專利名稱：使用甲酰－甘氨酸生成酶(fge)對多種硫酸酯酶缺乏癥和其它病癥進行診斷和治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
此發(fā)明涉及診斷和治療多種硫酸酯酶缺乏癥(MSD)以及其它硫酸酯酶缺乏癥的方法和組合物。更特異地，本發(fā)明涉及被分離的調(diào)節(jié)硫酸酯酶翻譯后修飾的分子。這類修飾為硫酸酯酶的正確功能所必需。
背景技術(shù)：
硫酸酯酶是高度保守的基因家族的成員，共享廣泛的序列同源性(Franco，B.等，Cell，1995，8115-25；Parenti，G.等，Curr.Opin.Gen.Dev.，1997，7386-391)，高度的結(jié)構(gòu)類似性(Bond，C.S.等，Structure，1997，5277-289；Lukatela，G.等，Biochemistry，1998，373654-64)，和獨特的為硫酸酯斷裂所必需的翻譯后修飾(Schmidt，B.等，Cell，1995，82271-278；Selmer，T.等，Eur.J.Biochem.，1996，238341-345)。翻譯后修飾包括對保守的半胱氨酸(在真核細胞中)或絲氨酸(在某些原核細胞中)殘基在Cβ處的氧化，得到L-Cα-甲酰甘氨酸(也叫做FGly；2-氨基-3-氧代丙酸)，其中醛基代替了側(cè)鏈的硫代甲基基團。醛基是硫酸酯酶催化位點的必需部分，很可能作為醛水合物起作用。成對的羥基之一在硫酸酯斷裂時接受硫酸基團，導(dǎo)致共價硫酸化的酶中間物的形成。其它羥基是隨后的硫酸基團消去和醛基再生所需要的。此修飾在初生硫酸酯酶多肽輸入期間或間隔很短時間之后發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并被圍繞著將被修飾的半胱氨酸(或絲氨酸)殘基的短線性序列所調(diào)控。此高度保守序列是六肽L/V-C(S)-X-P-S-R(SEQ ID NO32)，出現(xiàn)在所有真核細胞硫酸酯酶的N末端區(qū)域，并最頻繁地在殘基X上攜帶羥基或硫羥基(Dierks，T.等，Proc.Natl.Acad .Sci.U.S.A.，1997，9411963-11968)。
迄今為止，已在人體中鑒別出13個硫酸酯酶基因。它們編碼具有不同底物專一性和亞細胞定位如溶酶體、高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的酶。這些基因中的四種ARSG，ARSD，ARSE，和ARSF(分別編碼芳基硫酸酯酶C，D，E和F)，位于相同的染色體區(qū)域(Xp22.3)內(nèi)。它們共享顯著的序列類似性和幾乎相同的基因組組織方式，說明它們來源于在進化中近來才發(fā)生的復(fù)制事件(Franco B等，Cell，1995，8115-25；Meroni G等，Hum Mol Genet，1996，5423-31)。
由單獨硫酸酯酶活性的缺乏所引起的至少八種人單基因疾病的鑒定，強調(diào)了硫酸酯酶在人體代謝中的重要性。這些病癥中的大部分是溶酶體存貯病，其中，表型結(jié)果源于被儲存物質(zhì)的類型和組織分布。在它們中，有五種不同類型的因硫酸酯酶對粘多糖分解代謝作用的缺乏而引起的粘多糖病(MPS類型II，IIIA，IIID，IVA和VI)(Neufeld和Muenzer，2001，The mucopolysaccharidoses，In The Metabolicand Molecular Bases of Inherited Disease，C.R.Scriver，A.L.Beaudet，W.S.Sly，D.Valle，B.Childs，K.W.Kinzler和B.Vogelstein編，New YorkMc Graw-Hill，pp.3421-3452)，和以腦硫脂在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中儲存并引起嚴重和漸進性神經(jīng)退化為特征的異常染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(MLD)。兩種另外的人類疾病由非溶酶體硫酸酯酶缺乏引起。這些包括X-連鎖的魚鱗病，因類固醇硫酸酯酶(STS/ARSC)缺乏而引起的皮膚??；和點狀軟骨發(fā)育不全，由芳基硫酸酯酶E(ARSE)缺乏引起的影響骨和軟骨的疾病。硫酸酯酶也牽涉到藥物誘導(dǎo)的人畸形綜合癥，例如Warfarin胚胎病，由懷孕期間在宮內(nèi)暴露于殺鼠靈而抑制ARSE活性所引起。
在引起人興趣的人類單基因疾病中，多種硫酸酯酶缺乏癥(MSD)是所有硫酸酯酶活性同時有缺陷。因此，此嚴重的多系統(tǒng)性疾病的表型結(jié)合了在單獨硫酸酯酶缺乏中所觀察到的特征。來自多種硫酸酯酶缺乏癥患者的細胞即使以編碼人硫酸酯酶的cDNAs轉(zhuǎn)染之后也缺乏硫酸酯酶活性，暗示所有硫酸酯酶活性所需要的普遍機制的存在(Rommerskirch和von Figura，Proc.Natl.Acad Sci.，USA，1992，892561-2565)。硫酸酯酶的翻譯后修飾被發(fā)現(xiàn)在多種硫酸酯酶缺乏癥患者中有缺陷，暗示此疾病由基因的突變所引起，該基因牽涉到半胱氨酸至甲酰甘氨酸的轉(zhuǎn)化機制(Schmidt，B.等，Cell，1995，82271-278)。盡管存在強烈的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)興趣，以鑒別此基因為目標的努力卻被多種硫酸酯酶缺乏癥患者的稀有性和隨之帶來的缺乏合適的家族病例而無法完成遺傳圖譜繪制所妨礙。
發(fā)明概述本發(fā)明提供診斷和治療多種硫酸酯酶缺乏癥(MIM 272200)及治療其它硫酸酯酶缺乏癥的方法和組合物。更特異地，已鑒別出編碼甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的基因，此酶負責發(fā)生于硫酸酯酶的獨特的翻譯后修飾(形成L-Cα-甲酰甘氨酸；也叫做FGly和/或2-氨基-3-氧代丙酸)，該翻譯后修飾為硫酸酯酶功能所必需。已發(fā)現(xiàn)，出乎意料的是FGE基因中的突變導(dǎo)致受試者中的多種硫酸酯酶缺乏癥(MSD)的發(fā)展。也發(fā)現(xiàn)，出乎意料的是FGE增強了硫酸酯酶的活性，包括但不限于，艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1，HSulf-2，HSulf-3，HSulf-4，HSulf-5，和HSulf-6?？紤]到這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的分子可用于診斷和治療多種硫酸酯酶缺乏癥以及其它硫酸酯酶缺乏癥。
在多種硫酸酯酶缺乏癥的診斷中應(yīng)用本發(fā)明的分子的方法被提供。
另外，為調(diào)節(jié)硫酸酯酶上FGly形成的目的而在體內(nèi)或體外應(yīng)用這些分子的方法，治療與這種修飾相關(guān)的病癥的方法，和對制備治療多種硫酸酯酶缺乏癥及其它硫酸酯酶缺乏癥的藥學(xué)制劑有用的組合物，也被提供。
本發(fā)明因此在幾個方面包括調(diào)節(jié)硫酸酯酶上FGly形成的多肽，分離的編碼那些多肽的核酸，它們的功能修飾物和變體，它們的有用的片段，以及與其相關(guān)的治療、診斷和研究的方法、組合物與工具。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，選自下列的分離的核酸分子被提供(a)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列所組成的分子在嚴格條件下雜交的核酸分子，該核酸分子編碼具有Cα-甲酰甘氨酸生成活性的甲酰甘氨酸生成酶(FGE)；(b)與(a)的核酸分子在密碼子序列上因遺傳密碼簡并性而有所區(qū)別的核酸分子；和(c)(a)或(b)的互補鏈。在一定的實施方案中，分離的核酸分子包括SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。在某些實施方案中，分離的核酸分子由SEQ ID NO3所示的核苷酸序列或其片段組成。
本發(fā)明的另一方面提供分離的選自下列的核酸分子(a)SEQ IDNO1所示的核苷酸序列的獨特(unique)片段，和(b)(a)的互補鏈，條件是(a)中的獨特片段包括了不與某些序列相同的連續(xù)核苷酸序列，所述某些序列選自(1)與SEQ ID NO.4和/或SEQ ID NO.4的核苷酸20-1141相同的序列，和(2)(1)中核酸分子的互補鏈。在任何前述的實施方案中，互補鏈指全長互補鏈。
在一個實施方案中，連續(xù)核苷酸序列選自(1)至少兩個不與序列組完全相同的連續(xù)核苷酸，(2)至少三個不與序列組完全相同的連續(xù)核苷酸，(3)至少四個不與序列組完全相同的連續(xù)核苷酸，(4)至少五個不與序列組完全相同的連續(xù)核苷酸，(5)至少六個不與序列組完全相同的連續(xù)核苷酸，和(6)至少七個不與序列組完全相同的連續(xù)核苷酸。
在另一實施方案中，片段大小選自至少8個核苷酸，10個核苷酸，12個核苷酸，14個核苷酸，16個核苷酸，18個核苷酸，20個核苷酸，22個核苷酸，24個核苷酸，26個核苷酸，28個核苷酸，30個核苷酸，40個核苷酸，50個核苷酸，75個核苷酸，100個核苷酸，200個核苷酸，1000個核苷酸和其間的每一整數(shù)長度。
根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供包含上述核酸分子的表達載體和以該表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。
