專利名稱：N-末端氨基酸經(jīng)修飾的促胰島素釋放肽衍生物的制作方法
專利說明N-末端氨基酸經(jīng)修飾的促胰島素釋放肽衍生物 [技術(shù)領(lǐng)域] 本發(fā)明涉及一種具有改良的促胰島素釋放活性的促胰島素釋放肽衍生物。特別是，本發(fā)明涉及一種具有高穩(wěn)定性和促胰島素釋放活性的N-末端氨基酸經(jīng)修飾的促胰島素釋放肽。
[背景技術(shù)] 由于肽穩(wěn)定性低，會(huì)被體內(nèi)蛋白水解酶降解，所以其很容易變性，因而喪失活性，并且其具有相對(duì)小的大小，從而易于經(jīng)過腎。因此，為了保持含有作為藥物有效成分的肽的藥物的血液水平和滴度，必須經(jīng)常給病人施用肽藥物以便維持所需要的血液水平和滴度。然而，肽藥物通常是以可注射制劑的形式施用，而且為了保持生理活性肽的血液水平所采取的頻繁施用會(huì)給病人帶來嚴(yán)重的疼痛。為了解決這些問題，已經(jīng)進(jìn)行了許多研究。其中一項(xiàng)研究提出的方法是增加通過生物膜的肽藥物的傳輸，于是肽藥物通過口咽或鼻咽吸入轉(zhuǎn)移進(jìn)入機(jī)體。然而，這一方法與可注射制劑相比較，其體內(nèi)轉(zhuǎn)移效率非常低，所以仍難于保持肽藥物的體內(nèi)活性。
另一方面，許多研究針對(duì)改良肽藥物的血液穩(wěn)定性以及長時(shí)間保持藥物在血液中的高濃度，從而最大化藥物的藥效。這種長效的肽藥物制劑因此需要增加肽藥物的穩(wěn)定性并且要保持足夠高水平的滴度而不會(huì)在病人中產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
作為穩(wěn)定肽以及抑制蛋白水解酶降解的方法，已進(jìn)行了一些實(shí)驗(yàn)來修飾對(duì)蛋白水解酶敏感的特異氨基酸序列。例如GLP-1(7-37或7-36酰胺)，其功能是降低血液中葡萄糖濃度以治療2型糖尿病，其生理活性半衰期短，大約有4分鐘或更少(Kreymann等，1987)，這是由于二肽基肽酶IV(DPPIV)在第8位氨基酸(Ala)和第9位氨基酸(Asp)之間的裂解而使GLP-1滴度喪失。因此，許多研究在對(duì)DPP IV具有抗性的GLP-1類似物方面進(jìn)行，有些實(shí)驗(yàn)用Gly取代Ala8(Deacon等，1998；Burcelin等，1999)，或用Leu或D-Ala取代Ala8(Xiao等，2001)，從而增加對(duì)DPP IV的抗性，同時(shí)保持其活性。GLP-1的N-末端氨基酸His7對(duì)于GLP-1的活性是關(guān)鍵的，而且還是DPP IV的靶。因此，美國專利No.5,545,618公開了用烷基或?；揎桸-末端，Gallwitz等公開了將His7進(jìn)行N-甲基化、或者α-甲基化、或用咪唑?qū)⒄麄€(gè)His取代以增加對(duì)DPP IV的抗性并保持生理活性。盡管增加對(duì)二肽基肽酶的抗性從而改善了穩(wěn)定性，但發(fā)現(xiàn)His7-修飾的衍生物在用相同濃度的較低的cAMP刺激時(shí)具有明顯降低的受體親合性(Gallwitz.等，Regulatory Peptide 7993-102(1999)，Regulatory Peptide 86103-111(2000))。
除GLP-1之外，毒蜥外泌肽(exendin)是在Arizona和Northern Mexico常見的蜥蜴glia monster毒液中發(fā)現(xiàn)的肽。毒蜥外泌肽-3存在于珠毒蜥(Heloderma horridum)的毒液中，毒蜥外泌肽-4存在于毒蜥(Helodermasuspectum)的毒液中。毒蜥外泌肽與GLP-1有53％的高同源性(Goke等，J.Bio.Chem.，26819650-55(1993))。據(jù)報(bào)道毒蜥外泌肽-4可以作用在特異性胰島素分泌細(xì)胞上的GLP-1受體，以及作用在豚鼠胰腺的分散的腺泡細(xì)胞，胃的胃壁細(xì)胞，并且所述肽也可以在分離的胃中刺激促生長素抑制素的釋放以及抑制促胃液素釋放。