專利名稱：由大腸桿菌產(chǎn)生的修飾的三角酵母D－氨基酸氧化酶制備頭孢菌素烷基7β－(4－羧丁基 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶法制備7β-(4-羧丁基酰胺)頭孢菌素烷酸(7β-(4-carboxybutanamide)cephalosporanic acid)的一種方法。具體地說，描述了一種利用重組技術(shù)分離一個基因的方法，該基因編碼一個具有D-氨基酸氧化酶活性的酶，所述的基因被克隆到大腸桿菌(E.coli)屬微生物，利用蛋白質(zhì)工程修飾該酶，通過所述的微物生發(fā)酵的方法可以得到高產(chǎn)的所述的修飾酶，提取修飾酶用于制備7β-(4-羧丁基酰胺)頭孢菌素烷酸。該酸是制備7-氨基頭孢菌素烷酸的一個中間體，該中間體是制備頭孢菌素家族中抗細(xì)菌制劑的一個已知中間體。
7β-(4-羧丁基酰胺)頭孢菌素烷酸也稱為戊二酰-7-氨基頭孢菌素烷酸(GL-7ACA)是從頭孢菌素C用D-氨基酸氧化酶(以下簡稱DAO)作用產(chǎn)生的。該酶可從各種微生物中得到，例如，三角酵母(Trigonopsisvariabilis)(Biochem.Biophys.Res.Commun.(1993)31709)，Rhodotorula gracilis(J.Biol.Chem.(1994)26917809)and Fusariumsolani(J.Biochem.1990)1081063。用這些微生物產(chǎn)生的DAO存在許多缺點。其一，所產(chǎn)生的DAO活性水平很低；其二，一些不希望有的酶活性，例如酯酶類和過氧化氫酶類與DAO酶同時存在，前者，酯酶會裂解GL7ACA，降低其產(chǎn)率而增加純化過程的成本。后者，過氧化氫酶會分解催化反應(yīng)中所需的過氧化氫。必需添加該化合物，也增加了利用該方法的成本，同時造成酶活喪失，以至降低它重復(fù)使用的可能性。要想避免所述的對該酶的污染必需要純化DAO活性，不然會大大增加從頭孢菌素C得到GL-7ACA酶法制備的成本和難度。
最近，一個方法已經(jīng)被描述，即從三角酵母(T.variabilis)分離編碼DAO基因，并在大腸桿菌和三角酵母中得以表達(dá)，如日本專利，(JapanesePatent Application Laid-Open No.71180/1988；European PatentApplication No.93202219.7，Publication No.0583817A2)。
此外，由腐皮鐮孢菌(F.solani)編碼DAO活性的基因也已被克隆，并在大腸桿菌和產(chǎn)黃半知菌(Achremonium Chrysogenum)中表達(dá)(日本專利，Japanese Patent Application Laid-Open No.2000181/1990；J.Biochem.(1990)1081063；Bio/Technology(1991)9188)。最近，來自細(xì)長紅酵母(R.gracilis)編碼DAO的基因也已被克隆，并在大腸桿菌中表達(dá)(西班牙專利，Spanish Patent P9600906)。
鑒于利用純的DAO活性生產(chǎn)GL-7ACA已產(chǎn)業(yè)化，本發(fā)明致力于生產(chǎn)一種具有DAO活性的酶，并且能非常容易地被純化。眾所周知純化蛋白質(zhì)最有效的方法是用親和層析(Sassenfeld，H.M.(1990)Trends Biotechnol.888)。為此，需要尋找一個層析的載體，該載體有利于蛋白被選擇性地連結(jié)和/或洗脫。該層析載體必需含有一個為該蛋白質(zhì)可識別的分子或配基，并使蛋白質(zhì)和配體間相互作用是特異的同時其強度足以使該蛋白質(zhì)選擇性的洗脫。開發(fā)一種親和層析的載體是不容易的，至今尚未見采用簡單的一步親和層析法純化DAO酶活性的報導(dǎo)。
此外，眾所周知，某些遺傳工程方法可修飾蛋白質(zhì)，改變其某些特性使其更易被純化。因此，修飾一個蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)使其適合于親和性純化的各種體系已被建立(Sii，D.And Sadana，A.(1991)J.Biotechnol.1983；Narayanan，S.R.and Crane，L.J.(1990)Trends Biotechnol.812；Scouten，W.H.(1991)Curr.Opinion Biotechnol.237；Sassenfeld，H.M.(1990)Trends Biotechnol.888)。這些修飾的要素是將一個多肽融合到蛋白質(zhì)上，該多肽具有與一個特別的層析載體相互作用的特異性。因此它能使融合蛋白質(zhì)通過親和層析被純化，這些修飾之一是在于融合一個聚組氨酸到這蛋白質(zhì)上。該聚組氨酸序列使融合蛋白質(zhì)能在含有二價金屬離子載體的親合層析柱上純化。(Arnols，F(xiàn).H.(1991)Bio/Technology9151；Hochuli et al.(1988)Bio/Technology 61321)。
雖然，利用得到的融合蛋白質(zhì)改進(jìn)純化方法原則上是簡單而有效的技術(shù)，但它的缺點是蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)被改變也可能對其二級結(jié)構(gòu)有很大的影響。這些結(jié)構(gòu)上的改變可能影響到蛋白質(zhì)的功能至完全或部分被喪失的程度，針對蛋白質(zhì)的功能，它已轉(zhuǎn)化為沒有價值的蛋白質(zhì)。因此，得到一種融合蛋白質(zhì)總是要擔(dān)一種不確定性的風(fēng)險，特別是當(dāng)進(jìn)行第一次融合試驗時，即在以前的融合結(jié)果未知時。正是因為最終結(jié)果的這種不確定性是獲得融合蛋白的方法具有新穎性，因為事先不能確切預(yù)見進(jìn)行蛋白質(zhì)融合試驗將發(fā)生些什么情況。
