一種Sabin株脊髓灰質(zhì)炎III型病毒單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅲ型病毒的單克隆抗體及其應(yīng)用，屬于免疫學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明將Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅲ型病毒免疫接種小鼠后，將鼠脾臟細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選產(chǎn)生抗Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅲ型病毒的特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其保藏編號(hào)為CGMCC No.9233，其分泌的單克隆抗體效價(jià)高，中和活性強(qiáng)，能在體外有效阻斷Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒的感染；同時(shí)抗體可以特異性的區(qū)分Ⅲ型與Ⅰ、Ⅱ型脊灰病毒以及其他多種腸道病毒，特異性好，可用于制備脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅲ型抗原含量檢測(cè)試劑盒和抗體檢測(cè)試劑盒，也可以用于Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒的鑒別檢測(cè)，具有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域與前景。
CGMCC No9233
20140526
【專利說明】-種Sabin株脊髓灰質(zhì)炎I I I型病毒單克隆抗體及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域與疫苗學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及一種抗Sabin株脊髓灰質(zhì)炎 III型病毒的中和性單克隆抗體及產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細(xì)胞株以及抗體的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 脊髓灰質(zhì)炎疾病早在公元前1580-1350時(shí)期就存在于人類社會(huì)中，最早的證據(jù)來 源于古埃及石壁畫中一個(gè)呈站立姿態(tài)的人物，具有明顯的脊髓灰質(zhì)炎疾病癥狀：腿部彎曲 萎縮，腳面畸形。然而，直到1789年，英國(guó)人Michael Underwood才首次描述了脊髓灰質(zhì)炎 疾病的臨床癥狀，稱之為"下肢衰弱"。半個(gè)世紀(jì)后，德國(guó)人的研究表明脊髓灰質(zhì)炎疾病可 能具備傳染性。1894年在美國(guó)爆發(fā)了有記載以來最大規(guī)模的嬰兒癱瘓災(zāi)難，后來被證實(shí)罹 患的是脊髓灰質(zhì)炎疾病。1908年澳大利亞醫(yī)生Karl Landsteiner和Erwin Popper首次 提出了假說，認(rèn)為脊髓灰質(zhì)炎疾病是由一種病毒引起的。隨后在美國(guó)流行的疫情更加速了 人們對(duì)疾病傳播的研究。直到1931年Macfarlane Burnet和Jean MacNamara首次解釋 了三種脊髓灰質(zhì)炎病毒（后稱脊灰病毒），即I、II和III型。上述三種病毒導(dǎo)致脊髓灰質(zhì)炎 (poliomyelitis)疾病，該疾病是一種傳播廣泛、侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)的傳染病。感染脊灰病 毒的患者中有90%沒有臨床癥狀或只有很輕的臨床癥狀。這些癥狀包括發(fā)燒、頭疼、嘔吐、 疲勞、脖頸僵直、四肢疼痛等。在每200名受感染的患者中會(huì)有一位產(chǎn)生不可逆的癱瘓，部 位主要集中在腿部。更為嚴(yán)重的癱瘓癥狀可以延伸到患者的軀干，包括胸部和腹部肌肉的 麻痹，最為嚴(yán)重的癥狀是當(dāng)脊灰病毒侵染腦部細(xì)胞后造成中樞呼吸系統(tǒng)的破壞，導(dǎo)致吞咽 和說話的困難。有5-10%的患者因?yàn)楹粑÷楸詫?dǎo)致死亡。脊髓灰質(zhì)炎疫苗（包含I、II、 III型的脊髓灰質(zhì)炎病毒）是預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎疾病的有效手段。
[0003] 自1988年實(shí)施消滅脊髓灰質(zhì)炎（脊灰）戰(zhàn)略以來，我國(guó)通過接種口服脊髓灰質(zhì)炎 減毒活疫苗（OPV)消滅了本土野毒株引起的脊髓灰質(zhì)炎。但是仍存在OPV引起的疫苗相關(guān) 麻痹病例（VAPP)和疫苗衍生株（VDPV)，脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗（IPV)基本可避免OPV上述缺 點(diǎn)。WHO指出當(dāng)全球證實(shí)消除脊灰后，將停止使用0PV，屆時(shí)可能需要脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗 (IPV)來長(zhǎng)期保持脊灰免疫水平。相對(duì)于野毒株IPV，Sabin株IPV在制造和使用過程中更 安全，對(duì)它的研究受到了 WHO的高度重視。目前生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)炎減毒株滅活疫苗的國(guó)家有 中國(guó)、日本及荷蘭。