此外，毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4被報(bào)道發(fā)現(xiàn)在胰腺腺泡細(xì)胞中刺激cAMP生成以及刺激胰腺腺泡細(xì)胞的淀粉酶釋放。因?yàn)槎掘嵬饷陔?4(美國專利No.5,424,686)具有His-Gly序列而不是作為GLP-1中二肽基肽酶底物的His-Ala，因此其對(duì)DPP IV具有抗性而且比GLP-1具有更高的生理活性。因此，它的體內(nèi)半衰期比GLP-1長，有2到4個(gè)小時(shí)。雖然天然毒蜥外泌肽比GLP-1具有增加的體內(nèi)半衰期，但是它的生理活性仍然不足以持久。例如在商購可得毒蜥外泌肽-4(exenatide)的情況中，需要每天給病人注射兩次，這對(duì)病人來說仍然是困難的。
為了改善天然毒蜥外泌肽的治療效力，進(jìn)行了制備其類似物、衍生物和變體方面的嘗試。術(shù)語“類似物或變體”典型性地指通過在天然肽中或自天然肽中取代、缺失或插入一或多個(gè)氨基酸而制備的肽。術(shù)語“衍生物”指通過對(duì)天然肽的一或多個(gè)氨基酸進(jìn)行烷基化、?；?、酯化或酰胺化制備的化學(xué)修飾的肽。
PCT申請(qǐng)PCT/US98/16387描述了新型毒蜥外泌肽激動(dòng)劑化合物。通過要求其優(yōu)先權(quán)，美國專利No.6956026公開了一種利用毒蜥外泌肽減少食物攝入的方法。此外，通過要求所述PCT申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，EP0996459公開了使用毒蜥外泌肽及其類似物以減少食物攝入，美國專利No.7157555公開了毒蜥外泌肽激動(dòng)劑化合物。然而它們僅公開了毒蜥外泌肽類似物的一些序列。此外，也沒有提到所述類似物的活性和性質(zhì)，而且其也未得到詳細(xì)說明書的支持。
[發(fā)明內(nèi)容] [技術(shù)問題] 因此，本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)His1-修飾的毒蜥外泌肽衍生物比天然毒蜥外泌肽顯示更高的血液穩(wěn)定性以及促胰島素釋放活性，從而完成本發(fā)明。
[技術(shù)方案] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有改良的血液穩(wěn)定性和促胰島素釋放活性的促胰島素釋放肽衍生物。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供用于治療糖尿病的藥物組合物，其包含具有改良的促胰島素釋放活性的促胰島素釋放肽衍生物。
[


] 圖1顯示毒蜥外泌肽-4衍生物在血清中的穩(wěn)定性。A毒蜥外泌肽-4，DDA-毒蜥外泌肽-4，HHY-毒蜥外泌肽-4，CCA-毒蜥外泌肽-4。
圖2顯示毒蜥外泌肽-4、毒蜥外泌肽-4衍生物和CA-毒蜥外泌肽-4的促胰島素釋放活性。
圖3顯示在糖尿病動(dòng)物模型中毒蜥外泌肽-4和CA-毒蜥外泌肽-4的降血糖作用。
[最優(yōu)方案] 一方面，本發(fā)明涉及具有改良的血液穩(wěn)定性和促胰島素釋放活性的促胰島素釋放肽衍生物。
本發(fā)明的衍生物是具有化學(xué)修飾的N-末端組氨酸殘基的衍生物或者N-末端組氨酸殘基上具有化學(xué)修飾的氨基的衍生物。
優(yōu)選地，本發(fā)明的促胰島素釋放肽是毒蜥外泌肽-4、毒蜥外泌肽-3或其衍生物。本文使用的術(shù)語“毒蜥外泌肽-4或毒蜥外泌肽-3衍生物”指的是對(duì)毒蜥外泌肽-4或毒蜥外泌肽-3取代、缺失和/或增加一或多個(gè)氨基酸所制備的肽，或具有一或多個(gè)化學(xué)修飾的氨基酸殘基例如烷基化、?；Ⅴセ蝓０坊碾?，其活性與天然毒蜥外泌肽-4類似。
