專利名稱：針對CXCR4和其他GPCRs的氨基酸序列以及包含所述氨基酸序列的多肽的制作方法
針對CXCR4和其他GPCRs的氨基酸序列以及包含所述氨基
酸序列的多肽本發(fā)明涉及針對(如本文所定義)G蛋白偶聯受體(GPCRs)和具體地針對CXCR4 和CXCR7的氨基酸序列，以及涉及包含一個或多個所述氨基酸序列或基本上由其組成的化 合物或構建體，并且特別是蛋白和多肽(在本文中還分別地稱為“本發(fā)明的氨基酸序列”、 “本發(fā)明的化合物”和“本發(fā)明的多肽”)。此外，本發(fā)明提供一種制備針對跨膜蛋白，和具體 地針對在其他"體外"系統(tǒng)中無法復制其天然構象的多次跨膜的跨膜蛋白(例如，一般， GPCRs)的氨基酸序列的新方法。本發(fā)明還涉及編碼所述氨基酸序列和多肽的核酸(在本文中還稱為“本發(fā)明的核 酸”或“本發(fā)明的核苷酸序列”)；制備所述氨基酸序列和多肽的方法；表達或能夠表達所 述氨基酸序列或多肽的宿主細胞；包含所述氨基酸序列、多肽、核酸和/或宿主細胞的組合 物、且特別是藥物組合物；以及所述氨基酸序列或多肽、核酸、宿主細胞和/或組合物的應 用，特別是用于預防、治療或診斷目的，諸如本文所提到的預防、治療或診斷目的的應用。本發(fā)明的其它方面、實施方案、優(yōu)點和應用將從本發(fā)明的進一步描述中變得顯而 易見。GPCRs是公知的受體類型。參考例如針對以下綜述進行=Surgand等，Proteins (蛋 白質)62 :509-538^006) ；Vassilatis 等，Proc Natl Acad Sci U S A(美國國家科學院
) 100 :4903-4908 (2003)和 Pierce 等，Nat Rev MolCellBiol (分子細胞生物學自然 評論)3 :639-65(K2002)；以及針對例如George 等，Nat Rev Drug Discov(藥物發(fā)現 自然評論)1 :808-82(K2002) ；Kenakin, Trends Pharmacol ki (藥理學科學趨勢)25 186-192(2002) ；Rios 等，Pharmacol Ther (藥理學和治療學)92 :71-87 Q001) Jacoby 等， ChemMedChem 2006，1，760-782 ；以及 khlyer 和Horuk，Drug Discoveryhday (今日藥物發(fā) 現)，11，11/12. 2006 年 6 月，481 ；且還例如針對 Rosenkilde, Oncogene (癌基因)(2001)， 20，1582-1593 和 Sadee 等，AAPSPharmSci (AAPS 藥學科學)2001 ；3 ；1-16 ；以及針對其中引 用的其他參考文獻。G蛋白偶聯受體(GPCRs)是最大的細胞表面受體類型(人基因組中存在多于1000 個基因)。它們可以通過多種多樣系列的刺激，例如激酶、肽、氨基酸、可見光子來激活，且這 些受體在中樞神經系統(tǒng)和在外周中起重要作用。GPCRs是含有7個具有高度保守結構域的 跨膜結構域的蛋白。因為全部已知的藥物的一半通過G蛋白偶聯受體工作，因此選擇針對該蛋白家族 的納米抗體在商業(yè)上非常吸引人。估計在2000年中，全部現代藥物的一半和200種最暢銷 藥物的幾乎四分之一均針對或調節(jié)GPCR靶標(總共約30個)。然而，由于其7次跨膜螺旋 結構和其強烈的聚集傾向，使得它是一個非常具有挑戰(zhàn)性的靶標類型。GPCR可以基于序列同源性分組為若干不同的家族。盡管全部GPCR都具有類似的 7次跨膜α -螺旋結構，但是該受體類型中的不同家族彼此間表現出無序列同源性，由此提 示它們的跨膜結構域結構的相似性可能確定共有的功能要求。根據胞外結構域的尺寸來區(qū) 分三個家族。
-家族1(也稱為家族A或視紫紅質樣家族)的成員僅具有小的胞外環(huán)且與跨膜 裂溝內的殘基發(fā)生配體的相互作用。這是迄今為止最大的組(>90%的GPCRs)并包含嗅 覺受體，小分子諸如兒茶酚胺和胺、(神經)肽和糖蛋白激素。屬于該家族的視紫紅質是其 結構問題已經解決的唯一 GPCR。-家族2或家族BGPCR的特征在于參與至配體結合中的相對長的氨基末端胞外 結構域。關于跨膜結構域的定位幾乎毫無所知，但是它可能與視紫紅質非常不同。這些GPCR 的配體是激素，諸如胰高血糖素、促性腺激素釋放激素和甲狀旁腺激素。-家族3成員也具有大胞外結構域，其類似“維納斯捕蠅草(Venusflytrap) ”起 作用，因為它可以打開和關閉，使激動劑結合在其內部。家族成員有代謝型谷氨酸受體、 Ca2+-感受受體和Y -氨基丁酸(GABA)B受體。傳統(tǒng)上，使用小分子來開發(fā)針對GPCR的藥物，不僅因為制藥公司具有對其研究 的歷史原因，而且更重要的是因為家族1 GPCR的結構限制，所述家族1 GPCR具有跨膜 裂溝內的配體結合位點(Nat Rev Drug Discov(藥物發(fā)現自然評論M2004)The state of GPCR research in 2004 (2004 ^Ξ GPCR). Nature Reviews Drug Discovery GPCR QuestionnaireParticipants (藥物發(fā)現自然評論 GPCR 調查表參與者)3(7) :575， 577-626)。由于該原因，證實很難或不可能生成針對該靶標類型的單克隆抗體。本發(fā)明的 氨基酸序列(和具體地，本發(fā)明的納米抗體)可以通過它們經由延伸至腔(cavities)內的 CDR環(huán)結合的固有性質來解決該具體問題。治療相關GPCR的一些非限制性實例是例如以下，它們都是已經被批準或處于臨 床開發(fā)中的已知藥物的靶標。括號之間的文字表示本發(fā)明氨基酸序列、納米抗體或多肽的 預期作用(例如，作為激動劑或拮抗劑)A 型 GPCRs-毒蕈堿性Ml受體-腎上腺素受體-組胺受體-5-HT GPCR-大麻素受體-A型激素蛋白GPCR-趨化因子-甘丙肽-黑皮質素-神經肽Y受體-神經降壓肽受體-阿片樣物質-促生長素抑制素-血管升壓素樣受體-前列腺素類物質受體B 型 GPCRs-ACTH釋放因子受體(調節(jié)劑)；
C 型 GPCRs-GABAB受體(激動劑)；-代謝型谷氨酸受體治療相關GPCR的一些其他非限制性實例在表C中提及。人GPCR的更廣泛列表在 表D中給出。CXCR4，( 一種CXC趨化因子受體)，也稱融合素，是對基質衍生因子_1 (SDF-1，也 稱CXCLU)特異的α-趨化因子受體，所述基質衍生因子-1是賦予淋巴細胞有效趨化活性 的分子。該受體是可以被HIV分離株用來感染CD4+T細胞的若干趨化因子受體之一。傳統(tǒng) 上，使用CXCR4的HIV分離株被稱為T細胞向性分離株。典型地，這些病毒感染中很晚出現。 不清楚使用CXCR4的HIV的出現是免疫缺陷的結果還是原因。CXCR4的配體SDF-I被認為在造血干細胞歸巢至骨髓中和在造血干細胞靜止中很重要。通常關于趨化因子，SDF-I和CXCR4是相對"單配的"配體-受體對(其他趨化 因子傾向于以相當“混雜的”方式利用若干不同趨化因子受體)。因為SDF-I和CXCR4之間的相互作用在保持骨髓中的造血干細胞中起重要作用， 所以阻斷CXCR4受體的藥物似乎能夠使造血干細胞“移動”至血流中作為外周血干細胞。外 周血干細胞動員在造血干細胞移植中非常重要(作為近年來用于手術收獲的骨髓的移植 的替代方案)并且目前利用藥物諸如G-CSF來進行。G-CSF是嗜中性粒細胞(常見的白細 胞類型)的生長因子，并可以通過增加骨髓中嗜中性粒細胞-來源的蛋白酶諸如嗜中性粒 細胞彈性蛋白酶的活性，由此導致SDF-I的蛋白水解性降解來發(fā)揮作用。