acatcagcgt 2340cttctaccaa accagaatag tcgtccctct ttcgacaccc agagagatgg acatccttgg 2400ttttgtgtca gcgtgtaatg acttcagcgt gcgcttgatg cgagatacca cacatataga 2460gcaaaaagcg ctagcacagg ggttaggtca gatgcttgaa agcatgattg acaacacagt 2520ccgtgaaacg gtgggggcgg caacgtctag agacgctctc ccaaacactg aagccagtgg 2580accagcacac tccaaggaaa ttccggcact caccgcagtg gaaactgggg ccacaaatcc 2640actagtccct tctgatacag tgcaaaccag acatgttgta caacataggt caaggtcaga 2700gtctagcata gagtctttct tcgcgcgggg tgcatgcgtg gccattataa ccgtggataa 2760ctcagcttcc accaagaata aggataagct atttacagtg tggaagatca cttataaaga 2820tactgtccag ttacggagga aattggagtt cttcacctat tctagatttg atatggaatt 2880tacctttgtg gttactgcaa atttcactga gactaacaat gggcatgcct taaatcaagt 2940gtaccaaatt atgtacgtac caccaggcgc tccagtgccc gagaaatggg acgactacac 3000atggcaaacc tcatcaaatc catcaatctt ttacacctac ggaacagctc cagcccggat 3060ctcggtaccg tatgttggta tttcgaacgc ctattcacac ttttacgacg gtttttccaa 3120agtaccactg aaggaccagt cggcagcact aggtgactcc ctctatggtg cagcatctct 3180aaatgacttc ggtattttgg ctgttagagt agtcaatgat cacaacccga ccaaggtcac 3240ctccaaaatc agagtgtatc taaaacccaa acacatcaga gtctggtgcc cgcgtccacc 3300gagggcagtg gcgtactacg gccctggagt ggattacaag gatggtacgc ttacacccct 3360ctccaccaag gatctgacca catatggatt cggacaccaa aacaaagcgg tgtacactgc 3420aggttacaaa atttgcaact accatttggc cactcaggaa gatttgcaaa acgcagtgaa 3480cgtcatgtgg aatagagacc tcttagtcac agaatcaaga gcccagggca ccgattcaat 3540cgcaaggtgc aattgcaacg caggggtgta ctactgcgag tctagaagga aatactaccc 3600agtatccttc gttggcccaa cgttccagta catggaggct aataactatt acccagctag 3660gtaccagtcc catatgctca ttggccatgg attcgcatct ccaggggatt gtggtggcat 3720actcagatgt caccacgggg tgatagggat cattactgct ggtggagaag ggttggttgc 3780atttacagac attagagact tgtatgccta cgaagaagaa gccatggaac aaggcatcac 3840caattacata gagtcacttg gggccgcatt tggaagtgga tttactcagc agattggaga 3900caaaataaca gagttgacta atatggtgac cagtaccatc actgaaaagc tacttaagaa 3960cttgatcaag atcatatcct cactagttat tataactagg aattatgaag acaccacaac 4020agtgctcgct accctggccc ttcttgggtg tgatgcttca ccatggcagt ggcttagaaa 4080gaaagcatgc gatgttctgg agatacctta tgtcaccaag caaggtgaca gttggttgaa 4140gaagtttact gaagcatgca acgcagctaa gggactggag tgggtgtcaa acaaaatctc 4200aaaattcatt gattggctca aggagaaaat tatcccacaa gctagagata agttggaatt 4260tgtaacaaaa cttagacaac tagaaatgct ggaaaaccaa atctcaacta tacaccaatc 4320atgccctagt caggaacacc aggaaattct attcaataat gtcagatggt tatccatcca 4380gtctaagagg tttgcccctc tttacgcagt ggaagccaaa agaatacaga aactagagca 4440taccattaac aactacatac agttcaagag caaacaccgt attgaaccag tatgtttgct 4500agtacatggc agccccggaa caggtaaatc tgtagcaacc aacctgattg ctagagccat 4560agctgaaaga gaaaacacgt ccacgtactc gctacccccg gatccatcac acttcgacgg 4620atacaaacaa cagggagtgg tgattatgga cgacctgaat caaaacccag atggtgcgga 4680catgaagctg ttctgtcaga tggtatcaac agtggagttt ataccaccca tggcatccct 4740ggaggagaaa ggaatcctgt ttacttcaaa ttacgttcta gcatccacga actcaagcag 4800aatttccccc cccactgtgg cacacagtga tgcattagcc aggcgctttg cgttcgacat 4860ggacattcag gtcatgaatg agtattctag