根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供表達內(nèi)源FGE基因的活化形式的細胞。在一個實施方案中，內(nèi)源FGE基因的活化通過同源重組發(fā)生。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，分離的多肽被提供。分離的多肽被前述的本發(fā)明核酸分子所編碼。在某些實施方案中，分離的多肽被SEQ IDNO1的核酸編碼，產(chǎn)生出具有SEQ ID NO2序列和Cα-甲酰甘氨酸生成活性的多肽。在其它的實施方案中，分離的多肽也許是前述的片段或變體，其長度足以代表人基因組中獨特序列并且是具有Cα-甲酰甘氨酸生成活性的多肽，條件是該片段包括不與任何被具有SEQ ID NO.4的核酸序列所編碼的序列相同的連續(xù)氨基酸的序列。在另一實施方案中，上述多肽分子的免疫源性片段被提供。免疫源性片段也許具有也許不具有Cα-甲酰甘氨酸生成活性。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，分離的結(jié)合多肽被提供，其選擇性地與前述的本發(fā)明核酸分子所編碼的多肽結(jié)合。優(yōu)選分離的結(jié)合多肽選擇性地結(jié)合包含SEQ ID NO2序列的多肽、其片段或?qū)儆诜蛛x的具有Cα-甲酰甘氨酸生成活性的多肽家族而在本文其它部分所述的多肽。在優(yōu)選的實施方案中，分離的結(jié)合多肽包括抗體和抗體片段(如Fab，F(xiàn)(ab)2，F(xiàn)d和包括了與FGE多肽選擇性結(jié)合的CDR3區(qū)域的抗體片段)。在一定的實施方案中，抗體是人抗體。在某些實施方案中，抗體是單克隆抗體。在某一實施方案中，抗體是多克隆抗血清。在進一步的實施方案中，抗體是人源化的。在更進一步的實施方案中，抗體是嵌合的。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，具有Cα-甲酰甘氨酸生成活性的分離的多肽的家族被提供。每一所述多肽從氨基端到羧基端包含(a)氨基端亞結(jié)構(gòu)域1；亞結(jié)構(gòu)域2；包含35到45個氨基酸的羧基端亞結(jié)構(gòu)域3，而其中亞結(jié)構(gòu)域3與選自SEQ ID NO.2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，和78的多肽的亞結(jié)構(gòu)域3具有至少約75％的同源性和大致相同的長度。在重要的實施方案中，亞結(jié)構(gòu)域2含有120到140個氨基酸。在進一步的重要實施方案中，亞結(jié)構(gòu)域2中至少5％的氨基酸是色氨酸。在某些實施方案中，亞結(jié)構(gòu)域2與選自SEQ ID NO.2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，和78的多肽的結(jié)構(gòu)域2之間具有至少50％的同源性。在一定的實施方案中，每一多肽的亞結(jié)構(gòu)域3與選自SEQ ID NO.2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，和78的多肽的亞結(jié)構(gòu)域3具有介于約80％和約100％之間的同源性。
根據(jù)本發(fā)明進一步的方面，用于測定某一受試者中的FGE表達水平的方法被提供。方法包括測量來自某一受試者的測試樣本中的FGE表達以確定FGE在受試者中的表達水平。在一定的實施方案中，測得的測試樣本中的FGE表達與對照樣本(含有已知FGE表達水平)中的FGE表達進行比較。表達被定義成FGE mRNA表達，F(xiàn)GE多肽表達，或如本文其它部分所定義的FGE的Cα-甲酰甘氨酸生成活性。多種方法能用于測量表達。本發(fā)明優(yōu)選的實施方案包括用于測量mRNA表達的PCR和RNA印跡，作為測量FGE多肽表達的試劑的FGE單克隆抗體或FGE多克隆抗血清，以及測量FGE Cα-甲酰甘氨酸生成活性的方法。
在一定的實施方案中，測試樣本例如活檢樣本和生物液體如血液被用作測試樣本。FGE在某一受試者的測試樣本中的表達與對照樣本中的FGE表達比較。
根據(jù)本發(fā)明另一方面，用于鑒別在調(diào)節(jié)分子的Cα-甲酰甘氨酸生成活性中有用的物質(zhì)的方法被提供。方法包括(a)將具有Cα-甲酰甘氨酸生成活性的分子與候選物質(zhì)接觸，(b)測量該分子的Cα-甲酰甘氨酸生成活性，和(c)將測得的該分子Cα-甲酰甘氨酸生成活性與對照進行比較以確定候選物質(zhì)是否調(diào)節(jié)分子的Cα-甲酰甘氨酸生成活性，其中該分子是具有選自SEQ ID NO1，3，4，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和80-87的核苷酸序列的核酸分子，或其表達產(chǎn)物(例如，具有選自SEQ ID NO.2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，和78的序列的肽)。在一定的實施方案中，對照是在缺乏候選物質(zhì)的條件下測得的該分子的Cα-甲酰甘氨酸生成活性。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，在受試者中診斷多種硫酸酯酶缺乏癥的方法被提供。方法包括將生物樣本與試劑接觸，所述生物樣本來自被懷疑具有多種硫酸酯酶缺乏癥的受試者，所述試劑特異結(jié)合選自下面的分子(i)具有SEQ ID NO1，3，或4核苷酸序列的FGE核酸分子，(ii)核酸分子(i)的表達產(chǎn)物，或(iii)(ii)的表達產(chǎn)物的片段；以及測量結(jié)合的試劑數(shù)量并由此確定所述核酸分子或其表達產(chǎn)物的表達是否異常，異常表達表明受試者患有多種硫酸酯酶缺乏癥。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，用于對特征為核酸分子或其表達產(chǎn)物的異常表達的病癥進行診斷的方法被提供。方法包括將來自受試者的生物樣本與試劑接觸，其中所述試劑特異結(jié)合所述核酸分子、其表達產(chǎn)物或其表達產(chǎn)物的片段；并測量結(jié)合的試劑數(shù)量并由此確定所述核酸分子或其表達產(chǎn)物的表達是否異常，異常表達表明具有所述病癥，其中所述核酸分子具有SEQ ID NO1核苷酸序列而所述病癥是多種硫酸酯酶缺乏癥。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，用于在受試者中測量特征為核酸分子或其表達產(chǎn)物的異常表達的多種硫酸酯酶缺乏癥的方法被提供。方法包括對來自患者的樣本監(jiān)測選自下面的參數(shù)(i)具有SEQ ID NO1，3，4的核苷酸序列的核酸分子或具有來源于FEG基因組位點的序列的核酸分子，(ii)所述核酸分子編碼的多肽，(iii)來源于所述多肽的肽，和(iv)選擇性結(jié)合所述多肽或肽的抗體，將它們作為對受試者中的多種硫酸酯酶缺乏癥的測定。在某些實施方案中，樣本是如前述實施方案任一項所描述的生物液體或組織。在一定的實施方案中，監(jiān)測步驟包括將樣本與選自下面的可檢測的試劑接觸(a)在嚴格條件下與(i)中的核酸分子選擇性雜交的分離的核酸分子，(b)選擇性結(jié)合(ii)中的多肽或(iii)中的肽的抗體，和(c)與(iv)中的抗體結(jié)合的多肽或肽?？贵w、多肽、肽或核酸能用放射性標記或酶進行標記。在進一步的實施方案中，方法進一步包含檢驗樣品中的肽。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，試劑盒被提供。試劑盒包含包裝，包裝包含選擇性結(jié)合前述FGE的分離的核酸或其表達產(chǎn)物的任一種的試劑，和用于與測量值比較的對照，此測量值為所述試劑與前述FGE的分離的核酸或其表達產(chǎn)物的任一種結(jié)合的測量值。在某些實施方案中，對照是用于與測量值比較的預(yù)定值。在一定的實施方案中，對照包含前述FGE的分離的核酸的任一種的表達產(chǎn)物的表位。在一種實施方案中，試劑盒進一步包含選擇性結(jié)合選自下面的多肽的第二試劑艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶，硫酸胺酶(sulfamidase)，N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1，HSulf-2，HSulf-3，HSulf-4，HSulf-5，和HSulf-6，或其肽段，和用于與所述第二試劑結(jié)合到所述多肽或其肽段的測量值進行比較的對照。