本發(fā)明的多肽和組合物通常可以用于調節(jié)，且具體地抑制和/或防止，GPCR介導 的信號傳導和/或用于調節(jié)GPCR參與的生物學途徑，和/或用于調節(jié)與所述信號傳導或這 些途徑相關的生物學機制、反應和作用。同樣地，本發(fā)明的多肽和組合物可以用于預防和治療(如本文中定義)GPCR相關 的疾病和紊亂。一般地，“GPCR相關疾病和紊亂”可以定義為可以分別通過對有此需要(即， 患有所述疾病或紊亂或其至少一種癥狀和/或處于引起或發(fā)生所述疾病或紊亂的風險)的 受試者適當地施用本發(fā)明的多肽或組合物(且具體地，其藥物有效量)和/或針對GPCR或 GPCR參與的生物學途徑或機制的已知活性的有效成分(且具體地，其藥物有效量)來預防 和/或治療的疾病和紊亂?；诒疚闹械墓_內容，所述GPCR相關的疾病和紊亂的實例對 于技術人員應該是清楚的。因此，在不受其限制的條件下，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽可以例如用于預防和 /或治療目前使用可以調節(jié)GPCR介導的信號傳導的有效成分預防或治療的全部疾病和紊 亂，諸如以上引用的現有技術中提及的那些。還設想，本發(fā)明的多肽可以用于預防和/或治 療所有這樣的疾病和紊亂，對于所述疾病和紊亂使用所述有效成分的治療目前正在開發(fā)、 已經提議、或將來應該提議或開發(fā)。另外，設想，由于其如本文中進一步所述的有利性質，本 發(fā)明的多肽可以用于預防和治療除對其正在使用或將提議或開發(fā)這些已知有效成分的疾 病和紊亂以外的其他疾病和紊亂；和/或本發(fā)明的多肽可以提供用于治療本文中所述疾病 和紊亂的新方法和方案。
從本文的進一步公開內容，對于專業(yè)技術人員來說本發(fā)明的氨基酸序列和多肽的 其他應用和用途將變得顯而易見?！愕兀景l(fā)明的一個目的是提供藥理學活性劑，以及包含其的組合物，它們可用 于GPCR相關疾病和紊亂以及本文提到的其他疾病和紊亂的診斷、預防和/或治療中；以及 提供用于這些疾病和紊亂的診斷、預防和/或治療的方法，這些方法涉及這些藥劑和組合 物的施用和/或應用。特別地，本發(fā)明的一個目的是提供與本領域中目前所用的和/或所知的藥劑、組 合物和/或方法相比具有某些優(yōu)點的此類藥理學活性劑、組合物和/或方法。這些優(yōu)點將 從下文的進一步描述而變得顯而易見。更特別地，本發(fā)明的一個目的是提供可以用作藥理學活性劑的治療性蛋白，以及 包括其的組合物，其用于診斷、預防和/或治療GPCR相關的疾病和紊亂以及本文提及的其 他的疾病和紊亂；和提供用于診斷、預防和/或治療所述疾病和紊亂的方法，所述方法涉及 所述治療性蛋白和組合物的施用和/或應用。因此，本發(fā)明的具體目的是提供針對(如本文所定義)GPCR、特別是針對來自溫血 動物的GPCR、更特別是針對來自哺乳動物的GPCR、并且尤其是針對人GPCR的氨基酸序列； 并且提供包括至少一種所述氨基酸序列或基本上由其組成的蛋白和多肽。特別地，本發(fā)明的具體目的是提供適合在溫血動物、并且特別是在哺乳動物、且更 特別是在人中用于預防、治療和/或診斷應用的所述氨基酸序列和所述蛋白和/或多肽。更特別地，本發(fā)明的具體目的是提供可以在溫血動物、特別是在哺乳動物、且更特 別是在人中用于預防、治療、減輕和/或診斷一種或多種與GPCR相關和/或由GPCR介導的 疾病、紊亂或病癥(如本文所提及的疾病、紊亂和病癥)的所述氨基酸序列和所述蛋白和/ 或多肽。本發(fā)明還有一個具體目的是提供可以用于制備用于預防和/或治療溫血動物、特 別是哺乳動物、且更特別是人中的一種或多種與GPCR相關的和/或由GPCR介導的疾病、紊 亂或病癥(如本文所提及的疾病、紊亂和病癥)的藥物或獸醫(yī)用組合物的所述氨基酸序列 和所述蛋白和/或多肽。 在本發(fā)明中，通常，這些目的通過利用本文所述的氨基酸序列、蛋白、多肽和組合 物實現。一般地，本發(fā)明提供針對(如本文所定義)和/或可以特異性結合(如本文所定 義)GPCR的氨基酸序列；以及包括至少一個所述氨基酸序列的化合物和構建體、且特別是 蛋白和多肽。更特別地，本發(fā)明提供可以以如本文所定義的親和力(適當測量和/或表示為 Kd-值(實際的或表觀的)，Ka-值(實際的或表觀的)，k。n-速率和/或k。ff-速率，或備選 地為IC5tl值，如本文進一步所述)與GPCR結合的氨基酸序列；以及包括至少一個所述氨基 酸序列的化合物和構建體、且特別是蛋白和多肽。特別地，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽優(yōu)選是這樣的，即，它們-以10_5-10_12摩爾/升或更小、并且優(yōu)選地10_7-10_12摩爾/升或更小、并且更優(yōu)選 地10_8-10_12摩爾/升的解離常數(Kd)(即，以IO5-IO12升/摩爾或更大、并且優(yōu)選地IO7-IO12 升/摩爾或更大、且更優(yōu)選地IO8-IO12升/摩爾的締合常數(Ka))與GPCR結合；
和/或是這樣的，S卩，它們-以IO2M-1S-1-約 IO7MW 優(yōu)選 ΙΟ^ΤΥ^ΙΟ 、-1，更優(yōu)選 ΙΟ Υ Ο'Μ 諸如 IO5M-1S-LlO7M-1S-1的k。n-速率與GPCR結合；和/或是這樣的，即，它們-以Is—1(t1/2 = 0. 69s) -KTfV1 (假定具有多天的t1/2的幾乎不可逆的復合體)，優(yōu) 選 IO-2S-LlO-6S-1,更優(yōu)選 IO-3S-LlO-6S-1,諸如 IOYU 的 k。ff 速率與 GPCR 結合。優(yōu)選地，本發(fā)明的單價氨基酸序列(或包含僅一個本發(fā)明的氨基酸序列的多肽) 優(yōu)選是這樣的，即，它將以小于500nM，優(yōu)選小于200nM，更優(yōu)選小于ΙΟηΜ，諸如小于500pM的 親和力與GPCR結合。對于本發(fā)明的氨基酸序列或多肽與GPCR結合的一些優(yōu)選的IC50值將從本發(fā)明的 進一步描述和實施例中變得顯而易見。對于與GPCR合，本發(fā)明的氨基酸序列通常將在其氨基酸序列內包含一個或多個 氨基酸殘基、或氨基酸殘基的一個或多個序列(即，每個“序列(stretch) ”包括彼此相鄰或 彼此緊鄰的兩個(或多個)氨基酸殘基，即，在該氨基酸序列的一級或三級結構上)，通過其 本發(fā)明的氨基酸序列可以與GPCR結合，因此所述氨基酸殘基或氨基酸殘基的序列形成結 合GPCR的“位點”(本文還稱為“抗原結合位點”)。本發(fā)明提供的氨基酸序列優(yōu)選地基本上采用分離形式(如本文所定義)、或形成 本發(fā)明的蛋白或多肽的一部分(如本文所定義)，其可以包括一個或多個本發(fā)明的氨基酸 序列或基本上由其組成，并且其可以任選地還包括一個或多個其它的氨基酸序列(全部任 選地通過一個或多個適當的接頭連接)。例如，并且不限于，本發(fā)明的一個或多個氨基酸序 列可以用作在這樣的蛋白或多肽內的結合單位，所述蛋白或多肽可以任選地包含可以充當 結合單位的一個或多個其它的氨基酸序列(即，針對除GPCR外的一個或多個其它靶標)，以 便分別提供單價、多價或多特異性的本發(fā)明的多肽，全如本發(fā)明所述。這樣的蛋白或多肽還 可以采用基本上分離的形式(如本文所定義)。因此，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽優(yōu)選地基本上由不通過二硫鍵與任一另一氨基 酸序列或鏈連接(但是其可以或可以不包含一個或多個分子內二硫鍵。例如，已知納米抗 體如本文所述有時可以含有在CDR3和CDRl或FR2之間的二硫鍵)的單個氨基 酸鏈組成。