agatgggaaa ttgaacatgg ccatggctac 4920tgaaatgtgt aagaactgtc accaaccagc aaactttaag agatgctgtc ctttagtgtg 4980tggtaaggca actcaattaa tggacaaatc ttccagagtt agatacagta ttgaccagat 5040cactacaatg attatcaatg agaaaaacag aagatccaac attggcaatt gtatggaggc 5100tttgttccaa ggaccactcc agtataaaga cttgaagatt gacatcaaga cgagtccccc 5160tcctgaatgt atcaatgact tgctccaagc agttgactcc caggaggtga gagattactg 5220tgagaagaag ggttggatag tcaacatcac cagccaggtt caaacagaaa ggaacatcaa 5280cagggcaatg acaattctac aagcggtgac aaccttcgcc gcagtggctg gagttgtcta 5340tgtcatgtat aaactgtttg ctggacacca gggagcatac actggtttac caaacaaaaa 5400acccaacgtg cccaccatta ggacagcaaa ggtacaaggg ccagggttcg attacgcagt 5460ggctatggct aaaagaaaca ttgttacagc aactactagc aagggagagt tcactatgtt 5520aggagtccac gacaacgtgg ctattttacc aacccacgct tcacctggtg aaagcattgt 5580gatcgatggc aaagaagcgg agatcttgga tgccaaagcg ctcgaagatc aagcaggaac 5640caatcttgaa atcactacaa tcactctaaa gagaaatgaa aagttcagag acattagacc 5700acatatacct actcaaatca ctgagacaaa tgatggagtc ttgatcgtga acactagcaa 5760gtaccccaat atgtatgttc ctgtcggtgc tgtgactgaa cagggatatc taaatctcgg 5820tgggcgccaa actgctcgta ctctaatgta caactttcca accagagcag gacagtgtgg 5880tggagtcatc acatgtactg ggaaagtcat cgggatgcat gttggtggga acggttcaca 5940cgggtttgca gcggccctga agcgatcata cttcactcag agtcaaggtg aaatccagtg 6000gatgagacct tcgaaggaag tgggatatcc aatcataaat gccccgtcca aaaccaagct 6060tgaacccagt gctttccact atgtgtttga aggggtgaag gaaccagcag tcctcactaa 6120aaacgatccc aggcttaaga caaactttga ggaggcaatt ttctccaagt acgtgggtaa 6180caaaattact gaagtggatg agcacatgaa agaggcagta gaccactatg ctggccagct 6240catgtcacta gacatcaaca cagaacaaat gtgcttggag gatgccatgt atggcactga 6300tggtctagaa gcacttgatt tgtccaccag tgctggctac ccttatgtag caatgggaaa 6360gaagaagaga gatatcttga acaaacaaac cagagacact aaggaaatgc aaaaactgct 6420cgacacatat ggaatcaacc tcccactggt gacttatgta aaggatgaac ttagatccaa 6480aacaaaggtt gagcagggga aatccagatt aattgaagct tctagtttga atgactcagt 6540ggcaatgaga atggctcttg ggaacctata tgctgctttt cacaaaaacc caggagtgat 6600aacaggttca gcagtagggt gcgatccaga tttgttttgg agcaaaattc cggtattgat 6660ggaagagaag ctgtttgcct ttgactacac agggtatgat gcatctctca gccctgcttg 6720gttcgaggca ctagagatgg tgcttgagaa aatcggattc ggagacagag ttgactacat 6780cgactaccta aaccactcac accacctgta caagaataaa acatactgtg tcaagggcgg 6840tatgccatct ggttgctcag gcacttcaat ttttaactca atgattaaca acttgattat 6900caggacactc ttactgaaaa cctacaaggg catagattta gaccacctaa aaatgattgc 6960ctatggtgat gatgtaattg cttcctaccc ccatgaagtt gacgctagtc tcctagccca 7020atcaggaaaa gactatggac taactatgac tccagctgac aaatcagcta tatttgaaac 7080agtcacatgg gagaatgtaa cattcttgaa gagattcttc agggcagacg agaaataccc 7140atttcttatt catccagtaa tgccaatgaa ggaaattcat gaatcaatta gatggacaaa 7200agatcctagg aacactcagg atcacgttcg ctctctgtgc ctattagctt ggcacaatgg 7260cgaagaagaa tataacaaat tcctagctaa aatcaggagt gtgccaattg gaagagcttt 7320attgctccca gagtactcaa cattgtaccg ccgttggctt gactcatttt agtaacccta 7380cctcagtcga attggattgg gtcatactgc tgtaggggta aatttttctt taattcggag 7440g 