乙酰輔酶a衍生的類異戊二烯的生產(chǎn)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明中提供用于在宿主細(xì)胞中異源生產(chǎn)乙酰-CoA衍生的類異戊二烯的組合物和方法。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞經(jīng)遺傳修飾以包含編碼乙醛脫氫酶，?；?ADA，E.C.1.2.1.10)的異源核苷酸序列，和包含利用NADP的HMG-CoA還原酶的MEV途徑。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞經(jīng)遺傳修飾以包含編碼ADA的異源核苷酸序列和包含乙酰乙酰-CoA合酶的MEV途徑。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞還包含一種或多種編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的異源核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞還包含天然PDH旁路的功能性破壞。本文中所描述的組合物和方法為乙酰-CoA衍生的類異戊二烯的異源生產(chǎn)提供節(jié)能且氧化還原平衡的路徑。
【專利說明】乙酰輔酶A衍生的類異戊二烯的生產(chǎn)
[0001]本申請要求2011年11月9日提交的美國臨時申請N0.61/557,893的優(yōu)先權(quán)，據(jù)此通過提述完整并入其內(nèi)容。
1.發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本公開文本涉及用于在工程化宿主細(xì)胞中生產(chǎn)乙酰-CoA衍生的類異戊二烯的組合物和方法。
[0003]2.發(fā)明背景
[0004]乙酰輔酶A(乙酰-CoA)是包括聚酮化合物，脂肪酸，類異戊二烯，酚類(pheno lies),生物堿，維生素和氨基酸在內(nèi)的必需生物學(xué)化合物的合成中的關(guān)鍵中間體。在自乙酰-CoA衍生的代謝物中有初級和次級代謝物，包括有工業(yè)效用的化合物。例如，類異戊二烯用于醫(yī)藥產(chǎn)品及用作生物燃料，食品添加劑和其它專業(yè)化學(xué)藥品。類異戊二烯產(chǎn)品通常由重復(fù)的五碳異戊烯二磷酸(IPP)單元構(gòu)成，盡管不規(guī)則的類異戊二烯和多萜也有報(bào)道。在自然界中，類異戊二烯通過它們的前體IPP和它的異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的連續(xù)縮合來合成。已知這些前體的兩條途徑。除一些例外以外，原核生物通常采用脫氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途徑將丙酮酸和甘油醛3-磷酸(G3P)轉(zhuǎn)化成IPP和DMAPP。除植物以外，真核生物一般利用甲羥戊酸依賴性(MEV)途徑將乙酰-CoA轉(zhuǎn)化成ΙΡΡ,ΙΡΡ隨后異構(gòu)化成DMAPP。
[0005]單細(xì)胞真菌釀 酒酵母及其近緣生物利用兩種內(nèi)源途徑生成乙酰-CoA。一條途徑發(fā)生在線粒體基質(zhì)中，其中PDH復(fù)合物催化經(jīng)糖酵解自葡萄糖生成的丙酮酸氧化脫羧成乙酰CoA。PDH復(fù)合物由60條多肽鏈組成,24條硫辛酰胺還原酶-轉(zhuǎn)乙酰酶(Iipoamidereductase-transacetylase)鏈，12 條二氫硫辛酸脫氫酶(dihydrolipoyl dehydrogenase)鏈,和24條丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase)鏈。這種大型復(fù)合物將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA，生成NADH作為副產(chǎn)物。所得乙酰-CoA然后可以經(jīng)檸檬酸循環(huán)完全氧化成CO2和&0以產(chǎn)生能量，或者用于在線粒體中實(shí)施的生物合成反應(yīng)。
[0006]在線粒體中生成的乙酰-CoA無法穿越線粒體膜進(jìn)入胞質(zhì)溶膠。因此，為了生成重要的初級和次級代謝物的生物合成需要的胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA，釀酒酵母利用位于胞質(zhì)溶膠中稱作“PDH旁路”的一種獨(dú)立機(jī)制。這種多步驟途徑催化:(1)由丙酮酸脫羧酶(PDC，EC4.1.1.1)將丙酮酸脫羧成乙醛；(2)由乙醛脫氫酶(ACDH，ECl.2.1.5和ECl.2.1.4)將乙醛轉(zhuǎn)化成乙酸，這將一個NADP+還原成一個NADPH ;和(3)由乙酰-CoA合成酶(ACS，EC6.2.1.1)自乙酸和CoA合成乙酰-CoA，這將I個ATP水解成I個AMP，即將2個ATP水解成2個ADP的能量當(dāng)量。
[0007]由于自然界對于很多乙酰-CoA衍生的生物分子的提取僅提供低產(chǎn)率來源，因此利用經(jīng)遺傳修飾的微生物進(jìn)行的發(fā)酵生產(chǎn)已經(jīng)因它們的產(chǎn)量而成為有前景的替代方式。然而，利用天然乙酰-CoA途徑生產(chǎn)乙酰-CoA中間體具有某些限制。例如，如圖1所示，經(jīng)天然MEV途徑生產(chǎn)類異戊二烯對于生成的每個甲羥戊酸分子需要3個乙酰-CoA分子和氧化兩個NADPH。雖然PDH旁路每產(chǎn)生一個乙酰-CoA就生成一個NADPH，但是在該過程中消耗兩個ATP當(dāng)量。如此，盡管NADPH的產(chǎn)生對于天然MEV途徑的輔因子要求是有益的，但是每生成一個甲羥戊酸消耗6個ATP當(dāng)量導(dǎo)致低能效反應(yīng)，因?yàn)楸仨殞⒏嗟奶荚匆駻TP合成，例如經(jīng)TCA循環(huán)和氧化磷酸化，即以產(chǎn)物產(chǎn)率為代價。
[0008]因此，設(shè)計(jì)高效生成乙酰-CoA衍生的化合物的生產(chǎn)宿主的挑戰(zhàn)之一是優(yōu)化乙酰-CoA生成，使得ATP需求最小化，同時還滿足生物合成途徑的要求和輔因子。本文中提供的組合物和方法解決了這種需要并提供相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。
[0009]3.發(fā)明概述
[0010]本文中提供的組合物和方法提供乙酰-CoA衍生的類異戊二烯的高能效且輔因子平衡的生產(chǎn)。通過利用異源?；胰┟摎涿?也稱作“乙酰醛脫氫酶，乙酰化”，“乙酰醛脫氫酶，?；保颉癆DA” (EC1.2.1.10))作為對于乙酰-Cok的胞質(zhì)溶膠生成而言PDH旁路的替代，每生成一分子乙酰-Cok節(jié)省兩個ATP當(dāng)量。ADA將乙醛直接轉(zhuǎn)化成乙酰-Coh,不消耗ATP，并在該過程中將一個NAD+還原成一個NADH。
[0011]雖然可利用用ADA替換PDH旁路獲得的節(jié)省的ATP來獲取更高的產(chǎn)物產(chǎn)率，但是也存在與組合使用ADA與天然甲羥戊酸途徑有關(guān)的缺點(diǎn)。首先，天然PDH旁路的滅活去除了一種NADPH來源，而由ADA催化的反應(yīng)產(chǎn)生NADH。因此，用ADA替換PDH旁路在沒有進(jìn)一步途徑修飾的情況下會在消耗NADPH的類異戊二烯合成中引入氧化還原失衡。
[0012]第二，ADA催化下述可逆反應(yīng):
[0013]
乙醛 + NAD+ + 輔酶A O 乙酰-CoA + NADH + ?\
[0014]形成乙酰-CoA的天然PDH旁路反應(yīng)是熱力學(xué)上有利的，因?yàn)樵摲磻?yīng)與ATP水解成AMP偶聯(lián)。相反，ADA反應(yīng)不與ATP偶聯(lián)，而且比形成乙酰-Cok的天然PDH旁路反應(yīng)更加接近平衡得多。因而，由ADA催化的反應(yīng)具有更低的熱力學(xué)驅(qū)動力將乙醛轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA，而且在沒有進(jìn)一步途徑修飾的情況下ADA的理論能量增益可能無法實(shí)現(xiàn)。
[0015]本文中描述的組合物和方法解決了這些缺點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，為了解決用ADA替換TOH旁路引入的氧化還原失衡，經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞還在類異戊二烯途徑中利用利用NADH的酶來消耗ADA產(chǎn)生的NADH。因此，可直接利用由ADA介導(dǎo)的乙醛轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA所生成的NADH集合進(jìn)行類異戊二烯合成。在一些實(shí)施方案中，利用NADH的酶是對于類異戊二烯途徑而言非天然的酶。例如，利用NADH的酶可替換對于類異戊二烯途徑而言天然的利用NADPH的酶。在具體的實(shí)施方案中，利用NADH的酶是利用NADH將HMG-CoA轉(zhuǎn)化成甲羥戊酸的3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA還原酶(HMG-CoA還原酶)。
[0016]在一些實(shí)施方案中，為了解決ADA反應(yīng)更低的熱力學(xué)驅(qū)動力，經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞還在緊鄰乙酰-CoA的下游利用熱力學(xué)上有利的反應(yīng)作為甲羥戊酸途徑的第一步，以拉動ADA反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，由乙酰乙酰-Cok合酶(AACS ;也稱作乙酰-CoA:丙二酰-CoA?；D(zhuǎn)移酶)催化自乙酰-CoA形成乙酰乙酰-CoA。由于乙酰-CoA羧化酶生成丙二酰-CoA導(dǎo)致I個ATP的水解，因此由AACS催化的反應(yīng)比由天然甲羥戊酸途徑的乙酰-CoA硫解酶催化的反應(yīng)在熱力學(xué)上更加有利(圖5)。因此，AACS對乙酰-CoA提供更強(qiáng)的拉動來驅(qū)動ADA反應(yīng)前行。
[0017]利用異源ADA與這些修飾相組合的優(yōu)點(diǎn)的例證在于包含MEV途徑的宿主細(xì)胞中倍半萜法呢烯升高的理論產(chǎn)率。圖1和圖2中圖示了經(jīng)天然甲羥戊酸途徑的類異戊二烯生成。如圖3中指出的，如在酵母天然代謝網(wǎng)絡(luò)中發(fā)生的，當(dāng)僅利用化學(xué)反應(yīng)自葡萄糖合成胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA時，葡萄糖經(jīng)甲羥戊酸途徑轉(zhuǎn)化成法呢烯的最大可能化學(xué)計(jì)量產(chǎn)率是
23.6wt%，合成每分子法呢烯需要4.77分子葡萄糖。每分子法呢烯需要27個ATP，其中18個在經(jīng)PDH旁路自乙醛合成胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA中消耗掉。然而，如圖4中圖示的，通過將由ADA催化的反應(yīng)和利用NADH的HMG-CoA還原酶納入用于生成甲羥戊酸的代謝網(wǎng)絡(luò)，最大理論化學(xué)計(jì)量產(chǎn)率提高至25.2wt%。具體而言，在無需任何ATP輸入的情況下ADA將乙醛轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA ;這將法呢烯合成需要的ATP當(dāng)量降至9，導(dǎo)致每生成一分子法呢烯節(jié)省18個ATP當(dāng)量(2個ATP當(dāng)量/乙酰-CoAx9個乙酰-CoA/法呢烯)。乙酰-CoA生成期間ATP用量的節(jié)省消除了細(xì)胞為生成法呢烯而運(yùn)行TCA循環(huán)對氧的需求。葡萄糖轉(zhuǎn)化成法呢烯的氧需求從每個葡萄糖7.8分子O2降至6，由此降低大規(guī)模向發(fā)酵罐提供氧氣的主要生產(chǎn)成本。此外，通過共引入利用NADH的HMG-CoA還原酶(其消耗由ADA生成的NADH)減輕氧化還原失衡。
[0018]如圖4中指出的，在包含ADA和利用NADH的HMG-CoA還原酶二者的菌株中仍有化學(xué)計(jì)量上過量的ATP，其可被細(xì)胞用于維持和生長?；蛘?，通過引入乙酰乙酰-CoA合酶(AACS)，可將這些過量ATP中的一些用于改善乙酰乙酰-CoA生成的動力學(xué)。如圖5中圖示的，AACS是自丙二酰-CoA和乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA的酶。丙二酰-CoA合成每轉(zhuǎn)化I分子乙酰-Cok (由乙酰-Cok羧化酶催化)需要I個ATP的能量輸入，由此改善自乙酰-Cok合成乙酰乙酰-CoA的熱力學(xué)驅(qū)動力。重要的是，如圖6中圖示的，由于這種菌株設(shè)計(jì)中仍有可利用的過量ATP，因此這不影響自糖生成法呢烯的最大化學(xué)計(jì)量產(chǎn)率或該途徑的氧需求。
[0019]如圖7中顯示的，通過引入磷酸轉(zhuǎn)酮酶(PK)和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(PTA)可獲得額外的效率。PK和PTA催化果糖-6-磷酸(F6P)或木酮糖-5-磷酸(X5P)轉(zhuǎn)化成乙酰-Cok的反應(yīng)。憑借這些可利用 的代謝途徑，最佳時，反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)能夠達(dá)到29.8wt%的質(zhì)量產(chǎn)率或更高，即最大理論產(chǎn)率的明顯提高。這種方案涉及將碳從導(dǎo)致較少ATP和NADH生成(二者在包含ADA和利用NADH的HMG-CoA還原酶修飾的網(wǎng)絡(luò)中早就過量了)的下游糖酵解(lowerglycolysis) (G3P—丙酮酸)移開。減少通過下游糖酵解的流的一個好處是丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙醛時產(chǎn)生較少的CO2，且因此在終產(chǎn)物中捕獲更多的碳，由此提高網(wǎng)絡(luò)的最大理論產(chǎn)率。第二個好處是產(chǎn)生更少的NADH，并因此再氧化它需要顯著更少的氧。具體而言，最佳時，氧需求是每消耗I個葡萄糖僅1.84分子的氧。如圖13中圖示的，即使是在微規(guī)模的低產(chǎn)率中，也可見對ADA背景增加PK和PTA的氧化還原影響，其中甘油生成回到野生型水平。
[0020]因此，本文中提供經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞及使用它們生產(chǎn)乙酰-CoA衍生的類異戊二烯的方法。一方面，本文中提供能夠生成類異戊二烯的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包含:(a)編碼甲羥戊酸(MEV)途徑中一種或多種用于生成異戊烯焦磷酸的酶的一種或多種異源核酸；和(b)編碼?；阴Ｈ┟摎涿傅漠愒春怂帷?br> [0021]在一些實(shí)施方案中，所述MEV途徑中的一種或多種酶包括及乙酰-CoA與丙二酰-CoA縮合以形成乙酰乙酰-CoA的酶。在一些實(shí)施方案中，所述MEV途徑中的一種或多種酶包括乙酰-CoA:丙二酰-Cok?；D(zhuǎn)移酶(即乙酰乙酰-Cok合酶(AACS))。
[0022]在一些實(shí)施方案中，所述MEV途徑中的一種或多種酶包括將HMG-CoA轉(zhuǎn)化成甲羥戊酸的利用NADH的酶。在一些實(shí)施方案中，所述MEV途徑中的一種或多種酶包括利用NADH的HMG-CoA還原酶。