然而，應該注意，一個或多個本發(fā)明的氨基酸序列可以彼此連接和/或與其他氨 基酸序列連接(例如，通過二硫鍵)，以提供也可以用于本發(fā)明的肽構建體(例如，Fab'片 段，F(ab’)2片段，ScFv構建體，“雙抗體”和其他多特異性構建體。例如，參考Holliger和 Hudson, Nat Biotechnol.(自然生物技術)2005 年 9 月；23 (9) :11洸_36 的綜述)。一般地，當本發(fā)明的氨基酸序列(或包含其的化合物、構建體或多肽)意欲施用給 受試者時(例如，為了如本文所述的治療和/或診斷目的)，優(yōu)選其是在所述受試者內天然 不存在的氨基酸序列；或當它在所述受試者內天然存在時，采用基本上分離的形式(如本 文所定義)。專業(yè)技術人員還應該清楚，對于藥物應用，本發(fā)明的氨基酸序列(以及包含其的 化合物、構建體和多肽)優(yōu)選地針對GPCR ；而對于獸醫(yī)用目的，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽 優(yōu)選地針對來自待治療的物種的GPCR，或至少與來自待治療的物種的GPCR交叉反應。此外，本發(fā)明的氨基酸序列可以任選地，并且除了所述至少一個針對GPCR結合的 結合位點之外，包含針對其它抗原、蛋白或靶標結合的一個或多個其它的結合位點。本發(fā)明的氨基酸序列和多肽的功效、以及包含其的組合物的功效可以使用任何適合的體外測定、 基于細胞的測定、體內測定和/或本身已知的動物模型、或它們的任何組合進行檢測，這取 決于所涉及的具體的疾病或紊亂。適當的測定和動物模型對于專業(yè)技術人員來說將是清楚 的，并且例如，包括爪蟾卵母細胞中受體的表達，其后使許多GPCR與離子通道的偶聯容許 通過電壓鉗技術在卵母細胞中監(jiān)測的這些GPCR的活化或抑制。異源GPCR可以通過將外 源性GPCR-編碼mRNA注射到卵母細胞中而在卵母細胞中功能性表達，并然后容許20種卵 母細胞內源性細胞機器將受體翻譯并插入到質膜中(參見，例如，Houamed等，kience (科 學)252 :1318-21,1991 ；Dahmen 等，J. Neurochem.(神經化學雜志)58 :1176-79,1992.)。 在受體功能性表達后，配體誘導跨膜電導變化的能力可以通過兩電極電壓鉗系統(tǒng)(Dahmen 等，見上)觀察到，這可以檢測膜電勢的去極化或超極化。用于篩選GPCR的其他技術是專業(yè)技術人員清楚的，例如，來自本文中引用的手 冊、綜述和現有技術。這些包括例如放射性配體結合測定，如例如在Lundstrom等，J Struct Funct Genomics.(結構功能遺傳學雜志)2006年11月22日；[在出版前的電子公開]中 使用的和如在 Andre 等，Protein Sci (蛋白質科學)5 :1115 (2006) ；Hassaine 等，(2006) Prot Purif Expr (蛋白質純化表達)45 :343 ；Nicholson 等 J Pharmacol Exp Ther.(藥理 學實驗治療雜志)2006 May ；317 (2) :771-7. [2006年1月25日電子公開]和Vilardaga 等，JBiol Chem.(生物化學雜志)2001 年 9 月 7 日；276 (36) :33435-43. 2001 年 5 月 31 日 電子公開中所述的，其例如利用可以如Hovius等，(1998) JNeurochem(神經化學雜志)70 824中所述制備的膜制劑。用于篩選GPCR的一些HTS技術在由Jacoby等綜述的表4中提 及。并且，根據本發(fā)明，針對來自第一溫血動物物種的GPCR的氨基酸序列和多肽可 以或可以不表現出與來自一種或多種其它溫血動物物種的GPCR的交叉反應性。例如， 針對人GPCR的氨基酸序列和多肽可以或可以不表現出與來自一種或多種其它靈長類 物種(諸如，不限于，來自獼猴屬(Macaca)的猴子(諸如，并且特別地，食蟹猴(食蟹猴 (Macacafascicularis))和/或恒河猴(恒河猴(Macaca mulatta)))和狒狒(豚尾狒狒 (Papio ursinus)))的GPCR的交叉反應性，和/或與來自通常用于疾病的動物模型中(例 如小鼠、大鼠、兔、豬或狗)、且特別是用于與GPCR相關的疾病和紊亂的動物模型中的一種 或多種動物物種(諸如本文提及的物種和動物模型)的GPCR的交叉反應性。在這一方面， 對于專業(yè)技術人員應該清楚，從藥物開發(fā)觀點來看，所述交叉反應性，當存在時，可能具有 優(yōu)點，因為它允許所述針對人GPCR的氨基酸序列和多肽在所述疾病模型中被檢測到。更一般地，與來自多個哺乳動物物種的GPCR交叉反應的本發(fā)明的氨基酸序列和 多肽將通常有利于用于獸醫(yī)應用，原因在于它將允許在多種物種之間使用相同的氨基酸序 列或多肽。因此，在本發(fā)明的范圍內還包括，針對來自一個動物物種的GPCR的氨基酸序列 和多肽(諸如針對人GPCR的氨基酸序列和多肽)可以用于治療另一個動物物種，只要所述 氨基酸序列和/或多肽的應用在待治療的物種中提供所需要的作用。本發(fā)明在其最廣泛意義上也不特別限于或限定于本發(fā)明的氨基酸序列和多肽所 針對的GPCR的特異性抗原決定簇、表位、部分、結構域、亞單位或構象(confirmation)(在 適用時)。例如，本發(fā)明的氨基酸序列可以通過用已經在合適表達系統(tǒng)中表達的或已經由合 適細胞或細胞級分分離的GPCR適當免疫哺乳動物(諸如駱駝科動物(Camelid))產生。具體地，本發(fā)明的氨基酸序列可以(例如利用Kiefer, Biochim. Biophys. Acta, 1610(2003)， 57-62的綜述中描述的技術)針對已經重折疊的GPCR產生，并且針對和/或已經針對重折 疊的GPCR產生的氨基酸序列、納米抗體和多肽形成本發(fā)明的另一方面。
本發(fā)明的氨基酸序列和多肽通?？梢葬槍θ魏涡枰腉PCR，且可以具體地針對具 有至少一個胞外環(huán)或胞外結構域的GPCR。所述GPCR的實例基于本文中引用的現有技術對 專業(yè)技術人員應該是清楚的。根據本發(fā)明的特殊方面，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽可以針對(如本文所定義) 在細胞表面上表達的GPCR和/或針對GPCR的至少一個胞外區(qū)、胞外結構域、胞外環(huán)或其他 胞外表位。例如，這樣的氨基酸序列可以通過用具有GPCR或其表面的細胞或細胞級分適當 地免疫哺乳動物(諸如駱駝科動物)產生。特別地，根據該方面，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽針對(如本文所定義)GPCR，例 如人CXCR4和/或人CXCR7的至少一個胞外區(qū)、胞外結構域、胞外環(huán)或其他胞外表位，且優(yōu) 選進一步是這樣的，即所述本發(fā)明的氨基酸序列和多肽能夠調節(jié)(如本文所定義)所述 GPCR,例如人CXCR4和/或人CXCR7。更特別地，根據該方面，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽針 對(如本文所定義)GPCR，例如人CXCR4和/或人CXCR7的至少一個胞外區(qū)、胞外結構域、 胞外環(huán)或其他胞外表位；且優(yōu)選進一步是這樣的，即所述本發(fā)明的氨基酸序列和多肽能夠 (完全地或部分地)阻斷所述GPCR，例如人CXCR4和/或人CXCR7。