新型減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒：PV-1單-cre-X的制作方法
【專利摘要】通過將天然復(fù)制元件(cre)工程化入5’非翻譯基因組區(qū)域(位于2C(單-crePV)的編碼區(qū)中的天然ere元件失活)，和用具有減少的密碼子對(duì)偏好性的替代PI編碼區(qū)替換衣殼編碼區(qū)(PI)的全部或部分的核酸序列來產(chǎn)生新型的且穩(wěn)定的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒。穩(wěn)定的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒對(duì)于疫苗和免疫是有效的。
【專利說明】新型減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒：PV-1單-cre-X 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及新型減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒。減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒在組織培養(yǎng)中顯示優(yōu) 良的生長表型同時(shí)穩(wěn)定地維持極低的神經(jīng)毒性。因此，將減毒病毒優(yōu)選用于疫苗。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0003] 本申請(qǐng)要求2011年12月16日提交的美國申請(qǐng)No. 61/576,706(將所述申請(qǐng)通過 引用整體并入本文）的優(yōu)先權(quán)。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 脊髓灰質(zhì)炎病毒（"PV"）基因組包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)，稱為順式作用復(fù)制元件（cre)， 其為基因組復(fù)制所必需的。該ere元件位于2CATP酶蛋白的編碼區(qū)中（在P2結(jié)構(gòu)域內(nèi)）。 該環(huán)內(nèi)的特定突變導(dǎo)致無復(fù)制表型。在P2中具有失活的ere的PV基因組可通過將在其 它地方合成的ere插入PV基因組，例如5'非翻譯區(qū)（5'NTR)來恢復(fù)活性。合成的ere在 5' NTR的苜蓿葉式立體交叉與IRES之間的插入產(chǎn)生被稱為PV-1 (單-ere)的變體，其在 HeLa細(xì)胞中以野生型動(dòng)力學(xué)復(fù)制。在表達(dá)CD155的轉(zhuǎn)基因小鼠中，脊髓灰質(zhì)炎病毒受體 PV-1 (單-ere)被減毒，具有大于107個(gè)顆粒的LD5(I。然而，PV-1 (單-ere)在33°C和37°C 于Vero和MRC5細(xì)胞中生長良好。病毒對(duì)減毒作用的丟失具有抗性，因?yàn)閑re元件必須被 維持來進(jìn)行病毒復(fù)制。
[0006] 密碼子在人mRNA的開放閱讀框架中緊鄰出現(xiàn)的頻率不是在統(tǒng)計(jì)上從每一個(gè)密碼 子單獨(dú)使用的頻率所預(yù)期的。在人基因組的每一個(gè)基因中存在被過度代表的密碼子對(duì)和未 被充分代表的密碼子對(duì)。通過使用全基因組化學(xué)合成，我們已顯示未被充分代表的密碼子 對(duì)的過量減弱病毒基因的表達(dá)。此外，病毒的一個(gè)或數(shù)個(gè)0RF中的密碼子對(duì)去最優(yōu)化（相 對(duì)于過度代表的密碼子對(duì)增加未被充分代表的密碼子對(duì)）可導(dǎo)致巨大的減弱。
[0007] 我們先前已構(gòu)建了密碼子對(duì)去最優(yōu)化的脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組PV-X。在該P(yáng)V基 因組中，759nt"X"區(qū)段（衣殼結(jié)構(gòu)域的前三分之一）相較于wt PV基因組包含181個(gè)核苷 酸的變化。PV基因組的該設(shè)計(jì)不僅被減毒，而且還具有減毒的表型將因 X中的大量突變而 不回復(fù)至完全毒力的有利方面。在完整區(qū)段的背景中，單個(gè)核苷酸逆轉(zhuǎn)在表型上僅賦予極 小的差異（如果有的話）。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明提供了減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒，其在組織培養(yǎng)中顯示優(yōu)良的生長表型，同時(shí) 穩(wěn)定地維持極低的神經(jīng)毒性。本發(fā)明提供了減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組，其包含位于苜蓿 葉式立體交叉與內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)之間的5'_NTR的間隔區(qū)中的單個(gè)活性順式作 用復(fù)制元件（ere)和脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白質(zhì)編碼序列（所述脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白質(zhì)編碼序 列的密碼子對(duì)偏好性少于其所源自的親代脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白質(zhì)編碼序列的密碼子對(duì)偏 好性）。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，活性ere元件被插入在核苷酸102/103。在本發(fā)明的實(shí)施 方案中，ere元件如SEQ ID NO: 1中一樣定位。