在科技文獻(xiàn)中，尚未見用任何方法描述遺傳修飾三角酵母(T.variabilis)生產(chǎn)DAO酶，并使其能一步被純化，同時在大腸桿菌或在另一個微生物中以活性的形式高產(chǎn)DAO酶的報道。本發(fā)明的詳細(xì)描述描述本發(fā)明的起點是酵母(三角酵母，T.variabilis)ATCC 20931作為脫氧核糖核酸(以下稱為之為DNA)的供體。一旦得到這種酵母的基因組DNA(該基因組DNA含有與生成DAO有關(guān)的遺傳信息的基因，以下稱之為dao基因)，用噬菌體載體λ-GEM12，在大腸桿菌中構(gòu)建一個DNA文庫。根據(jù)不同DAO之間保守的堿基序列，設(shè)計并合成寡核苷酸，并將其作為探針通過標(biāo)準(zhǔn)的雜交技術(shù)分析該DNA文庫。這樣，一系列含有能編碼dao基因的三角酵母DNA片段的大腸桿菌重組克隆被發(fā)離出來。將得到的DNA片段再克隆到一個大腸桿菌質(zhì)粒載體。用這個重組載體來得到含有三角酵母(T.variabilis)dao基因的DNA片段的序列(SEQ ID NO1)。該序列分析表明這dao基因具有2個外顯子和一個內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)特征。
如前所述所得到的含有三角酵母(T.variabilis)dao基因基因組序列的DNA片段有一個內(nèi)含子，這不能直接用于在大腸桿菌中的表達(dá)。因此要得到缺少該內(nèi)含子的dao基因?；谶@目的，用兩個合成的寡粒苷酸通過PCR擴增這dao基因。第一個寡核苷酸，要這樣設(shè)計需包含以下成分一個核糖體聯(lián)結(jié)位點、一個轉(zhuǎn)譯起始位點，第一個外顯子的全序列和第二個外顯子的5’端前面一些核苷酸。第二寡核苷酸相應(yīng)于dao基因第二個外顯子3’端的互補序列并包括一個轉(zhuǎn)譯終止密碼。為克隆DNA片段，不同的限制酶位點也要包括在這些合成的寡核酸中。通過這樣的步驟得到了一個新的DNA片段，分離后被克隆到大腸桿菌質(zhì)粒載體(

圖1)。用限制酶切過的含有缺失內(nèi)含子的完整dao基因DNA片段又被克隆到不同的大腸桿菌質(zhì)粒載體，這些載體具有一些啟動子，這些啟動子能使外源基因在這宿主細(xì)菌中過量表達(dá)。各克隆產(chǎn)生的DAO活性用顯色技術(shù)和HPLC層析來測定。這樣，得到了能產(chǎn)生大量具活性的DAO酶重組大腸桿菌克隆。
將該dao基因通過加一段可編碼聚組氨酸的核苷酸序列進(jìn)行修飾。為此目的，將含dao基因質(zhì)粒用一能切開轉(zhuǎn)譯起始密碼子的限制酶酶解。酶解后將產(chǎn)生的DNA粘性末端用大腸桿菌DNA聚合酶I片段補平。然后與一個編碼聚組氨酸的合成的寡核苷酸連接子(linker)連接起來，以此可產(chǎn)生一個在編碼區(qū)5’端含有被修飾的dao基因(SEQ ID NO2)。產(chǎn)生的重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化到一株大腸桿菌，用聚組氨酸的連接子作為探針，通過雜交技術(shù)來篩選陽生克隆。修飾的dao基因再次被測序以證明按設(shè)計正確地產(chǎn)生融合。
用不同株系大腸桿菌作為先前構(gòu)建的上述質(zhì)粒的宿主來研究聚組氨酸修飾的DAO產(chǎn)生(以下稱hisDAO)。經(jīng)測試該hisDAO酶是有活性的。
將上述選擇出來的重組大腸桿菌克隆培養(yǎng)在含碳源、氮源和無機鹽的培養(yǎng)基上，使其產(chǎn)生hisDAO。培養(yǎng)溫度是在18℃-37℃之間，pH必需維持在5-9之間。小規(guī)模發(fā)酵可用各種體積50ml-1000ml的三角瓶，培養(yǎng)基的量可占三角瓶體積的10％至50％之間，發(fā)酵周期可控制在12-90小時的范圍。
如果選用適于保持重組載體穩(wěn)定性的培養(yǎng)條件，可以改善該重組微生物對DAO的產(chǎn)生，這是通過在培養(yǎng)基中加入抗菌素來實現(xiàn)的，該含有dao基因的重組質(zhì)粒具有對該抗菌素的抗性標(biāo)記(抗氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、四環(huán)素等等)。除了使DAO能穩(wěn)定產(chǎn)生以外，還能防止培養(yǎng)基被其它一些不必要的微生物所污染，同時也排除了因重組載體丟失而停止產(chǎn)生DAO的菌株。
重組的產(chǎn)hisDAO細(xì)胞通過離心方法使其從培養(yǎng)液中分離出來，再用化學(xué)的、酶學(xué)的或機械的方法進(jìn)行細(xì)胞破碎或透析。為了得到高純度的hisDAO酶提取物，用Co2+-IDA柱通過親和層析法一步純化hisDAO。為此，將粗酶液樣品注進(jìn)Co2+-IDA樹脂柱上，用20mM磷酸-緩沖液，pH7.0，含0.2MNaCl的洗脫液洗脫除去雜蛋白。然后用10mM咪唑洗脫，得到hisDAO酶。
如果用Cu2+-IDA或Zn2+-IDA替代Co2+-IDA作為層析載體，his-DAO酶與層析的載體保持很強的結(jié)合，不可能用高濃度咪唑?qū)is-DAO酶洗脫下來。這樣載體通過適當(dāng)?shù)南礈斐ルs蛋白可用于固定化酶系統(tǒng)。
利用從表達(dá)該鑲嵌基因的重組大腸桿菌克隆中純化的hisDAO酶，由頭孢菌素C制備了GL-7ACA。
從Co2+-IDA載體柱層析上得到的，經(jīng)過透析和濃縮的酶提取物也能與另外一些適當(dāng)?shù)乃逍怨滔噍d體反應(yīng)成為固定化酶，使循環(huán)使用固定酶成為可能。