[0023]在一些實(shí)施方案中，所述經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞還包含編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶(phosphoketolase)的異源核酸。在一些實(shí)施方案中，所述經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞還包含編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(phosphotransacetylase)的異源核酸。
[0024]在一些實(shí)施方案中，所述ADA的氨基酸序列與SEQ ID NO: 2至少80%同一。在一些實(shí)施方案中，所述乙酰-CoA:丙二酰-CoA酰基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列與SEQ ID NO: 16至少80%同一。在一些實(shí)施方案中，所述利用NADH的HMG-CoA還原酶的氨基酸序列與SEQ IDNO:20至少80%同一。在一些實(shí)施方案中，所述磷酸轉(zhuǎn)酮酶的氨基酸序列與SEQ ID NO: 12至少80%同一。在一些實(shí)施方案中，所述磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的氨基酸序列與SEQ ID NO: 14至少80% 同一。
[0025]在一些實(shí)施方案中，所述經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞還包含天然丙酮酸脫氫酶(TOH)旁路中一種或多種酶的功能性破壞。在一些實(shí)施方案中，所述PDH旁路中的一種或多種酶選自乙酰-CoA合酶I (ACSl)，乙酰-Cok合酶2 (ACS2)，和醛脫氫酶6 (ALD6)。在一些實(shí)施方案中，ACSl是功能性破壞的。在一些實(shí)施方案中，ACS2是功能性破壞的。在一些實(shí)施方案中，ALD6是功能性破壞的。在一些實(shí)施方案中，ACSl和ACS2是功能性破壞的。在一些實(shí)施方案中，ACSl，ACS2和ALD6是功能性破壞的。
[0026]在一些實(shí)施方案中，所述經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞還包含一種或多種具有醇脫氫酶(ADH)活性的酶的功能性破壞。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種具有ADH活性的酶選自醇脫氫酶I (ADHl)，醇脫氫酶3 (ADH3)，醇脫氫酶4 (ADH4)，和醇脫氫酶5 (ADH5)。 [0027]在一些實(shí)施方案中，所述MEV途徑中的一種或多種酶包括將兩分子乙酰-CoA縮合以形成乙酰乙酰-CoA的酶。在一些實(shí)施方案中，所述MEV途徑中的一種或多種酶包括將乙酰乙酰-CoA與乙酰-Cok縮合以形成HMG-CoA的酶。在一些實(shí)施方案中，所述MEV途徑中的一種或多種酶包括將HMG-CoA轉(zhuǎn)化成甲羥戊酸的酶。在一些實(shí)施方案中，所述MEV途徑中的一種或多種酶包括將甲羥戊酸磷酸化成甲羥戊酸5-磷酸的酶。在一些實(shí)施方案中，所述MEV途徑中的一種或多種酶包括將甲羥戊酸5-磷酸轉(zhuǎn)化成甲羥戊酸5-焦磷酸的酶。在一些實(shí)施方案中，所述MEV途徑中的一種或多種酶包括將甲羥戊酸5-焦磷酸轉(zhuǎn)化成異戊烯焦磷酸的酶。在一些實(shí)施方案中，所述MEV途徑中的一種或多種酶選自HMG-CoA合酶，甲羥戊酸激酶，磷酸甲羥戊酸激酶和甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶。
[0028]在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞包含編碼MEV途徑中所有酶的眾多異源核酸。在一些實(shí)施方案中，所述編碼MEV途徑中一種或多種酶的一種或多種異源核酸在一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的控制下。在一些實(shí)施方案中，所述編碼MEV途徑中一種或多種酶的一種或多種異源核酸在多種異源轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的控制下。
[0029]在一些實(shí)施方案中，所述經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞還包含編碼能將異戊烯焦磷酸(IPP)轉(zhuǎn)化成二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的酶的異源核酸。在一些實(shí)施方案中，所述經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞還包含編碼能縮合IPP和/或DMAPP分子以形成聚異戊二烯(polyprenyl)化合物的酶的異源核酸。在一些實(shí)施方案中，所述經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞還包含編碼能修飾IPP或聚異戊二烯以形成類異戊二烯化合物的酶的異源核酸。在一些實(shí)施方案中，所述能修飾IPP或聚異戊二烯以形成類異戊二烯化合物的酶選自下組:蒈烯(carene)合酶，牦牛兒醇(geran1l)合酶，芳樟醇(Iinalool)合酶，朽1檬烯(Iimonene)合酶，香葉烯(myrcene)合酶,羅勒烯(ocimene)合酶，α -菔烯(pinene)合酶，β -菔烯合酶，Y-職品烯(terpinene)合酶,職品油烯(terpinolene)合酶,紫穗槐雙烯(amorphadiene)合酶，α-法呢烯(farnesene)合酶，β_法呢烯合酶,法尼醇(farnesol)合酶,橙花叔醇(nerolidol)合酶，廣藿香醇(patchoul1l)合酶，諾卡酮(nootkatone)合酶和松香雙烯(abietadiene)合酶。在一些實(shí)施方案中，所述類異戍二烯選自下組:半職，單職，雙職，三萜，四萜，倍半萜，和多萜。在一些實(shí)施方案中，所述類異戊二烯是C5-C2tl類異戊二烯。在一些實(shí)施方案中，所述類異戊二烯選自下組:松香雙烯，紫穗槐雙烯，蒈烯，α-法呢烯，β-法呢烯，法尼醇，牦牛兒醇，牦牛兒基牦牛兒醇(geranylgeranitol),異戍二烯(isoprene),芳樟醇，朽1檬烯，香葉烯，橙花叔醇，羅勒烯，廣藿香醇，β-菔烯，香檜烯(sabinene), Y -品烯,職品油烯和瓦倫烯(valencene)。
[0030]在一些實(shí)施方案中，所述經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述酵母是釀酒酵母。
[0031]另一方面，本文中提供能夠生成類異戊二烯的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包含:(a)編碼甲羥戊酸(MEV)途徑中一種或多種用于生成異戊烯焦磷酸的酶的一種或多種異源核酸；(b)編碼乙酰醛脫氫酶，?；?(ADA)的異源核酸；(c)天然TOH旁路中至少一種選自乙酰-Cok合酶I (ACSl)，乙酰-Cok合酶2 (ACS2)，和醛脫氫酶6 (ALD6)的酶的功能性破壞；(d)編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶(PK)的異源核酸；和(e)編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶(PTA)的異源核酸。
[0032]另一方面，本文中提供能夠生成類異戊二烯的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包含:(a)編碼甲羥戊酸(MEV)途徑中一種或多種用于生成異戊烯焦磷酸的酶的一種或多種異源核酸，其中該一種或多種酶包括利用NADH的HMG-CoA還原酶；(b)編碼乙酰醛脫氫酶，酰化(ADA)的異源核酸；和(c)天然PDH旁路中至少一種選自乙酰-CoA合酶I (ACSl)，乙酰-Cok合酶2 (ACS2)，和醛脫氫酶6 (ALD6)的酶的功能性破壞。
[0033]另一方面，本文中提供能夠生成類異戊二烯的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包含:(a)編碼甲羥戊酸(MEV)途徑中一種或多種用于生成異戊烯焦磷酸的酶的一種或多種異源核酸，其中該一種或多種酶包括利用NADH的HMG-CoA還原酶；(b)編碼乙酰醛脫氫酶，?；?ADA)的異源核酸；(c)天然PDH旁路中至少一種選自乙酰-CoA合酶I (ACSl)，乙酰-CoA合酶2 (ACS2)，和醛脫氫酶6 (ALD6)的酶的功能性破壞；(d)編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶(PK)的異源核酸；和(e)編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶(PTA)的異源核酸。
[0034]另一方面，本文中提供能夠生成類異戊二烯的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包含:(a)編碼甲羥戊酸(MEV)途徑中一種或多種用于生成異戊烯焦磷酸的酶的一種或多種異源核酸，其中該一種或多種酶包括乙酰-CoA:丙二酰-CoA?；D(zhuǎn)移酶；(b)編碼乙酰醛脫氫酶，?；?ADA)的異源核酸；和(c)天然PDH旁路中至少一種選自乙酰-CoA合酶I (ACSl)，乙酰-Cok合酶2 (ACS2)，和醛脫氫酶6 (ALD6)的酶的功能性破壞。
[0035]另一方面，本文中提供能夠生成類異戊二烯的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包含:(a)編碼甲羥戊酸(MEV)途徑中眾多用于生成異戊烯焦磷酸的酶的一種或多種異源核酸，其中該眾多酶包括乙酰-CoA:丙二酰-Cok酰基轉(zhuǎn)移酶和利用NADH的HMG-CoA還原酶；(b)編碼乙酰醛脫氫酶，?；?ADA)的異源核酸；(c)天然PDH旁路中至少一種選自乙酰-CoA合酶I (ACSl)，乙酰-CoA合酶2 (ACS2)，和醛脫氫酶6 (ALD6)的酶的功能性破壞；(d)編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶(PK)的異源核酸；和(e)編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶(PTA)的異源核酸。[0036]另一方面，本文中提供生產(chǎn)類異戊二烯的方法，該方法包括:(a)在適于生成所述類異戊二烯化合物的條件下在含碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本文中描述的經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞的群體；并(b)自培養(yǎng)基回收所述類異戊二烯化合物。
[0037]4.附圖簡述
[0038]圖1提供用于生成異戊烯二磷酸(“IPP”)的甲羥戊酸(“MEV”)途徑的示意圖。
[0039]圖2提供將IPP和二甲基烯丙基焦磷酸(“DMAPP”)轉(zhuǎn)化成牦牛兒基焦磷酸(“GPP”)，法呢基焦磷酸(“FPP”)和牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸(“GGPP”)的示意圖。
[0040]圖3提供經(jīng)甲羥戊酸途徑葡萄糖轉(zhuǎn)化成法呢烯中的最佳碳流，代謝需求和產(chǎn)率的示意圖，其中經(jīng)“野生型”PDH旁路生成胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA。
[0041]圖4提供經(jīng)甲羥戊酸途徑葡萄糖轉(zhuǎn)化成法呢烯中的最佳碳流，代謝需求和產(chǎn)率的示意圖，其中經(jīng)ADA生成胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA，且甲羥戊酸途徑包含利用NADH的HMGr，代替利用 NADPH 的 HMGr。
[0042]圖5提供自乙酰-CoA生成法呢烯的示意圖，其中由乙酰乙酰-CoA合酶(AACS)自丙二酰-CoA和乙酰-CoA (AcCoA)合成乙酰乙酰-CoA (AcAcCoA)。丙二酰-CoA合成每轉(zhuǎn)化I分子乙酰-CoA(由乙酰-Cok羧化酶(ACCl)催化)需要IATP的能量輸入。
[0043]圖6提供經(jīng)甲羥戊酸途徑葡萄糖轉(zhuǎn)化成法呢烯中的最佳碳流，代謝需求和產(chǎn)率的示意圖，其中經(jīng)ADA生成胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA，甲羥戊酸途徑包含利用NADH的HMGr，代替理由NADPH的HMGr，且由乙酰乙酰-CoA合酶自丙二酰-CoA和乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA。 [0044]圖7提供在經(jīng)甲羥戊酸途徑葡萄糖轉(zhuǎn)化成法呢烯中的最佳碳流，代謝需求和產(chǎn)率的示意圖，其中經(jīng)ADA生成胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA，甲羥戊酸途徑包含利用NADH的HMGr，代替利用NADPH的HMGr，且磷酸轉(zhuǎn)酮酶(PK)和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(PTA)催化果糖_6_磷酸(F6P)轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA的反應(yīng)
[0045]圖8 提供來自釀酒酵母(Sc.tHMG-CoA 還原酶),Pseudomonas mevalonii (Pm.),食酸戴爾福特菌(Delftia acidovorans) (Da.)和 Silicibacter pomeroyi (Sp.)的羥基甲基戊二酰-CoA還原酶的NADPH特異性或NADH特異性活性(以nmol/mg/min測量)。
[0046]圖9提供分別在野生型ADHl和ADHl敲除(adhl Δ )背景中包含異源MevT途徑的釀酒酵母(Sc.)菌株在24和48小時后的細(xì)胞密度(以0D_測量)，該MevT途徑包含利用NADPH的HMG-CoA還原酶(Sc.tHMG-CoA還原酶)或利用NADH的HMG-CoA還原酶(Pm.—Pseudomonas mevalonii ；Da.—食酸戴爾福特菌；Sp.—Silicibacter pomeroyi)。
[0047]圖10提供在野生型ADHl和ADHl敲除二者背景中包含異源MevT途徑的釀酒酵母(Sc.)菌株在24和48小時后的甘油產(chǎn)量(以g/L測量)，該MevT途徑包含利用NADPH的HMG-CoA 還原酶(Sc.tHMG-CoA 還原酶)或利用 NADH 的 HMG-CoA 還原酶(Pm.-Pseudomonasmevalonii ；Da.—食酸戴爾福特菌；Sp.—Silicibacter pomeroyi)。
[0048]圖11提供在野生型ADHl和ADHl敲除(adhl Δ ) 二者背景中包含利用NADPH的HMG-CoA 還原酶(Sc.tHMG-CoA 還原酶)或利用 NADH 的 HMG-CoA 還原酶(Pm.-Pseudomonasmevalonii ；Da.—食酸戴爾福特菌；Sp.—Silicibacter pomeroyi)的釀酒酵母(Sc.)菌株在24和48小時后的甲羥戊酸產(chǎn)量(以g/L測量)。
[0049]圖12提供釀酒酵母菌株的法呢烯產(chǎn)量和細(xì)胞密度，該釀酒酵母菌株包含:(A)與acsl Δ acs2 Δ ald6 Δ偶聯(lián)的異源表達(dá)的ADA (Dz.eutE)和包含利用NADPH的HMG-CoA還原酶或利用NADH的HMG-CoA還原酶任一的MEV途徑；(B)完整(野生型)PDH旁路和包含利用NADPH的HMG-CoA還原酶或利用NADH的HMG-CoA還原酶任一的MEV途徑。標(biāo)示為“空白”的柱代表只有培養(yǎng)基(沒有細(xì)胞)的孔。