[0010] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)編碼序列的密碼子對(duì)偏好性比親代蛋白質(zhì)編碼序 列的密碼子對(duì)偏好性少至少約0. 05,或少至少約0. 1，少至少約0. 2。在本發(fā)明的實(shí)施方案 中，蛋白質(zhì)編碼序列具有約-ο. 05或更少，或約-ο. 1或更少，或約-ο. 3或更少，或約-0. 4 或更少的密碼子對(duì)偏好性。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)編碼序列與親代病毒的蛋白質(zhì) 編碼序列具有小于90 %的同一'丨生或小于80 %的同一'丨生。
[0011] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，雖然在序列內(nèi)交換密碼子，但所得的蛋白質(zhì)編碼序列和 親代蛋白質(zhì)編碼序列編碼相同的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)序列是蛋白質(zhì)的 天然分離物的蛋白質(zhì)序列。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，編碼的蛋白質(zhì)是Mahoney株的蛋白質(zhì)。
[0012] 在某些實(shí)施方案中，減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組編碼與天然分離物相異約10個(gè) 氨基酸或更少，或約20個(gè)氨基酸或更少的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，減毒脊髓灰質(zhì)炎病 毒基因組編碼與其所源自的親代蛋白質(zhì)相異約10個(gè)氨基酸或更少或約20個(gè)氨基酸或更少 的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組包含PV_Min(SEQIDN0:2) 的從核苷酸755至核苷酸1514的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒 基因組包含SEQ ID N0:3。
[0013] 本發(fā)明提供了包含上述脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組中任一種減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒。本 發(fā)明還提供了包含這樣的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒的疫苗組合物，以及用于通過給受試者施用 有效劑量的疫苗組合物來引發(fā)受試者的免疫反應(yīng)的方法。
[0014] 本發(fā)明提供了產(chǎn)生減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的方法，其包括制備核酸序列，所 述核酸序列包含位于苜蓿葉式立體交叉與內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)之間的5'-NTR的間 隔區(qū)中的順式作用復(fù)制元件（ere)，和脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白質(zhì)編碼核苷酸序列，其具有比其 所源自的親代脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白質(zhì)編碼序列的密碼子對(duì)偏好性少的密碼子對(duì)偏好性。根 據(jù)本發(fā)明，減少的密碼子對(duì)偏好性蛋白質(zhì)編碼序列通過重排親代脊髓灰質(zhì)炎病毒核苷酸序 列的密碼子來制備。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，重排的序列編碼與親代脊髓灰質(zhì)炎病毒核苷 酸序列相同的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了將脊髓灰質(zhì)炎病毒引入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞和培養(yǎng)所述 宿主細(xì)胞以產(chǎn)生脊髓灰質(zhì)炎病毒。本發(fā)明還提供了包含這樣的重組脊髓灰質(zhì)炎病毒及其使 用說明材料的試劑盒。
[0015] 附圖簡述
[0016] 圖1.野生型PV和親代減毒PV株的基因組結(jié)構(gòu)。舉例說明了脊髓灰質(zhì)炎病毒1 型Mahoney ( "PV(M)"）和使用的嵌合病毒的基因組結(jié)構(gòu)。PVM的IRES序列以黑色顯示。 2C編碼區(qū)中的ere元件顯示為莖-環(huán)。在單-ere株中，天然ere (2C)通過其保守序列中 由〃X〃 指示的突變來滅活（Toyoda, H.，等人，Cancer Res Marchl5, 2007, 67 ;2857)。將野 生型ere的第二拷貝插入苜蓿葉式立體交叉與IRES之間。在命名為PV-X的株系中，P1編 碼區(qū)的部分（nt755-ntl513,顯示為灰色條塊）包含未被充分代表的密碼子對(duì)（Coleman，J. R.，等人，Science, 2008 年 6 月 27 日，320 (5884) : 1784-7)。