[0004] 如上所述，根據(jù)抗原決定簇不同脊髓灰質(zhì)炎病毒可分為I、ΙΙ、ΠΙ型三個(gè)血清型， 任何一型病毒造成的疾病都稱為脊髓灰質(zhì)炎。I型易引起癱瘓，也最容易引起流行。三個(gè) 型別的病毒間中和試驗(yàn)無交叉反應(yīng)。每種脊髓灰質(zhì)炎病毒均有兩種抗原，D(致密）抗原和 C(無核心）抗原。前者存在于成熟的、有感染性的病毒顆粒中，是脊髓灰質(zhì)炎病毒的中和抗 原，具有型特異性。C抗原存在于經(jīng)過56°C滅活，或者未成熟的空心病毒顆粒中，是一種耐 熱的抗原成份，與三個(gè)型別的脊髓灰質(zhì)炎病毒的抗血清均呈補(bǔ)體結(jié)合陽性反應(yīng)。D抗原含量 反應(yīng)完整的病毒抗原顆粒的多少，是體外測(cè)定IPV效力的關(guān)鍵指標(biāo)，與疫苗在人體內(nèi)的免 疫效力有較好的一致性。脊髓灰質(zhì)炎病毒抗體是指動(dòng)物或人體抗脊髓灰質(zhì)炎各型別病毒產(chǎn) 生的IgG、IgM等類型抗體的總稱，廣泛應(yīng)用于脊髓灰質(zhì)炎病毒鑒定、脊髓灰質(zhì)炎疫苗以及 各型別抗原的定性和定量檢測(cè)中。
[0005] 由于目前III型病毒抗原檢測(cè)普遍采用的多抗包被--多抗夾心的檢測(cè)體系，該體 系對(duì)于I、II型存在較大的交叉反應(yīng)，尤其在用于三型混合疫苗Sabin株IPV的III型抗原 檢測(cè)時(shí)，由于交叉反應(yīng)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不能真實(shí)反應(yīng)III型抗原的含量以及疫苗III型的免疫原 性，同時(shí)WHO也推薦采用多抗與單抗匹配的方式檢測(cè)三價(jià)脊灰疫苗中的各型抗原含量；目 前國(guó)際上尚缺乏Sabin株IPV D抗原檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化的試劑，制備特異性好，具有中和活性的 單克隆抗體，可為Sabin株IPV體外效力檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化奠定基礎(chǔ)。因此，有必要制備一 種型特異的脊髓灰質(zhì)炎III型單克隆抗體，用于III型脊灰抗原、抗體的檢測(cè)與病毒的鑒別。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種Sabin株脊髓灰質(zhì)炎III型病毒的中和性單克隆抗體， 用于III型脊灰病毒抗原含量的檢測(cè)。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述單克隆抗體的應(yīng)用。為了達(dá)到上述目的，本發(fā) 明首先提供一種分泌Sabin株脊髓灰質(zhì)炎III型病毒的中和性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株 SVASIPV-III，于2014年5月26日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 (地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，簡(jiǎn)稱CGMCC，郵編 100101)保藏，分類命名為Sabin株脊髓灰質(zhì)炎III型單抗雜交瘤細(xì)胞株，保藏編號(hào)CGMCC No.9233〇
[0008] 本發(fā)明提供了保藏編號(hào)為CGMCC No. 9233的雜交瘤細(xì)胞株在制備預(yù)防或治療脊髓 灰質(zhì)炎藥物中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明還提供了由上述雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的單克隆抗體。
[0010] 具體而言，本發(fā)明采用小鼠骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備Sabin株脊髓灰質(zhì)炎III型 病毒的中和性單克隆抗體，通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：通過將免疫脊髓灰質(zhì)炎病毒原液的小 鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，分離出能夠分泌脊髓灰質(zhì)炎抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞，接種 小鼠腹腔，制備含有特異性脊髓灰質(zhì)炎III型病毒抗體的腹水，經(jīng)過后期處理并驗(yàn)證，得到特 異性好、抗體水平高且能長(zhǎng)期保存的Sabin株脊髓灰質(zhì)炎III型病毒單克隆抗體。