作為毒蜥外泌肽-3或毒蜥外泌肽-4衍生物的例子，可以通過缺失毒蜥外泌肽-4的C-末端或者用非天然氨基酸正亮氨酸取代毒蜥外泌肽-4的氨基酸所制備的毒蜥外泌肽-4衍生物在WO97/46584中公開。WO99/07404也公開了毒蜥外泌肽衍生物，其氨基酸用非天然氨基酸例如戊基甘氨酸、高脯氨酸或叔丁基甘氨酸取代，并且US2008/0119390公開了通過缺失毒蜥外泌肽-4的一些氨基酸制備的和通過用其它氨基酸殘基取代毒蜥外泌肽-4的一些氨基酸殘基制備的毒蜥外泌肽衍生物，其與天然毒蜥外泌肽-4相比由更短的氨基序列組成。這些出版物援引加入。
特別地，本發(fā)明也包括N-末端組氨酸的氨基脫去的衍生物(脫氨基-組氨酰衍生物)，其通過氨基被羥基取代制備的衍生物(β-羥基咪唑并丙酰衍生物)，其用二甲基殘基修飾氨基制備的衍生物(二甲基-組氨酰衍生物)，其用羧基取代氨基制備的衍生物(β-羧基咪唑并丙酰衍生物)，或是其脫去帶正電荷的氨基的衍生物，其中脫去其N-末端組氨酸殘基的α碳以只保留咪唑并乙?；?咪唑并乙酰衍生物)，以及其它N-末端氨基修飾的衍生物。
優(yōu)選地，本發(fā)明提供了毒蜥外泌肽-4衍生物，其具有化學(xué)修飾的N-末端氨基或氨基酸殘基，更優(yōu)選地其中N-末端組氨酸殘基的α氨基或α碳(毒蜥外泌肽-4的第一個(gè)氨基酸)被取代或去除的毒蜥外泌肽-4衍生物，更優(yōu)選地除去N-末端氨基的脫氨基-組氨酰-毒蜥外泌肽-4(DA-毒蜥外泌肽-4)，用羥基取代氨基制備的β-羥基咪唑并丙酰-毒蜥外泌肽-4(HY-毒蜥外泌肽-4)，用羧基取代氨基制備的β-羧基咪唑并丙酰-毒蜥外泌肽-4(CX-毒蜥外泌肽-4)，用兩個(gè)甲基殘基修飾氨基制備的二甲基-組氨酰-毒蜥外泌肽-4(DM-毒蜥外泌肽-4)，以及脫去N-末端組氨酸殘基的α碳的咪唑并乙酰-毒蜥外泌肽-4(CA-毒蜥外泌肽-4)。

脫氨基-組氨酰(DA)- β-羥基咪唑并丙酰(HY)-β-羧基咪唑并丙酰(CX)-毒 毒蜥外泌肽-4 毒蜥外泌肽-4 蜥外泌肽-4
咪唑并乙酰(CA)- 二甲基-組氨酰(DM)-毒蜥外泌肽-4 毒蜥外泌肽-4 本發(fā)明的一個(gè)特殊方面涉及含有下式1的氨基酸的促胰島素釋放肽衍生物。
R1-X-R2(式1) 其中R1選自由脫氨基-組氨酰、N-二甲基-組氨酰、β-羥基咪唑并丙酰、4-咪唑并乙酰和β-羧基咪唑并丙酰組成的組； R2選自由-NH2、-OH或-Lys組成的組； X 選自由Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Z-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser、Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Z-Asn-Gly-Gly和Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Z-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser組成的組； Y選自由Lys、Ser和Arg組成的組； Z選自由Lys、Ser和Arg組成的組。
優(yōu)選促胰島素釋放肽衍生物具有式1，其中R1選自由脫氨基-組氨酰、N-二甲基組氨酰、β-羥基咪唑并丙酰、4-咪唑并乙酰和β-羧基咪唑并丙酰組成的組，Y為Lys或Ser，Z為Lys，R2為-NH2。
本發(fā)明的另一個(gè)特殊方面涉及含有下式2的氨基酸的促胰島素釋放肽衍生物。
R3-X′-R4(式2) 其中R3是4-咪唑并乙?；?， X′為Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Z-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser或Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Z-Asn-Gly-Gly； R4為-NH2； Y選自由Lys、Ser和Arg組成的組； Z選自由Lys、Ser和Arg組成的組。