本發(fā)明的新穎性在于首次將三角酵母(T.vaniabilis)的DAO酶修飾成hisDAO使其在一個原核微生物如大腸桿菌中以活性形式表達(dá)并通過親和層析一步就被純化。此外，其產(chǎn)量相對于三角酵母(T.vaniabilis)中得到的量備提高，從而使其適合于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。再不含有不需要的酶，如果氧化氫酶，酯酶，的不同的大腸桿菌菌株中產(chǎn)生hisDAO的可能性，以及用蛋白質(zhì)工程技術(shù)進(jìn)一步修飾，改進(jìn)酶的穩(wěn)定性和催化特性諸多方面的可能性，均增加了本專利的新穎性。
本發(fā)明在下述實施例中將被詳細(xì)闡述，而不對其進(jìn)行任何限定。實施例11.DAO活性的測定DAO活性測定是按照早先描述的方法進(jìn)行的(J.Biol.Chem.(1967)2423957)，用D-苯基甘氨酸(25mM)為底物。在50mM磷酸鹽緩沖液pH8.0保溫15至30分鐘，用1/10體積的純醋酸終止反應(yīng)。根據(jù)在252nm OD值的大小測定酶活，同時考慮在反應(yīng)中所形成的89.77nmol苯酰甲酸在252mM的吸收值為1.0。
2.DNA載體和用于轉(zhuǎn)化的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備用堿法溶菌的方法制備質(zhì)粒載體pBluescript I KS(+)(Apr)(Stratagene)和pkk233.2(Apr)(pharmacia)(Sambrook et al.(1989)Molecular cloningA Laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold spring Harbor，New York，USA)。為此目的，攜帶前面談及的質(zhì)粒的大腸桿菌在振蕩搖床培養(yǎng)16hr，轉(zhuǎn)速為250rpm，培養(yǎng)溫度37℃，500毫升LB培養(yǎng)基含有100μg/ml濃度的氨芐青霉素，通過這種方法得到的質(zhì)粒DNA用氯化銫CsCl梯度離心進(jìn)行純化。
大腸桿菌TG1和DH5α的感受態(tài)細(xì)胞通過Rbcl方法獲得。(Sambrooket al.(1989)Molecular cloningA Laboratory Manual，cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA)。
3.含有D關(guān)于氨基酸氧化酶DAO產(chǎn)生的遺傳信息的DNA供體的制備三角酵母T.variabilis ATCC 20931菌株在YMPG培養(yǎng)基(麥芽浸提物0.3％，酵母抽提物0.3％，蛋白胨0.5％和葡萄糖1％)中培養(yǎng)，連續(xù)振蕩培養(yǎng)36小時(OD660＝5.0)，轉(zhuǎn)速250rpm，培養(yǎng)溫度30℃。
沉淀和洗滌細(xì)胞后，用溶菌酶溶解細(xì)胞，用前述的方法提取DNA(Sherman et al.(1986)Laboratory Course for Methods in yeastGenetics，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，Newyork)。為了達(dá)到更高的純度，將DNA用RNase消化，用苯酚和氯仿-異戊醇24/1(CIA)抽提幾次，并用異丙醇沉淀。將DNA沉淀物用100％乙醇和70％乙醇洗滌，并溶解于含有1mM EDTA的10mM Tris-HCl緩沖液，pH7.5(TE緩沖液)。實施例21.三角酵母DNA文庫的構(gòu)建按照實施例1-3部分所述的方法，得到了三解酵母ATCC20931菌株的總DNA。所述的總DNA取300μg，用20單位的Sau 3AI部分裂解，反應(yīng)體積600μl，37℃保溫，按45秒，1分和2分鐘不同反應(yīng)時間，分別取出200μl等體積的反應(yīng)液，用20mM冷的EDTA液終止裂解反應(yīng)。用0.7％的瓊脂糖凝膠電泳檢測裂解物后，將他們合并到一起并加熱至68℃10分鐘，慢慢冷卻至室溫，放在一個38毫升含10-40％的蔗糖梯度離心管上面，進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為2600rpm，時間24小時，溫度15℃，按0.5毫升一個分部采集樣品，取10微升樣品在0.4％的瓊脂糖凝膠電泳上分析。
合并含有18至22kb之間的DNA的分部，用蒸餾水稀釋至大約10％的蔗糖濃度。DNA用乙醇沉淀和重新懸浮在50μl的TE緩沖液中取后者3μl進(jìn)行0.4％瓊脂糖凝膠電脈分析，電泳檢測表明DNA片段的大小是對的，他們的濃度大約50ng/μl。
前面描述的方法稍做修改同樣可制備細(xì)菌噬菌體λ-GEM12(Promega)DNA(Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA)。
為此目的，大腸桿菌菌株NM 538(promega)在NZCYM-0.2％麥芽糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)10小時，在600nm檢測菌體生長的OD。培養(yǎng)細(xì)胞的濃度相當(dāng)于3×109細(xì)胞時，用臺式離心機離心收集菌體細(xì)胞，轉(zhuǎn)速4000rpm；時間10分鐘；溫度4℃。細(xì)胞用1.2ml的SM緩沖液再懸浮；λ-GEM12噬菌體(3×107噬圖斑形成單位)加入懸浮的細(xì)菌細(xì)胞溶液中，37℃靜止保溫培養(yǎng)30分鐘，每500毫升搖瓶裝100毫升NZCYM-0.2％麥芽糖培養(yǎng)基，瓶子予熱至37℃，接種200μl感染的細(xì)胞。37℃搖瓶培養(yǎng)直到培養(yǎng)出現(xiàn)溶菌(5-6小時)。裂解物在室溫條件下用DNase(1μg/ml)和RNase(2μg/ml)處理45分鐘。接著，每100ml裂解物，加5.8克的NaCl，混合物在冰浴放置60分鐘，隨后過濾除去細(xì)胞殘存物，每100ml溶解物加入20ml 50％PEG-6000，其混合物于冰浴放置60分鐘，然后在4℃條件下，10,000g離心20分鐘。該沉淀物用1ml的TE緩沖液再懸浮，用CIA提取二次除去多余的FEG-6000。然后再用中性酚提取二次，酚-CIA提取一次，CIA提取一次。水相用4M NaCl調(diào)至0.5M NaCl，DNA用二倍體積的乙醇在-20℃沉淀，用小臺式離心機，4℃，12,000rpm離心20分鐘，沉淀用70％的乙醇洗，干燥后重新懸浮在50μl的TE緩沖液中。