根據(jù)本發(fā)明進一步的方面，治療多種硫酸酯酶缺乏癥的方法被提供。方法包括對需要這種治療的受試者施用調(diào)節(jié)Cα-甲酰甘氨酸生成活性的試劑，用量為治療受試者的多種硫酸酯酶缺乏癥的有效量。在某些實施方案中，方法進一步包含某一試劑的共施用，所述試劑選自編碼艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1，HSulf-2，HSulf-3，HSulf-4，HSulf-5，或HSulf-6的核酸分子，該核酸分子的表達產(chǎn)物，和該核酸分子的表達產(chǎn)物的片段。在一定的實施方案中，調(diào)節(jié)Cα-甲酰甘氨酸生成活性的試劑是本發(fā)明的分離的核酸分子(例如如權(quán)利要求1-8所要求的核酸分子或具有選自SEQ ID NO1，3，4，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和80-87的序列的核酸)。在重要的實施方案中，調(diào)節(jié)Cα-甲酰甘氨酸生成活性的試劑是本發(fā)明的肽(例如，如權(quán)利要求11-15，19，20所要求的肽，或具有選自SEQ ID NO.2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，和78的序列的肽)。調(diào)節(jié)Cα-甲酰甘氨酸生成活性的試劑可通過表達內(nèi)源和/或外源FGE核酸分子的細胞產(chǎn)生。在重要的實施方案中，內(nèi)源FGE核酸分子可被活化。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，用于在受試者中增加Cα-甲酰甘氨酸生成活性的方法被提供。方法包括施用本發(fā)明的分離的FGE核酸分子(例如，權(quán)利要求1-8的核酸分子，或具有選自SEQ ID NO1，3，4，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和80-87的序列的核酸)，和/或其表達產(chǎn)物到受試者中，用量為在受試者中增加Cα-甲酰甘氨酸生成活性的有效量。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，用于治療患多種硫酸酯酶缺乏癥的受試者的方法被提供。方法包括對需要這種治療的受試者施用調(diào)節(jié)Cα-甲酰甘氨酸生成活性的試劑，用量為在受試者中增加Cα-甲酰甘氨酸生成活性的有效量。在某些實施方案中，調(diào)節(jié)Cα-甲酰甘氨酸生成活性的試劑是本發(fā)明的有義核酸(例如，權(quán)利要求1-8的核酸分子，或具有選自SEQ ID NO1，3，4，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和80-87的序列的核酸)。在一定的實施方案中，調(diào)節(jié)Cα-甲酰甘氨酸生成活性的試劑是本發(fā)明的分離的多肽(例如，權(quán)利要求11-15，19，20的多肽或具有選自SEQ ID NO.2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，和78的序列的肽)。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，用于在細胞中增加Cα-甲酰甘氨酸生成活性的方法被提供。方法包括將細胞與本發(fā)明的分離的核酸分子接觸(例如，權(quán)利要求1-8的核酸分子，或具有選自SEQ ID NO1，3，4，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和80-87的序列的核酸)，或其表達產(chǎn)物，用量為在細胞中增加Cα-甲酰甘氨酸生成活性的有效量。在重要的實施方案中，方法包括活化內(nèi)源FGE基因以在細胞中增加Cα-甲酰甘氨酸生成活性。
根據(jù)本發(fā)明進一步的方面，藥物組合物被提供。組合物包含治療多種硫酸酯酶缺乏癥的藥學(xué)有效量的某種試劑，該試劑含有本發(fā)明的分離的核酸分子(例如，權(quán)利要求1-8中任一項的分離的核酸分子，具有選自SEQ ID NO1，3，4，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和80-87序列的FGE核酸分子)，或其表達產(chǎn)物，以及藥學(xué)上可接受的載體。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，用于鑒別在治療多種硫酸酯酶缺乏癥中有用的候選物質(zhì)的方法被提供。方法包括測定一套核酸分子在細胞或組織中的表達，條件是缺乏候選物質(zhì)時，允許該套核酸分子的最初量的表達，其中該套核酸分子包含至少一種選自下面的核酸分子(a)嚴格條件下與由SEQ ID NO1所示核苷酸序列組成的分子雜交并編碼具有Cα-甲酰甘氨酸生成活性(FGE)的多肽的核酸分子，(b)遺傳密碼簡并性引起的在密碼子序列中與(a)或(b)中核酸分子不同的核酸分子，(c)具有選自SEQ ID NO1，3，4，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和80-87的序列的核酸分子，和(d)(a)或(b)或(c)的互補鏈，將細胞或組織與候選物質(zhì)接觸并探測該套核酸分子表達的測試量，其中在候選物質(zhì)存在的條件下表達的測試量相對于表達最初量的增加表明候選物質(zhì)在治療多種硫酸酯酶缺乏癥中有用。
根據(jù)本發(fā)明進一步的方面，制備在治療多種硫酸酯酶缺乏癥和/或其它硫酸酯酶缺乏癥中有用的藥劑的方法被提供。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，固相核酸分子陣列被提供。陣列基本上由固定于固相基質(zhì)的一套核酸分子、其表達產(chǎn)物或其片段(或是核酸的或是多肽分子的)組成，每一核酸分子編碼選自下面的多肽SEQ ID NO.2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，和78，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1，HSulf-2，HSulf-3，HSulf-4，HSulf-5，和HSulf-6。在某些實施方案中，固相陣列進一步包含至少一種對照核酸分子。在一定的實施方案中，該套核酸分子包含至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種或甚至至少五種核酸分子，每一種選自SEQ ID NO.2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，和78，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1，HSulf-2，HSulf-3，HSulf-4，HSulf-5，和HSulf-6。
根據(jù)本發(fā)明進一步的方面，用于在受試者中治療硫酸酯酶缺乏癥的方法被提供。方法包括對需要這種治療的受試者施用已根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)出的硫酸酯酶，用量為在受試者中治療硫酸酯酶缺乏癥的有效量，而此硫酸酯酶缺乏癥不是多種硫酸酯酶缺乏癥。在重要的實施方案中，通過已與調(diào)節(jié)Cα-甲酰甘氨酸生成活性的試劑接觸的細胞產(chǎn)生硫酸酯酶。在一定的實施方案中，硫酸酯酶缺乏癥包括但不限于粘多糖病II(MPS IIHunter綜合癥)，粘多糖病IIIA(MPS IIIA；Sanfilippo綜合癥A)，粘多糖病VIII(MPS VIII)，粘多糖病IVA(MPS IVA；Morquio綜合癥A)，粘多糖病VI(MPS VI；Maroteaux-Lamy綜合癥)，異常染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(MLD)，X-連鎖的隱性點狀軟骨發(fā)育不全1，或X-連鎖的魚鱗病(類固醇硫酸酯酶缺乏癥)。在一定的實施方案中，調(diào)節(jié)Cα-甲酰甘氨酸生成活性的試劑可以是本發(fā)明的核酸分子或肽。在一種實施方案中，硫酸酯酶和調(diào)節(jié)Cα-甲酰甘氨酸生成活性的試劑在同一細胞中共表達。硫酸酯酶和/或調(diào)節(jié)Cα-甲酰甘氨酸生成活性的試劑可以是內(nèi)源性或外源性的來源。如果是內(nèi)源性來源，它可被活化(例如，通過在本領(lǐng)域中已知的合適的位置插入強啟動子和/或其它元件)。如果是外源性的，其表達可被表達載體上的元件所驅(qū)動，或它可靶向于細胞基因組中合適的位置以允許其被增強的表達(例如，強啟動子下游)。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，藥物組合物被提供。組合物包含治療硫酸酯酶缺乏癥的藥學(xué)有效量的某種試劑，該試劑含有本發(fā)明的分離的核酸分子或其表達產(chǎn)物，及藥學(xué)上可接受的載體。
根據(jù)本發(fā)明更進一步的方面，用于在細胞中增加硫酸酯酶活性的方法被提供。方法包括將表達硫酸酯酶的細胞與本發(fā)明的分離的核酸分子(例如，權(quán)利要求1-8中任一項的分離的核酸分子，具有選自SEQID NO1，3，4，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和80-87的序列的FGE核酸分子)或其表達產(chǎn)物(例如，權(quán)利要求11-15，19，20的多肽，或具有選自SEQ ID NO.2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，和78的序列的肽)接觸，用量為在細胞中增加硫酸酯酶活性的有效量。細胞可表達內(nèi)源性和/或外源性的硫酸酯酶。在重要的實施方案中，內(nèi)源性的硫酸酯酶被活化。在一定的實施方案中，硫酸酯酶是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1，HSulf-2，HSulf-3，HSulf-4，HSulf-5，和/或HSulf-6。在一定的實施方案中，細胞是哺乳動物細胞。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，藥物組合物被提供。