[0050]圖13提供(A)野生型菌株(Y968);異源表達(dá)ADA (Dz.eutE)的菌株(Y12869);和(B)異源表達(dá)ADA (Dz.eutE)，磷酸轉(zhuǎn)酮酶(PK)和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(PTA)的菌株(Y12745)的甘油產(chǎn)量(頂部小圖)和葡萄糖消耗(下部小圖)。
[0051]圖14提供包含完整(野生型)PDH旁路或與acslAacs2Aald6A偶聯(lián)的異源表達(dá)的ADA (Dz.eutE);和包含ERGlO (乙酰-CoA硫解酶)或nphT7 (乙酰乙酰-CoA合酶)的MEV途徑任一的釀酒酵母菌株的甲羥戊酸產(chǎn)量。
[0052]5.發(fā)明詳述
[0053]5.1 術(shù)語
[0054]如本文中使用的，術(shù)語“異源”指正常情況下在自然界中找不到的。術(shù)語“異源核苷酸序列”指正常情況下在自然界中在給定細(xì)胞中找不到的核苷酸序列。因而，異源核苷酸序列可以是:(a)對其宿主細(xì)胞而目是外來的(即對細(xì)胞而目是“外源”的)；(b)在宿主細(xì)胞中天然發(fā)現(xiàn)的(即“內(nèi)源”的)但在細(xì)胞中以非天然數(shù)量存在的(即高于或低于在宿主細(xì)胞中天然發(fā)現(xiàn)的數(shù)量)；或(C)在宿主細(xì)胞中天然發(fā)現(xiàn)的但定位于其天然基因座以外的。術(shù)語“異源酶”指正常情況下在自然界中在給定細(xì)胞中找不到的酶。該術(shù)語涵蓋如下的酶:(a)對給定細(xì)胞而言是外源的(即由非天然存在于宿主細(xì)胞中或非天然存在于宿主細(xì)胞中的給定背景(context)中的核苷酸序列編碼)；和(b)在宿主細(xì)胞中天然發(fā)現(xiàn)的(例如該酶由對細(xì)胞而言內(nèi)源的核苷酸序列編碼)但在宿主細(xì)胞中以非天然量生成(例如高于或低于天然發(fā)現(xiàn)的量)。
[0055]另一方面，如本文中關(guān)于分子(特別是酶和核酸)使用的術(shù)語“天然”或“內(nèi)源”指在它們的起源生物或在自然界中發(fā)現(xiàn)它們的生物中表達(dá)的分子，與表達(dá)水平無關(guān)，表達(dá)水平可以低于，等于或高于該分子在天然微生物中的表達(dá)水平。應(yīng)當(dāng)理解，在重組微生物中天然酶或多核苷酸的表達(dá)可被修飾。
[0056]如本文中使用的，例如靶基因(例如PDH旁路的一種或多種基因)的“功能性破壞”表示改變靶基因從而降低由該靶基因編碼的蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中的活性。類似地，例如靶蛋白質(zhì)(例如PDH旁路的一種或多種酶)的“功能性破壞”表示改變靶蛋白質(zhì)從而降低該蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中的活性。在一些實(shí)施方案中，在宿主細(xì)胞中消除由靶基因編碼的靶蛋白質(zhì)的活性。在其它實(shí)施方案中，在宿主細(xì)胞中降低由靶基因編碼的靶蛋白質(zhì)的活性。靶基因的功能性破壞可通過刪除整個或部分基因，從而消除或降低基因表達(dá)或者消除或降低基因產(chǎn)物的活性來實(shí)現(xiàn)。靶基因的功能性破壞也可以通過突變該基因的調(diào)節(jié)元件(例如該基因的啟動子)，由此消除或降低表達(dá)或者通過突變該基因的編碼序列，由此消除或降低基因產(chǎn)物的活性來實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，靶基因的功能性破壞導(dǎo)致靶基因的可讀框整個去除。
[0057] 如本文中使用的，術(shù)語“親本細(xì)胞”指如下的細(xì)胞，它與本文中公開的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞具有同樣的遺傳背景，只是不包含工程化改造入經(jīng)修飾宿主細(xì)胞中的一種或多種特定遺傳修飾，例如一種或多種選自下組的修飾=ADA的異源表達(dá)，利用NADH的HMG-CoA還原酶的異源表達(dá)，AACS的異源表達(dá)，磷酸轉(zhuǎn)酮酶的異源表達(dá)，磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的異源表達(dá)，和甲羥戊酸途徑的一種或多種酶的異源表達(dá)。
[0058]如本文中使用的，術(shù)語“產(chǎn)量”一般指由本文中提供的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞生成的類異戊二烯的量。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)量表述為宿主細(xì)胞的類異戊二烯產(chǎn)率。在其它實(shí)施方案中，產(chǎn)量表述為宿主細(xì)胞生成類異戊二烯的生產(chǎn)力。
[0059]如本文中使用的，術(shù)語“生產(chǎn)力”指宿主細(xì)胞的類異戊二烯產(chǎn)量，表述為隨時間的推移(每小時)每份量的培養(yǎng)宿主細(xì)胞的發(fā)酵液(以體積計(jì))中所生成的類異戊二烯的量(以重量計(jì))。
[0060]如本文中使用的，術(shù)語“產(chǎn)率”指宿主細(xì)胞的類異戊二烯產(chǎn)量，表述為宿主細(xì)胞消耗每份量的碳源生成的類異戊二烯的量，以重量計(jì)。
[0061]5.2生成乙酰-CoA衍生的類異戊二烯的經(jīng)遺傳修飾的微生物
[0062]5.2.1宿主細(xì)胞
[0063]在本文中提供的組合物和方法中有用的宿主細(xì)胞包括古細(xì)菌(archae)，原核或真核細(xì)胞。
[0064]合適的原核宿主包括但不限于多種革蘭氏陽性，革蘭氏陰性或是革蘭氏可變性細(xì)菌任一。例子包括但不限于屬于下述屬的細(xì)胞:土壤桿菌屬(Agrobacterium)，脂環(huán)酸桿菌屬(Alicyclobacillus)，魚腥藍(lán)細(xì)菌屬(Anabaena)，組囊藍(lán)細(xì)菌屬(Anacystis)，節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)，固氮 菌屬(Azobacter，Azotobacter)，芽抱桿菌屬(Bacillus)，短桿菌屬(Brevibacterium)，著色菌屬(Chromatium)，梭菌屬(Clostridium),棒桿菌屬(Corynebacterium)，腸桿菌屬(Enterobacter)，歐文氏菌屬(Erwinia)，埃希氏菌屬(Escherichia)，乳桿菌屬(Lactobacillus)，乳球菌屬(Lactococcus)，Mesorhizobium,甲基桿菌屬(Methylobacterium)，微桿菌屬(Microbacterium)，席藍(lán)細(xì)菌屬(Phormidium)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)，紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)，紅螺菌屬(Rhodospirillum)，紅球菌屬(Rhodococcus)，沙門氏菌屬(Salmonella)，Scenedesmun，沙雷氏菌屬(Serratia)，志賀氏菌屬(Shigella)，葡萄球菌屬(Staphlococcus)，鏈霉菌屬(Strepromyces，Streptomyces)，Synnecoccus，和發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)。原核菌株的例子包括但不限于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefacines)，產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacteriumammoniagenes)，嗜氨短桿菌(Brevibacterium immar1philum, Brevibacteriumimmar1philum)，拜氏梭菌(Clostridium beigerinckii)，Enterobacter sakazakii，大腸桿菌(即大腸埃希氏菌)(Escherichia coli)，乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)，Mesorhizobium 1ti，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，Pseudomonas mevalonii,惡臭假單胞菌(Pseudomonas pudica，Pseudomonas putida),莢膜紅細(xì)菌(Rhodobactercapsulatus)，類球紅球菌(Rhodobacter sphaeroides)，深紅紅螺菌(Rhodospirillumrubrum)，腸沙門氏菌(Salmonella enterica)，傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)，痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)，弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)，索氏志賀氏菌(Shigella sonnei)，和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。在一個具體的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
[0065]合適的古細(xì)菌宿主包括但不限于屬于下述屬的細(xì)胞:Aeropyrum，古生球菌屬(Archaeglobus)，鹽桿菌屬(Halobacterium)，甲焼球菌屬(Methanococcus)，甲焼桿菌4.+ Vs.ι \._..，.' CV' E W卜 J O1- \ ，.，C / E
迴夠乂 s3ST30umldfns)掛氍撇腰乂 T3TEJOP^PT3doJods)掛氍tetHJl^lp (SsAEoJOqOJOdS)掛勸迴S.(g^o-Qsp^oag)掛勸迴SΦ 翁.(SSAEOIUU 目 IPS)掛勸遲街朱.(ss7clucapLP3psoz*rHLPS)Φ勸聽潮藤.(uo*rH.xodsopsp1-Hqoz*rHLPS)Φ勸撕藤 Sjodsolxxnq^s
hcdlllou^cdicds hcd1-H1-Ho〇p*rHcd§ h (SISdoohmoiHcdlloocdg) Φ ^ ^ ^ h (sopoohsoiHcdnoocds)敢
餘銶.(SSAEOJT31P3T3S) # 勸盤* (13JnJCnOPOHe 掛勸 Hf ~ (EnJPJJOdsopone 掛勸迴^^H^03TMOTd)掛勸墘Sf乂 1--?)Φ勸閨擗胺乂13 JOds Oip ItlPmM) #勸迴瑯?乂 §J0S^CH3J)掛勸撇駟^EnjpJJOdSOO)掛勸迴?^ω?ιο 乂 T3Jodsopl8s掛勸迴41 乂 T3JUOSPT3SΦ勸 SI iASXAS -T33T3JS乂131 Mod Utp S P①S#餘取體SJZassT3JT3s* (SSAEOJaPPOq)Φ氍.蘇 * (SSAEOdJq)Φ氍惡菊 * (EnjpJJOdSOOnaq)& 勸^嶺(635 S ①oVOUOUcdUIZPiHnM hcd*rHns*lHcdiHnM hcdOPUOM.(8Θο7αυο?ΗΘΛΝηΙ-ΗΜ)掛勸繳 _ 傾SJOdS^X①勻① οι-ημ ?οΘΟΙ-ΗΜ)掛勸傾赫傾^p^slpssshh)掛勸?取 GILPIdOHd^1.(suoscdouuofl) Φ ^ ^ hcdluupulxop1-Hofl hcdocdMcdgoscdfl IpluUOSUPf1.(cdiHodscdluosucdfl)
&勸?髟迴伸.03II1!TT9e # 勸徘，f/.(Εηιρ?ροΘο)It?h (luu*rHp*rHscdqo1-H*rHh) ft ^ ^ ^ h s oohluo1-H1-Hoh h UIUIPIScdqoiHnp Ν?ΗωιεηιοΘιιροεΘ?ΗωhsuoscdluoiHW.(Τ3Π ① sd8AEOPUB0 0, (enaiB# 勸軺螞酬 Isnospods 5 Jsd8ST3pods乂 13.ΙΤ3?β 掛氍傾働Nv-^SSAEOAJeqae 掛氍屆aj働^EnJPJSeqo^o+Js^乂 sn880+JSJ3)煙.(Iasis掛勸迴#~ (SSAEOJfnIS掛勸撇畫~ 03ρ?ρ§3)掛勸劃篳ISSAEOJan 口 a.(SaJJng)掛氍截截踩柜 * (SSAEOUTnPaJS 掛氍稱藤 iAZ0AJ40g
hsnoscd〇hJ4〇g hcd*rH u〇p^ou*rHsuog hcdJAOf qcdg hcdhqusv hcdluhz〇*rHxiHv h (snoscdoiHnpiHV) Φ ^ M fcn.乂！zolsolv)Φ勸?# 乂E5PTU80T3PV)掛勸迴肽 44"掛勸軺1|閎?-^1|￥ (渺
8XVoh袞孽)鏨運(yùn)饅雄蓉胡寒屮饅雄舊靼坻掛勸軺旺蚺蛋想柃將坩~蛋膽柃輯鋱.1
坩。駕親蓉鵯蔣駕親鉺駕親銶擁*駕親細(xì)?屮隍艮1>?坻州蜱逛?軺腳傘 〔9900〕





OXJUJaa SnJAaOJay QtlJSSAqO snooooOJAJ
*I Jiisosjjoh SnoOOOOJAJ ~ (EnJUcd3JOA.cdEscdJaoEfHanx) ^ M- ^ ~ (Sn JJlIaOP JocdIST3a0EJanx)拉l?^ll_.(E3JndoJ40+JnT30EJai EnJJacpeqoue1s細(xì)H-ligfr^皿轅
*(I Jtpscduucdf Snoooooucdn+Jos) ft fr 53 (.aGOE=iJfH0+J3cdq0Jcdx) J^H-1# ^ (snp J&cJnJ
snqoj&coompjv)細(xì)莆胡扣毀s=l.隍^1>?坻^孽軺奪細(xì)細(xì)親扣。(Isejdouu①lu)11拉?恭蔣乂 SnqOJOJJnS)11細(xì)左芝握乂 Sn880j^)11細(xì)翁-^乂 EnlJa:PT3qoum^as11
罔9寸/6 f ? S V寸Ζ66ε〇寸OT Zopolymorpha)(現(xiàn)稱為Pichia angusta)。在一些實(shí)施方案中，所述宿主微生物是假絲酵母屬諸如解脂假絲酵母(Candida lipolytica),季也蒙氏假絲酵母(Candida guilliermondii),克魯斯氏假絲酵母(Candida krusei),假熱帶假絲酵母(Candidapseudotropicalis),或產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)的菌株。
[0068]在一個具體的實(shí)施方案中，所述宿主微生物是釀酒酵母。在一些實(shí)施方案中，所述宿主是選自下組的釀酒酵母菌株:面包酵母(Baker’s yeast)，CBS7959，CBS7960，CBS7961，CBS7962, CBS7963, CBS7964, IZ-1904，TA, BG-1，CR-1，SA-1, M-26, Y-904, PE-2, PE-5, VR-1,BR-1，BR-2，ME-2，VR-2，MA-3，MA-4，CAT-1，CB-1，NR-1，BT-1，和 AL-1。在一些實(shí)施方案中，所述宿主是選自下組的釀酒酵母菌株:PE-2，CAT-1, VR-1, BG-1, CR-1，和SA-1。在一個具體的實(shí)施方案中，所述釀酒酵母菌株是PE-2。在另一個具體的實(shí)施方案中，所述釀酒酵母菌株是CAT-1。在另一個具體的實(shí)施方案中，所述釀酒酵母菌株是BG-1。
[0069]在一些實(shí)施方案中，所述宿主微生物是適合于工業(yè)發(fā)酵的微生物。在具體的實(shí)施方案中，所述微生物進(jìn)行條件化以在高溶劑濃度，高溫，擴(kuò)展的底物利用，營養(yǎng)物限制，糖和鹽所致滲透應(yīng)激，酸度，亞硫酸鹽和細(xì)菌污染，或其組合下存活，它們是公認(rèn)的工業(yè)發(fā)酵環(huán)境的應(yīng)激條件
[0070]5.2.2用于乙酰-CoA生產(chǎn)的異源ADA