50μg細(xì)菌噬菌體DNA用限制酶BamHI和XbaI于37℃酶解2小時。雙酶切后經(jīng)酚-CIA和CIA抽提，再用乙醇沉淀DNA，加TE緩沖液50μl懸浮后，取出2μl后為了促進(jìn)載體粘著端臂的重新環(huán)化剩余液體加MgCl2至10mM；42℃保溫1小時，一份2μl的樣品和前面的樣品一同在0.5％瓊脂膠分析并收集。經(jīng)過確認(rèn)粘著末端確實重新環(huán)化了?；旌弦悍诺?8ml 10-40％蔗糖密度梯度上。在混合液鋪放梯度上之前DNA是沒有受到68℃的熱處理，不然會導(dǎo)致噬菌體的粘著末端的分離。梯度離心轉(zhuǎn)速26000rpm，離心24小時，溫度15℃，隨后以0.5ml一個分部進(jìn)行收集。每個分部取15μl用0.5％瓊脂糖凝膠電泳分析后，合并那些缺少非必需中心片段或“stuffer”的部分，用蒸餾水稀釋至大約10％蔗糖濃度。DNA用乙醇沉淀，沉淀部分再用50μl的TE懸浮，取2μl用0.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測用以確認(rèn)缺少中心片段，估計它的濃度大約是100ng/μl。
以插入DNA片段/載體＝0.25μg/0.25-0.75μg的比率進(jìn)行一系列的連接反應(yīng)。連接反應(yīng)在12-14℃進(jìn)行16小時。在0.4％瓊脂糖凝膠上檢測連接結(jié)果。連接產(chǎn)生的DNA片段要比載體或插入片段大，全部連接反應(yīng)的混合物用乙醇沉淀，并重懸浮在4μl的連接緩沖液中。
用Packagene(Promega)的“體外”包裝抽提物來包裝連接后的重組噬菌體。包裝后的產(chǎn)生重懸浮在500μl SM并使其感染大腸桿菌NM538，為了滴定存在的噬菌體數(shù)目和大腸桿菌NM539(Promega)的數(shù)目(測定重組噬菌體的百分比)。大腸桿菌NM539是噬菌體P2的一個溶菌株。當(dāng)感染該大腸桿菌噬菌體缺少非必需的中心區(qū)時才產(chǎn)生噬菌斑。構(gòu)建的DNA文庫含有200,000噬菌斑，大約85％噬菌體攜帶一個外源的DNA片段。
經(jīng)計算后，大腸桿菌NM539是被感染，完整的基因文庫涂布在150毫米直徑的培養(yǎng)皿上。
2.含dao基因克隆的鑒定完整的DNA文庫被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上按照前面所述的雜交方法(Sambrook et al.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA)篩選陽性噬菌體。硝酸纖維素膜在雜交緩沖液中保溫于42℃預(yù)雜交3小時，除去預(yù)雜交時用的緩沖液后，加入新的雜交緩沖液和10pmol的32P標(biāo)記寡核苷酸OA(5’-TCTTGTCCTCGACACC-3’)和OB(5’-GACGTGGATTGTCAACTG-3’)進(jìn)行雜交。按(Sambrook et al.(1989)Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA)標(biāo)準(zhǔn)方法，用噬菌體T4聚核酸激酶和[γ-32P]ATP(ICN Biochemicals)標(biāo)記上述寡核苷酸的5’端。膜在42℃保溫16小時后于室溫在2×SSC-0.1％SDS中洗2次，在同樣長的時間，同樣溫室下再用1×SSC-0.1％SDS緩沖液洗2次。最后，硝酸纖維素膜加增感屏后用Hyperfilm-MP(Amershan)壓片，在-70℃放48小時。
一旦預(yù)雜交、雜交、洗滌和放射身顯影完成后，經(jīng)兩個探針OA和OB篩選出63個陽性克隆。其中的9個陽性噬菌斑從培養(yǎng)皿中分別被收集，每一個均被懸浮在1ml SM(加50μl氯仿)中。滴定該溶液中的噬菌體。為此，該噬菌體必需被稀釋5000倍，以保證用20μl進(jìn)行感染時，每個培養(yǎng)皿中的噬菌斑數(shù)目在500-1000之間。一旦每個培養(yǎng)皿上物質(zhì)被轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的硝酸纖維素膜上，硝酸纖維素膜再用OA、OB探針進(jìn)行雜交。放射自顯影表明每個培養(yǎng)皿中有20％-50％噬菌體產(chǎn)生陽性信號。因此，需要用第三次雜交來純化每一個陽性噬菌體。為此用一吸管去收集那些陽性的噬菌斑使它們與其它的物質(zhì)進(jìn)一步分開，或者被也是陽性的噬菌斑包圍，然后被懸浮在1ml SM(加50μl氯仿)。稀釋100倍后，取15μl進(jìn)行感染，得到了大約每培養(yǎng)皿大約有300噬菌斑的滴度。在經(jīng)過與前面2個循環(huán)相同的條件下進(jìn)行處理后，可達(dá)到每個培養(yǎng)中100％噬菌體為陽性。這樣，純化了9個獨立的噬菌斑。將每個噬菌斑重懸浮在100μl SM(加10μl氯仿)，取出2μl匯合溶菌斑溶液涂布在固相培養(yǎng)基上，用于擴增陽性噬菌體。收集上層瓊脂并懸浮在5ml SM，溶液中噬菌體濃度約為107噬菌斑形成單位/μl。