組合物包含治療硫酸酯酶缺乏癥的藥學(xué)有效量的被細胞產(chǎn)生的硫酸酯酶，和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述細胞已與包含本發(fā)明的分離的核酸分子(例如，權(quán)利要求1-8中的，或具有選自SEQ ID NO1，3，4，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和80-87的序列的核酸分子)，或其表達產(chǎn)物(例如，選自SEQ ID NO.2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，和78的肽)的試劑接觸。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，分離的人FGE基因的變體等位基因(其編碼變體FGE多肽)被提供。分離的變體等位基因包含某一氨基酸序列，該氨基酸序列在SEQ ID NO2中至少包含一個變異，其中這至少一個變異包含MetlArg；MetlVal；Leu20Phe；Ser155Pro；Ala177Pro；Cys218Tyr；Arg224Trp；Asn259Ile；Pro266Leu；Ala279Val；Arg327Stop；Cys336Arg；Arg345Cys；Ala348Pro；Arg349Gln；Arg349Trp；Arg349Trp；Ser359Stop；或其組合。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，分離的人類變體FGE多肽被提供。分離的人類變體FGE多肽包含某一氨基酸序列，該氨基酸序列在SEQ ID NO2中至少含有一個變異，其中這至少一個變異包含Met1Arg；Met1Val；Leu20Phe；Ser155Pro；Ala177Pro；Cys218Tyr；Arg224Trp；Asn259Ile；Pro266Leu；Ala279Val；Arg327Stop；Cys336Arg；Arg345Cys；Ala348Pro；Arg349Gln；Arg349Trp；Arg349Trp；Ser359Stop；或其組合。
以前述任何人類變體FGE多肽為免疫原的抗體也被提供。這類抗體包括多克隆抗體、單克隆、嵌合的抗體，也可被進行可探測性的標記?？商綔y性的標記也許包含放射性元素，熒光化學(xué)物或酶。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，產(chǎn)生硫酸酯酶的細胞被提供，其中被細胞產(chǎn)生的活性硫酸酯酶對總硫酸酯酶的比率得到增加。細胞包含(i)表達增強的硫酸酯酶，和(ii)表達增強的甲酰甘氨酸生成酶，其中被細胞產(chǎn)生的活性硫酸酯酶對總硫酸酯酶的比率(即，硫酸酯酶的比活性)相對于由缺乏甲酰甘氨酸生成酶的細胞產(chǎn)生的活性硫酸酯酶對總硫酸酯酶的比率至少增加5％。在一定的實施方案中，被細胞產(chǎn)生的活性硫酸酯酶對總硫酸酯酶的比率相對于由缺乏甲酰甘氨酸生成酶的細胞產(chǎn)生的活性硫酸酯酶對總硫酸酯酶的比率，增加了至少10％，15％，20％，50％，100％，200％，500％，1000％。
根據(jù)本發(fā)明進一步的方面，在受試者中治療硫酸酯酶缺乏癥的改進方法被提供。方法包括以在受試者中治療硫酸酯酶缺乏癥的有效量對需要這種治療的受試者施用硫酸酯酶，其中硫酸酯酶與有效增加硫酸酯酶比活性的量的甲酰甘氨酸生成酶接觸。在重要的實施方案中，硫酸酯酶選自艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1，HSulf-2，HSulf-3，HSulf-4，HSulf-5，和HSulf-6。在一定的實施方案中，甲酰甘氨酸生成酶被權(quán)利要求1-8的核酸分子或具有選自SEQ ID NO1，3，4，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和80-87的序列的核酸所編碼。在某些實施方案中，甲酰甘氨酸生成酶是權(quán)利要求11-15，19，20的肽，或是具有選自SEQ ID NO.2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，和78的序列的肽。
本發(fā)明的這些和其它目標將被進一步結(jié)合本發(fā)明詳細描述進行詳述。
序列簡述SEQ ID NO1是人FGE cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO2是人FGE cDNA(SEQ ID NO1)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO3是編碼SEQ ID NO2的多肽的人FGE cDNA的核苷酸序列(即，SEQ ID NO1的核苷酸20-1141)。
SEQ ID NO4是GenBank Acc.No.AK075459的核苷酸序列。
SEQ ID NO5是SEQ ID NO4翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列，一未命名的具有GenBank Acc.No.BAC11634的蛋白產(chǎn)物。
SEQ ID NO6是人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶cDNA(GenBank Acc.No.M58342)的核苷酸序列。
SEQ ID NO7是人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶cDNA(SEQ ID NO6)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO8是人硫酸胺酶cDNA(GenBank Acc.No.U30894)的核苷酸序列。
SEQ ID NO9是人硫酸胺酶cDNA(SEQ ID NO8)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO10是人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶cDNA(GenBankAcc.No.U06088)的核苷酸序列。
SEQ ID NO11是人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶cDNA(SEQ IDNO10)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO12是人N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶cDNA(GenBankAcc.No.Z12173)的核苷酸序列。
SEQ ID NO13是人N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶cDNA(SEQ IDNO12)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO14是人芳基硫酸酯酶A cDNA(GenBank Acc.No.X52151)的核苷酸序列。
SEQ ID NO15是人芳基硫酸酯酶A cDNA(SEQ ID NO14)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO16是人芳基硫酸酯酶B cDNA(GenBank Acc.No.J05225)的核苷酸序列。
SEQ ID NO17是人芳基硫酸酯酶B cDNA(SEQ ID NO16)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO18是人芳基硫酸酯酶C cDNA(GenBank Acc.No.J04964)的核苷酸序列。
SEQ ID NO19是人芳基硫酸酯酶C cDNA(SEQ ID NO18)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO20是人芳基硫酸酯酶D cDNA(GenBank Acc.No.X83572)的核苷酸序列。
SEQ ID NO21是人芳基硫酸酯酶D cDNA(SEQ ID NO20)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO22是人芳基硫酸酯酶E cDNA(GenBank Acc.No.X83573)的核苷酸序列。
SEQ ID NO23是人芳基硫酸酯酶E cDNA(SEQ ID NO22)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO24是人芳基硫酸酯酶F cDNA(GenBank Acc.No.X97868)的核苷酸序列。
SEQ ID NO25是人芳基硫酸酯酶F cDNA(SEQ ID NO24)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO26是人芳基硫酸酯酶G cDNA(GenBank Acc.No.BC012375)的核苷酸序列。
SEQ ID NO27是人芳基硫酸酯酶G(SEQ ID NO26)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO28是HSulf-1 cDNA(GenBank Acc.No.AYl01175)的核苷酸序列。
SEQ ID NO29是HSulf-1 cDNA(SEQ ID NO28)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO30是HSulf-2 cDNA(GenBank Acc.No.AYl01176)的核苷酸序列。