[0071]一方面，本文中提供能夠生成乙酰-CoA衍生的類異戊二烯的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包含一種或多種編碼?；胰┟摎涿?也稱作“乙酰醛脫氫酶，乙?；保耙阴Ｈ┟摎涿?，酰化”，或ADA (EC1.2.1.10))的異源核苷酸序列。
[0072]對本文中提供的組合物和方法有用的能夠催化這種反應(yīng)的蛋白質(zhì)包括下述四種類型的蛋白質(zhì):
[0073](I)催化乙酰-CoA可逆轉(zhuǎn)化成乙醛，及隨后乙醛可逆轉(zhuǎn)化成乙醇的雙功能蛋白質(zhì)。這種類型的蛋白質(zhì)的一個例子是大腸桿菌中的AdhE蛋白(GenBank No:NP_415757)。AdhE看來是基因融合的進(jìn)化產(chǎn)物。AdhE蛋白的NH2末端區(qū)域與醛:NAD+氧化還原酶高度同源，而COOH末端區(qū)域與Fe2+依賴性乙醇:NAD+氧化還原酶同源(Membrillo-Hernandez etal.，(2000) J.B1l.Chem.275:33869-33875)。大腸桿菌AdhE經(jīng)受金屬催化的氧化，因此對氧敏感(Tamarit et al.(1998) J.B1l.Chem.273:3027-32)。
[0074](2)在嚴(yán)格或兼性厭氧微生物中催化乙酰-Cok可逆轉(zhuǎn)化成但不擁有醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。已經(jīng)報(bào)告了克氏梭菌(Clostridiumkluyveri)中這種類型蛋白質(zhì)的一個例子(Smith et al.(1980) Arch.B1chem.B1phys.203:663-675)。已經(jīng)在克氏梭菌 DSM555 的基因組中注釋了 ADA(登錄號:EDK33116)。在植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的基因組中鑒定出同源蛋白AcdH(登錄號:NP_784141)。這種類型蛋白質(zhì)的另一個例子是拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii) NRRL B593 中的 aid 基因產(chǎn)物(Toth et al.(1999) Appl.Environ.Microb1l.65:4973-4980，登錄號:AAD31841)。
[0075](3)參與乙醇胺分解代謝的蛋白質(zhì)。乙醇胺可作為碳源和氮源二者被許多腸細(xì)菌利用(Stojiljkovic et al.(1995) J.Bacter1l.177:1357-1366)。首先乙醇胺氨裂合酶將乙醇胺轉(zhuǎn)化成氨和乙醒，隨后ADA將乙醛轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA。這種類型的ADA的一個例子是鼠傷寒沙門氏菌中的 EutE 蛋白(Stojiljkovic et al.(1995) J.Bacter1l.177:1357-1366，登錄號:AAL21357 ;還可參見U18560.1)。大腸桿菌也能夠利用乙醇胺(Scarlett etal.(1976) J.Gen.Microb1l.95:173-176)且具有與鼠傷寒沙門氏菌中的EutE蛋白同源的EutE蛋白(登錄號:AAG57564 ;還可參見EU897722.1)。
[0076](4)作為參與4-羥基-2-酮基戊酸鹽分解代謝的雙功能醛縮酶-脫氫酶復(fù)合物的一部分的蛋白質(zhì)。此類雙功能酶催化兒茶酚間位切割途徑的最后兩步，兒茶酚是多種細(xì)菌物種中降解酚，甲苯酸酯(toluates)，萘，聯(lián)苯和其它芳香族化合物的中間產(chǎn)物(Powlowski and Shingler(1994)B1degradat1n5, 219-236)。首先 4-羥基 ~2~ 酮基戍酸鹽醛縮酶將4-羥基-2-酮基戊酸鹽轉(zhuǎn)化成丙酮酸和乙醛，隨后ADA將乙醛轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA0這種類型的ADA的一個例子是假單胞菌(Pseudomonas sp.) CF600中的DmpF蛋白(登錄號:CAA43226) (Shingler et al.(1992) J.Bacter1l.174:711-24)。大腸桿菌具有與假單胞菌CF600中的DmpF蛋白同源的MphF蛋白(Ferrandez et al.(1997)J.Bacter1l.179:2573-2581，登錄號:NP_414885)。
[0077]在一些實(shí)施方案中，對本文中描述的組合物和方法有用的ADA(或編碼此類活性的核酸序列)選自下組:大腸桿菌adhE, Entamoeba histolytica adh2,金黃色葡萄球菌adhE, Piromyces sp.E2adhE,克氏梭菌(EDK33116),植物乳桿菌acdH,和惡臭假單胞菌(YP001268189)，如記載于國際公 開文本號W02009/013159，通過提述完整收錄其內(nèi)容。在一些實(shí)施方案中，ADA 選自下組:肉毒梭菌(Clostridium botulinum) eutE (FR745875.1)，Desulfotalea psychrophila eutE(CR522870.1),不動桿菌(Acinetobacter sp.)HBS-2eutE (ABQ44511.2), Caldithrix abyssi eutE(ZP_09549576),和 Halorubrumlacusprofundi ATCC49239 (YP_002565337.1)。
[0078]在具體的實(shí)施方案中，對本文中提供的組合物和方法有用的ADA是來自Dickeya zeae的eutE。Dickeya zeae的一種代表性eutE核苷酸序列包括登錄號NC_012912.1:1110476..1111855 和如本文中提供的 SEQ ID NO:1。Dickeya zeae 的一種代表性eutE蛋白質(zhì)序列包括登錄號YP_003003316和如本文中提供的SEQ ID NO: 2。
[0079]在本文中提供的組合物和方法中有用的ADA還包括那些據(jù)說是本文中描述的任何ADA的“衍生物”的分子。此類“衍生物”具有下述特征:(I)與本文中描述的任何ADA分享實(shí)質(zhì)同源性；和⑵能夠催化乙醛轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA。如果ADA衍生物的氨基酸序列與本文中描述的任何ADA的氨基酸序列至少80%，至少85%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%相同，那么就說該衍生物與ADA分享“實(shí)質(zhì)同源性”。
[0080]5.2.2.1用于鑒定功能性ADA的方法
[0081]另一方面，本文中提供具有升高的體內(nèi)性能的ADA的篩選方法。在這種篩選方法中，通過其挽救工程化宿主細(xì)胞避免細(xì)胞死亡的能力來鑒定具有升高的體內(nèi)性能的ADA。工程化宿主細(xì)胞包含用于生成胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA衍生的次級代謝物(例如類異戊二烯)的異源途徑。在一些實(shí)施方案中，工程化宿主細(xì)胞還包含功能性破壞的PDH旁路途徑和具有微弱活性的ADA，其中功能性破壞的PDH旁路途徑和具有微弱活性的AM的組合活性不生成足夠的胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA來滿足生成細(xì)胞存活，健康和/或生長需要的(I)胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA衍生的次級代謝物；和(2)胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA衍生的初級代謝物二者的需要。對于存活，健康和/或生長，因此宿主細(xì)胞需要活性ADA，其能夠生成升高的胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA
隹A
口 O
[0082]在一些實(shí)施方案中，具有升高的體內(nèi)性能的ADA的篩選方法包括:(a)在具有功能性破壞的PDH旁路途徑的宿主細(xì)胞中表達(dá)對照ADA以生成升高水平的胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA衍生的次級代謝物，其中與不生成升高水平的胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA衍生的次級代謝物的親本細(xì)胞相比，生成升高水平的胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA衍生的次級代謝物降低宿主細(xì)胞的存活力；及(b)在宿主細(xì)胞中表達(dá)測試ADA，代替對照ADA ;由此，與表達(dá)對照ADA的宿主細(xì)胞相t匕，表達(dá)測試ADA的宿主細(xì)胞的存活力提高將測試ADA鑒定為與對照ADA相比，具有改善的體內(nèi)性能。
[0083]在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞中升高水平的胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA衍生的次級代謝物的生成是可誘導(dǎo)的。誘導(dǎo)可響應(yīng)誘導(dǎo)劑(例如半乳糖)或特定生長條件(例如生長溫度)而發(fā)生。當(dāng)在誘導(dǎo)劑缺失下培養(yǎng)時，宿主細(xì)胞的ADA活性足以能夠生成宿主細(xì)胞存活需要的胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA。然而，當(dāng)在誘導(dǎo)劑存在下培養(yǎng)時，宿主細(xì)胞的ADA活性不足以能夠生成宿主細(xì)胞存活需要的胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA和升高水平的胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA衍生的次級代謝物二者。因此，在后一種情況中，宿主細(xì)胞存活需要能夠生成升高集合的胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA的、活性更高的ADA。宿主細(xì)胞中胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA衍生的次級代謝物的產(chǎn)量的范圍可以是比親本細(xì)胞中胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA衍生的次級代謝物的產(chǎn)量高約10%到至少約1，000倍或更多。
[0084]與親本細(xì)胞相比，表達(dá)對照ADA的宿主細(xì)胞的降低的存活力的范圍可以是降低的細(xì)胞生長至致死。因此，在一些實(shí)施方案中，與親本細(xì)胞相比，表達(dá)對照ADA的宿主細(xì)胞在液體培養(yǎng)物中或瓊脂板上產(chǎn)生減少數(shù)目的后代細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，與親本細(xì)胞相比，表達(dá)對照ADA的宿主細(xì)胞在液體培養(yǎng)物中或在瓊脂板上不產(chǎn)生后代細(xì)胞。因而,與表達(dá)對照ADA的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的后代細(xì)胞數(shù)目或集落尺寸相比，表達(dá)測試ADA代替對照ADA的宿主細(xì)胞的存活力的升高可表現(xiàn)為在液體培養(yǎng)物中更高數(shù)目的后代細(xì)胞或在瓊脂板上更大的集落尺寸。
[0085]可通過修飾在宿 主細(xì)胞中參與胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA衍生的次級代謝物或其前體生成的酶的表達(dá)和/或活性來實(shí)現(xiàn)宿主細(xì)胞中升高水平的胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA衍生的次級代謝物的生成。在一些此類實(shí)施方案中，修飾MEV或DXP途徑中的酶的表達(dá)和/或活性。在一些此類實(shí)施方案中，修飾HMG-CoA還原酶和/或甲羥戊酸激酶的表達(dá)和/或活性。
[0086]對照ADA和測試ADA可以是天然存在的ADA或非天然存在的ADA。在一些實(shí)施方案中，測試ADA是對照ADA的變體，其因一處或多處氨基酸替代，刪除，和/或添加而不同于對照ADA。在一些實(shí)施方案中，測試ADA包含與對照ADA同一的氨基酸，但是編碼這些氨基酸的密碼子在測試ADA和對照ADA之間不同。在一些此類實(shí)施方案中，密碼子針對宿主細(xì)胞中的使用率經(jīng)過優(yōu)化。在一些實(shí)施方案中，對照ADA和/或測試ADA與丙酮酸脫羧酶融合。在一些實(shí)施方案中，測試ADA的表達(dá)在強(qiáng)啟動子的調(diào)節(jié)性控制下。在一些實(shí)施方案中，測試ADA的表達(dá)在中等強(qiáng)度的啟動子的調(diào)節(jié)性控制下。在一些實(shí)施方案中，測試ADA的表達(dá)在弱啟動子的調(diào)節(jié)性控制下。
[0087]可通過比對照ADA更具活性的測試ADA或通過具有與對照ADA相似或更弱活性但以更高水平表達(dá)的測試ADA來實(shí)現(xiàn)在測試ADA存在下宿主細(xì)胞存活力的升高。可通過在宿主細(xì)胞中以相似水平表達(dá)對照ADA和測試ADA來完成對具有升高活性的測試ADA的鑒定。例如，這可通過在宿主細(xì)胞中將編碼對照ADA和測試ADA的核苷酸序列置于相同調(diào)節(jié)元件的控制下來完成。在使用該方法的其它實(shí)施方案中，例如，為了鑒定提供期望表達(dá)水平的調(diào)節(jié)元件(例如啟動子)，測試ADA不在核苷酸或氨基酸序列上而是在表達(dá)水平上不同于對照ADA。在此類實(shí)施方案中，可將不同調(diào)節(jié)元件用于對照ADA和測試ADA的表達(dá)，宿主細(xì)胞存活力的比較提供并非有關(guān)測試ADA的活性而是關(guān)于驅(qū)動測試ADA表達(dá)的調(diào)節(jié)元件的強(qiáng)度的信息。
[0088]為了防止快速生長的假陽性宿主細(xì)胞(其包含促進(jìn)生長的突變而非改善的ADA變體)超越宿主細(xì)胞培養(yǎng)物的競爭性生長情況，篩選方法的一個實(shí)施方案涉及基于瓊脂板的選擇系統(tǒng)。在這個實(shí)施方案中，將宿主細(xì)胞涂布于瓊脂板上，并通過集落生長來鑒定包含具有改善的體內(nèi)性能的測試ADA變體的宿主細(xì)胞。
[0089]當(dāng)前公開的篩選方法的實(shí)質(zhì)性優(yōu)點(diǎn)在于其簡單性和高通量執(zhí)行的能力。僅僅根據(jù)細(xì)胞存活力就鑒定ADA變體，使得其它昂貴且費(fèi)時的篩選方法實(shí)際上不必要。因此，在一個實(shí)施方案中，該方法用于對ADA變體的集合(例如突變體ADA的文庫)篩選具有改善的體內(nèi)性能的ADA變體。在一個此類實(shí)施方案中，不是在宿主細(xì)胞中表達(dá)單一的測試ADA，而是在宿主細(xì)胞的集合中表達(dá)測試ADA的集合。然后，可以在瓊脂板上培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并且可以根據(jù)集落生長鑒定表達(dá)具有改善的體內(nèi)性能的ADA變體的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，ADA變體的集合包含2到5，5到10，10到50，50到100，100到500，500到I, 000，I, 000到10，000，10，000 到 100，000，100，000 到 I, 000，000，和更多種 ADA 變體。