7441<210>2<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述具有多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的用于DNA擴(kuò)增的合成三測序引物<400>2gacaattgta tcataatgcc gcgggttaac cggccggctt tgttccaagg tgctcaggtt 60tcttca66<210>3<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述SEQ.ID.NO2編碼的肽<400>3Pro Arg Val Asn Arg Pro Ala Leu Phe Gln1 5 10<210>4<211>79<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述具有多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的用于DNA擴(kuò)增的引物<400>4attgtatcataatgggtgct ccgcgggggc cccggccggc tttgttccaa ggaggagcac 60aggtttcatc acagaaagt 79<210>5<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述SEQ.ID.NO.4編碼的肽<400>5Pro Arg Gly Pro Arg Pro Ala Leu Phe Gln Gly Gly Ala1 5 10<210>6<21>76<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述具有多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的用于DNA擴(kuò)增的引物<400>6attgtatcat aatgggtgct ccgcgggggc cccggccggc tttgttccaa ggagcacagg 60tttcatcaca gaaagt 76<210>7<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述具有多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的用于DNA擴(kuò)增的引物<400>7atgggtgctc cgcgggttaa cctcgaggct ttgttccaag ga42<210>8<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述SEQ.ID.NO.7編碼的肽<400>8Pro Arg Val Asn Leu Gly Ala Leu Phe Gln Gly Ala1 5 10<210>9<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述具有多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的用于DNA擴(kuò)增的引物<220><223>人工序列描述具有多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的用于DNA擴(kuò)增的引物<400>9gcgctagcac aggggcccgt taacctcgag aaggcacttg cgcaaggatt aggtcagatg 60ctt 63<210>10<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述SEQ.ID.NO.9編碼的肽<400>10Gly Pro Val Asn Leu Gln Lys Ala Leu Ala Gln1 5 10<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述具有多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的用于DNA擴(kuò)增的SstII有義引物<400>11aggcctccgc ggcctatagt gcaaaacatc30<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述具有多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的用于DNA擴(kuò)增的EagI反義引物<400>12aggcctcggc cgatagaacc ggtctacata30<210>13<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述cDNA合成引物<400>13cgttgccgcc cccaccgt 18<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述覆蓋脊髓灰質(zhì)炎病毒薩賓I型核苷酸680-697的用于DNA擴(kuò)增的有義引物<400>14cattgagtgt gtttactc 18<210>15<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述覆蓋脊髓灰質(zhì)炎病毒薩賓I型核苷酸798-814的用于DNA擴(kuò)增的反義引物<400>15ggtagaacca ccatacgc 18<210>16<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于DNA擴(kuò)增的SstII有義引物<400>16attaatccgc ggattaggcc agtagtatca 30<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于DNA擴(kuò)增的EagI反義引物<400>17attaatcggc cgactgtgcg ttacaatttc 30<210>18<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于DNA擴(kuò)增的有義引物<400>18aggcctccgc ggatgagcac aaatcctaaa 30<210>19<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于DNA擴(kuò)增的反義引物<400>19aggcctcggc cggggtagca ggagcca 27<210>20<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述具有多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的序列<400>20ccgcgggtta accggccggc tttgttccaa 30