SEQ ID NO31是HSulf-2 cDNA(SEQ ID NO30)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO32是出現(xiàn)于硫酸酯酶的高度保守的六肽L/V-FGly-X-P-S-R。
SEQ ID NO33是合成的FGly形成底物；其一級序列是來源于人芳基硫酸酯酶A。
SEQ ID NO34是混雜寡肽PVSLPTRSCAALLTGR。
SEQ ID NO35是Ser69寡肽PVSLSTPSRAALLTGR。
SEQ ID NO36是人FGE-特異性引物1199nc。
SEQ ID NO37是人FGE-特異性正向引物1c。
SEQ ID NO38是人FGE-特異性反向引物1182c。
SEQ ID NO39是包含EcoRI位點的人5’-FGE-特異性引物。
SEQ ID NO40是HA-特異性引物。
SEQ ID NO41是c-myc-特異性引物。
SEQ ID NO42是RGS-His6-特異性引物。
SEQ ID NO43是來自人FGE制備物的胰蛋白酶解寡肽SQNTPDSSASNLGFR。
SEQ ID NO44是來自人FGE制備物的胰蛋白酶解寡肽MVPIPAGVFTMGTDDPQIK。
SEQ ID NO45是人FGE2平行進化同源物(paralog)(GenBank GI24308053)的核苷酸序列。
SEQ ID NO46是人FGE2平行進化同源物(SEQ ID NO45)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO47是小鼠FGE平行進化同源物(GenBank GI26344956)的核苷酸序列。
SEQ ID NO48是小鼠FGE平行進化同源物(SEQ ID NO47)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO49是小鼠FGE定向進化同源物(ortholog)(GenBankGI22122361)的核苷酸序列。
SEQ ID NO50是小鼠FGE定向進化同源物(SEQ ID NO49)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO51是果蠅FGE定向進化同源物(GenBank GI20130397)的核苷酸序列。
SEQ ID NO52是果蠅FGE定向進化同源物(SEQ ID NO51)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO53是蚊子FGE定向進化同源物(GenBank GI21289310)的核苷酸序列。
SEQ ID NO54是蚊子FGE定向進化同源物(SEQ ID NO53)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO55是密切相關(guān)的S.coelicolor FGE定向進化同源物(GenBank GI21225812)的核苷酸序列。
SEQ ID NO56是S.coelicolor FGE定向進化同源物(SEQ IDNO55)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO57是密切相關(guān)的C.efficiens FGE定向進化同源物(GenBank GI25028125)的核苷酸序列。
SEQ ID NO58是C.efficiens FGE定向進化同源物(SEQ ID NO57)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO59是N.aromaticivorans FGE定向進化同源物(GenBank GI23108562)的核苷酸序列。
SEQ ID NO60是N.aromaticivorans FGE定向進化同源物(SEQID NO59)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO61是M.loti FGE定向進化同源物(GenBank GI13474559)的核苷酸序列。
SEQ ID NO62是M.loti FGE定向進化同源物(SEQ ID NO61)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO63是B.fungorum FGE定向進化同源物(GenBank GI22988809)的核苷酸序列。
SEQ ID NO64是B.fungorum FGE定向進化同源物(SEQ ID NO63)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO65是S.meliloti FGE定向進化同源物(GenBank GI16264068)的核苷酸序列。
SEQ ID NO66是S.meliloti FGE定向進化同源物(SEQ ID NO65)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO67是微顫菌屬物種FGE定向進化同源物(GenBank GI14518334)的核苷酸序列。
SEQ ID NO68是微顫菌屬物種FGE定向進化同源物(SEQ ID NO67)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO69是P.putida KT2440FGE定向進化同源物(GenBankGI26990068)的核苷酸序列。
SEQ ID NO70是P.putida KT2440FGE定向進化同源物(SEQ IDNO69)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO71是R.metallidurans FGE定向進化同源物(GenBankGI22975289)的核苷酸序列。
SEQ ID NO72是R.metallidurans FGE定向進化同源物(SEQ IDNO71)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO73是P.marinus FGE定向進化同源物(GenBank GI23132010)的核苷酸序列。
SEQ ID NO74是P.marinus FGE定向進化同源物(SEQ ID NO73)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO75是C.crescentus CB15 FGE定向進化同源物(GenBank GI16125425)的核苷酸序列。
SEQ ID NO76是C.crescentus CB15 FGE定向進化同源物(SEQID NO75)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO77是M.tuberculosis Ht37Rv FGE定向進化同源物(GenBank GI15607852)的核苷酸序列。
SEQ ID NO78是M.tuberculosis Ht37Rv FGE定向進化同源物(SEQ ID NO77)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO79是出現(xiàn)在FGE定向進化同源物和平行進化同源物的亞結(jié)構(gòu)域3的高度保守六肽。
SEQ ID NO80是具有GenBank Acc.No.CA379852的FGE定向進化同源物EST片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO81是具有GenBank Acc.No.AI721440的FGE定向進化同源物EST片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO82是具有GenBank Acc.No.BJ505402的FGE定向進化同源物EST片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO83是具有GenBank Acc.No.BJ054666的FGE定向進化同源物EST片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO84是具有GenBank Acc.No.AL892419的FGE定向進化同源物EST片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO85是具有GenBank Acc.No.CA064079的FGE定向進化同源物EST片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO86是具有GenBank Acc.No.BF189614的FGE定向進化同源物EST片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO87是具有GenBank Acc.No.AV609121的FGE定向進化同源物EST片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO88是HSulf-3 cDNA核苷酸序列.
SEQ ID NO89是HSulf-3 cDNA(SEQ ID NO88)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO90是HSulf-4 cDNA核苷酸序列.
SEQ ID NO91是HSulf-4 cDNA(SEQ ID NO90)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO92是HSulf-5 cDNA核苷酸序列.
SEQ ID NO93是HSul-5 cDNA(SEQ ID NO92)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO94是HSulf-6 cDNA核苷酸序列.