[0090]當(dāng)前公開的篩選方法的另一項(xiàng)主要優(yōu)點(diǎn)在于其以迭代方式選擇越來越好的ADA變體的持續(xù)能力，其中將在某一迭代中鑒定得到的測試ADA在下一迭代中用作對照ADA。然而，一個此類實(shí)施方案要求在每一迭代檢查宿主細(xì)胞中胞質(zhì)溶膠乙酰-Cok衍生的次級代謝物的產(chǎn)量，并潛在地提高(例如通過提高或降低酶的表達(dá)水平，添加或去除酶，增加或減少基因的拷貝數(shù)，替換控制酶表達(dá)的啟動子，或通過遺傳突變改變酶)到當(dāng)宿主細(xì)胞表達(dá)新對照ADA(即前一迭代中的測試ADA)時引起存活力降低的水平?；蛘?另外，在每一迭代，可降低對照ADA的表達(dá)(例如通過降低表達(dá)或通過使用更弱的啟動子或通過降低對照ADA轉(zhuǎn)錄物或多肽的穩(wěn)定性)以提供降低的對照ADA活性。然后，在下一迭代中可鑒定仍具有與先前迭代的測試ADA相比升高的體內(nèi)性能的測試ADA。
[0091]當(dāng)前公開的篩選方法的另一項(xiàng)主要優(yōu)點(diǎn)在于對改善的ADA的選擇發(fā)生在體內(nèi)而不是體外。結(jié)果是，可獲得增強(qiáng)ADA變體體內(nèi)性能的多種酶特性的改善。
[0092]使用當(dāng)前公開的篩選方法開發(fā)的酶可進(jìn)行另外的任選篩選手段，包括但不限于熒光篩選和/或通過氣相層析對胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA衍生的次級代謝物的直接定量。更具體而言，這包括用于測量倍半萜(諸如法呢烯)的產(chǎn)量的基于尼羅紅的高通量熒光測定法，和用于測量倍半萜(諸如法呢烯)的滴度的基于氣相層析(GC)的直接定量方法。改善的酶也可通過遺傳工程方法(諸如誘導(dǎo)突變等等)進(jìn)一步改善。結(jié)果是，相繼實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)最終酶性能的多種酶特性的改進(jìn)，并鑒定出最有效的酶變體。
[0093]5.2.3 PDH旁路的功能性破壞
[0094] 在線粒體中，可通過丙酮酸由PDH復(fù)合物催化的氧化脫羧而形成乙酰-CoA。然而，由于釀酒酵母沒有將乙酰-CoA轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體外的能力，因此PDH旁路對于提供胞質(zhì)溶膠區(qū)室中的乙酰-CoA具有至關(guān)重要的作用，并且為丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA的PDH反應(yīng)提供一種備選途徑。PDH旁路涉及丙酮酸脫羧酶(PDC ；EC4.1.1.1)，乙醛脫氫酶(A⑶H ；ECl.2.1.5和ECl.2.1.4)，和乙酰-CoA合成酶(ACS ；EC6.2.1.1)。丙酮酸脫羧酶催化丙酮酸脫羧成乙醛和二氧化碳。乙醛脫氫酶將乙醛氧化成乙酸。在釀酒酵母中，醛脫氫酶家族包含5個成員。ALD2 (YMR170c)，ALD3 (YMR169c)和ALD6 (YPL061w)對應(yīng)于胞質(zhì)溶膠同種型，而ALD4(Y0R374w)和ALD5 (YER073w)編碼線粒體酶。主要的胞質(zhì)溶膠乙醛脫氫酶同種型由ALD6編碼。自乙酸形成乙酰-CoA由ACS催化，且涉及ATP的水解。兩種結(jié)構(gòu)基因(ACSI和ACS2)編碼 ACS。
[0095]在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞包含PDH旁路途徑中一種或多種基因的功能性破壞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞的PDH旁路中一種或多種基因的破壞導(dǎo)致經(jīng)遺傳修飾的微生物細(xì)胞在其催化一種或多種下述反應(yīng)的能力上受損:(I)由丙酮酸脫羧酶將丙酮酸脫羧成乙醛；(2)由乙醛脫氫酶將乙醛轉(zhuǎn)化成乙酸；和(3)由乙酰-CoA合成酶自乙酸和Cok合成乙酰-CoA。
[0096]在一些實(shí)施方案中，與親本細(xì)胞相比，宿主細(xì)胞包含PDH旁路途徑的一種或多種基因的功能性破壞，其中單獨(dú)的或與弱ADA組合的功能減弱的或無功能的PDH旁路途徑的活性不足以支持宿主細(xì)胞生長，存活和/或健康。
[0097]在一些實(shí)施方案中，PDH旁路的一種或多種內(nèi)源蛋白質(zhì)的活性或表達(dá)降低至少約50%。在另一個實(shí)施方案中，與不包含PDH旁路的一種或多種內(nèi)源蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性降低或缺失的重組微生物相比，PDH旁路的一種或多種內(nèi)源蛋白質(zhì)的活性或表達(dá)降低至少約60 %，至少約65 %，至少約70 %，至少約75 %，至少約80 %，至少約85 %，至少約90 %，至少約95%，或至少約99%。
[0098]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，有數(shù)種機(jī)制可用于降低或破壞蛋白質(zhì)(諸如PDH旁路中的蛋白質(zhì))的活性，包括但不限于使用受調(diào)節(jié)的啟動子，使用組成性弱啟動子，在二倍體酵母中破壞編碼蛋白質(zhì)的 基因的兩個拷貝之一，在二倍體酵母中破壞基因的所有兩個拷貝，表達(dá)反義核酸，表達(dá)siRNA，過表達(dá)內(nèi)源啟動子的負(fù)調(diào)節(jié)物，改變內(nèi)源或異源基因的活性，使用具有較低比活性的異源基因，等等，或其組合。
[0099]在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞包含至少一種編碼PDH旁路蛋白質(zhì)的基因中的突變，導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的活性降低。在另一個實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞包含編碼PDH旁路蛋白質(zhì)的基因的部分刪除，導(dǎo)致由該基因編碼的多肽的活性降低。在另一個實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞包含編碼PDH旁路蛋白質(zhì)的基因的完全刪除，導(dǎo)致由該基因編碼的多肽的活性降低。在還有另一個實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞包含與編碼PDH旁路蛋白質(zhì)的基因相關(guān)的調(diào)節(jié)區(qū)的修飾，導(dǎo)致由所述基因編碼的多肽的表達(dá)降低。在還有另一個實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的修飾，導(dǎo)致編碼PDH旁路蛋白質(zhì)的基因的轉(zhuǎn)錄降低。在還有另一個實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞包含所有編碼PDH旁路蛋白質(zhì)的基因中的突變，導(dǎo)致由該基因編碼的多肽的活性降低。在一個實(shí)施方案中，PDH旁路蛋白質(zhì)的活性或表達(dá)降低至少約50%。在另一個實(shí)施方案中，與不包含PDH旁路蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性降低的重組微生物相比，PDH旁路蛋白質(zhì)的活性或表達(dá)降低至少約60 %，至少約65 %，至少約70 %，至少約75 %，至少約80 %，至少約85%，至少約90%，至少約95%，或至少約99%。
[0100]在一些實(shí)施方案中，通過使用“破壞構(gòu)建體”來實(shí)現(xiàn)PDH旁路中的一種或多種基因的破壞，在將“破壞構(gòu)建體”引入微生物細(xì)胞后，構(gòu)建體能夠特異性破壞I3DH旁路的基因，由此使得受到破壞的基因無功能。在一些實(shí)施方案中，靶基因的破壞阻止功能性蛋白質(zhì)的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，靶基因的破壞導(dǎo)致自受到破壞的基因表達(dá)非功能性蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，通過同源重組將“破壞序列”整合到靶基因基因座中，由此實(shí)現(xiàn)PDH旁路基因的破壞。在此類實(shí)施方案中，破壞構(gòu)建體包含破壞序列，其側(cè)翼是與靶基因基因座的一對核苷酸序列同源的一對核苷酸序列(同源序列)。一旦破壞構(gòu)建體替換了靶基因的靶定部分，破壞序列阻止功能性蛋白質(zhì)的表達(dá)，或引起自靶基因表達(dá)非功能性蛋白質(zhì)。
[0101]能夠破壞PDH旁路基因的破壞構(gòu)建體可使用本領(lǐng)域共知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)來構(gòu)建。參見例如 Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning—A LaboratoryManual, 3rd edit1n, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 和 Ausubelet al., eds., Current Edit1n, Current Protocols in Molecular B1logy, GreenePublishing Associates and Wiley Interscience, NY。在本方法的實(shí)踐中可變化的破壞構(gòu)建體參數(shù)包括但不限于同源序列的長度，同源序列的核苷酸序列，破壞序列的長度，破壞序列的核苷酸序列，和靶基因的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，每種同源序列的長度的有效范圍是50到5，000個堿基對。在具體的實(shí)施方案中，每種同源序列的長度是約500個堿基對。關(guān)于基因打靶需要的同源性長度的討論參見Hasty et al.,Mol CellB1lll:5586-91(1991)。在一些實(shí)施方案中，同源序列包含靶基因的編碼序列。在其它實(shí)施方案中，同源序列包含祀基因的上游或下游序列。在一些實(shí)施方案中，一種同源序列包含與位于靶基因編碼序列5’端的核苷酸序列同源的核苷酸序列，而另一種同源序列包含與位于靶基因編碼序列3’端的核苷酸序列同源的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，破壞序列包含編碼選擇標(biāo)記的核苷酸序列，其能夠選擇包含破壞序列的微生物細(xì)胞。因而，在此類實(shí)施方案中，破壞構(gòu)建體具有雙重功能，即功能性破壞靶基因和提供選擇標(biāo)記(用于鑒定其中的靶基因受到功能性破壞的細(xì)胞)。在一些實(shí)施方案中，終止密碼子以符合讀碼框的方式位于編碼選擇標(biāo)記的核苷酸序列下游以阻止翻譯通讀，翻譯通讀可能產(chǎn)生具有一定程度的、由靶基因編碼的野生型蛋白質(zhì)的活性的融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，破壞序列長度是一個堿基對。單個堿基對的插入會足以破壞靶基因，因?yàn)榫幋a序列中單個堿基對的插入可構(gòu)成移碼突變，移碼突變能阻止功能性蛋白質(zhì)的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，破壞序列的序列與位于同源序列之間的靶基因的核苷酸序列相差單個堿基對。一旦用破壞序列替換靶基因內(nèi)的核苷酸序列，引入的單個堿基對替代會導(dǎo)致蛋白質(zhì)中關(guān)鍵位點(diǎn)處的單個氨基酸替代和非功能性蛋白質(zhì)的表達(dá)。然而，應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，使用非常短的破壞序列造成的破壞易于通過自發(fā)突變回復(fù)成野生型序列，由此導(dǎo)致宿主菌株恢復(fù)PDH旁路功能。因而，在具體的實(shí)施方案中，破壞序列要更長一個至一些堿基對。在另一個極端，過長的破壞序列不大可能比長度適中的破壞序列賦予任何優(yōu)點(diǎn)，而且可能降低轉(zhuǎn)染或打靶的效率。這種背景中的過長指比靶基因中的選定同源序列之間的距離長許多倍。因而，在某些實(shí)施方案中，破壞序列的長度可以是2到2，000個堿基對。在其它實(shí)施方案中，破壞序列的長度大約等同于靶基因基因座中與破壞構(gòu)建體中的同源序列匹配的區(qū)域之間的距離。
[0102]在一些實(shí)施方案中，破壞構(gòu)建體是線性DNA分子。在其它實(shí)施方案中，破壞構(gòu)建體是環(huán)狀DNA分子。在一些實(shí)施方案中，如上所述，環(huán)狀破壞構(gòu)建體包含由破壞序列分開的一對同源序列。在一些實(shí)施方案中，環(huán)狀破壞構(gòu)建體包含單一同源序列。一旦整合到靶基因基因座，此類環(huán)狀破壞構(gòu)建體會變成線性化的，具有位于每個末端的同源序列一部分，而且破壞構(gòu)建體的剩余區(qū)段插入并破壞靶基因，不替換靶基因的任何核苷酸序列。在具體的實(shí)施方案中，環(huán)狀破壞構(gòu)建體的單一同源序列與位于靶基因編碼序列內(nèi)的序列同源。
[0103]可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法將破壞構(gòu)建體引入微生物細(xì)胞，沒有限制。此類方法包括但不限于細(xì)胞自溶液直接攝取分子，或經(jīng)由脂轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)(使用例如脂質(zhì)體或免疫脂質(zhì)體)的促進(jìn)攝取，顆粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，等。參見例如美國專利N0.5，272，065;Goeddel et al., eds, 1990, Methods in Enzymology, vol.185, Academic Press, Inc., CA ；Krieger, 1990,Gene Transfer and Express1n —A Laboratory Manual, StocktonPress, NY ；Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning—A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory, NY ；Ausubel et al.,eds., Current Edit1n, Current Protocols inMolecular B1logy, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY。用于轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞的具體方法是本領(lǐng)域公知的。參見Hinnen et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA75:1292-3 (1978) ；Cregg et al.，Mol.Cell.B1l.5:3376-3385 (1985)。例示性技術(shù)包括但不限于原生質(zhì)球法，電穿孔，PEG1000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，和乙酸鋰或氯化鋰介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
[0104]5.2.3.1 ALD4 和 ALD6