按(Sambrook et al.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA)，采用Southern方法，以上述OA、OB為探針，測定基因組DNA片段是否包含三角酵母(T.variabilis)dao基因。為此目的，用限制酶(pharmacia)BamH、EcoRI、HindIII、KnpI、PstI、PvuII、XbaI和XhoI酶解的DNA在瓊脂糖凝膠上分離并在下述條件下進(jìn)行雜交。將DNA片段按分子大小被分離開的瓊脂糖膠，于室溫在0.25M HCl中輕輕振蕩15分鐘，在變性溶液中振蕩1小時，在中和溶液中振蕩1小時。然后把凝膠放在一小塊浸過10×SSCWhatman 3MM濾紙上，一張與凝膠大小相同的在2×SSC中浸過的BA85硝酸纖維素膜(0.45μM)(Schleicher and Schuell)放在凝膠的上面(小心，不要有氣泡)。兩張在2×SSC浸過的Whatman 3MM濾紙再放在硝酸纖維素膜上，最后在上面復(fù)蓋8-10厘米高的同樣大小的一疊干濾紙，并壓上約500g重的東西，經(jīng)16小時可完成印跡轉(zhuǎn)移。一旦DNA轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜，將膜小心地放在6×SSC中浸5分鐘，然后在室溫中放1小時使其變干，再放在兩張Whatman 3MM濾紙之間在80℃(抽真空)保溫3小時，使DNA固定在濾紙上。如DNA文庫篩選部分所描述的相同條件下進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。放射自顯影結(jié)果表明每鐘酶解均顯現(xiàn)特異的雜交帶。詳述這些帶的大小如下EcoRI酶解顯現(xiàn)10.2kb的帶，BamHI酶解顯現(xiàn)3.7kb的帶，HindIII酶解顯現(xiàn)3.5kb的帶，KpnI酶解顯現(xiàn)11.6kb的帶，PstI酶解顯現(xiàn)11.3kb的帶PvuII酶解顯現(xiàn)4.8kb帶，XbaI酶解顯現(xiàn)4.8kb的帶，XhoI酶解顯現(xiàn)4.7kb的帶。
2.克隆編碼dao基因DNA片段噬菌體DNA純化后(實施例2-1)用SalI酶解，用噬菌體T4(Amersham)DNA連接酶在ATP存在條件下和所推薦的緩沖液下與經(jīng)SalI酶解的pBluescriptI KS(+)(Stratagene)在12℃保溫5小時，并用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1細(xì)胞(Amersham)。在含氨芐青霉素(100μg/ml)、X-gal(40μg/ml)和0.2mM IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，挑選出轉(zhuǎn)化子。在一些白色的選擇性表型克隆中質(zhì)粒pALT1被分離出來。用Southern技術(shù)和探針OB，dao基因被定位于pALT1質(zhì)粒3.7kb BamHI片段。這BamHI片段亞克隆到經(jīng)BamHI酶解的質(zhì)粒pBluescript I KS(+)(Stratagene)。質(zhì)粒pALT2和pALT3含有3.7kb BamHI片段(圖1)。
4.含Dao基因的片段的測序按前面描述的方法(Sanger et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.74，5663-5464)用T7 DNA聚合酶試劑盒(Pharmacia)和[35S]dATP測定了包含在質(zhì)粒pALT2中片段的核苷酸序列。這序列請見SEQ ID NO1。與在基因庫(Gene Bank/EMBL)中其它已知序列進(jìn)行比較后指示克隆的片段可編碼三角酵母(T.variabilis)dao基因。實施例31.用PCR消除dao基因內(nèi)含子從質(zhì)粒pALT2得到0.15μg DNA與10μl(25μM)下列各寡核苷酸混合。
寡核苷酸DAO1(5’-CATGCCATGGCTAAAATCGTTGTTATTGGGGCCGGTGTTGCCGGTTTAAC-3’)，它編碼第一個外顯子的全序列和第二個外顯子的5’端前幾個核苷酸，同時還包含一個NcoI限制酶位點。DAO2(5’-CCCAAGCTTCTAAAGGTTTGGACGAG-3’)，它含有一個HindIII限制酶位點和帶有一個轉(zhuǎn)譯終止密碼子的相應(yīng)于dao基因第二個外顯子的3’端序列。在這混合物中加入2.5單位Tag聚合酶(Perkin-Elmer)與相應(yīng)的緩沖液在PCR儀(Gene-ATAQ，Pharmacia)上進(jìn)行30個循環(huán)的擴增。每個循環(huán)是95℃(1分鐘)，50℃(2分鐘)和72℃(2.5分鐘)。少量反應(yīng)混合物在1％瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)EB染色觀察擴增結(jié)果。
由PCR得到的DNA片段其大小約0.9kb，按說明書推薦方法用β-agarose(BioLabs)從瓊脂糖凝膠中提取純化該DNA片段。2μg純化的片段與1μg經(jīng)HincII(Pharmacia)酶切的載體M13tg130(Amersham)用噬菌體T4(Amersham)DNA連接酶在存在ATP和所推薦的緩沖液條件下進(jìn)行連接。獲得了噬菌體M13DAO(圖1)測序后證明內(nèi)含子已被排除。
在噬菌體M13DAO中所含該片段的核苷酸序列按Sanger et al.(1977)Proc.Natl.Aca.Sci.USA 745463-5464所描述的方法用T7 DNA聚合酶試劑盒(Pharmacia)和[35S]dATP進(jìn)行序列測定。這核苷酸序列揭示所克隆的0.9kb片段為沒有內(nèi)含子的三角酵母(T.variabilis)dao基因序列。