SEQ ID NO95是HSulf-6 cDNA(SEQ ID NO94)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
附圖簡述

圖1在缺乏(A)或存在(B)來自牛睪丸微粒體的可溶性抽提物的條件下培育后的P23的MALDI-TOF質(zhì)譜圖示。
圖2來源于人FGE和PFAM-DUF323種子的21種蛋白的排列的系統(tǒng)發(fā)生樹。
圖3人和鼠FGE基因位點的組織。外顯子顯示為以盒子和亮盒子(鼠的位點)表示。內(nèi)含子線上的數(shù)字指出了以kb表示的內(nèi)含子大小。
圖4顯示FGE表達質(zhì)粒pXMG.1.3結(jié)構(gòu)圖的圖表。
圖5柱狀圖描述以FGE表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染的36F細胞中的N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶活性。
圖6柱狀圖描述以FGE表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染的36F細胞中的N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶比活性。
圖7柱狀圖描述以FGE表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染的36F細胞中的N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶生產(chǎn)。
圖8描述以FGE表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染的30C6細胞中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性。
圖9描述了囊括本發(fā)明的特征的試劑盒。
發(fā)明詳述本發(fā)明包括對編碼甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的基因的發(fā)現(xiàn)，此酶負責發(fā)生在硫酸酯酶上的對硫酸酯酶功能必需的獨特翻譯后修飾形成L-Cα-甲酰甘氨酸(a.k.a.FGly和/或2-氨基-3-氧代丙酸)。已發(fā)現(xiàn)，出人意料地，F(xiàn)GE基因中的突變引起受試者中的多種硫酸酯酶缺乏癥(MSD)的發(fā)展。也已發(fā)現(xiàn)，出人意料地，F(xiàn)GE增強硫酸酯酶的活性，包括但不限于，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1，HSulf-2，HSulf-3，HSulf-4，HSulf-5，和HSulf-6，及在申請?zhí)枮?0030073118，20030147875，20030148920，20030162279和20030166283的U.S.臨時申請中所述的硫酸酯酶(其內(nèi)容被清楚地整合在本文中)。考慮到這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的分子可用于診斷和/或治療多種硫酸酯酶缺乏癥，以及其它硫酸酯酶缺乏癥的治療。
在診斷多種硫酸酯酶缺乏癥中應(yīng)用本發(fā)明的分子的方法被提供。
此外，為了對硫酸酯酶上FGly的形成進行調(diào)節(jié)的目的而在體內(nèi)或體外應(yīng)用這些分子的方法，治療與這種修飾相關(guān)的病癥的方法，及在制備用于治療多種硫酸酯酶缺乏癥及其它硫酸酯酶缺乏癥的治療性制劑中有用的組合物也被提供。
本發(fā)明因此在幾個方面中包括調(diào)節(jié)硫酸酯酶上的FGly的形成的多肽，編碼這些多肽的分離的核酸，前述的功能性修飾物和變體，前述的有用片段，以及治療、診斷和研究的方法、組合物和與其相關(guān)的工具。
“Cα-甲酰甘氨酸生成活性”指分子在底物上形成FGly或增強FGly形成的能力。底物也許是如本文其它部分所述的硫酸酯酶，或合成的寡肽(參見，例如SEQ ID NO33，和實施例)。底物優(yōu)選包含SEQ IDNO32的保守六肽[L/V-C(S)-X-P-S-R]。分析FGly形成的方法如本領(lǐng)域中(參見，例如Dierks，T.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1997，9411963-11968)，和本文其它部分(參見，例如實施例)所描述。在本文中所用的“分子”包含“核酸”和“多肽”。FGE分子能在體內(nèi)和體外形成FGly，或增強/增加FGly的形成。
在本文中所用的“增強(或“增加”)”Cα-甲酰甘氨酸生成活性，典型地指增加FGE和/或它編碼的多肽表達。增加的表達指增加(即，到可探測的程度)本發(fā)明任意核酸(如本文其它部分所描述的FGE核酸)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，既然上調(diào)任何這些過程將導(dǎo)致基因(核酸)所編碼多肽的濃度/數(shù)量的增加。增強(或增加)Cα-甲酰甘氨酸生成活性也指防止或抑制FGE的降解(例如通過增加的泛素化作用)、下調(diào)等，所述降解和下調(diào)導(dǎo)致例如相對于對照被增加的或穩(wěn)定的FGE分子t1/2(半衰期)。下調(diào)或減少的表達指基因和/或它編碼的多肽減少的表達。通過使用本領(lǐng)域已知的任何適合的方法例如核酸雜交或抗體探測方法，分別探測基因(例如FGE)mRNA水平或基因所編碼的多肽的蛋白表達水平相對于對照的增加或是減少，可直接測定基因表達的上調(diào)或下調(diào)。FGE基因表達的上調(diào)或下調(diào)也能通過探測Cα-甲酰甘氨酸生成活性的變化而間接測定。
在本文中所用的“表達”指核酸和/或多肽表達，以及多肽分子的活性(例如分子的Cα-甲酰甘氨酸生成活性)。
本發(fā)明的一個方面包括對編碼FGE的cDNA的克隆。根據(jù)本發(fā)明的FGE是包含SEQ ID NO1的核酸分子的分離的核酸分子，并編碼具有Cα-甲酰甘氨酸生成活性的多肽。人FGE cDNA的序列以SEQ ID NO1而出現(xiàn)，此cDNA編碼的蛋白產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列以SEQ ID NO2出現(xiàn)。
在本文中所用的受試者是哺乳動物或非人類的哺乳動物。在所有實施方案中，人FGE和人受試者都是優(yōu)選。
本發(fā)明因此在一個方面包括分離的FGE多肽，編碼此多肽的cDNA，前述的功能性修飾物和變體，前述的有用片段，以及與其相關(guān)的診斷和治療。
在本文中所用的關(guān)于核酸的術(shù)語“分離的”表示(i)在體外通過例如聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)所擴增的；(ii)通過克隆所重組性地產(chǎn)生的；(iii)如通過切斷和凝膠分離所純化的；或(iv)通過例如化學(xué)合成所合成。分離的核酸是容易通過本領(lǐng)域眾所周知的重組DNA技術(shù)操作的類型。因此，包含在一定載體中的核苷酸序列被認為是分離的，其中所述載體的5’和3’限制性位點已知或者其聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)引物序列已被公開，但在其天然宿主中以其天然狀態(tài)存在的核酸不是分離的。分離的核酸可被充分純化，但不必這樣。例如，在克隆或表達載體內(nèi)的分離的核酸不純，這在于它在其寄生的細胞中也許只包含很少百分比的物質(zhì)。然而，這種核酸是分離的，如本文中所用的術(shù)語一樣，因為它容易通過本領(lǐng)域中一般技術(shù)人員所知道的標準技術(shù)被操作。
在本文中所用的關(guān)于多肽的術(shù)語“分離的”表示從其天然環(huán)境中被以充分純的形式分開以至于它可被操作于或用于本發(fā)明的任一目的。因此，“分離的”表示純度足以(i)用于生產(chǎn)和/或分離抗體，(ii)用作分析中的試劑，(iii)用于測序，(iv)用作治療等。
根據(jù)本發(fā)明，編碼具有Cα-甲酰甘氨酸生成活性的FGE多肽的分離的核酸分子包括(a)核酸分子，其在嚴格條件下與SEQ ID NO1的核酸所組成的分子雜交并編碼具有Cα-甲酰甘氨酸生成活性的FGE多肽，(b)(a)的刪除、添加和置換物，其編碼各自的具有Cα-甲酰甘氨酸生成活性的FGE多肽，(c)因為遺傳密碼簡并性而與(a)或(b)的核酸分子在密碼子序列中不同的核酸分子，和(d)(a)，(b)或(c)的互補鏈。在本文中所用的“互補鏈”包括“(a)，(b)或(c)的全長互補鏈或100％的互補鏈”。