[0105]在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞中編碼醛脫氫酶(ACDH)活性的一種或多種基因是功能性破壞的。在一些實(shí)施方案中，醛脫氫酶是由選自ALD2，ALD3，ALD4，ALD5，ALD6，及其同系物或變體的基因編碼的。
[0106]在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞包含ALD4的功能性破壞。代表性的釀酒酵母ALD4核苷酸序列包括登錄號ΝΜ_001183794和本文中提供的SEQ ID NO: 7。代表性的釀酒酵母的Ald4蛋白 質(zhì)序列包括登錄號NP_015019.1和本文中提供的SEQ ID N0:8。
[0107]在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞包含胞質(zhì)溶膠醛脫氫酶(ALD6)的功能性破壞。Ald6p在天然TOH旁路中發(fā)揮將乙醛轉(zhuǎn)化成乙酸的功能。代表性的釀酒酵母ALD6核苷酸序列包括登錄號S⑶56604和本文中提供的SEQ ID NO: 9。代表性的釀酒酵母Ald6蛋白質(zhì)序列包括登錄號AAB01219和本文中提供的SEQ ID NO: 10。
[0108]如本領(lǐng)域會理解的，可使用本文中描述的方法類似地滅活醛脫氫酶在除釀酒酵母以外的酵母中的天然存在同系物。
[0109]如本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解的，可降低或消除超過一種醛脫氫酶的活性或表達(dá)。在一個具體的實(shí)施方案中，可降低或消除ALD4和ALD6或其同系物或變體的活性或表達(dá)。在另一個具體的實(shí)施方案中，可降低或消除ALD5和ALD6或其同系物或變體的活性或表達(dá)。在還有另一個具體的實(shí)施方案中，可降低或消除ALD4，ALD5，和ALD6或其同系物或變體的活性或表達(dá)。在還有另一個具體的實(shí)施方案中，可降低或消除定位于胞質(zhì)溶膠的醛脫氫酶ALD2，ALD3，和ALD6或其同系物或變體的活性或表達(dá)。在還有另一個具體的實(shí)施方案中，可降低或消除定位于線粒體的醛脫氫酶ALD4和ALD5或其同系物或變體的活性或表達(dá)。
[0110]5.2.3.2 ACSl 和 ACS2
[0111]在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞中編碼乙酰-CoA合酶(ACS)活性的一種或多種基因是功能性破壞的。在一些實(shí)施方案中，乙酰-CoA合酶是由選自ACSl，ACS2，及其同系物和變體的基因編碼的。
[0112]在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞中編碼乙酰-CoA合酶(ACS)活性的一種或多種基因是功能性破壞的。ACSl和ACS2均是能將乙酸轉(zhuǎn)化成乙酰-Cok的乙酰-Cok合酶。ACSl僅在呼吸條件下表達(dá)，而ACS2是組成性表達(dá)的。當(dāng)ACS2被敲除時，菌株能在呼吸條件(例如乙醇，甘油或乙酸培養(yǎng)基)上生長，但是在可發(fā)酵碳源(例如蔗糖，葡萄糖)上死亡。
[0113]在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞包含ACSl的功能性破壞。釀酒酵母ACSl基因的序列先前已有記載。參見例如Nagasu et al.，Gene37 (1-3): 247-253 (1985)。代表性的釀酒酵母ACSl核苷酸序列包括登錄號X66425和本文中提供的SEQ ID N0:3。代表性的釀酒酵母Acsl蛋白質(zhì)序列包括登錄號AAC04979和本文中提供的SEQ ID N0:4。
[0114]在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞包含ACS2的功能性破壞。釀酒酵母的ACS2基因的序列先前已有記載。參見例如Van den Berg et al.，Eur.J.B1chem.231 (3): 704-713 (1995)。代表性的釀酒酵母ACS2核苷酸序列包括登錄號S79456和本文中提供的SEQ IDN0:5。代表性的釀酒酵母Acs2蛋白質(zhì)序列包括登錄號CAA97725和本文中提供的SEQ ID NO:6。
[0115]如本領(lǐng)域會理解的，也可使用本文中描述的方法類似地滅活乙酰-CoA合酶在除釀酒酵母以外的酵母中的天然存在同系物。
[0116]在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含能在呼吸條件下(即當(dāng)宿主細(xì)胞在例如乙醇，甘油，或乙酸存在下生長時)將乙酸轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA的胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA合酶活性。在一些此類實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是包含ACSl活性的酵母細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，與親本細(xì)胞相比，宿主細(xì)胞不包含或包含減弱的、呼吸條件下的內(nèi)源乙酰-CoA合酶活性。在一些此類實(shí)施方案中，與親本細(xì)胞相比，宿主細(xì)胞是不包含或包含減弱的ACSl活性的酵母細(xì)胞。
[0117]在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含能在非呼吸條件下(即當(dāng)宿主細(xì)胞在可發(fā)酵碳源(例如蔗糖，葡萄糖)存在下生長時)將乙酸轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA的胞質(zhì)溶膠乙酰-CoA合酶活性。在一些此類實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是包含ACS2活性的酵母細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，與親本細(xì)胞相比，宿主細(xì)胞不包含或包含減弱的、非呼吸條件下的內(nèi)源乙酰-CoA合酶活性。在一些此類實(shí)施方案中，與親本細(xì)胞相比，宿主細(xì)胞是不包含或包含減弱的ACS2活性的酵母細(xì)胞。
[0118]5.2.4磷酸轉(zhuǎn)酮酶(PK)和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(PTA)
[0119]在酵母中，經(jīng)由糖酵解，三羧酸(TCA)循環(huán)，氧化磷酸化和丙酮酸代謝自葡萄糖生物合成乙酰-CoA。然而，在這種生物合成途徑中，在由丙酮酸羧化酶進(jìn)行的丙酮酸代謝期間以及在由丙酮酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶進(jìn)行的TCA循環(huán)中失去C02。在工業(yè)發(fā)酵設(shè)置中，減少經(jīng)由下游糖酵解的流量(flux)的一個好處是丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙醛時產(chǎn)生較少的C02，并且因此在終產(chǎn)物中捕獲更多的碳，由此提高最大理論產(chǎn)率。第二個好處是產(chǎn)生較少的NADH，并且因此將其再氧化需要顯著更少的氧。理論上可通過繞開TCA循環(huán)來避免碳原子的丟失。這可使用磷酸轉(zhuǎn)酮酶(PK)(酶類EC4.1.2.9，EC4.1.2.22)結(jié)合磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(PTA)(EC2.3.1.8)來實(shí)現(xiàn)。
[0120]PK和PTA催化果糖-6-磷酸(F6P)或木酮糖_5_磷酸(X5P)轉(zhuǎn)化成乙酰-Cok的反應(yīng)(圖7)。PK自戊糖磷酸中間物提取木酮糖5-磷酸，或自上游糖酵解中間物提取D-果糖6-磷酸(F6P) ;PK將X5P分裂成甘油醛3-磷酸(G3P)和乙酰磷酸，或?qū)6P分裂成赤蘚糖4-磷酸(Ε4Ρ)。然后PTA將乙酰磷酸轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA。G3P能重新進(jìn)入下游糖酵解，而E4P能通過經(jīng)由轉(zhuǎn)醒醇酶(transaldolase)和轉(zhuǎn)酮醇酶(transketolase)的非氧化性戍糖磷酸途徑網(wǎng)絡(luò)循環(huán)而重新進(jìn)入戊糖磷酸途徑或糖酵解。
[0121]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞包含編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶的異源核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，磷酸轉(zhuǎn)酮酶來自腸系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)(Lee et al., B1technol Lett.27 (12) ;853_858 (2005))。代表性的腸系膜明串珠菌磷酸轉(zhuǎn)酮酶核苷酸序列包括登錄號AY804190和本文中提供的SEQ ID NO: 11。代表性的腸系膜明串珠菌磷酸轉(zhuǎn)酮酶蛋白質(zhì)序列包括登錄號YP_819405，AAV66077.1和本文中提供的SEQ ID NO: 12。其它有用的磷酸轉(zhuǎn)酮酶包括但不限于來自齒雙歧桿菌(Bifidobacterium dentium) ATCC27678 (ABIX0200000
2.1:2350400..2352877 ；EDT46356.1);動物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis)(NC_017834.1:1127580..1130057 ；YP_006280131.1);和偽長雙歧桿菌(Bifidobacteriumpseudolongum) (AY518216.1:988..3465 ；AAR98788.1)的磷酸轉(zhuǎn)酮酶。
[0122]在本文中提供的組合物和方法中有用的磷酸轉(zhuǎn)酮酶還包括那些據(jù)說是本文中描述的任何磷酸轉(zhuǎn)酮酶的“衍生物”的分子。此類“衍生物”具有下述特征:(I)與本文中描述的任何磷酸轉(zhuǎn)酮酶分享實(shí)質(zhì)同源性；和(2)能夠催化X5P轉(zhuǎn)化成甘油醛3-磷酸(G3P)和乙酰磷酸；或F6P轉(zhuǎn)化成赤蘚糖4-磷酸(E4P)。如果磷酸轉(zhuǎn)酮酶衍生物的氨基酸序列與磷酸轉(zhuǎn)酮酶的氨基酸序列至少80%,更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%相同，那么就說該衍生物與磷酸轉(zhuǎn)酮酶分享“實(shí)質(zhì)同源性”。
[0123]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞包含編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的異源核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶來自克氏梭菌。代表性的克氏梭菌磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶核苷酸序列包括登錄號NC_009706.1:1428554..1429555和本文中提供的SEQ ID NO: 13。代表性的克氏梭菌磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶蛋白質(zhì)序列包括登錄號YP_001394780和本文中提供的SEQ ID Ν0:14。其它有用的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶包括但不限于來自羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri) (NC_010609.1:460303..461277 ；YP_001841389.10)；枯草芽孢桿菌(NC_014479.1:3671865..3672836 ；YP_003868063.1);和嗜熱甲烷八疊球菌(Methanosarcina therm ophile) (L23147.1:207..1208 ；AAA72041.1)的憐酸轉(zhuǎn)乙酸酶。
[0124]在本文中提供的組合物和方法中有用的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶還包括那些據(jù)說是本文中描述的任何磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的“衍生物”的分子。此類“衍生物”具有下述特征:(I)與本文中描述的任何磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶分享實(shí)質(zhì)同源性；和(2)能夠催化乙酰磷酸轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA。如果磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶衍生物的氨基酸序列與磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的氨基酸序列至少80%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%相同，那么就說該衍生物與磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶分享“實(shí)質(zhì)同源性”。
[0125]5.2.5 MEV 途徑
[0126]在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含MEV途徑的一種或多種異源酶。在一些實(shí)施方案中，MEV途徑中的一種或多種酶包括將乙酰-CoA與丙二酰-CoA縮合以形成乙酰乙酰-CoA的酶。在一些實(shí)施方案中，MEV途徑中的一種或多種酶包括將兩分子乙酰-CoA縮合以形成乙酰乙酰-CoA的酶。在一些實(shí)施方案中，MEV途徑中的一種或多種酶包括將乙酰乙酰-CoA與乙酰-Cok縮合以形成HMG-CoA的酶。在一些實(shí)施方案中，MEV途徑中的一種或多種酶包括將HMG-CoA轉(zhuǎn)化成甲羥戊酸的酶。在一些實(shí)施方案中，MEV途徑中的一種或多種酶包括將甲羥戊酸磷酸化成甲羥戊酸5-磷酸的酶。在一些實(shí)施方案中，MEV途徑中的一種或多種酶包括將甲羥戊酸5-磷酸轉(zhuǎn)化成甲羥戊酸5-焦磷酸的酶。在一些實(shí)施方案中，MEV途徑中的一種或多種酶包括將甲羥戊酸5-焦磷酸轉(zhuǎn)化成異戊烯焦磷酸的酶。
[0127]在一些實(shí)施方案中，MEV途徑中的一種或多種酶選自下組:乙酰-CoA硫解酶，乙酰乙酰-CoA合酶，HMG-CoA合酶，HMG-CoA還原酶，甲羥戊酸激酶，磷酸甲羥戊酸激酶和甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶。在一些實(shí)施方案中，關(guān)于MEV途徑中能夠催化乙酰乙酰-Cok形成的酶，經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞包含將兩分子乙酰-CoA縮合以形成乙酰乙酰-CoA的酶(例如乙酰-Cok硫解酶)或?qū)⒁阴?Cok與丙二酰-Cok縮合以形成乙酰乙酰-Cok的酶(例如乙酰乙酰-CoA合酶)任一。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞包含將兩分子乙酰-CoA縮合以形成乙酰乙酰-Cok的酶(例如乙酰-CoA硫解酶)和將乙酰-Cok與丙二酰-Cok縮合以形成乙酰乙酰-CoA的酶(例如乙酰乙酰-CoA合酶)二者。