根據本發(fā)明的這個方面，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽可以針對GPCR，例如人 CXCR4和/或人CXCR7的任何合適胞外部分、胞外區(qū)、胞外結構域、胞外環(huán)或其他胞外表位， 但優(yōu)選針對跨膜結構域的一個胞外部分或更優(yōu)選針對連接跨膜結構域的一個胞外環(huán)。所述合適的胞外區(qū)、胞外結構域、胞外環(huán)或表位的氨基酸序列可以通過相關GPCR， 例如人CXCR4和/或人CXCR7的氨基酸序列的Kyte-Doolittle分析；通過比對屬于相同 (亞)家族的GPCR和識別各種跨膜結構域和胞外部分、胞外區(qū)、胞外結構域或胞外環(huán)；通過 TMAP分析；或通過其任何合適的組合獲得。本發(fā)明還涉及針對所述胞外部分、胞外區(qū)、胞外 結構域、胞外環(huán)或表位的和/或已經針對其產生(和/或針對所述胞外部分、胞外區(qū)、胞外 結構域、胞外環(huán)或表位的合適部分或片段的和/或已經針對其和/或針對基于所述胞外部 分、胞外區(qū)、胞外結構域、胞外環(huán)或表位獲得的合成或半合成肽產生)的氨基酸序列(如本 文中進一步所定義)。特別地，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽優(yōu)選是這樣的，即，它們-以KT5-IO-12摩爾/升或更小、并且優(yōu)選地KT7-IO-12摩爾/升或更小、并且更優(yōu)選 地10_8-10_12摩爾/升的解離常數(Kd)(即，以IO5-IO12升/摩爾或更大、并且優(yōu)選地IO7-IO12 升/摩爾或更大、且更優(yōu)選地IO8-IO12升/摩爾的締合常數(Ka))與GPCR(如本文中所述) 的胞外部分、胞外區(qū)、胞外結構域、胞外環(huán)或其他胞外表位結合或針對由其獲得的肽結合；和/或是這樣的，S卩，它們-以IO2M-1S-1-約 IO7MW 優(yōu)選 ΙΟ^ΤΥ^ΙΟ 、-1，更優(yōu)選 ΙΟ Υ Ο'Μ 諸如 ΙΟ^ΤΥΜΟΙΥ1的k。n-速率與GPCR(如本文中所述)的胞外部分、胞外區(qū)、胞外結構域、胞 外環(huán)或其他胞外表位結合或針對由其獲得的肽結合；和/或是這樣的，S卩，它們-以Is—1 (t1/2 = 0. 69s)-IO-6S-1 (提供具有多天的t1/2的幾乎不可逆的復合體)，優(yōu)選IOYU，更優(yōu)選IOYU，諸如IOYU的k。ff速率與GPCR(如本文中 所述)的胞外部分、胞外區(qū)、胞外結構域、胞外環(huán)或其他胞外表位結合或針對由其獲得的肽結合。優(yōu)選地，本發(fā)明的單價氨基酸序列(或包含僅一個本發(fā)明的氨基酸序列的多肽) 優(yōu)選是這樣的，即，它將以小于500nM，優(yōu)選小于200nM，更優(yōu)選小于ΙΟηΜ，諸如小于500pM的 親和力與GPCR(如本文中所述)的胞外部分、胞外區(qū)、胞外結構域、胞外環(huán)或其他胞外表位結合。而且，根據該方面，本發(fā)明的任何多價或多特異性(如本文所定義)多肽也可以適 當地針對同一抗原上的兩個或更多不同的胞外部分、胞外區(qū)、胞外結構域、胞外環(huán)或其他胞 外表位，例如針對兩個不同的胞外環(huán)、針對跨膜結構域的兩個不同的胞外部分或針對一個 胞外環(huán)和一個胞外環(huán)。本發(fā)明的這樣的多價或多特異性多肽還可以具有(或被改造和/或 被選擇為)對于所需GPCR的增加的抗體親抗原性(avidity)和/或提高的選擇性，和/或 對于可以通過使用所述多價或單特異性多肽獲得的任何其他所需性質或所需性質的組合。通常，預期本發(fā)明的針對GPCR的胞外環(huán)或胞外結構域(或針對源自其或基于其的 小肽)，和/或已經針對GPCR的胞外環(huán)或胞外結構域(或針對源自其或基于其的小肽)篩 選、利用其選擇和/或針對其產生的氨基酸序列和多肽也應該能夠結合(且特別地，特異性 結合，如本文中定義)所述形成存在于細胞表面上的GPCR的一部分(或其至少一個亞單 位)的胞外環(huán)或胞外結構域(或源自其的肽)。因此，所述胞外環(huán)或胞外結構域(或源自其 的肽)可以在用于生成本發(fā)明的氨基酸序列和多肽(如本文所定義)的方法中存在用途； 且所述方法和用途形成本發(fā)明的其他方面；針對胞外環(huán)或胞外結構域或源自其的肽或針對 其產生的本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽也形成本發(fā)明的其他方面。例如，所述方法可以包括以下a)用包含所需胞外部分、胞外區(qū)、胞外結構域、胞外環(huán)或其他胞外表位的合適抗 原，或用源自其或基于其的合適肽適當地免疫駱駝科動物，從而產生針對所需胞外部分、胞 外區(qū)、胞外結構域、胞外環(huán)或其他胞外表位的免疫應答的步驟?？乖梢允悄軌虍a生針對所 需胞外部分、胞外區(qū)、胞外結構域、胞外環(huán)或其他一個或多個胞外表位的免疫應答的任何合 適抗原；諸如，例如且不限于，有生命的并以其天然構象在其表面上過表達所需胞外部分、 胞外區(qū)、胞外結構域、胞外環(huán)或其他一個或多個胞外表位的完整細胞，其細胞壁片段或源自 所述細胞的任何其他制劑，在其表面上具有所需胞外部分、胞外區(qū)、胞外結構域、胞外環(huán)或 其他一個或多個胞外表位的囊泡，包含所需胞外部分、胞外區(qū)、胞外結構域、胞外環(huán)或其他 一個或多個胞外表位的GPCR例如人CXCR4和/或人CXCR7亞單位或亞單位的片段，或包 含和/或基于所需胞外部分、胞外區(qū)、胞外結構域、胞外環(huán)或其他一個或多個胞外表位(的 氨基酸序列)的合成或半合成肽；更優(yōu)選地，有生命的并以其天然構象在其表面上過表達 所需胞外部分、胞外區(qū)、胞外結構域、胞外環(huán)或其他一個或多個胞外表位的完整細胞(例如 HEK293)；和b)利用過表達所述GPCR，例如人CXCR4和/或人CXCR7的不同(與免疫中使用 的那種不同)和若干細胞類型的細胞膜制劑來選擇用于結合所需胞外部分、胞外區(qū)、胞外 結構域、胞外環(huán)或其他一個或多個胞外表位的步驟。這可以通過從在其表面上表達重鏈抗 體的細胞的組、集合或文庫(例如獲自適當免疫的駱駝科動物的B細胞)選擇和使用例如用于第一輪選擇的第一類細胞諸如例如CHO和例如用于第二輪選擇的第二類細胞諸如例 如C0S-7細胞的細胞膜制劑來實現，通過使用例如用于第一輪選擇的第一類細胞諸如例如 CHO和例如用于第二輪選擇的第二類細胞諸如例如C0S-7細胞的細胞膜制劑從VHH序列或 納米抗體序列的(幼稚或免疫)庫中選擇來實現，或通過使用例如用于第一輪選擇的第一 類細胞諸如例如CHO和例如用于第二輪選擇的第二類細胞諸如例如C0S-7細胞的細胞膜制 劑從編碼VHH序列或納米抗體序列的核苷酸序列的(幼稚或免疫)文庫中選擇來實現；其 都可以以本身已知的方式進行；和任選地c)用緩沖液諸如無去污劑的PBS僅適度洗滌；且該方法可以任選地進一步包括一 個或多個本身已知的其他合適步驟，諸如，例如且不限于，親和力成熟的步驟，表達所需氨 基酸序列的步驟，篩選針對所需抗原(在該情形中，GPCR)結合和/或針對所需抗原(在該 情形中，GPCR)的活性的步驟，確定所需氨基酸序列或核苷酸序列的步驟，引入一個或多個 人源化取代(例如如本文中進一步所述)的步驟，以合適的多價和/或多特異性形式格式 化的步驟，篩選所需生物學和/或生理學性質(即利用合適的測定，諸如本文中所述的那 些)的步驟；和/或一個或多個所述步驟以任何合適順序的任何合適組合。