也具有Cα-甲酰甘氨酸生成活性的本發(fā)明的FGE核酸的同源物和等位基因也被本發(fā)明所包含。本文所述的同源物，包括本文其它部分所鑒別的分子(參見例如SEQ ID NOs4，5，45-78，和80-87)即定向進化同源物和平行進化同源物。進一步的，同源物能依照本發(fā)明的指導(dǎo)以及傳統(tǒng)技術(shù)所鑒別。既然本文所述的FGE同源物全都具有Cα-甲酰甘氨酸生成活性，它們能與人FGE分子在本發(fā)明的所有方面中互換性使用。
因此，本發(fā)明的一個方面是那些編碼FGE多肽并在嚴格條件下與SEQ ID NO1的編碼區(qū)所組成的核酸分子雜交的核酸序列。在重要的實施方案中，如在此所用的術(shù)語“嚴格條件”指本領(lǐng)域所熟悉的參數(shù)。對核酸，被稱為嚴格的雜交條件典型的是在低離子強度和恰好低于DNA雜交復(fù)合物熔點(Tm)(典型地，低于雜交物Tm約3℃)的溫度下。更高的嚴格性限定了探針序列和靶之間更專一的相關(guān)性。核酸雜交中所用的嚴格條件在本領(lǐng)域中眾所周知，可在匯編這類方法的參考文獻中找到，例如Molecular CloningA Laboratory Manual，J.Sambrook等編，Second Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York，1989，或Current Protocolsin Molecular Biology，F(xiàn).M.Ausubel等編，John Wiley & Sons，Inc.，New York.“嚴格條件”的實例是在6xSSC中于65℃下雜交。另一嚴格條件的實例是在雜交緩沖液中于65℃下雜交，雜交緩沖液由3.5xSSC，0.02％ Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，2.5mM NaH2PO4[pH7]，0.5％SDS，2mM EDTA組成(SSC是0.15M氯化鈉/0.15M檸檬酸鈉，pH7；SDS是十二烷基硫酸鈉；而EDTA是乙二胺四乙酸)。雜交之后，轉(zhuǎn)上DNA的膜在2xSSC中于室溫下清洗，然后在最高68℃的溫度下于0.1xSSC/0.1xSDS中清洗。在進一步的實施例中，雜交水溶液的使用的替代是雜交甲酰胺溶液的使用。應(yīng)用例如50％甲酰胺溶液和42℃，嚴格的雜交條件能因此被實現(xiàn)。有其它能被應(yīng)用的條件、試劑等，并將導(dǎo)致類似的嚴格程度。技術(shù)人員將熟悉這類條件，因此它們不在這里給出。然而，需要被理解的是，技術(shù)人員將能以允許清晰鑒別本發(fā)明FGE核酸的同源物和等位基因的方式操控條件。技術(shù)人員也將熟悉對于細胞和之后將被常規(guī)分離的這類分子的表達庫進行篩選，然后再分離相關(guān)的核酸分子和序列的方法。
一般地，同源物和等位基因典型地將分別與SEQ ID NO1和SEQ IDNO2具有至少40％核苷酸同一性和/或至少50％氨基酸同一性，在某些情況下將具有至少50％核苷酸同一性和/或至少65％氨基酸同一性，而在其它情況下將具有至少60％核苷酸同一性和/或至少75％氨基酸同一性。在進一步的情形中，同源物和等位基因典型地將分別與SEQ IDNO1和SEQ ID NO2具有至少90％，95％或甚至99％的核苷酸同一性和/或至少95％，98％或甚至99％的氨基酸同一性。同一性可應(yīng)用多種由NCBI(Bethesda，Maryland)開發(fā)的公開可得的軟件工具計算得到。示例的工具包括Altschul SF等的啟發(fā)式算法(J Mol Biol，1990，215403-410)，也稱為BLAST。Pairwise和ClustalW比對(BLOSUM30矩陣設(shè)置)以及Kyte-Doolittle水療分析可應(yīng)用公開(EMBL，Heidelberg，Germany)和商業(yè)(例如來自O(shè)xford MolecularGroup/Genetics Computer Group，Madison，WI的MacVector序列分析軟件)的類型而獲得。前述核酸的Watson-Crick互補鏈也被本發(fā)明所包括。
在對FGE相關(guān)基因如FGE的同源物和等位基因的篩選中，Southern印跡可應(yīng)用前述條件以放射性探針來完成。對DNA最終轉(zhuǎn)移上去的膜進行清洗之后，此膜可放置到X-射線膠片或磷成像平板(phosphoimager plate)以探測放射性信號。
在此給定關(guān)于全長人FGE cDNA克隆的指導(dǎo)，則對應(yīng)于人FGE基因的其它哺乳動物序列如小鼠cDNA克隆可應(yīng)用標準菌落雜交技術(shù)從cDNA庫中分離。
本發(fā)明也包括含有天然物質(zhì)中出現(xiàn)的那些密碼子的替代物的簡并核酸。例如，絲氨酸殘基被密碼子TCA，AGT，TCC，TCG，TCT和AGC編碼。因此，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員將很明白，任何絲氨酸編碼核苷酸三聯(lián)體可被用于在體內(nèi)或體外指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成裝置，以將絲氨酸殘基整合進入正在延伸的FGE多肽。類似地，編碼其它氨基酸殘基的核苷酸序列三聯(lián)體包括但不限于CCA，CCC，CCG和CCT(脯氨酸密碼子)；CGA，CGC，CGG，CGT，AGA和AGG(精氨酸密碼子)；ACA，ACC，ACG和ACT(蘇氨酸密碼子)；AAC和AAT(天冬酰胺密碼子)；及ATA，ATC和ATT(異亮氨酸密碼子)。其它氨基酸殘基可類似地被若干核苷酸序列編碼。因此，本發(fā)明包括與生物學(xué)上分離的核酸在密碼子序列中因遺傳密碼簡并性而有所不同的簡并核酸。
本發(fā)明也提供分離的SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或其互補鏈的獨特片段。獨特片段是這樣的類型，它是更大的核酸的“標志”。例如，獨特片段長度足以確保其精確序列無法在人基因組中位于上述FGE核酸(及人的等位基因)之外的分子中找到。那些本領(lǐng)域中的一般技術(shù)人員可不必應(yīng)用常規(guī)之外的程序來測定片段是否在人基因組中是獨特的。然而，獨特片段排除完全由選自SEQ ID NO4和/或其它如本申請的申請日以前發(fā)表過的序列的核苷酸序列所組成的片段。
完全由前述GenBank保藏庫描述的序列所組成的片段不包括任何對于本發(fā)明序列而言獨特的核苷酸。因此，根據(jù)本發(fā)明的獨特片段必須包含除那些GenBank保藏庫中的確切序列或其片段之外的核苷酸序列。區(qū)別可以是相對于GenBank序列的添加、刪除或置換，或可以是完全不同于GenBank序列的序列。
獨特片段能在Southern和Northern印跡分析中用作探針以鑒別這類核酸，或能用于如那些采用PCR的擴增分析。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，大探針如200，250，300或更多的核苷酸優(yōu)選用于一定的應(yīng)用如Southern和Northern印跡，而更小的片段將優(yōu)選用于例如PCR。獨特片段也能被用于產(chǎn)生融合蛋白，以產(chǎn)生抗體或測定如實施例中證明的多肽片段的結(jié)合或產(chǎn)生免疫分析組分。同樣地，獨特片段可被用于產(chǎn)生例如在抗體制備、免疫分析或治療應(yīng)用中有用的FGE多肽非融合片段。獨特片段進一步地可被用作反義分子以抑制FGE核酸和多肽各自的表達。
如將被本領(lǐng)域技術(shù)人員所認識到的一樣，獨特片段的大小將依賴于其遺傳密碼中的保守性。因此，SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的部分區(qū)域和互補鏈將需要更長的節(jié)段來實現(xiàn)獨特，而其它的只需要短節(jié)段，典型的是長12和32個核苷酸之間(例如12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31和32堿基)或更長，長到公開序列的全長。如上述所提及的，此公開內(nèi)容傾向于包含每一序列的每一片段，起點在第一核苷酸、第二核苷酸等等，直到離末端剩下8個核苷酸，而終點在從第8、9、10核苷酸等等開始直到恰好最后一個核苷酸的任何位置(前提為序列是如上述的獨特片段)。事實上SEQ ID NO1區(qū)域的以核苷酸1開始而在核苷酸1180終止或SEQ ID NO3區(qū)域的以核苷酸1開始而在核苷酸1122終止的任何節(jié)段或其互補鏈，長度為20或更多核苷酸都將是獨特的。本領(lǐng)域技術(shù)人員對選擇這類序列的方法(一般是基于獨特片段選擇性區(qū)分目的序列與人類基因組中其它序列的能力)很精通，雖然可以進行體外的證實性的雜交和序列分析。