2.pKK233.2中無任何內(nèi)含子dao基因的亞克隆來自質(zhì)粒pkk232.2的0.1μg DNA樣品用限制酶NcoI和HindIII(pharmacia)于37℃在所推薦的緩沖液中酶解1小時，然后在65℃加熱10分鐘終止該反應(yīng)。酶切過的質(zhì)粒與用上述相同限制酶酶解的0.2μg噬菌體M13DAO混合，在存在ATP和所推薦的緩沖液條件下通過噬菌體T4 DNA連接酶(AmerSham)將2個DNA連接起來。
上述連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1細(xì)胞。在含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。通過這方法獲得了含重組質(zhì)粒pKDA003(圖1)的克隆。該重組質(zhì)粒含有通過PCR擴增得到的0.9-kb DNA片段，并已插入到質(zhì)粒pkk233.2(即在trc啟動子操縱下可表達(dá)的質(zhì)粒)的NcoI和HindIII酶切位點之間。
實施例41.設(shè)計一個含有6個組氨酸尾巴的嵌合DNA酶為了在三角酵母(T.variabilis)DAO酶的氨基末端插入聚組氨酸尾巴，用限制酶NcoI(Pharmacia)于37℃在推薦的緩沖液中酶解，0.1μg質(zhì)粒pKDAO3 1個小時，然后65℃加熱終止其反應(yīng)。酶解后的質(zhì)粒用大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段(Pharmacia)按說明書推薦的方法進(jìn)行處理。樣品在65℃加熱10分鐘終止反應(yīng)。得到的線性質(zhì)粒在存在ATP和所推薦的緩沖液條件下通過噬菌體T4 DNA連接酶(Amersham)連接到一個含有編碼6個組氨酸殘基的核苷酸序列的DNA片段。編碼6個組氨酸殘基的DNA片段是通過兩個被稱為HIS1(5’-CATCATCACCACCATCACTT-3’)和HIS2(5’-AAGTGATGGTGGTGATGATG-3’)的2個互補寡苷酸的1.5μg混合物，經(jīng)100℃加熱5分鐘，冷卻到室溫，由雜交形成一個雙鏈DNA片段而得到的。
得到的連接混合物用于轉(zhuǎn)化感受大腸桿菌TG1細(xì)胞，在含100μg/ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)基上挑選出轉(zhuǎn)化子。通過這種方法，得了一個含有重組質(zhì)粒pKDAOHIS的克隆，該質(zhì)粒的dao基因連接在一個5’端編碼6個組氨酸殘基的一段18個核苷酸序列上。)為了證明質(zhì)粒pKDAOHIS(圖1)含有預(yù)期的相嵌結(jié)構(gòu)，其序列按(Sangeret al.(1977).Proc.Natl.Aca.Sci.USA 745463-5464)方法，用T7 DNA聚合酶試劑盒(Pharmacia)和[35S]dATP在同一重組質(zhì)粒上進(jìn)行測定。這序列如Seq ID NO1所示。
經(jīng)質(zhì)粒pKDAOHIS轉(zhuǎn)化的大腸桿菌TG1在LB培養(yǎng)液在25℃和250rpm條件下發(fā)酵20小時。細(xì)胞通過離心收集(5000Xg；10分鐘)并用超聲波破碎細(xì)胞，其DAO活性如同實施例1-1部分描述的方法測定，其DAO活性是每毫克蛋白質(zhì)350單位。表明用這樣的方法得到的具有組氨酸鏈(hisDAO)的嵌合DAO酶是有活性的。SDS-PAGE實驗也表明hisDAO酶分子量略大于天然DAO酶。被質(zhì)粒pKDAOHIS轉(zhuǎn)化的大腸桿菌TG1菌株已于1997年10月6日保存在西班牙菌種保藏中心(CECP)，保藏號CECT4888。保藏中心位于Valencia大學(xué)生物學(xué)院微生物系，46100 Burjasot(Valencia)。
實施例51.瓊脂糖-金屬螯合載體的制備5.7ml 3-氯-1，2-環(huán)氧丙烷與11.4ml乙二醇二甲醚的混合物是被緩慢地加入到含7g瓊脂糖CL6B的57ml 0.1N NOH(含340mg NaBH4)懸浮液中于25℃輕輕地連接攪拌4小時。所得到的瓊脂糖-環(huán)氧化物用足量的蒸餾水洗后，再補加2.5ml 2M亞胺雙醋酸鈉和19ml 0.1M碳酸鹽緩沖液pH11，于25℃輕輕地連續(xù)攪拌該懸浮液12小時。最后，載體用蒸餾水洗，并重懸浮在5mg/ml所選的金屬鹽溶液中，形成的瓊脂糖-金屬螯合載體用足量蒸餾水洗以備下步使用。當(dāng)CoCl2作為金屬鹽被加入時，得到的是一種瓊脂糖-鈷螯合載體。
2.嵌合hisDAO酶在瓊脂糖-鈷螯合載體上的純化含瓊脂糖-鈷螯合載體的柱用含0.2M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)平衡，可溶性細(xì)胞提取液注入到該柱，該可溶性細(xì)胞提取液是從上述實施例所描述的轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒pKDAOHIS的大腸桿菌TG1細(xì)胞中得到的。當(dāng)提取液完全進(jìn)入柱以后，用足夠量的相同的平衡緩沖液洗柱，除hisDAO留在柱上外，其它所有蛋白質(zhì)都被洗脫下來。然后用含10mM咪唑的20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)將hisDAO洗脫下來。收集含有該酶的分部，經(jīng)20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)透析后，酶(9000單位/毫克)的純度達(dá)90％，可用于將頭孢菌素C轉(zhuǎn)化成GL-7ACA。