[0017] 圖2. PVM和PV-1 (單cre-X)的生長表型。在左邊舉例說明了 PVM和PV-1 (單 cre-X)的基因組結(jié)構(gòu)。將RNA轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染進(jìn)入HeLa(R19)細(xì)胞并通過噬菌斑測(cè)定在CPE滴 定獲得病毒（如果有的話）。
[0018] 圖3.單-cre-X病毒在HeLa (R19)、MRC5和293T細(xì)胞中的一步生長曲線。以0. 5 的Μ0Ι感染細(xì)胞并將其在33°C、37°C和39. 5°C下進(jìn)行溫育。通過在HeLa(R19)細(xì)胞的單層 上進(jìn)行噬菌斑測(cè)定來確定病毒滴度。
[0019] 圖4. PV(M)脊髓灰質(zhì)炎病毒、單-crePV和雙重-crePV的基因組組織。單鏈RNA在 非翻譯區(qū)（5'-NTR)的5'末端共價(jià)連接于病毒編碼的蛋白質(zhì)VPg。5'-NTR由被間隔區(qū)分隔 的兩個(gè)順式作用結(jié)構(gòu)域、苜蓿葉式立體交叉和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)組成。IRES控制 由結(jié)構(gòu)（P1)區(qū)和非結(jié)構(gòu)區(qū)（P2和P3)組成的多聚蛋白質(zhì)（空心框）的翻譯，指定了復(fù)制蛋 白質(zhì)。在2C ATPBI編碼區(qū)內(nèi)，指示了順式復(fù)制元件（ere)。3'-NTR包含雜聚區(qū)域并且被多腺苷 酸化。RNA復(fù)制需要所有三個(gè)結(jié)構(gòu)元件，苜蓿葉式立體交叉、ere和3' -NTR。將復(fù)制的ere 插入苜蓿葉式立體交叉與IRES(雙重-crePV)之間的間隔區(qū)。通過如由莖環(huán)（單-crePV) 上的X指示的突變滅活2C ATPSI中的天然ere。
[0020] 圖5.㈧確定人和病毒0RF的密碼子對(duì)偏好性。每一個(gè)點(diǎn)代表針對(duì)其長度作圖的 一個(gè)0RF的平均密碼子對(duì)分?jǐn)?shù)每密碼子對(duì)。計(jì)算14, 795個(gè)注釋的人基因的密碼子對(duì)偏好 性（CPB)。未被充分代表的密碼子對(duì)產(chǎn)生負(fù)分?jǐn)?shù)。將不同脊髓灰質(zhì)炎病毒P1構(gòu)建體（由 具有箭頭的符號(hào)代表的）的CPB作圖。圖舉例說明了大量人基因簇集在0.1周圍。顯示了 PV (M) -wt (標(biāo)記的"WT"）（-0. 02)、自定義的合成的脊髓灰質(zhì)炎病毒衣殼PV-Max (+0. 25)、 PV-Min(-〇. 48)以及 PV(M)-wt:PV-Min 嵌合衣殼 Ρν-Μ?η755-247°( ="PV-MinXY"）（-0· 31)和 PV-Min247°_3386 ( ="PV-Min Z"）（-0. 20)的CPB。（B)描繪了不同嵌合的、部分合成的脊髓灰 質(zhì)炎病毒構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)。PV-Min X在本文中也稱為PV-X。
[0021] 發(fā)明詳述
[0022] 本發(fā)明提供了高度減毒的脊髓灰質(zhì)炎病毒，其適合用于疫苗和用于治療或改善人 實(shí)體瘤例如兒童的神經(jīng)母細(xì)胞瘤。本發(fā)明的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒包含調(diào)節(jié)減毒作用的兩個(gè) 特征。一個(gè)特征是稱為順式作用復(fù)制元件（ere)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)至脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的5' 非翻譯區(qū)（5'NTR)的插入。第二特征是脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的蛋白質(zhì)編碼部分的密碼子 對(duì)偏好性的減少。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明，可使脊髓灰質(zhì)炎病毒分離株穩(wěn)定地減毒，和增強(qiáng)復(fù)制性質(zhì)。這樣的脊 髓灰質(zhì)炎病毒可以是天然存在的分離株或其衍生物。本文中例舉了脊髓灰質(zhì)炎病毒1型 (Mahoney) (PV1 (M))。神經(jīng)毒性脊髓灰質(zhì)炎病毒的其它非限定性實(shí)例包括P3/Leon/37 (減 毒沙賓（Sabin)疫苗所源自的）以及那些P3/Leon/37和Mahoney的神經(jīng)毒性衍生物。例 如，存在于減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒（例如沙賓）中的非減毒突變?cè)诒绢I(lǐng)域中與引起減毒作用 的那些突變是有區(qū)別的。其它實(shí)例為來自長期分泌疫苗來源的脊髓灰質(zhì)炎病毒的個(gè)體的脊 髓灰質(zhì)炎病毒分尚株。
[0024] Cre 至 5? NTR 的插入