[0128]在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含編碼MEV途徑的超過一種酶的一種或多種異源核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含編碼MEV途徑的兩種酶的一種或多種異源核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含編碼能將HMG-CoA轉(zhuǎn)化成甲羥戊酸的酶和能將甲羥戊酸轉(zhuǎn)化成甲羥戊酸5-磷酸的酶的一種或多種異源核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含編碼MEV途徑的三種酶的一種或多種異源核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含編碼MEV途徑的四種酶的一種或多種異源核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含編碼MEV途徑的五種酶的一種或多種異源核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含編碼MEV途徑的六種酶的一種或多種異源核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含編碼MEV途徑的七種酶的一種或多種異源核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含編碼MEV途徑的所有酶的眾多異源核酸。
[0129]在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞還包含編碼能將異戊烯焦磷酸(IPP)轉(zhuǎn)化成二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的酶的異源核酸。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞還包含編碼能縮合IPP和/或DMAPP分子以形成聚異戊二烯化合物的酶的異源核酸。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳 修飾的宿主細(xì)胞還包含編碼能修飾IPP或聚異戊二烯以形成類異戊二烯化合物的酶的異源核酸。
[0130]5.2.5.1乙酰-CoA轉(zhuǎn)化成乙酰乙酰-CoA
[0131]在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞包含編碼能縮合兩分子乙酰-CoA以形成乙酰乙酰-CoA的酶(例如乙酰-CoA硫解酶)的異源核苷酸序列。編碼此類酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于:(NC_000913區(qū):2324131.2325315 ;大腸桿菌)，(D49362 ；脫氮副球菌(Paracoccus denitrificans)),和(L20428 ;釀酒酵母)。
[0132]乙酰-Cok硫解酶催化可逆的兩分子乙酰-Cok縮合以產(chǎn)生乙酰乙酰-CoA，但是這個反應(yīng)是熱力學(xué)上不利的；乙酰乙酰-CoA硫解反應(yīng)相對于乙酰乙酰-CoA合成反應(yīng)是有利的。乙酰乙酰-CoA合酶(AACS)(也稱作乙酰-CoA:丙二酰-CoA?；D(zhuǎn)移酶；EC2.3.1.194)將乙酰-CoA與丙二酰-CoA縮合以形成乙酰乙酰-CoA。與乙酰-CoA硫解酶相反，由于相關(guān)的丙二酰-CoA脫羧反應(yīng)，AACS催化的乙酰乙酰-CoA合成反應(yīng)本質(zhì)上是能量有利的反應(yīng)。此外，AACS針對乙酰乙酰-Cok不表現(xiàn)硫解活性，因此該反應(yīng)是不可逆的。
[0133]在包含異源ADA和乙酰-CoA硫解酶的宿主細(xì)胞中，由乙酰-CoA硫解酶(其偏好乙酰乙酰-CoA硫解反應(yīng))催化的可逆反應(yīng)可產(chǎn)生大量乙酰-CoA集合。鑒于ADA的可逆活性，這個乙酰-Cok集合繼而可驅(qū)動ADA朝著將乙酰-Cok轉(zhuǎn)化成乙醛的逆反應(yīng)，由減弱由ADA朝向乙酰-CoA生成提供的好處。因此，在一些實(shí)施方案中，為了提供對乙酰-CoA的強(qiáng)拉動以驅(qū)動朝向ADA的正反應(yīng)，本文中提供的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞中的MEV途徑利用乙酰乙酰-CoA合酶自乙酰-CoA和丙二酰-CoA形成乙酰乙酰-CoA。[0134]在一些實(shí)施方案中，AACS來自鏈霉菌(Streptomyces sp.)菌株CL 190 (Okamuraet al.,Proc Natl Acad Sci USA107 (25): 11265-70 (2010))。代表性的鏈霉菌菌株CL190AACS核苷酸序列包括登錄號AB540131.1和本文中提供的SEQ ID N0:15。代表性的鏈霉菌菌株CL190AACS蛋白質(zhì)序列包括登錄號D7URV0，BAJ10048和本文中提供的SEQ ID NO: 16。對本文中提供的組合物和方法有用的其它乙酰乙酰-CoA合酶包括但不限于鏈霉菌(AB183750 ；K0-3988BAD86806) ；S.anulatus 菌株 9663 (FN178498 ；CAX48662)；鏈霉菌 K0-3988 (AB212624 ;BAE78983)；游動放線菌(Actinoplanessp.)A40644(AB113568 ；BAD07381)；鏈霉菌 C(NZ_ACEW010000640 ;ZP_05511702);Nocard1psis dassonvillei DSM43111 (NZ_ABU101000023 ；ZP_04335288);潰瘍分枝桿菌(Mycobacterium ulcerans) Agy99 (NC_008611 ；YP_907152);海分枝桿菌(Mycobacteriummarinum)M(NC_010612 ；YP_001851502);鏈霉菌 Mgl (NZ_DS570501 ；ZP_05002626)；鏈霉菌 AA4(NZ_ACEV01000037 ；ZP_05478992);玫瑰孢鏈霉菌(S.roseosporus) NRRL15998 (NZ_ABYBO1000295 ；ZP_04696763);鏈霉菌 ACTE (NZ_ADFD01000030 ；ZP_06275834);產(chǎn)綠色鏈霉菌(S.viridochromogenes)DSM40736(NZ_ACEZ01000031 ；ZP_05529691);弗蘭克氏菌(Frankia sp.) CcI3 (NC_007777 ；YP_480101)；巴西諾卡氏菌(Nocardia brasiliensis)(NC_018681 ；YP_006812440.1)；和 Austwickia chelonae(NZ_BAGZ01000005 ；ZP_10950493.1)。另外的合適的乙酰乙酰-CoA合酶包括美國專利申請公開文本N0.2010/0285549和N0.2011/0281315中記載的那些，通過提述完整收錄其內(nèi)容。
[0135]在本文中提供的組合物和方法中有用的乙酰乙酰-CoA合酶還包括那些據(jù)說是本文中描述的任何乙酰乙酰-CoA合酶的“衍生物”的分子。此類“衍生物”具有下述特征:(I)與本文中描述的任何乙酰乙酰-CoA合酶分享實(shí)質(zhì)同源性；和(2)能夠催化乙酰-CoA與丙二酰-Cok形成乙酰乙酰-Cok的不可逆縮合。如果乙酰乙酰-Cok合酶衍生物的氨基酸序列與乙酰乙酰-CoA合酶的氨基酸序列至少80%,更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%相同，那么就說該衍生物與乙酰乙酰-CoA合酶分享“實(shí)質(zhì)同源性”。 [0136]5.2.5.2 乙酰乙酰-CoA 轉(zhuǎn)化成 HMG-CoA
[0137]在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含編碼能將乙酰乙酰-Cok與另一分子乙酰-Cok縮合以形成3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA(HMG-CoA)的酶(例如HMG-CoA合酶)的異源核苷酸序列。編碼此類酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于:(NC_001145.互補(bǔ)物 19061.20536 ;釀酒酵母)，(X96617 ;釀酒酵母)，(X83882;擬南芥(Arabidopsisthaliana)), (AB037907 ；Kitasatospora griseola), (BT007302 ；人(Homo sapiens)),和(NC_002758，基因座標(biāo)簽SAV2546，GeneIDl 122571 ;金黃色葡萄球菌)。
[0138]5.2.5.3 HMG-CoA轉(zhuǎn)化成甲羥戊酸
[0139]在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含編碼能將HMG轉(zhuǎn)化成甲羥戊酸的酶(例如HMG-CoA還原酶)的異源核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，HMG-CoA還原酶是利用NADH的羥基甲基戊二酰-CoA 還原酶。HMG-CoA 還原酶(EC1.1.1.34 ；EC1.1.1.88)催化(S) -HMG-CoA還原性脫?；?R)-甲羥戊酸，而且可分成兩類，即I類和II類HMGr。I類包括來自真核生物和大多數(shù)古細(xì)菌的酶，而II類包括某些原核生物和古細(xì)菌的HMG-CoA還原酶。除了序列上的差異之外，兩類酶在它們的輔因子特異性方面也不同。與專一利用NADPH的I類酶不同，II類HMG-CoA還原酶在辨別NADPH和NADH的能力方面不同。參見例如Hedl etal.，Journal of Bacter1logyl86 (7):1927-1932(2004)。下文提供選定的 II 類 HMG-CoA還原酶的輔因子特異性。
[0140]表1:選定的II類HMG-CoA還原酶的輔因子特異性
[0141]
【權(quán)利要求】
1.能夠生成類異戊二烯的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包含: (a)編碼甲羥戊酸(MEV)途徑中一種或多種用于生成異戊烯焦磷酸的酶的一種或多種異源核酸；和 (b)編碼?；阴Ｐ?acetylaldehyde)脫氫酶(ADA)的異源核酸。
2.權(quán)利要求1的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述MEV途徑中的一種或多種酶包括將乙酰-Cok與丙二酰-Cok縮合以形成乙酰乙酰-Cok的酶。
3.權(quán)利要求1或2的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述MEV途徑中的一種或多種酶包括乙酸-CoA:丙二酸-CoA酸基轉(zhuǎn)移酶。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述MEV途徑中的一種或多種酶包括利用NADH將3-羥基-3-甲基戊二?；?CoA(HMG-CoA)轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸的酶。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述MEV途徑中的一種或多種酶包括利用NADH的HMG-CoA還原酶。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其還包含編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶(PK)的異源核酸。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其還包含編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(PTA)的異源核酸。
8.權(quán)利要求1-7中任 一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其還包含天然丙酮酸脫氫酶(PDH)旁路中一種或多種酶的功能性破壞。
9.權(quán)利要求8的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述PDH旁路中的一種或多種酶選自:乙酰-CoA合酶I (ACSl)，乙酰-CoA合酶2 (ACS2)，和醛脫氫酶6 (ALD6)。
10.權(quán)利要求9的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中ACSl是功能性破壞的。
11.權(quán)利要求9的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中ACS2是功能性破壞的。
12.權(quán)利要求9的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中ALD6是功能性破壞的。
13.權(quán)利要求9的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中ACSl和ACS2是功能性破壞的。
14.權(quán)利要求9的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中ACS1，ACS2和ALD6是功能性破壞的。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其還包含一種或多種具有醇脫氫酶(ADH)活性的酶的功能性破壞。
16.權(quán)利要求15的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述一種或多種具有ADH活性的酶選自:醇脫氫酶I (ADHl)，醇脫氫酶3 (ADH3)，醇脫氫酶4 (ADH4)，和醇脫氫酶5 (ADH5)。
17.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述ADA的氨基酸序列與SEQ ID NO: 2 至少 80% 同一。
18.權(quán)利要求3的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述乙酰-CoA:丙二酰-CoA?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸序列與SEQ ID NO: 16至少80%同一。
19.權(quán)利要求5的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述利用NADH的HMG-CoA還原酶的氨基酸序列與SEQ ID NO: 20至少80%同一。
20.權(quán)利要求6的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述磷酸轉(zhuǎn)酮酶(PK)的氨基酸序列與SEQ ID NO: 12 至少 80% 同一。
21.權(quán)利要求7的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(PTA)的氨基酸序列與 SEQ ID NO: 14 至少 80% 同一。
22.權(quán)利要求1，4-17和19-21中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述MEV途徑中的一種或多種酶包括將兩分子乙酰-CoA縮合以形成乙酰乙酰-CoA的酶。
23.權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述MEV途徑中的一種或多種酶包括將乙酰乙酰-Cok與乙酰-Cok縮合以形成HMG-CoA的酶。