圖表的詳細(xì)描述圖1.質(zhì)粒pKDAOHIS的構(gòu)建方法缺少內(nèi)含子，在編碼蛋白質(zhì)的第一個甲硫氨酸ATG有一NcoI位點的dao基因通過PCR從質(zhì)粒pALT2得到，PCR擴增的片段然后被亞克隆在M13DAO的M13tg130載體的HincII位點。從M13DAO得到的NcoI-HindIII片段被亞克隆到pKDAO3的質(zhì)粒pKK233.2的NcoI-HindIII位點。這質(zhì)粒有dao基因，在大腸桿菌trc啟動子操縱下該基因得以表達(dá)。最后，將編碼聚組氨酸尾巴DNA片段引入dao基因的5’端，產(chǎn)生質(zhì)粒pKDAOHIS。
序列表<110>抗生素有限公司<120>由大腸桿菌產(chǎn)生的修飾的三角酵母D-氨基酸氧化酶制備頭孢菌素烷基7β-(4-羧丁基酰胺)酸的方法<130>PCT-47<150>ES 9702008<151>25.09.97<160>2<210>SEQ ID NO1<211>3668堿基對<212>ADN<213>三角酵母(Trigonopsis variabilis)<220><221>CDS<222>(1481...1503，1543...2506)<223>dao基因<220><221>內(nèi)含子<222>1504...1442<220><221>CDS<222>2952...3668<223>ORF1<400>GGATCCTTAC GAGGAAGATC TGATAATGGA GAATTCTCTC GCTTTATGCC ATGACTTGCA60GGTTCCTCGG GTAATGGAAC CACTGACAAA TCGGCTGCTT GAGGTTTTGT TCCCTTCAAC 120ACTTCATCTT CCAAGGTTCT AATTCGTAGT TTCTTCTCAT TCAATAAAGC TGCAAACCGC 180TCCAACATTT GTAGATCATT ATTCTTTGTC TTCACGGCAA CTGTATCTAG TTCCTTCTGA 240AGGTCCTTCG TTTCTTTGGT TAGTAGATCT ACCATGCCAG TTAAGCGATC AATCTCCTCT 300TGGACCTCCT TCTTGAGCGA TAGCTCTGAC CAGAACCAAT CAAAAAGAAC ACCAGGATCG 360GTACATGTTC CTTGTCGGGA TAGGGACAGT GATCCCAAAG TAATTGATAG ATCCTGAACT 420TTCTGGGTAA TCGAGATAAT AACCGAACTC AAATCTTGTG ATGGCTTGGC GTTCAATTGA 480ATGTTTTCGC TAGAAAGCCT CGGACTCTTA CGTTGGTCTT CATCTGTAAG CGACCGCGTG 540AACAGTTGTT GGAATAAGTC ATTCCATTCA CTTTCACTTT GAGGACTTCT ATTTGACCGT 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TCC TCT TAC GGC ATG GCT GAT GAA GCT GTT TCT TAC 2556Ala Gly Tyr Gln Ser Ser Tyr Gly Met Ala Asp Glu Ala Val Ser Tyr335 340 345GTC GAA AGA GCT CTT ACT CGT CCA AAC CTT TAGAAATCAT GTATACAATT 2606Val Glu Arg Ala Leu Thr Arg Pro Asn Leu350 355ATTCTCTCTC TATAAATCTA ATTTTTTTGT GTGGTCTAAT ATTCGTAAAC ACGTCGCAGT 2666CGTCTATGTC GCCCTCGTCA CCGTGTCCAA AGTCGTAAAG TGACTGATTG CAATTGCGAC 2726AACACGTGAC TCGACCTGCC TCCTTACCTC CCATCAACAA CAAAAGAAGC TGGCTAAGAT 2786AGAGGTCTGT TGACGAGCAC TCGTAAGAAC GGCAAACATA GAAAGGAGGC TCTATAATTA 2846CCTGGAAACT GTGTTATATA CTATCACTAG TGAGGGTGAG TGATTAGAAG CAAGGGGACT 2906AGAATACTGA CATGGATAGA GATCCAGGAG CCTTATAAAT AATCA ATG AAT ACA ATT 2963Met Asn Thr IleGAT TTG GAA TCT TGG GAT GAT GAT CCA GAT TTC GCA GAT GAC TTT GAG 3011Asp Leu Glu Ser Trp Asp Asp Asp Pro Asp Phe Ala Asp Asp Phe Glu360 365 370 375AAT TTA AAG ACT CCA GCT CCT ACG TTT TAT GAA GCC AAC GAT GAG ATT 3059Asn Leu Lys Thr Pro Ala Pro Thr Phe Tyr Glu Ala Asn Asp Glu Ile380 385 390AGG GAT GGA GAA GAA GAG GAT GAT TTT TTC 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ATT ATC GAG GAC AGG TCC AGG ATT GTC CAC435Thr Val Asp Ser Phe Glu Ile Ile Glu Asp Arg Ser Arg Ile Val His125 130 135 140GAT GAT GTG GCT TAT CTA GTC GAA TTT GCT TCC GTT TGT ATC CAC ACC483Asp Asp Val Ala Tyr Leu Val Glu Phe Ala Ser Val Cys Ile His Thr145 150 155GGA GTC TAC TTG AAC TGG CTG ATG TCC CAA TGC TTA TCG CTC GGC GCC531Gly Val Tyr Leu Asn Trp Leu Met