[0011] 進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種Sabin株脊髓灰質(zhì)炎III型病毒單克隆抗體，其由保藏 編號(hào)為CGMCC No. 9233的雜交瘤細(xì)胞株分泌獲得。
[0012] 更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了上述單克隆抗體在制備檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎III型病毒抗原 試劑盒中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明提供了上述的單克隆抗體在制備檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎III型病毒抗體試劑盒中 的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎III型病毒抗原或抗體的試劑盒，含有上述 單克隆抗體。
[0015] 對(duì)本發(fā)明的單克隆抗體，經(jīng)生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記后獲得的的單克隆抗體也屬于本 發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0016] 進(jìn)一步地，經(jīng)酶標(biāo)記的單克隆抗體屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0017] 所述的酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。
[0018] 上述單克隆抗體不進(jìn)行生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記，而添加第二抗體；即采用一種物種 的抗脊灰抗體包被酶標(biāo)板，添加脊髓灰質(zhì)炎III型病毒抗原后，加入本發(fā)明單抗，然后加入抗 屬二抗HRP，用于檢測(cè)或制備檢測(cè)試劑。
[0019] 本發(fā)明提供了一種可以用于脊髓灰質(zhì)炎治療性抗體的改造的細(xì)胞株，以及包含于 細(xì)胞株的保護(hù)性抗體的基因信息。
[0020] 進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種使用Sabin株脊髓灰質(zhì)炎III型病毒直接免疫動(dòng)物制備 多克隆抗體和單克隆抗體的全新模式，收獲液的免疫效果優(yōu)于常規(guī)的疫苗原液添加佐劑的 免疫效果，可以為其他病毒制備抗體提供參考，因此采用Sabin株脊髓灰質(zhì)炎III型病毒收 獲液免疫小鼠制備雜交瘤細(xì)胞。
[0021] 所述脊髓灰質(zhì)炎病毒Sabin株III型收獲液的制備方法為：取Vero細(xì)胞工作細(xì)胞庫 復(fù)蘇后培養(yǎng)，至細(xì)胞濃度為〇. 1-10 X IO6細(xì)胞/ml時(shí)，接種病毒；取III型病毒制備的工作種 子批毒種按MOI = 10?0. 05接種Vero細(xì)胞或其他原代、傳代細(xì)胞，然后進(jìn)行培養(yǎng)；病毒培 養(yǎng)后收獲細(xì)胞上清，即為脊髓灰質(zhì)炎病毒Sabin株III型病毒收獲液。
[0022] 本發(fā)明提供的Sabin株脊髓灰質(zhì)炎III型病毒單克隆抗體具有如下有益效果：
[0023] 1、本發(fā)明的單克隆抗體具有較高的效價(jià)即反應(yīng)性，間接法效價(jià)最高可達(dá)106。
[0024] 2、本發(fā)明的單克隆抗體具有較高的中和效價(jià)，可以有效反映脊髓灰質(zhì)炎III型病毒 有效抗原表位，用于抗原含量檢測(cè)優(yōu)于多抗--多抗的檢測(cè)體系；同時(shí)該單抗反映的中和 表位即有效抗體，可用于抗脊髓灰質(zhì)炎IgG抗體競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)，用于疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)及 流行病學(xué)調(diào)查，更加有效的評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果及地區(qū)的過往發(fā)病史。
[0025] 3、本發(fā)明的脊髓灰質(zhì)炎III型單克隆抗體可以特異性的區(qū)分脊髓灰質(zhì)炎野毒株I、 Π 型病毒，不與其反應(yīng)，是能夠與sabin株脊髓灰質(zhì)炎III型病毒特異性結(jié)合的單抗。
[0026] 4、本發(fā)明的單克隆抗體與甲肝病毒、腸道病毒71型病毒、柯薩奇A16病毒等無交 叉反應(yīng)，均有較好的病毒特異性。