24.權(quán)利要求1-3，6-18和20-22中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述MEV途徑中的一種或多種酶包括將HMG-CoA轉(zhuǎn)化成甲羥戊酸的酶。
25.權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述MEV途徑中的一種或多種酶包括將甲羥戊酸磷酸化成甲羥戊酸5-磷酸的酶。
26.權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述MEV途徑中的一種或多種酶包括將甲羥戊酸5-磷酸轉(zhuǎn)化成甲羥戊酸5-焦磷酸的酶。
27.權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述MEV途徑中的一種或多種酶包括將甲羥戊酸5-焦磷酸轉(zhuǎn)化成異戊烯焦磷酸的酶。
28.權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述MEV途徑中的一種或多種酶選自=HMG-CoA合酶，甲羥戊酸激酶，磷酸甲羥戊酸激酶和甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶。
29.權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含編碼MEV途徑中所有酶的眾多異源核酸。
30.權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述編碼MEV途徑中一種或多種酶的一種或多 種異源核酸在一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的控制下。
31.權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述編碼MEV途徑中一種或多種酶的一種或多種異源核酸在多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的控制下。
32.權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其還包含編碼能將異戊烯焦磷酸(IPP)轉(zhuǎn)化成二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的酶的異源核酸。
33.權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其還包含編碼能縮合IPP和/或DMAPP分子以形成聚異戍二烯(polyprenyl)化合物的酶的異源核酸。
34.權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其還包含編碼能修飾IPP或聚異戊二烯以形成類異戊二烯化合物的酶的異源核酸。
35.權(quán)利要求34的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述能修飾IPP或聚異戊二烯以形成類異戍二烯化合物的酶選自下組:蒈烯(carene)合酶,牦牛兒醇(geran1l)合酶,芳樟醇(Iinalool)合酶，朽1樣烯(Iimonene)合酶，香葉烯(myrcene)合酶，羅勒烯(ocimene)合酶，α-菔烯(pinene)合酶，β-菔烯合酶，Y-職品烯(terpinene)合酶，職品油烯(terpinolene)合酶，紫穗槐雙烯(amorphadiene)合酶，α-法呢烯(farnesene)合酶，β_法呢烯合酶，法尼醇(farnesol)合酶，橙花叔醇(nerolidol)合酶，廣藿香醇(patchoul1l)合酶，諾卡酮(nootkatone)合酶和松香雙烯(abietadiene)合酶。
36.權(quán)利要求34的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述類異戊二烯選自下組:半萜，單萜，雙萜，三萜，四萜，倍半萜和多萜。
37.權(quán)利要求34的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述類異戊二烯是倍半萜。
38.權(quán)利要求34的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述類異戊二烯是C5-C2tl類異戊二烯。
39.權(quán)利要求34的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述類異戊二烯選自下組:松香雙烯，紫穗槐雙烯，蒈烯，α-法呢烯，β-法呢烯，法尼醇，牦牛兒醇，牦牛兒基牦牛兒醇(geranylgeranitol)，異戊二烯(isoprene)，芳樟醇，梓檬烯，香葉烯，橙花叔醇，羅勒烯，廣藿香醇，β-菠烯，香檜烯(sabinene)，Y _胳品烯，胳品油烯，和瓦倫烯(valencene) □
40.權(quán)利要求1-39中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
41.權(quán)利要求40的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述酵母細(xì)胞屬于選自下組的屬:針芽抱酵母(Aciculoconidium)，神食酵母(Ambros1zyma)，節(jié)囊酵母(Arthroascus)，Arx1zyma, Ashbya, Babjevia, Bensingtonia, Botryoascus, Botryozyma,酒香酵母(Brettanomyces)，布勒彈抱酵母(Bullera)，Bulleromyces，假絲酵母(Candida)，固囊酵母(Citeromyces)，棒抱酵母(Clavispora)，隱球酵母(Cryptococcus)，Cystofilobasidium，德巴利酵母(Debaryomyces)，德克酵母(Dekkara)，Dipodascopsis, Dipodascus，愛尼拉酵母(Eeniella)，擬內(nèi)抱霉(Endomycopsella)，Eremascus, Eremothecium, Erythrobasidium,Fellomyces,線黑粉菌(Filobasidium)，Galactomyces,地霉(Geotrichum),小季酵母(Guilliermondella)，有抱漢遜酵母(Hanseniaspora)， Hansenula, Hasegawaea,Holtermannia，連鎖酵母(Hormoascus)，Hyphopichia，伊薩酵母(Issatchenkia)，克勒克酵母(Kloeckera)，Kloeckeraspora，克魯維酵母(Kluyveromyces)，Kondoa, Kuraishia,Kurtzmanomyces,白色冬抱酵母(Leucosporidium)，油脂酵母(Lipomyces)，類德酵母(Lodderomyces)，Malassezia,酶奇酵母(Metschnikowia)，Mrakia, Myxozyma,納遜酵母(Nadsonia)，Nakazawaea，針抱酵母(Nematospora)，Ogataea，卵抱酵母(Oosporidium)，管囊酵母(Pachysolen)，厚壁抱酵母(Phachytichospora)，范菲亞酵母(Phaffia)，畢赤酵母(Pichia)，紅色冬抱酵母(Rhodosporidium)，紅酵母(Rhodotorula)，糖酵母(Saccharomyces)，類酵母(Saccharomycodes)，復(fù)膜抱子酵母(Saccharomycopsis)，Saitoella, Sakaguchia, Saturnospora，裂芽酵母(Schizoblastospor1n)，裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces)，許旺氏酵母(Schwann1myces)，鎖合擲抱酵母(Sporid1bolus)，擲孢酵母(Sporobolomyces)，孢皮肥厚酵母(Sporopachydermia)，冠囊酵母(Stephanoascus)，梗抱酵母(Sterigmatomyces)，擬梗抱酵母(Sterigmatosporidium)，Symb1taphrina,合軸酵母(Sympod1myces)， Sympod1mycopsis,有抱圓酵母(Torulaspora)，Trichosporiella，絲抱酵母(Trichosporon)，三角酵母(Trigonopsis)，Tsuchiyaea, Uden1myces, Waltomyces,威克酵母(Wickerhamia)，擬威克酵母(Wickerhamiella)，擬威爾酵母(Will1psis)，Yamadazyma，耶羅酵母(Yarrowia)，接合酵母(Zygoascus)，接合糖酵母(Zygosaccharomyces)，Zygowill1psis 和 Zygozyma0
42.權(quán)利要求40的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述酵母選自下組:釀酒酵母(即啤酒糖酵母)(Saccharomyces cerevisiae)，巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)，粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，布魯塞爾德克酵母(Dekkera bruxellensis)，乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis)(以前稱為乳酸酵母(Saccharomyces Iactis))，馬克斯克魯維酵母(Kluveromyces marxianus)，Arxula adeninivorans，和多形漢森酵母(Hansenula polymorpha)(現(xiàn)稱為 Pichia angusta)。
43.權(quán)利要求40的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述酵母選自下組:解脂假絲酵母(Candida lipolytica)，季也蒙氏假絲酵母(Candida guilliermondii)，克魯斯氏假絲酵母(Candida krusei)，假熱帶假絲酵母(Candida pseudotropicalis)，和產(chǎn)|元假絲酵母(Candida utilis)。
44.權(quán)利要求40的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述酵母是釀酒酵母。
45.權(quán)利要求44的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其中所述酵母是選自下組的釀酒酵母株:面包酵母(Baker，s yeast), CBS7959, CBS7960, CBS7961, CBS7962, CBS7963, CBS7964,IZ-1904，TA, BG-1，CR-1，SA-1, M-26，Y-904，PE-2, PE-5, VR-1, BR-1，BR-2, ME-2，VR-2,MA-3, MA-4, CAT-1, CB-1, NR-1, BT-1 和 AL-10
46.能夠生成類異戊二烯的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包含: (a)編碼甲羥戊酸(MEV)途徑中一種或多種用于生成異戊烯焦磷酸的酶的一種或多種異源核酸； (b)編碼乙酰醛脫氫酶，酰化(ADA)的異源核酸； (c)天然PDH旁路中至少一種選自下組的酶的功能性破壞:乙酰-Cok合酶I(ACSl)，乙酰-CoA合酶2 (ACS2)，和醛脫氫酶6 (ALD6)； (d)編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶(PK)的異源核酸；和 (e)編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶(PTA)的異源核酸。
47.能夠生成類異戊二烯的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包含: (a)編碼甲羥戊酸(ME V)途徑中一種或多種用于生成異戊烯焦磷酸的酶的一種或多種異源核酸，其中該一種或多種酶包括利用NADH的HMG-CoA還原酶； (b)編碼乙酰醛脫氫酶，酰化(ADA)的異源核酸；和 (c)天然PDH旁路中至少一種選自下組的酶的功能性破壞:乙酰-Cok合酶I(ACSl)，乙酰-CoA合酶2 (ACS2)，和醛脫氫酶6 (ALD6)。
48.能夠生成類異戊二烯的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包含: (a)編碼甲羥戊酸(MEV)途徑中一種或多種用于生成異戊烯焦磷酸的酶的一種或多種異源核酸，其中該一種或多種酶包括利用NADH的HMG-CoA還原酶； (b)編碼乙酰醛脫氫酶，?；?ADA)的異源核酸； (c)天然PDH旁路中至少一種選自下組的酶的功能性破壞:乙酰-Cok合酶I(ACSl)，乙酰-Cok合酶2 (ACS2)，和醛脫氫酶6 (ALD6)； (d)編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶(PK)的異源核酸；和 (e)編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶(PTA)的異源核酸。
49.能夠生成類異戊二烯的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包含: (a)編碼甲羥戊酸(MEV)途徑中一種或多種用于生成異戊烯焦磷酸的酶的一種或多種異源核酸，其中該一種或多種酶包括乙酰-CoA:丙二酰-CoA?；D(zhuǎn)移酶； (b)編碼乙酰醛脫氫酶，?；?ADA)的異源核酸；和 (c)天然PDH旁路中至少一種選自下組的酶的功能性破壞:乙酰-Cok合酶I(ACSl)，乙酰-CoA合酶2 (ACS2)，和醛脫氫酶6 (ALD6)。
50.能夠生成類異戊二烯的經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包含: (a)編碼甲羥戊酸(MEV)途徑中眾多用于生成異戊烯焦磷酸的酶的一種或多種異源核酸，其中該眾多酶包括乙酰-CoA:丙二酰-CoA?；D(zhuǎn)移酶和利用NADH的HMG-CoA還原酶； (b)編碼乙酰醛脫氫酶，?；?ADA)的異源核酸； (c)天然PDH旁路中至少一種選自下組的酶的功能性破壞:乙酰-Cok合酶I(ACSl)，乙酰-Cok合酶2 (ACS2)，和醛脫氫酶6 (ALD6)；(d)編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶(PK)的異源核酸；和 (e)編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶(PTA)的異源核酸。
51.生產(chǎn)類異戊二烯的方法，其包括: (a)在適于生成所述類異戊二烯化合物的條件下在含碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1-50中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的酵母細(xì)胞的群體；并 (b)自該培養(yǎng)基回收所述類異戊二烯化合物。
52.權(quán)利要求51的方法，其中以大于每升培養(yǎng)基約10克的量生成所述類異戊二烯化合物。
53.權(quán)利要求51的方法，其中以大于每克細(xì)胞干重約50mg的量生成所述類異戊二烯化合物。
54.權(quán)利要求51-53中任一項(xiàng)的方法,其中與不包含編碼所述ADA的異源核苷酸序列的相同宿主細(xì)胞相比，所述宿主細(xì)胞以升高的量生成類異戊二烯化合物。
55.權(quán)利要求5 4的方法，其中所述升高的量是至少10%。
【文檔編號】C12P23/00GK104039974SQ201280066027
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月9日
【發(fā)明者】T·S·加德納, K·M·霍金斯, A·L·梅多斯, A·E·聰, Y·策加耶 申請人:阿邁瑞斯公司