Ser Gln Cys Leu Ser Leu Gly Ala160 165 170ACG GTG GTT AAA CGT CGA GTG AAC CAT ATC AAG GAT GCC AAT TTA CTA579Thr Val Val Lys Arg Arg Val Asn His Ile Lys Asp Ala Asn Leu Leu175 180 185CAC TCC TCA GGA TCA CGC CCC GAC GTG ATT GTC AAC TGT AGT GGT CTC627His Ser Ser Gly Ser Arg Pro Asp Val Ile Val Asn Cys Ser Gly Leu190 195 200TTT GCC CGG TTC TTG GGA GGC GTC GAG GAC AAG AAG ATG TAC CCT ATT675Phe Ala Arg Phe Leu Gly Gly Val Glu Asp Lys Lys Met Tyr Pro Ile205 210 215 220CGA GGA CAA GTC GTC CTT GTT CGA AAC TCT CTT CCT TTT ATG GCC TCC723Arg Gly Gln Val Val Leu Val Arg Asn Ser Leu Pro Phe Met Ala Ser225 230 235TTT TCC AGC ACT CCT GAA AAA GAA AAT 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CGT CCA AAC CTT 1107Asp Glu Ala Val Ser Tyr Val Glu Arg Ala Leu Thr Arg Pro Asn Leu350 355 360 364TAGAAGCTTG GCTGTTTTGG C 1128
權(quán)利要求
1.一種在非人寄主的生物體中生產(chǎn)修飾的三角酵母(TrigonopsisVariabilis)D-氨基酸氧化酶的方法，其特征包含如下步驟(a)分離產(chǎn)生所述的D-氨基酸氧化酶的任何一種微生物的編碼所述酶的基因的DNA；(b)通過用合成的寡核苷酸和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法，去除所述的基因所含的內(nèi)含子；(c)將(b)所得到的寡核苷酸DNA片段插入能夠在宿主中復(fù)制的質(zhì)粒中；(d)將一種合成的含有編碼六個組氨酸的核苷酸序列融合于編碼D-氨基酸氧化酶活性的結(jié)構(gòu)基因區(qū)的5’端，該基因不含任何內(nèi)含子；(e)用由(d)產(chǎn)生的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主；(f)用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，在得以D-氨基酸氧化酶產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)由(e)得到的轉(zhuǎn)化了的宿主細(xì)胞；(g)由(f)的培養(yǎng)物中通過親和層析回收D-氨基酸氧化酶。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于編碼D-氨基酸氧化酶的基因是三角酵母(Trigonopsis Variabilis)的編碼D-氨基酸氧化酶的基因。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，該非人宿主是大腸桿菌。
4.按照前述任何一項權(quán)利要求所述的一種方法，其用于回收修飾酶的親和層析法使用了基于二價陽離子的載體。
5.由前述任何一項權(quán)利要求所述的方法生產(chǎn)和純化的經(jīng)修飾的D-氨基酸氧化酶。
6.使用權(quán)利要求5所述的D-氨基酸氧化酶酶促合成7β-(4-羧丁基酰胺)頭孢菌素烷酸的方法。
7.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，將頭孢菌素C與D-氨基酸氧化酶在一種水溶性介質(zhì)中反應(yīng)。
8.按照權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，酶促反應(yīng)是在D-氨基酸氧化酶被固相化的條件下進(jìn)行的。
全文摘要
酶法制備頭孢菌素烷基7β－(4－羧丁基酰胺)酸,是通過在大腸桿菌中產(chǎn)生的修飾過了的三角酵母(TrigonopsisVariabilis)D－氨基酸氧化酶進(jìn)行的,該方法包含:(1)分離相應(yīng)于編碼D－氨基酸氧化酶基因的DNA;(2)去除所述的基因中的內(nèi)含子;(3)將得到的DNA片段插入在大腸桿菌中能夠復(fù)制的質(zhì)粒;(4)合成含有編碼6個組氨酸的一段核苷酸序列,融合到基因結(jié)構(gòu)區(qū)的5’端;(5)用所得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌;(6)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了的大腸桿菌細(xì)胞;和(7)通過親和層析回收前面培養(yǎng)細(xì)胞的D－氨基酸氧化酶。
文檔編號C12N15/09GK1246147SQ9880133
公開日2000年3月1日 申請日期1998年9月24日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月25日
發(fā)明者何塞·路易斯·加西亞·洛佩斯, 埃斯特雷利亞·科爾提斯·魯比奧, 豪爾赫·阿隆索·帕拉西奧斯, 恩卡納西翁·梅拉多·杜蘭, 布魯諾·迪斯·加西亞, 何塞·曼努埃爾·吉桑·塞哈斯, 弗朗西斯科·薩爾托·馬爾多納多, 何塞·路易斯·巴雷多·富恩特 申請人:抗生素有限公司