[0027] 5、單克隆抗體可廣泛應(yīng)用于脊髓灰質(zhì)炎病毒的檢測(cè)、鑒別、篩查與疫苗生產(chǎn)的抗 原檢測(cè)以及流行病調(diào)查中；同時(shí)檢測(cè)的是抗原決定簇，可以更加有效的反應(yīng)疫苗的有效組 分，對(duì)疫苗的工藝研究與生產(chǎn)具有重要意義。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[0029] 本發(fā)明實(shí)施例中選用的Sabin株脊髓灰質(zhì)炎III型病毒來自荷蘭Intravacc，代次 RS0+2(S0+6)代，但毒株不限于本來源與本代次的毒株。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技 術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；實(shí)施例中所用的試劑為市售商品。
[0030] 實(shí)施例ISabin株脊髓灰質(zhì)炎III型病毒免疫原制備與動(dòng)物免疫
[0031] (1)取Vero細(xì)胞工作細(xì)胞庫復(fù)蘇后于36. 5±0. 5 °C培養(yǎng)，至細(xì)胞濃度為 0. I-IOXlO6細(xì)胞/ml時(shí)，接種病毒。
[0032] (2)取Intravacc來源的sabin株脊髓灰質(zhì)炎III型病毒制備的工作種子批毒種按 MOI = 10 ?0· 05 接種 Vero 細(xì)胞，置 32. 5±0· 5°C培養(yǎng)。
[0033] (3)病毒培養(yǎng)2?4天，收獲細(xì)胞上清，即為脊髓灰質(zhì)炎病毒Sabin株III型病毒收 獲液。
[0034] (4) III型收獲液澄清后用超濾膜包濃縮5倍以上。
[0035] (5)然后進(jìn)行分子篩層析和離子交換層析，監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為280nm，分別收集洗脫液和 流穿液，即得純化液，甲醛滅活后即得III型疫苗原液。（6)將疫苗原液與弗氏佐劑（0天免疫 為弗氏完全佐劑，14天、28天免疫為弗氏不完全佐劑）等體積混合乳化后于0天、14天、28 天背部皮下多點(diǎn)免疫BALB/c小鼠，0. 2ml/只。III型病毒收獲液于0天、14天、28天背部皮 下多點(diǎn)免疫BALB/c小鼠，0. 2ml/只。
[0036] (7)末次免疫一周后采血檢測(cè)抗體效價(jià)，血清稀釋IO4時(shí)收獲液免疫小鼠血清的間 接ELISA的OD值為1. 532,原液加佐劑免疫小鼠血清的間接ELISA的OD值為0. 237,收獲 液免疫小鼠血清效價(jià)高于疫苗原液加佐劑免疫小鼠，確定采用收獲液免疫小鼠進(jìn)行細(xì)胞融 合篩選單抗。于末次免疫二周后采用收獲液腹腔沖擊選定的小鼠，3天后取小鼠脾臟，進(jìn)行 細(xì)胞融合。
[0037] 實(shí)施例2細(xì)胞融合及建株
[0038] (1)細(xì)胞融合前復(fù)蘇培養(yǎng)SP2/0細(xì)胞株，融合前3天擴(kuò)大培養(yǎng)，融合前1天去除 RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液（Gibco)，重新添加培養(yǎng)液，準(zhǔn)備SP2/0細(xì)胞。
[0039] (2)處死免疫小鼠，按常規(guī)方法制備小鼠脾細(xì)胞懸液。
[0040] (3)根據(jù)脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果分別加入適量不完全I(xiàn)MDM培養(yǎng)液 (Gibco)，SP2/0細(xì)胞晃動(dòng)混勻，脾細(xì)胞用移液管吹打均勻。然后將脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞按 1:2?10:1混合于50ml離心管中，混勻。
[0041] (4)加不完全MDM培養(yǎng)液至50ml，離心5-10分鐘，倒凈上清。輕擊融合管底，使 沉淀細(xì)胞松散均勻，離心管置37°C水浴，準(zhǔn)備融合。
[0042] (5)將37 °C預(yù)熱的50%的PEG4000lml，用滴管緩慢滴入混合細(xì)胞管，邊滴邊轉(zhuǎn)動(dòng) 離心管，使細(xì)胞保存在混勻狀態(tài)。
[0043] (6)靜置90s后立即緩慢加入15ml無血清的MDM培養(yǎng)基（Gibco) (37°C )，然后離 心5-10分鐘，棄去上清。
[0044] (7)加入頂DM完全培養(yǎng)液（Gibco)，混勻，將混懸液分別加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 100μ 1/孔，于37°C，5% (：02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0045] (8)第 2 天細(xì)胞板加 HAT 培養(yǎng)液（MDM 含 1*HAT (Sigma)) 100 μ 1/ 孔。
[0046] (9)每2-3天換一次HAT培養(yǎng)液，觀察是否出現(xiàn)雜交瘤，兩周后換HT培養(yǎng)基（IMDM 含1*的HT (Sigma))，觀察融合細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。
[0047] (10)細(xì)胞融合后第七天開始觀察雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待其長(zhǎng)至孔底面積1/10 以上時(shí)吸出上清進(jìn)行抗體ELISA檢測(cè)。將陽性孔細(xì)胞轉(zhuǎn)入24孔板擴(kuò)大培養(yǎng)，及時(shí)做亞克隆。