所述方法和通過所述方法獲得的氨基酸序列，以及包含所述氨基酸序列或基本由 其組成的蛋白和多肽形成本發(fā)明的其他方面。本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽還可以在與內源性激動劑相同的位點(即 正構(orthosteric)位點)處結合GPCR，由此激活或增加受體信號傳導；或備選地由此減 少或抑制受體信號傳導。本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽還可以以這樣方式結合GPCR，所述方式是 它們阻斷GPCR的組成型活性。本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽還可以以這樣的方法結合GPCR，所述方 式是它們介導變構調節(jié)(例如在變構位點處結合GPCR)。這樣，本發(fā)明的氨基酸序列、納 米抗體和多肽可以通過結合受體中的不同區(qū)域(例如在變構位點處)來調節(jié)受體功能。 參考例如針對George等，Nat RevDrug Discov (藥物發(fā)現自然評論)1 :808-820 (2002)； Kenakin, TrendsPharmacol ki (藥理學科學趨勢)25 :186-192(2002)和 Rios 等， PharmacolTher (藥理學治療)92 :71-87(2001))進行。本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽還可以以這樣的方法結合GPCR，所述方式 是它們抑制或增強GPCR功能性同二聚體或異二聚體的裝配。本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽還可以以這樣的方法結合GPCR，所述方式 是它們延長GPCR介導的信號傳導的持續(xù)時間。本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽還可以通過增加受體-配體親和力來增強 受體信號傳導。針對GPCR及其配體的本發(fā)明多肽還可以通過使配體與正構位點交聯；和/或穩(wěn)定 配體與正構位點的結合而提供配體與GPCR增強的結合。因此，本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā) 明的多特異性多肽(如本文所定義)，其包含至少一個本發(fā)明的針對GPCR蛋白酶的氨基酸 序列(諸如納米抗體)和至少一個針對其天然配體的結合單元。所述多特異性蛋白也可以 進一步如本文中所述。而且，如由本文中進一步的公開內容應該清楚地，且取決于它們針對的GPCR和它們所需的(治療)作用，本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽可以擔當GPCR(和/或GPCR 的配體)和/或與其相關的生物學功能、途徑、機制、作用、信號傳導或反應的(完全的或部 分的)激動劑，(完全的或部分的，且競爭性的或非競爭性的)拮抗劑或反向激動劑。它們 可以以不可逆的方式執(zhí)行這些作用，但優(yōu)選以可逆的方式執(zhí)行。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽是本發(fā)明GPCR的(完全的或部 分的，且競爭性或非競爭性的)拮抗劑或反向激動劑，更優(yōu)選地，本發(fā)明的氨基酸序列和多 肽是納米抗體，其是本發(fā)明GPCR的(完全的或部分的，且競爭性或非競爭性的)拮抗劑或 反向激動劑。我們的結果顯示單價和/或多價形式的納米抗體，和可能地，還有本發(fā)明的氨基 酸序列和多肽，可以擔當表現出納米抗體平臺的廣闊適用性的針對組成型活性GPCR的中 性拮抗劑或反向激動劑。最暢銷的GPCR藥物中大部分表現為反向激動劑而非中性拮抗 劑(Milligan G. (2003). Mol. Pharmacol.(分子藥理學)64 :1271-1276)并且已經聲稱 反向激動劑與中性拮抗劑相比，可以對若干疾病包括癌癥具有特定的治療益處(Kenakin T. (2004). Mol. Pharmacol.(分子藥理學)65 :2-11)。此外，反向激動劑可以優(yōu)于中性拮抗 劑來抑制其他功能。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽是“單克隆”氨基酸序列或多 肽，這意味著所述針對所述蛋白或多肽中存在的GPCR(且優(yōu)選所述蛋白或多肽中存在的全 部免疫球蛋白序列)的一個或多個氨基酸序列至少每一個是“單克隆”，如專業(yè)技術人員通 常理解地。然而，在該方面，應該注意到，如進一步在本文中所述，本發(fā)明明確地涵蓋包含兩 個或更多個免疫球蛋白序列(且特別地，單克隆免疫球蛋白序列)的多價或多特異性蛋白， 所述兩個或更多個免疫球蛋白序列針對相同GPCR的不同部分、區(qū)、結構域、環(huán)或表位，且特 別地，針對相同GPCR的不同胞外部分、胞外區(qū)、胞外結構域、胞外環(huán)或表位。在適用時，本發(fā)明的氨基酸序列可以結合于GPCR的兩個以上的抗原決定簇、表 位、部分、結構域、亞單位或構象，這也在本發(fā)明范圍內。在此情況下，本發(fā)明的氨基酸序列 和/或多肽結合的GPCR的抗原決定簇、表位、部分、結構域或亞單位可以基本上是相同的 (例如，如果GPCR包含重復的結構基序或以多聚體形式存在)，或可以是不同的(并且在后 一種情況下，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽可以以可能相同或不同的親和力和/或特異性結 合于GPCR的所述不同的抗原決定簇、表位、部分、結構域、亞單位)。此外，例如，當GPCR以 活化構象存在和以無活性構象存在時，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽可以結合于這些構象中 的任一種，或者可以結合于這兩種構象(即，以可能是相同的或不同的親和力和/或特異 性)。此外，例如，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽可以這樣地結合于GPCR的構象，即，在所述構 象中其與相關配體結合；可以這樣地結合于GPCR的構象，S卩，在所述構象中其不與相關配 體結合，或者可以結合于所述兩種構象(同樣以可能是相同的或不同的親和力和/或特異 性)。還期望本發(fā)明的氨基酸序列和多肽通常將結合于GPCR的所有天然存在的或合成 的類似物、變體、突變體、等位基因、部分和片段；或至少結合于GPCR的下面的那些類似物、 變體、突變體、等位基因、部分和片段，即它們包含與在GPCR中(例如在野生型異二聚體細 胞因子和/或它們的受體中)與本發(fā)明的氨基酸序列和多肽結合的(一個或多個)抗原決 定簇或(一個或多個)表位基本上相同的一個或多個抗原決定簇或表位。同樣地，在此情況下，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽可以以本發(fā)明的氨基酸序列與(野生型)GPCR結合的親 和力和特異性相同或不同(即，高于或低于其)的親和力和/或特異性結合于所述類似物、 變體、突變體、等位基因、部分和片段。本發(fā)明的氨基酸序列和多肽結合于GPCR的一些類似 物、變體、突變體、等位基因、部分和片段而不結合于另一些，這也包括在本發(fā)明的范圍內。