權(quán)利要求
1.一種具有復(fù)制能力的重組體薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒載體，該載體在脊髓灰質(zhì)炎病毒薩賓I型株系cDNA N末端第1和第2氨基酸之間接點(diǎn)處含有編碼多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的一段序列。
2.按照權(quán)利要求1的具有復(fù)制能力的重組體薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒載體，其中所說的編碼多克隆位點(diǎn)和3C-蛋白酶切割位點(diǎn)的序列是SEQ.ID.No.19。
3.按照權(quán)利要求1或2的具有復(fù)制能力的重組體薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒，它是載體pTZ-PVS-3m(KCTC-0365BP)。
4.一種包含外源性疫苗基因和具有復(fù)制能力的載體的具有復(fù)制能力的嵌合薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒載體，其中所說載體是權(quán)利要求1的具有復(fù)制能力的重組體薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒載體，所說疫苗基因插入片段被引入到多克隆位點(diǎn)。
5.按照權(quán)利要求4的具有復(fù)制能力的嵌合薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒載體，其中所說的疫苗基因是從傳染性病毒獲得的。
6.按照權(quán)利要求5的具有復(fù)制能力的嵌合薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒載體，其中所說的傳染性病毒是HIV-1。
7.按照權(quán)利要求5的具有復(fù)制能力的嵌合嵌合薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒載體，其中所說的傳染性病毒是指丙型肝炎病毒。
8.按照權(quán)利要求4的具有復(fù)制能力的嵌合薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒載體，其中所說的疫苗基因是HIV-1p24基因。
9.按照權(quán)利要求4的具有復(fù)制能力的嵌合薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒載體，其中所說的疫苗基因是包含HIV-1gp120的V3環(huán)的包膜糖蛋白基因。
10.按照權(quán)利要求4的具有復(fù)制能力的嵌合薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒載體，其中所說的疫苗基因插入片段是HCV核心基因。
11.被權(quán)利要求1的具有復(fù)制能力的重組體薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒載體轉(zhuǎn)染的一種宿主細(xì)胞。
12.權(quán)利要求4的具有復(fù)制能力的嵌合薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒載體轉(zhuǎn)染的一種宿主細(xì)胞。
13.按照權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞，其中所說的疫苗基因來自傳染性病毒。
14.按照權(quán)利要求13的宿主細(xì)胞，其中所說的傳染性病毒是HIV-1。
15.按照權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞，其中所說的傳染性病毒是指丙型肝炎病毒。
16.按照權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞，其中所說的疫苗基因插入片段是HIV-1p24基因。
17.按照權(quán)利要求16的宿主細(xì)胞，其中所說的疫苗基因插入片段是包含HIV-1gp120的V3環(huán)的包膜糖蛋白基因。
18.按照權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞，其中所說的疫苗基因插入片段是HCV核心基因。
19.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1的具有復(fù)制能力的重組體薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒載體的方法，它包括下述步驟用權(quán)利要求1的載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞以產(chǎn)生受感染細(xì)胞；在培養(yǎng)基中培養(yǎng)受感染細(xì)胞產(chǎn)生子代病毒，及從培養(yǎng)物上清液中收獲子代病毒。
20.一種生產(chǎn)權(quán)利要求4的具有復(fù)制能力的嵌合薩賓I型脊髓灰質(zhì)炎病毒載體的方法，它包括下述步驟用權(quán)利要求4的載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞產(chǎn)生受感染細(xì)胞；在培養(yǎng)基中培養(yǎng)受感染細(xì)胞以產(chǎn)生子代病毒，及從培養(yǎng)物上清液中收獲子代病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有編碼多克隆位點(diǎn)和3C－蛋白酶切割位點(diǎn)之序列的具有復(fù)制能力的重組體薩賓Ⅰ型脊髓灰質(zhì)炎病毒載體。該載體使之易于將病毒疫苗基因從傳染性病毒中引入薩賓Ⅰ型脊髓灰質(zhì)炎病毒內(nèi)，并產(chǎn)生嵌合薩賓Ⅰ型脊髓灰質(zhì)炎病毒，期望能成為抵抗一些傳染性病毒疾病的有效口服粘膜疫苗。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1239512SQ98801323
公開日1999年12月22日 申請日期1998年8月7日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月7日
發(fā)明者裴容洙, 鄭彗蘭 申請人:奧爾特威爾生物技術(shù)公司