[0048] (11)經(jīng)3次亞克隆得到穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系，命名為SVASIPV-III，凍存細(xì)胞。 將雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行保藏，保藏號(hào)CGMCC NO. 9233,分類命名為：Sabin株脊髓灰質(zhì)炎III型 單抗雜交瘤細(xì)胞株，保藏時(shí)間：2014年5月26日；保藏單位：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理 中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，地址北京 市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。
[0049] 實(shí)施例3單抗細(xì)胞株腹水制備與抗體效價(jià)檢測(cè)
[0050] 按常規(guī)方法將凍存的實(shí)施例2獲得的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，培養(yǎng)，待細(xì)胞覆蓋 25ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶底50%以上時(shí)即可按照常規(guī)方法腹腔接種BALB/c小鼠，定期收集腹 水 SIPV-III。
[0051] 將脊髓灰質(zhì)炎III型疫苗原液采用0. OlM PBSl: 20稀釋，100 μ 1/孔包被酶標(biāo)板， 2-8°C過夜，檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎III型腹水SIPV-III的抗體效價(jià)，抗體效價(jià)為106,效價(jià)較高。結(jié) 果見表1。
[0052] 表1抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果
[0053]

【權(quán)利要求】
1. 一種分泌Sabin株脊髓灰質(zhì)炎III型病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其保藏編號(hào)為 CGMCC No. 9233。
2. 由權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體。
3. 權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎III型病毒抗原試劑盒中的應(yīng) 用。
4. 權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎III型病毒抗體試劑盒中的應(yīng) 用。
5. -種用于檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎III型病毒抗原的試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求2所 述的單克隆抗體。
6. -種用于檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎III型病毒抗體的試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求2所 述的單克隆抗體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，其特征在于，為經(jīng)生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記的單克 隆抗體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，其特征在于，為酶標(biāo)記的單克隆抗體。
9. 權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株在制備預(yù)防或治療脊髓灰質(zhì)炎藥物中的應(yīng)用。
10. -種制備權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株的方法，其特征在于，采用Sabin株脊髓灰 質(zhì)炎病毒III型病毒收獲液免疫小鼠，所述Sabin株脊髓灰質(zhì)炎病毒III型病毒收獲液的制備 方法為：取脊髓灰質(zhì)炎III型病毒制備的工作種子批毒種按M0I = 10?0. 05接種Vero細(xì)胞 或其他原代、傳代細(xì)胞，接種病毒時(shí)的細(xì)胞濃度為〇. 1-10x 106細(xì)胞/ml,病毒培養(yǎng)后收獲細(xì) 胞上清，即為Sabin株脊髓灰質(zhì)炎病毒III型病毒收獲液。
【文檔編號(hào)】C12N5/20GK104371980SQ201410549841
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月16日
【發(fā)明者】江志華, 童欽, 金亞明, 王欣, 程會(huì)欣, 王一丁, 姜德玉, 蔡芳, 高強(qiáng), 尹衛(wèi)東 申請(qǐng)人:北京科興生物制品有限公司