當GPCR以單體形式存在和以一個或多個多聚體形式存在時，本發(fā)明的氨基酸序 列和多肽只與單體形式的GPCR結合，只與多聚體形式的GPCR結合，或均與單體和多聚體形 式二者結合，在本發(fā)明的范圍內。同樣地，在這樣的情形中，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽可 以以與本發(fā)明的氨基酸序列和所述多聚體形式結合的親和力和特異性相同，或不同(即， 高于或低于其)的親和力和/或特異性與單體形式結合。此外，當GPCR可以與其他蛋白或多肽締合以形成蛋白復合體(例如，具有多個亞 基)時，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽與處于其非締合狀態(tài)的GPCR結合，與處于其締合狀態(tài) 的GPCR結合，或與二者均結合，這在本發(fā)明的范圍內。在所有這些情形中，本發(fā)明的氨基酸 序列和多肽可以以與本發(fā)明的氨基酸序列和多肽與處于其單體和非締合狀態(tài)的GPCR結合 的親和力和/或特異性可能是相同的或不同(即，高于或低于其)的親和力和/或特異性 與所述多聚體或締合的蛋白復合體結合。此外，對于專業(yè)技術人員應該是清楚的，包含兩個或更多個針對GPCR的氨基酸序 列的蛋白或多肽可以以比相對應的一個或多個單體氨基酸序列更高的親和力與GPCR結 合。例如，但不限于，包含兩個或更多個針對GPCR的不同表位的氨基酸序列的蛋白或多肽 可以(并且通常將)以比不同單體的每一個更高的抗體親抗原性結合，并且包含兩個或更 多個針對GPCR的氨基酸序列的蛋白或多肽還可以(并且通常將)以更高的抗體親抗原性 結合GPCR的多聚體。一般地，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽將至少結合那些形式的GPCR(包括單體、多 聚體和締合形式)，從生物學和/或治療觀點看來，這些形式是最相關的，這對于專業(yè)技術 人員將是清楚的。使用本發(fā)明的氨基酸序列和多肽的部分、片段、類似物、突變體、變體、等位基因和 /或衍生物，和/或使用包括一個或多個所述部分、片段、類似物、突變體、變體、等位基因和 /或衍生物或基本上由其組成的蛋白或多肽，也在本發(fā)明的范圍內，只要這些適用于本發(fā) 明考慮的應用。所述部分、片段、類似物、突變體、變體、等位基因和/或衍生物通常將包含 (至少部分地)針對GPCR結合的功能性抗原-結合位點；并且更優(yōu)選地將能夠特異性結合 GPCR，并且甚至更優(yōu)選地能夠以如本發(fā)明所定義的親和力(適當地測量和/或表示為Kd-值 (實際的或表觀的)，Ka-值(實際的或表觀的)，k。n-速率和/或k。ff-速率，或備選地作為 IC5tl值，如本發(fā)明進一步所述)結合GPCR。所述部分、片段、類似物、突變體、變體、等位基 因、衍生物、蛋白和/或多肽的一些非限制性實例將通過本發(fā)明的進一步描述變得清楚。還 可以通過適當組合(即，通過連接或基因融合)一個或多個(更小的)本發(fā)明所述的部分 或片段而提供本發(fā)明的其他片段或多肽。在本發(fā)明的一個具體而非限制性方面中，其將在本發(fā)明中進一步描述，與它們衍 生而來的氨基酸序列相比，所述類似物、突變體、變體、等位基因、衍生物具有增加的半衰期 (如本發(fā)明進一步所述)。例如，可以將本發(fā)明的氨基酸序列連接到(化學或其他方式)一 個或多個延長半衰期的基團或結構部分(諸如PEG)上，以提供具有增加的半衰期的本發(fā)明的氨基酸序列的衍生物。在一個具體而非限制性的方面中，本發(fā)明的氨基酸序列可以是包括免疫球蛋白 折疊的氨基酸序列，或可以是在適當條件(諸如生理條件)下能夠形成免疫球蛋白折疊 (即，通過折疊)的氨基酸序列。其中特別參考Halaby等，J. (1999)蛋白質工程(Protein Eng.) 12，563-71的綜述。優(yōu)選地，當正確折疊以形成免疫球蛋白折疊時，這樣的氨基酸序列 能夠特異性結合(如本發(fā)明所定義)GPCR ；并且更優(yōu)選地能夠以如本發(fā)明所定義的親和力 (適當地測量和/或表示為Kd-值(實際的或表觀的)，Ka-值(實際的或表觀的)，k。n-速 率和/或k。ff-速率，或備選地作為IC5tl值，如本發(fā)明進一步所述)結合GPCR。此外，所述氨 基酸序列的部分、片段、類似物、突變體、變體、等位基因和/或衍生物優(yōu)選是這樣的，以致 它們包括免疫球蛋白折疊或者能夠在適當的條件下形成免疫球蛋白折疊。特別地，但不限于，本發(fā)明的氨基酸序列可以是基本上由4個構架區(qū)(分別為 FR1-FR4)和3個互補性決定區(qū)(分別為CDR1-CDR3)組成的氨基酸序列；或所述氨基酸序 列的任何適當的片段(那么其通常將包含至少一些形成至少一個CDR的氨基酸殘基，如本 文進一步所述)。本發(fā)明的氨基酸序列可以特別是免疫球蛋白序列或其適當的片段，并且更特別地 是免疫球蛋白可變結構域序列或其適當的片段，諸如輕鏈可變結構域序列(例如，Vf序 列)或其適當的片段；或重鏈可變結構域序列(例如，Vh-序列)或其適當的片段。當本發(fā) 明的氨基酸序列是重鏈可變結構域序列時，它可以是來源于常規(guī)四鏈抗體的重鏈可變結構 域序列(諸如，不限于，來源于人抗體的Vh序列)，或是來源于所謂的“重鏈抗體”(如本文 所定義)的所謂的Vhh-序列(如本文所定義)。然而，應該注意到，本發(fā)明不限制本發(fā)明的氨基酸序列的來源(或用于表達其的 本發(fā)明的核苷酸序列的來源)，也不限制產生或獲得(或已經產生或獲得)本發(fā)明的氨基酸 序列或核苷酸序列的方法。因此，本發(fā)明的氨基酸序列可以是天然存在的氨基酸序列(來 自任何適當的物種)或合成的或半合成的氨基酸序列。在本發(fā)明的具體而非限制性方面， 所述氨基酸序列是天然存在的免疫球蛋白序列(來自任何適當的物種)或合成的或半合成 的免疫球蛋白序列，包括但不限于“人源化的”(如本文所定義)免疫球蛋白序列(諸如部 分或完全人源化的小鼠或兔免疫球蛋白序列，并且特別是部分或完全人源化的Vra序列或 納米抗體)，“駱駝源化的(camelized)”(如本文所定義的)免疫球蛋白序列，以及已經通 過下列技術獲得的免疫球蛋白序列諸如親和力成熟(例如，起始于合成的、隨機的或天然 存在的免疫球蛋白序列)，CDR移植，鑲蓋術(veneering)，組合來源于不同的免疫球蛋白序 列的片段，利用重疊的引物進行的PCR裝配，以及專業(yè)技術人員公知的加工免疫球蛋白序 列的相似技術；或前述任一項的任何適當的組合。例如，參考標準手冊，以及進一步描述和 本文提及的現有技術。類似地，本發(fā)明的核苷酸序列可以是天然存在的核苷酸序列或合成的或半合成的 序列，并且例如，可以是通過PCR從適當的天然存在的模板(例如，從細胞分離的DNA或 RNA)分離的序列，已經從文庫(并且特別是表達文庫)分離的核苷酸序列，已經通過向天然 存在的核苷酸序列中引入突變(利用任何適當的本身已知的技術，諸如錯配PCR)而制備的 核苷酸序列，已經使用重疊的引物通過PCR制備的核苷酸序列，或已經利用本身已知的DNA 合成技術制備的核苷酸序列。