就活性而言，毒蜥外泌肽-4的N-末端組氨酸殘基中的化學(xué)修飾與在其它促胰島素釋放肽GLP-1中具有不同的作用。GLP-1的N-末端組氨酸殘基中的化學(xué)修飾例如α-甲基-GLP-1、N-甲基-GLP-1或者imi-GLP-1預(yù)期抑制二肽基肽酶的降解，從而增加穩(wěn)定性，并且報(bào)道了降解速率的實(shí)際降低。然而，與天然的GLP-1相比，也報(bào)道了用較低cAMP刺激時(shí)它們具有相對(duì)降低的受體親和性。
相反，由于毒蜥外泌肽-4不被二肽基肽酶裂解，因此難以預(yù)測在N-末端組氨酸殘基上的化學(xué)修飾對(duì)活性的作用，尤其是其對(duì)受體親合性和血糖濃度的作用。
因此，本發(fā)明提供了具有化學(xué)修飾的N-末端組氨酸殘基或具有化學(xué)修飾的N-末端組氨酸殘基的氨基的毒蜥外泌肽-4衍生物，與天然毒蜥外泌肽-4相比其展現(xiàn)出出乎預(yù)料之外的極好的促胰島素釋放活性。與毒蜥外泌肽-4，這些衍生物展現(xiàn)出極好的體外血液穩(wěn)定性和促胰島素釋放活性(圖2)。實(shí)際上，糖尿病db/db小鼠中發(fā)現(xiàn)其與天然毒蜥外泌肽-4相比表現(xiàn)出極好的降血糖濃度的作用(圖3)。人們認(rèn)為由于N-末端組氨酸殘基的氨基的修飾導(dǎo)致的凈電荷的改變或者組氨酸殘基大小的改變導(dǎo)致了對(duì)血液中蛋白水解攻擊的敏感性的差異并影響了受體親合性。然而，仍需要對(duì)此進(jìn)行更廣泛的分子水平的研究。這種性質(zhì)預(yù)期可以最大化毒蜥外泌肽-4固有的促胰島素釋放活性，即對(duì)2型糖尿病的治療作用，并預(yù)期誘導(dǎo)降低食物攝入，延遲胃排空等等。
毒蜥外泌肽-4衍生物包括本發(fā)明的脫氨基-組氨酰-毒蜥外泌肽-4(DA-毒蜥外泌肽-4)、β-羥基咪唑并丙酰-毒蜥外泌肽-4(HY-毒蜥外泌肽-4)、β-羧基咪唑并丙酰-毒蜥外泌肽-4(CX-毒蜥外泌肽-4)、二甲基-組氨酰-毒蜥外泌肽-4(DM-毒蜥外泌肽-4)以及咪唑并乙酰-毒蜥外泌肽-4(CA-毒蜥外泌肽-4)通過脫去或取代N-末端組氨酸殘基的α氨基或者通過脫去N-末端組氨酸殘基的α碳制備。所以，只要它們的活性能夠保持，其它的氨基酸順序并沒有限定。而且，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是可以通過典型方法修飾毒蜥外泌肽-4衍生物，以增強(qiáng)其治療作用，以優(yōu)于天然毒蜥外泌肽-4，所述方法包括多聚物例如PEG和糖鏈的修飾和與白蛋白或運(yùn)鐵蛋白融合。
本發(fā)明另一個(gè)方面提供了用于治療糖尿病的藥物組合物，其包含促胰島素釋放肽衍生物。
本發(fā)明使用的術(shù)語“施用”表示通過合適的方法將預(yù)定量的物質(zhì)導(dǎo)入病人。本發(fā)明的綴合物可以通過任何通常途徑施用，只要它能到達(dá)所希望的組織?？梢钥紤]多種施用方式，包括腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、透皮、口服、局部、鼻內(nèi)、肺內(nèi)和直腸內(nèi)，但是本發(fā)明不限于這些舉例說明的施用方式。然而，因?yàn)殡脑诳诜┯脮r(shí)會(huì)被消化，為了保護(hù)不在胃里被降解，用于口服施用的組合物的活性成分應(yīng)被包衣或者配制。優(yōu)選所述組合物以可注射形式施用。此外，本發(fā)明的藥物組合物可以利用某些能夠?qū)⒒钚猿煞诌\(yùn)輸至靶細(xì)胞的裝置施用。