[0025] 當(dāng)脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的苜蓿葉式立體交叉與IRES之間的間隔區(qū)被病毒不能 承受其缺失的必需RNA復(fù)制元件中斷時(shí)，產(chǎn)生穩(wěn)定的減毒表型。這樣的元件為ere,定位至 天然脊髓灰質(zhì)炎病毒中的病毒蛋白質(zhì)2C ATPSI的編碼區(qū)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（圖1，頂圖）。根據(jù)本 發(fā)明，在脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的5' -NTR中在導(dǎo)致病毒減毒的位置上提供單個(gè)活性ere 元件，其中將可逆轉(zhuǎn)減毒作用的元件的任何突變導(dǎo)致ere元件的失活使得脊髓灰質(zhì)炎病毒 變成不能存活的。根據(jù)本發(fā)明，將活性ere元件插入苜蓿葉式立體交叉與內(nèi)部核糖體進(jìn)入 位點(diǎn)（IRES)之間的5' -NTR的間隔區(qū)內(nèi)。在具體實(shí)施方案中，將ere元件插入在核苷酸 102/103的間隔區(qū)。這樣的ere元件的再工程化描述于美國專利8, 066, 983中，將所述美國 專利通過引用并入本文。
[0026] 應(yīng)理解，減毒的能力取決于位于5' -NTR中的為唯一活性ere元件的ere元件。 因此，位于脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的2C編碼區(qū)中的天然ere元件被滅活。通常地，存在于 編碼區(qū)中的天然ere元件的序列被突變來滅活ere元件，但不改變由ere元件的核苷酸編 碼的氨基酸。然而，導(dǎo)致保守氨基酸置換的突變是可允許的。保守氨基酸置換是利用具有 一般相似性質(zhì)（如，酸性、堿性、芳香族、尺寸、帶正電荷或帶負(fù)電荷的、極性、非極性）的氨 基酸的置換以便置換大體上不改變肽、多肽或蛋白質(zhì)特征（如，電荷、等電點(diǎn)、親和力、親合 力、構(gòu)象和溶解度）或活性。對(duì)于這樣的保守氨基酸置換可進(jìn)行的典型置換可在如下的氨 基酸的組之中：
[0027] 甘氨酸（G)、丙氨酸（A)、纈氨酸（V)、亮氨酸（L)和異亮氨酸⑴；
[0028] 天冬氨酸⑶和谷氨酸（E);
[0029] 丙氨酸（A)、絲氨酸⑶和蘇氨酸⑴；
[0030] 組氨酸⑶、賴氨酸⑷和精氨酸（R):
[0031] 天冬酰胺（N)和谷氨酰胺（Q);
[0032] 苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)和色氨酸（W)。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明，將ere元件插入苜蓿葉式立體交叉與內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES) 之間的5' -NTR，以便產(chǎn)生減毒病毒。如本文中所例舉的，將ere元件插入在PV1 (Μ)的 5'-NTR(參見SEQ ID NO: 1)的核苷酸102/103上產(chǎn)生的Nhel位點(diǎn)，但定位不必這樣精確。 可以例如通過噬菌斑測(cè)定或本領(lǐng)域已知用于測(cè)量病毒復(fù)制的其它技術(shù)來確定減毒作用。已 在幾種小核糖核酸病毒包括脊髓灰質(zhì)炎病毒1型和3型、人鼻病毒（如，HRV2和HRV14)中 鑒定ere元件。ere元件經(jīng)預(yù)測(cè)與發(fā)夾的環(huán)部分上的約14個(gè)核苷酸的保守序列形成發(fā)夾結(jié) 構(gòu)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，ere元件來自指定為PV1(M)的脊髓灰質(zhì)炎病毒1型。
[0034] 如本文中例舉的，減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒的復(fù)制性質(zhì)可通過體外和體內(nèi)傳代來增 強(qiáng)。如本文中所顯示的，突變?cè)趥鞔^程中在本發(fā)明的減毒病毒中發(fā)生，但未觀察到在被工 程化入5'-NTR的ere元件中發(fā)生。因此，病毒的減毒作用未被克服。相反地，突變提供了 增強(qiáng)有益于腫瘤的溶瘤治療的復(fù)制性質(zhì)。此外，這樣的突變是可容易獲得的。因此，本發(fā)明 提供了在5' -NTR中包含單個(gè)活性ere調(diào)控元件的穩(wěn)定地減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒。
[0035] 密碼子對(duì)偏好件
[0036] 大多數(shù)氨基酸由不止一個(gè)密碼子編碼。例如，丙氨酸由G⑶、GCC、GCA和GCG編碼。 三個(gè)氨基酸（Leu、Ser和Arg)由六個(gè)不同的密碼子編碼,然而僅Trp和Met具有唯一密碼 子。"同義"密碼子是編碼相同氨基酸的密碼子。因此，例如CUU、CUC、CUA、CUG、UUA和UUG 是編碼Leu的同義密碼子。同義密碼子不以相同的頻率使用。一般地，特定生物體中最頻 繁使用的密碼子是關(guān)聯(lián)tRNA對(duì)于所述密碼子是豐富的那些密碼子，并且這些密碼子的使 用增加蛋白質(zhì)翻譯的速率和/或準(zhǔn)確性。相反地，很少使用的密碼子的tRNA以相對(duì)低的水 平被發(fā)現(xiàn)，并且稀有密碼子的使用被認(rèn)為減小翻譯速率和/或準(zhǔn)確性。因此，用同義但不太 頻繁使用的密碼子替代核酸中給定的密碼子是將"去最優(yōu)化的"密碼子置換入核酸。
[0037]
【權(quán)利要求】