本發(fā)明的氨基酸序列可以特別是結構域抗體(或適合用作結構域抗體的氨基酸 序列)，單結構域抗體(或適合用作單結構域抗體的氨基酸序列)，“dAb"(或適合用作 dAb的氨基酸序列)或納米抗體TM(NanobodyTM)(如本文所定義，并且包括但不限于Vhh序 列)；其它單可變結構域，或它們中任一種的任何適當的片段。對于(單)結構域抗體的 概括描述，參考上文引用的現有技術，以及參考EP 0 368 684。對于術語“dAb，s”，例如， 參考 Ward 等(自然(Nature) 1989 年 10 月 12 日；341 (6242) :544-6)，參考 Holt 等，生物 技術趨勢(Trends Biotechnol.)，2003，21 (11) :484-490 ；以及例如參考 W006/030220，WO 06/003388與Domantis (Domantis Ltd.)有限公司的其它公布的專利申請。還應該注意 到，盡管由于它們不是哺乳動物來源的，在本發(fā)明的情形中較不優(yōu)選，但是單結構域抗體或 單可變結構域可以來源于某些鯊魚(shark)物種(例如，所謂的“IgNAR結構域”，參見例如 W005/18629)。特別地，本發(fā)明的氨基酸序列可以是納米抗體 (如本文所定義)或其適當 的片段。[注意納米抗體1￥^皿0130(^ )，納米抗體“⑴^??！^！^肚⑶ ) 和納米克隆 (Nanoclone )為埃博靈克斯股份有限公司(AblynxN. V.)的商標。]所述針對GPCR的納 米抗體在本文也稱為“本發(fā)明的納米抗體”。對于納米抗體的概括描述，參考下文的進一步描述，以及參考本文所引用的現有 技術。在這一方面，然而，應該注意到，本文描述和現有技術主要描述所謂“Vh3種類”的納 米抗體(即，與VH3種類的人種系序列如DP-47、DP-51或DP-四具有高度序列同源性的納 米抗體)，所述納米抗體形成本發(fā)明的優(yōu)選方面。然而，應該注意到，本發(fā)明在其最廣泛意義 上通常涵蓋任何類型的針對GPCR的納米抗體，并且例如，還涵蓋屬于所謂的“Vh4種類”的 納米抗體(即，與Vh4種類的人種系序列如DP-78具有高度序列同源性的納米抗體)，例如， 如在埃博靈克斯股份有限公司(AblynxN. V.)于2006年4月14日提交的題目為“DP-78樣 納米抗體(DP-78-likeNanobodies)，，的美國臨時申請60/792，279中描述。一般地，納米抗體(特別是Vhh序列和部分人源化的納米抗體)可以特別地特征 在于，在一個或多個構架序列(同樣如本文進一步所述)中存在一個或多個“標志殘基 (hallmark residues) ” (如本文所述)。因此，通常，納米抗體可以定義為具有下述(通用)結構的氨基酸序列FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1-FR4分別是指構架區(qū)1_4，并且其中⑶Rl-⑶R3分別是指互補性決定區(qū) 1-3，并且其中一個或多個標志殘基如本文進一步所定義。特別地，納米抗體可以是具有下述(通用)結構的氨基酸序列FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1-FR4分別是指構架區(qū)1_4，并且其中⑶Rl-⑶R3分別是指互補性決定區(qū) 1-3，并且其中所述構架序列如本文進一步所定義。更特別地，納米抗體可以是具有下述(通用)結構的氨基酸序列FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1-FR4分別是指構架區(qū)1_4，并且其中⑶Rl-⑶R3分別是指互補性決定區(qū) 1-3，并且其中i)優(yōu)選地，在按照 Kabat 編號的位置 11，37，44，45，47，83，84，103，104 和 108 的氨基酸殘基的一個或多個選自下表A-3中提及的標志殘基；并且其中ii)所述氨基酸序列與SEQ ID NO，s :1-22中的至少一種氨基酸序列具有至少 80%的氨基酸同一性，其中為了確定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基 酸殘基(在序列SEQ ID NO，s 1-22中表示為X)。在這些納米抗體中，所述⑶R序列通常如本文進一步所定義。因此，本發(fā)明還涉及這樣的納米抗體，其可以結合(如本文定義)和/或針對 GPCR，涉及其適當的片段，以及涉及包含一種或多種所述納米抗體和/或適當的片段或基 本上由其組成的多肽。SEQ ID NO，s 238-253給出了已經針對人CXCR4產生的許多Vhh序列的氨基酸序 列(表1)。表1 針對人CXCR4(SEQ ID NO 254)的納米抗體
權利要求
1.多肽，其包含一種或多種特異性結合人CXCR4(SEQ ID NO 254)的納米抗體和可能 包含一種或多種特異性結合血清蛋白的納米抗體，且其中所述一種或多種特異性結合人CXCR4的納米抗體通過包括至少以下步驟的方 法生成a)用有生命的并在其表面上表達人CXCR4的完整細胞免疫美洲駝；和b)關于針對人CXCR4的結合進行選擇；和任選地c)在所述選擇步驟中，僅使用緩沖液諸如無去污劑的PBS溫和洗滌； 且其中a)所述多肽在競爭結合測定中結合人CXCR4時，在高濃度下(》IOOnM)替代超過 50 %，更優(yōu)選60 %，甚至更優(yōu)選70 %，甚至更優(yōu)選80 %，甚至更優(yōu)選90 %，最優(yōu)選95 %的人 CXCL12(SEQ ID NO :267)，和 / 或b)所述多肽在等于或低于ΙΟΟηΜ，更優(yōu)選ΙΟηΜ，更優(yōu)選InM和最優(yōu)選0.InM的濃度下， 完全拮抗人CXCL12對人CXCR4的趨化作用；并且其中如果所述多肽包含兩種或更多種納米抗體，則所述多肽任選還包含一個或更 多肽接頭。
2.權利要求1所述的多肽，其包含兩種或更多種特異性結合人CXCR4的納米抗體。
3.權利要求1或2所述的多肽，其包含兩種特異性結合人CXCR4的納米抗體。
4.權利要求1、2或3所述的多肽；其中至少一種納米抗體基本上由4個構架區(qū)(分別 為FR1-FR4)和3個互補性決定區(qū)(分別為⑶Rl-⑶R3)組成，其中⑶Rl選自由下列各項組 成的組a)SEQ ID NO，s :142-143 的氨基酸序列；b)與SEQID NO，s :142-143的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；c)與SEQID NO，s :142-143的至少一個氨基酸序列具有3，2，或1個氨基酸差異的氨 基酸序列；且-⑶R2選自由下列各項組成的組d)SEQ ID NO，s :174-175 的氨基酸序列；e)與SEQID NO，s :174-175的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；f)與SEQID NO，s :174-175的至少一個氨基酸序列具有3，2，或1個氨基酸差異的氨 基酸序列；且-⑶R3選自由下列各項組成的組g)SEQ ID NO，s =206-207 的氨基酸序列；h)與SEQID NO，s :206-207的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；i)與SEQID NO，s :206-207的至少一個氨基酸序列具有3，2，或1個氨基酸差異的氨基酸序列。
5.權利要求1、2、3或4的多肽；其中所述兩種特異性結合人CXCR4的納米抗體基本上 由4個構架區(qū)(分別為FR1-FR4)和3個互補性決定區(qū)(分別為⑶Rl-⑶R3)組成，其中⑶Rl 選自由下列各項組成的組a)SEQ ID NO，s :142-143 的氨基酸序列；b)與SEQID NO，s :142-143的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；c)與SEQID NO，s :142-143的至少一個氨基酸序列具有3，2，或1個氨基酸差異的氨 基酸序列；且-⑶R2選自由下列各項組成的組d)SEQ ID NO，s :174-175 的氨基酸序列；e)與SEQID NO，s :174-175的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；f)與SEQID NO，s :174-175的至少一個氨基酸序列具有3，2，或1個氨基酸差異的氨 基酸序列；且-⑶R3選自由下列各項組成的組g)SEQ ID NO，s =206-207 的氨基酸序列；h)與SEQID NO，s :206-207的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；i)與SEQID NO，s :206-207的至少一個氨基酸序列具有3，2，或1個氨基酸差異的氨基酸序列。