包含本發(fā)明的綴合物的藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體。對(duì)于口服施用，藥學(xué)上可接受的載體可包括粘合劑、潤滑劑、崩解劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、著色劑以及芳香劑。對(duì)于注射制劑，藥學(xué)上可接受的載體可包括緩沖劑、防腐劑、止痛劑、增溶劑、等滲劑和穩(wěn)定劑。對(duì)于局部施用制劑，藥學(xué)上可接受的載體可包括基質(zhì)、賦形劑、潤滑劑和防腐劑。本發(fā)明的藥物組合物可以與上述藥學(xué)上可接受的載體配制成多種劑型。例如，對(duì)于口服施用，藥物組合物可以配制成片劑、錠劑、包囊、酏劑、懸浮劑、糖漿或圓片。對(duì)于注射制劑，藥物組合物可以配制成單位劑量形式，如多劑量容器或以安瓿作為單一劑量劑型。藥物組合物也可以配制成溶液、懸浮液、片劑、丸劑、包囊和長效制劑。
另一方面，用于藥物制劑的載體、賦形劑以及稀釋劑的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚醇、麥芽糖醇、淀粉、刺槐橡膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥苯丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。此外，藥物制劑可進(jìn)一步包括填充劑、抗凝劑、潤滑劑、濕潤劑、芳香劑和殺菌劑。
本發(fā)明的藥物組合物的施用頻率和劑量通過幾個(gè)有關(guān)因素決定，包括治療疾病的類型，施用途徑，患者年齡、性別、體重以及患病嚴(yán)重程度，以及作為活性組分的藥物類型。因?yàn)楸景l(fā)明的藥物組合物具有良好的體內(nèi)效力和滴度持續(xù)時(shí)間，其可以顯著地減少本發(fā)明藥物的施用頻率和劑量。
本發(fā)明的促胰島素釋放衍生物并沒有被前人所公開，或者僅是泛泛公開而沒有揭示特異的氨基酸序列，并且它們的活性從來沒有與天然毒蜥外泌肽-4、其它的衍生物和變體相比較。所以，不能預(yù)料到N-末端的α氨基或α碳被取代或缺失的毒蜥外泌肽-4衍生物具有異常極好的活性。因此，本發(fā)明的促胰島素釋放肽衍生物的極好的血清穩(wěn)定性以及促胰島素釋放活性最大化了對(duì)2型糖尿病的治療作用。
[發(fā)明方式] 通過以下實(shí)施例更透徹地闡明本發(fā)明，但實(shí)施例僅是說明目的，不能解釋為對(duì)于本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1.毒蜥外泌肽-4衍生物的血漿穩(wěn)定性 為了測定毒蜥外泌肽-4衍生物的血漿穩(wěn)定性，將天然毒蜥外泌肽-4和毒蜥外泌肽-4衍生物的每一個(gè)暴露于血漿，利用反相HPLC測定未變性的剩余蛋白質(zhì)的量以進(jìn)行依賴于暴露時(shí)間的變性測試。
在本實(shí)驗(yàn)中，為分析暴露于血漿的樣品，將血漿混合樣品去蛋白，然后再分析。
將天然毒蜥外泌肽-4、脫氨基-組氨酰-毒蜥外泌肽-4(DA-毒蜥外泌肽-4)、β-羥基咪唑并丙酰-毒蜥外泌肽-4(HY-毒蜥外泌肽-4)、β-羧基咪唑并丙酰-毒蜥外泌肽-4(CX-毒蜥外泌肽-4)、二甲基-組氨酰-毒蜥外泌肽-4(DM-毒蜥外泌肽-4)和咪唑并乙酰-毒蜥外泌肽-4(CA-毒蜥外泌肽-4)分別制備成濃度為1mg/ml。每種毒蜥外泌肽-4衍生物樣品取200μl與200μl大鼠血清混合，37℃下進(jìn)行反應(yīng)，在每個(gè)取樣時(shí)間，每個(gè)樣品0小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、18小時(shí)和24小時(shí)的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出100μl。將冰浴冷卻的400μl甲醇加入至100μl的樣品中以終止反應(yīng)，然后渦旋20秒。每種混合物在15,000rpm下離心30分鐘，取上清液進(jìn)行分析。
反相HPLC用C18柱用于ACN中的TFA梯度作為流動(dòng)相進(jìn)行。
結(jié)果由毒蜥外泌肽-4的主峰面積與總峰面積的比率(％)計(jì)算得出，以時(shí)間點(diǎn)0小時(shí)的每個(gè)衍生物的結(jié)果作為100％，得出根據(jù)隨著暴露時(shí)間增加主峰面積比率減小的模式做出的圖。