1. 一種減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組，其包含： 單個(gè)活性順式作用復(fù)制元件（ere)，所述ere元件位于苜猜葉式立體交叉與內(nèi)部核糖 體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)之間的5' -NTR的間隔區(qū)中，和 脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白質(zhì)編碼序列，所述脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白質(zhì)編碼序列的密碼子對(duì)偏 好性少于其所源自的親代脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白質(zhì)編碼序列的密碼子對(duì)偏好性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組，其包含插入在核苷酸102/103 處的單個(gè)活性ere元件。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組，其中所述ere元 件如SEQIDNO: 1中一樣定位。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組，其中所述蛋白質(zhì) 編碼序列的密碼子對(duì)偏好性比所述親代蛋白質(zhì)編碼序列的密碼子對(duì)偏好性少至少約〇. 05， 優(yōu)選少至少約0. 1，更優(yōu)選少至少約0. 2。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組，其中所述蛋白質(zhì) 編碼序列具有約05或更少，優(yōu)選約-0. 1或更少，更優(yōu)選約-0. 2或更少，更優(yōu)選約-0. 3 或更少，更優(yōu)選約4或更少的密碼子對(duì)偏好性。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組，其中所述蛋白質(zhì) 編碼序列與所述親代病毒的蛋白質(zhì)編碼序列具有小于90%的同一性，優(yōu)選小于80%的同 一性。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組，其中所述蛋白質(zhì) 編碼序列和所述親代蛋白質(zhì)編碼序列編碼相同的蛋白質(zhì)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組，其中所述親代蛋 白質(zhì)編碼序列編碼蛋白質(zhì)的天然分離物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組，其中所述親代蛋 白質(zhì)編碼序列是Mahoney株的蛋白質(zhì)編碼序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組，其中所述蛋白質(zhì) 編碼序列編碼與天然分離物相異約10個(gè)氨基酸或更少，優(yōu)選約20個(gè)氨基酸或更少的蛋白 質(zhì)。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組，其中所述修飾 的蛋白質(zhì)編碼序列包含PV_Min(SEQIDN0:2)的從核苷酸755至核苷酸1514的序列。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組，其包含 SEQIDN0:3。
13. -種減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的脊髓灰質(zhì) 炎病毒基因組。
14. 一種產(chǎn)生減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的方法，其包括： 制備核酸序列，其包含 位于所述苜蓿葉式立體交叉與內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)之間的5'-NTR的間隔區(qū)中 的順式作用復(fù)制元件（ere)，和 脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白質(zhì)編碼序列，所述脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白質(zhì)編碼序列的密碼子對(duì)偏 好性少于其所源自的親代脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白質(zhì)編碼序列的密碼子對(duì)偏好性。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中通過重排所述親代脊髓灰質(zhì)炎病毒核苷酸序列 的密碼子以獲得突變的核苷酸序列來產(chǎn)生所述減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的脊髓灰質(zhì)炎 病毒蛋白質(zhì)編碼序列，所述突變的核苷酸序列編碼與所述親代脊髓灰質(zhì)炎病毒核苷酸序列 相同的氨基酸序列。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14或15中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括將所述脊髓灰質(zhì)炎病毒引入 適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞以及培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞來產(chǎn)生所述脊髓灰質(zhì)炎病毒。
【文檔編號(hào)】C12N7/04GK104204196SQ201280066104
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月16日
【發(fā)明者】E.維默, J.塞洛, Y.劉 申請(qǐng)人:紐約州州立大學(xué)研究基金會(huì)