6.權利要求1、2、3、4或5的多肽；其中所述一種特異性結合人CXCR4的納米抗體基本 上由4個構架區(qū)(分別為FR1-FR4)和3個互補性決定區(qū)(分別為⑶Rl-⑶R3)組成，其中 ⑶Rl選自由下列各項組成的組a)SEQ ID NO，s :142的氨基酸序列；b)與SEQID NO，s :142的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基 酸序列；c)與SEQID NO’ s 142的至少一個氨基酸序列具有3，2，或1個氨基酸差異的氨基酸 序列；且-⑶R2選自由下列各項組成的組d)SEQ ID NO，s :174的氨基酸序列；e)與SEQID NO，s :174的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基 酸序列；f)與SEQID NO’ s 174的至少一個氨基酸序列具有3，2，或1個氨基酸差異的氨基酸 序列；且-⑶R3選自由下列各項組成的組g)SEQ ID NO，s 206的氨基酸序列；h)與SEQID NO，s 206的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基 酸序列；i)與SEQID NO，s :206的至少一個氨基酸序列具有3，2，或1個氨基酸差異的氨基酸 序列；其中所述另一種特異性結合人CXCR4的納米抗體基本上由4個構架區(qū)(分別為 FR1-FR4)和3個互補性決定區(qū)(分別為⑶Rl-⑶R3)組成，其中⑶Rl選自由下列各項組成 的組j) SEQ ID NO，s 143的氨基酸序列；k)與SEQ ID NO，s :143的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基 酸序列；1)與SEQ ID NO’ s 143的至少一個氨基酸序列具有3，2，或1個氨基酸差異的氨基酸 序列； 且-⑶R2選自由下列各項組成的組 m) SEQ ID NO，s :175的氨基酸序列；η)與SEQ ID NO，s :175的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基 酸序列；ο)與SEQ ID NO’ s 175的至少一個氨基酸序列具有3，2，或1個氨基酸差異的氨基酸 序列； 且-⑶R3選自由下列各項組成的組 p) SEQ ID NO，s 207的氨基酸序列；q)與SEQ ID NO，s :207的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基 酸序列；r)與SEQ ID NO，s :207的至少一個氨基酸序列具有3，2，或1個氨基酸差異的氨基酸 序列。
7.權利要求1、2、3、4、5或6所述的多肽；其中所述納米抗體選自由與SEQID NO’ s 238-239的至少一種氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的納米抗體組成的組。
8.權利要求1、2、3、4、5、6或7所述的多肽，其中所述多肽選自由與SEQID NO，s 沈1力64，優(yōu)選SEQ ID NO，s 263-264的至少一種氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性 的多肽組成的組。
9.納米抗體，其基本上由4個構架區(qū)(分別為FR1-FR4)和3個互補性決定區(qū)(分別為 ⑶Rl-⑶R3)組成，其中⑶Rl選自由下列各項組成的組a)SEQ ID NO，s :142-143 的氨基酸序列；b)與SEQID NO，s :142-143的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；c)與SEQID NO，s :142-143的至少一個氨基酸序列具有3，2，或1個氨基酸差異的氨 基酸序列；且-⑶R2選自由下列各項組成的組d)SEQ ID NO，s :174-175 的氨基酸序列；e)與SEQID NO，s :174-175的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；f)與SEQID NO，s :174-175的至少一個氨基酸序列具有3，2，或1個氨基酸差異的氨 基酸序列；且-⑶R3選自由下列各項組成的組g)SEQ ID NO，s =206-207 的氨基酸序列；h)與SEQID NO，s :206-207的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；i)與SEQID NO，s :206-207的至少一個氨基酸序列具有3，2，或1個氨基酸差異的氨基酸序列。
10.核酸或核苷酸序列，其編碼根據權利要求1-9中任一項中所述的多肽或納米抗體。
11.宿主細胞，其在合適的環(huán)境下能夠表達根據權利要求1-9中任一項中所述的多肽 或納米抗體。
12.藥物組合物，其包含根據權利要求1-9中任一項所述的多肽或納米抗體。
13.根據權利要求12所述的藥物組合物，其還包含至少一種藥用載體、稀釋劑或賦形 劑和/或佐劑，且其任選地包含一種或多種另外的藥物活性多肽和/或化合物。
14.用于篩選針對人CXCR4(SEQID NO :254)的氨基酸序列的方法，所述方法包括至少 以下步驟a)提供編碼氨基酸序列的核酸序列的組、集合或文庫；b)從所述核酸序列的組、集合或文庫中篩選編碼可以結合人CXCR4和/或具有針對人 CXCR4的親和性且是交叉阻斷的或交叉阻斷根據權利要求1-9所述的納米抗體或多肽的氨 基酸序列的核酸序列；和c)分離所述核酸序列，然后表達所述氨基酸序列。
15.用于治療癌癥或AIDS的方法或應用，所述方法或應用包括向需要所述方法或應用 的受試者施用藥物活性量的根據權利要求1-9任一項中所述的至少一種多肽或納米抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對(如本文所定義)G蛋白偶聯受體(GPCRs)和具體地針對CXCR4和CXCR7的氨基酸序列，以及涉及包含一種或多種所述氨基酸序列或基本由其組成的化合物或構建體，且特別地蛋白和多肽(本文中分別也稱為“本發(fā)明的氨基酸序列”、“本發(fā)明的化合物”、和“本發(fā)明的多肽”)。此外，本發(fā)明提供制備針對跨膜蛋白，和特別地對于多次跨膜的跨膜蛋白的氨基酸序列的新方法，對于所述跨膜蛋白，不能在其他“體外”系統(tǒng)中復制天然構象(例如，一般GPCRs)。
文檔編號A61P31/18GK102099378SQ200980127612
公開日2011年6月15日 申請日期2009年5月18日 優(yōu)先權日2008年5月16日
發(fā)明者克里斯托夫·布朗什托, 彼得·萬蘭德舒特, 斯文·耶尼興, 約翰內斯·約瑟夫·威廉姆斯·德哈德, 邁克爾·約翰·斯科特·桑德斯, 雷格留斯·勒爾, 馬丁·斯密特 申請人:埃博靈克斯股份有限公司