直至?xí)r間點(diǎn)24小時(shí)時(shí)，天然毒蜥外泌肽-4的純度降低大約70％，三種衍生物(D、H、C形式)的純度分別降低大約77％、78％、77％(圖1)。
實(shí)施例2.測量毒蜥外泌肽-4衍生物的體外活性 為了測定包括脫氨基-組氨酰-毒蜥外泌肽-4的毒蜥外泌肽-4衍生物的效力，檢測它們的體外細(xì)胞活性。天然毒蜥外泌肽-4和毒蜥外泌肽-4衍生物由American Peptide Corporation合成。分離通常用來測量GLP-1體外活性的胰島瘤細(xì)胞或胰島，在經(jīng)GLP-1處理后分析cAMP產(chǎn)生的變化。
在本實(shí)驗(yàn)中，利用已知是大鼠胰島瘤細(xì)胞且具有GLP-1受體(因此通常被用來測量GLP-1的體外活性)的RIN-m5F(ATCC CRL-11605)測量體外活性。用不同濃度的GLP-1、天然毒蜥外泌肽-4以及包括N-末端-α-脫氨基-組氨酰-毒蜥外泌肽-4的毒蜥外泌肽-4衍生物處理RIN-m5F細(xì)胞，測定由于測試材料導(dǎo)致的cAMP生成以確定EC50值。
表1 實(shí)施例3.測量毒蜥外泌肽-4衍生物的促胰島素釋放活性 毒蜥外泌肽-4衍生物的促胰島素釋放活性在RINm5F細(xì)胞中進(jìn)行比較。解凍RINm5F細(xì)胞，亞培養(yǎng)至少一次，然后以1x105細(xì)胞/孔的密度接種至具有含F(xiàn)BS(Gibco，#11082)的培養(yǎng)基的96-孔板中。然后在5％CO2保溫箱中37℃下培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)。用含0.5％FBS的新配培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，然后保溫1小時(shí)。用含0.5％FBS和葡萄糖的培養(yǎng)基稀釋每個(gè)CA-毒蜥外泌肽-4以及毒蜥外泌肽-4(byetta，Amylin)以得到度為10nM到0.001nM。除了毒蜥外泌肽樣品，制備稀釋的溶液并用作對(duì)照組。去除RINm5F細(xì)胞的培養(yǎng)基，添加準(zhǔn)備好的樣品，然后在5％CO2保溫箱中37℃下培養(yǎng)1小時(shí)。然后，回收各個(gè)孔中的培養(yǎng)基。用大鼠胰島素ELISA試劑盒(Mercodia)測定所回收培養(yǎng)基中的胰島素濃度，結(jié)果示于圖2和表2。
表2 如圖2和表2所示，毒蜥外泌肽-4衍生物之一CA毒蜥外泌肽-4在相同濃度下展現(xiàn)出比天然毒蜥外泌肽-4高大約2倍的促胰島素釋放活性。
實(shí)施例3.毒蜥外泌肽-4衍生物的體內(nèi)效力的比較 為了測定毒蜥外泌肽-4衍生物的體內(nèi)效力，與天然毒蜥外泌肽-4相比較，在糖尿病動(dòng)物模型中測量了它們的降血糖作用。db/db小鼠(Jackson Lab，10-12周齡)被禁食2小時(shí)，然后分別以0.01-1000mcg.kg的量施用毒蜥外泌肽-4和CA毒蜥外泌肽-4。1小時(shí)后，從尾血管收集血樣以用血度儀測定血糖水平。毒蜥外泌肽-4、CA毒蜥外泌肽-4以及載體通過皮下途徑施用，在每個(gè)濃度計(jì)算與載體相比的血糖變化％。在各濃度下，用Prism程序計(jì)算降血糖作用的ED50(圖3，表3)。
表3 如圖3和表3所示，在糖尿病動(dòng)物模型中CA毒蜥外泌肽-4顯示出比天然毒蜥外泌肽-4高大約5倍的降血糖作用。
[工業(yè)實(shí)用性] 本發(fā)明的促胰島素釋放肽衍生物最大化了毒蜥外泌肽的固有的促胰島素釋放活性，即對(duì)于2型糖尿病的治療作用，并且誘導(dǎo)食物攝入的降低，延遲胃排空等等，優(yōu)于天然及其它促胰島素釋放肽類似物。所以，本發(fā)明的促胰島素釋放肽衍生物及包含其的藥物組合物可有效地治療上述疾病。
權(quán)利要求
1.一種促胰島素釋放肽衍生物，其中所述促胰島素釋放肽的N-末端組氨酸殘基被選自由脫氨基-組氨?；?、N-二甲基-組氨?；ⅵ?羥基咪唑并丙?；?、4-咪唑并乙酰基和β-羧基咪唑并丙?；M成的組中的材料取代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促胰島素釋放肽衍生物，其中所述促胰島素釋放肽選自毒蜥外泌肽-3、毒蜥外泌肽-4和其衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的促胰島素釋放肽衍生物，其中所述促胰島素釋放肽為毒蜥外泌肽-4或其衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的促胰島素釋放肽衍生物，其中所述促胰島素釋放肽衍生物由下式1所示的氨基酸組成
R1-X-R2(式1)
其中R1選自由脫氨基-組氨酰基、N-二甲基-組氨?；?、β-羥基咪唑并丙?；?-咪唑并乙?；挺?羧基咪唑并丙酰基組成的組中；
R2選自由-NH2或-OH組成的組中；
X選自由Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Z-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser、Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Z-Asn-Gly-Gly和Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Z-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser組成的組；
Y選自由Lys、Ser和Arg組成的組；
Z選自由Lys、Ser和Arg組成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的促胰島素釋放肽衍生物，其中R1為脫氨基-組氨?；琘為Lys或Ser，Z為Lys，R2為-NH2。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的促胰島素釋放肽衍生物，其中R1為N-二甲基-組氨?；?，Y為Lys或Ser，Z為Lys，R2為-NH2。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的促胰島素釋放肽衍生物，其中R1為4-咪唑并乙酰基，Y為Lys或Ser，Z為Lys，R2為-NH2。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的促胰島素釋放肽衍生物，其中R1為β-羥基-咪唑并丙酰基，Y為Lys或Ser，Z為Lys，R2為-NH2。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的促胰島素釋放肽衍生物，其中R1為β-羧基-咪唑并丙酰基，Y為Lys或Ser，Z為Lys，R2為-NH2。
10.一種用于治療糖尿病的藥物組合物，其包含權(quán)利要求1所述的促胰島素釋放肽衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有高活性的N-末端氨基酸經(jīng)修飾的促胰島素釋放肽以及包含其的藥物組合物。本發(fā)明的促胰島素釋放肽衍生物顯示出治療作用，該活性并未在天然和其它促胰島素釋放肽類似物中發(fā)現(xiàn)。因此本發(fā)明的促胰島素釋放肽衍生物及含有其的藥物組合物能有效用于治療所述疾病。
文檔編號(hào)C07K14/65GK101778863SQ200880024892
公開日2010年7月14日 申請(qǐng)日期2008年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月16日
發(fā)明者鄭圣燁, 林昌基, 宋大海, 裵城敏, 金永勛, 權(quán)世昌, 李寬淳 申請(qǐng)人:韓美藥品工業(yè)株式會(huì)社