如上述所提及的，本發(fā)明包含選擇性結(jié)合編碼FGE多肽的核酸分子以減少FGE活性的反義寡核苷酸。
在本文中所用的術(shù)語“反義寡核苷酸”或“反義”描述一定的寡核苷酸，該寡核苷酸是在生理條件下與包含特定基因的DNA或該基因的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交，而因此抑制該基因的轉(zhuǎn)錄和/或該mRNA的翻譯的寡核糖核苷酸，寡脫氧核糖核苷酸，修飾后的寡核糖核苷酸，或修飾后的寡脫氧核糖核苷酸。反義分子被設(shè)計成與靶基因或轉(zhuǎn)錄物雜交以干擾靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到反義寡核苷酸的確切長度和它與其目標互補的程度將依賴于所選的特異靶，包括靶的序列和構(gòu)成那一序列的特定堿基。優(yōu)選反義寡核苷酸被構(gòu)建和安排成在生理條件下選擇性地與靶結(jié)合，即相對于靶細胞中的任何其它序列在生理條件下更充分地與靶序列雜交。基于SEQ ID NO1或基于等位基因或同源基因組和/或cDNA序列，本領(lǐng)域中的技術(shù)人員能容易地挑選和合成出大量合適的反義分子中的任何類型以根據(jù)本發(fā)明而應(yīng)用。為了具有充分的選擇性和充分有能力進行抑制，這類反義寡核苷酸應(yīng)包含與靶互補的至少10個和更多連續(xù)堿基，優(yōu)選至少15個，雖然在某些情形中長度短至7個堿基的修飾后的寡核苷酸被成功用作反義寡核苷酸(Wagner等，Nat.Med，1995，1(11)1116-1118；Nat.Biotech.，1996，14840-844)。最優(yōu)選的是，反義寡核苷酸包含20-30個堿基的互補序列。雖然對基因或mRNA轉(zhuǎn)錄物任何區(qū)段反義的寡核苷酸可被選出，在優(yōu)選實施方案中，反義寡核苷酸對應(yīng)于N端或5’上游位點例如翻譯起點、轉(zhuǎn)錄起點或啟動子位點。此外，3’-非翻譯區(qū)可被反義寡核苷酸所靶向。對mRNA拼接位點的靶向也在本領(lǐng)域中應(yīng)用，但如果替代性的mRNA拼接發(fā)生，則可能不是那么被優(yōu)選。此外，反義物優(yōu)選靶向于不希望出現(xiàn)mRNA二級結(jié)構(gòu)(參見，例如Sainio等，Cell Mol.Neurobiol.14(5)439-457，1994)和不希望出現(xiàn)蛋白結(jié)合的位點。最后，雖然SEQ ID No1公開了cDNA序列，本領(lǐng)域中的一般技術(shù)人員可容易地得到對應(yīng)于此序列的基因組DNA。因此，本發(fā)明也提供與對應(yīng)于SEQ ID NO1的基因組DNA互補的反義寡核苷酸。類似地，等位基因或同源FGE cDNAs和基因組DNAs的反義物也能應(yīng)用，而不需要過度的實驗。
在一組實施方案中，本發(fā)明的反義寡核苷酸可由“天然”脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，或它們的任意組合所組成。也就是，一種天然核苷酸的5’末端和另一天然核苷酸的3’末端可通過核苷間的磷酸二酯鍵共價連接，如在天然系統(tǒng)中的一樣。這些寡核苷酸可通過領(lǐng)域內(nèi)認可的方法制備，所述方法可人工或通過自動合成儀而實施。它們也可通過載體被重組性地產(chǎn)生。
然而，在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的反義寡核苷酸也可包括“修飾后的”寡核苷酸。也就是，寡核苷酸可通過許多不會阻止它們雜交至其目標但增強它們的穩(wěn)定性或靶向性或者增強它們的治療效力的方式被修飾。
在本文中所用的術(shù)語“修飾后的寡核苷酸”描述這樣的寡核苷酸，其中(1)其核苷酸中的至少兩個通過合成性的核苷間連接而共價連接(即，一個核苷酸5’末端和另一核苷酸3’末端之間除磷酸二酯鍵之外的連接)和/或(2)通常不與核酸連接的化學(xué)基團已被共價附著到寡核苷酸。優(yōu)選的合成性核苷間連接是硫代磷酸酯，烷基膦酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸酯，烷基硫代硫酸酯(alkylphosphonothioates)，氨基磷酸酯，氨基甲酸酯，碳酸酯，磷酸三酯，acetamidates，羧甲基酯和肽。
術(shù)語“修飾后的寡核苷酸”也包括具有被共價修飾的堿基和/或糖的寡核苷酸。例如，修飾后的寡核苷酸包括具有已在除3’位置羥基和5’位置磷酸基之外的位置共價附著到低分子量有機基團的糖骨架的寡核苷酸。因此修飾后的寡核苷酸可包括2’-O-烷基化核糖基團。此外，修飾后的寡核苷酸可包括糖，例如代替核糖的阿拉伯糖。本發(fā)明因此涉及含有修飾后的反義分子與藥學(xué)上可接受的載體的藥物制劑，所述反義分子與編碼FGE多肽的核酸互補并在生理條件下雜交。反義寡核苷酸可作為藥物組合物的一部分被施用。這類藥物組合物可包括與任何本領(lǐng)域中已知的生理性和/或藥學(xué)上可接受的標準載體組合的反義寡核苷酸。組合物應(yīng)是消毒過的，并以適合對患者施用的單位重量或體積而含有藥學(xué)有效量的反義寡核苷酸。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”表示不干擾活性成分的生物活性的效力的非毒性物質(zhì)。術(shù)語“生理上可接受的”指與生物系統(tǒng)如細胞、細胞培養(yǎng)物、組織或器官相容的非毒性物質(zhì)。載體的特征將依賴于施用途經(jīng)。生理上和藥學(xué)上可接受的載體包括本領(lǐng)域眾所周知的稀釋劑、填充物、鹽、緩沖劑、穩(wěn)定物、增溶劑和其它物質(zhì)。
本發(fā)明也包括在細胞中增加Cα-甲酰甘氨酸生成活性的方法。在重要的實施方案中，這通過應(yīng)用載體(“表達載體”和/或“靶向載體”)而完成。
在本文中所用的“載體”可以是多種某類核酸中的任何類型，所需序列可通過限制和連接而插入所述核酸以在不同遺傳環(huán)境間運輸或在宿主細胞中表達。載體典型地由DNA組成，雖然RNA載體也可用。載體包括但不限于質(zhì)粒、噬菌粒和病毒基因組?？寺≥d體是能在宿主細胞中復(fù)制，并進一步以一個或更多核酸內(nèi)切酶限制性位點為特征的類型，載體能以可測方式在所述核酸內(nèi)切酶限制性位點處被切斷，所需DNA序列可連接進入所述位點處而使得新重組載體保持其在宿主細胞中復(fù)制的能力。在質(zhì)粒的情形中，所需序列的復(fù)制可因為質(zhì)粒在宿主菌內(nèi)增加拷貝數(shù)目而發(fā)生很多次，或在宿主通過有絲分裂而復(fù)制之前在每一宿主中恰好單獨一次。在噬菌體的情形中，復(fù)制可在裂解期期間主動發(fā)生或在溶原期被動發(fā)生。“表達載體”是這樣的類型，所需DNA序列(例如SEQ ID NO3的FGE cDNA)通過限制和連接插入其中而使得所需DNA序列被可操作性地連接于調(diào)節(jié)序列并可表達為RNA轉(zhuǎn)錄物。載體可進一步包含一個或更多適合用于鑒別細胞已被或未被載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的標記序列。標記包括，例如增加或減少對抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白的編碼基因，其活性通過本領(lǐng)域中已知的標準分析可測的酶(例如β-半乳糖苷酶或堿性磷酸酶)的編碼基因，及可視性地影響轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細胞、宿主、菌落或菌斑的表型(如綠色熒光蛋白)的基因。
“靶向載體”是典型地含有一定靶向性結(jié)構(gòu)/序列的類型，所述靶向性結(jié)構(gòu)/序列用于例如在內(nèi)源性基因中(例如，在外顯子和/或內(nèi)含子序列內(nèi))，內(nèi)源性基因啟動子序列中，或內(nèi)源性基因啟動子序列上游插入調(diào)節(jié)序列。在另一實施例中，靶向載體可包含目的基因(例如SEQID NO1的cDNA所編碼的)和對基因靶向于基因組中優(yōu)選位置所需的其它序列(例如，轉(zhuǎn)錄活躍位置如無關(guān)基因的內(nèi)源啟動子下游)。靶向性構(gòu)建體和載體的構(gòu)建在U.S.Patents 5,641,670和6,270,989中詳細描述，其被清楚地整合在本文中作為參考。
事實上，任何能被異源性DNA或RNA轉(zhuǎn)化并能在培養(yǎng)基中生長或保存的細胞(原核或真核)，可被用在本發(fā)明的實踐中。實施例包括細菌細胞如大腸桿菌，昆蟲細胞，和哺乳動物如人、小鼠、倉鼠、豬、山羊、靈長類等的細胞。它們可以是原代或次級細胞株(其在培養(yǎng)中顯示有限數(shù)目的平均群體倍增而不是永久的)和永久的細胞系(其在培養(yǎng)中顯示明顯的無限壽命)。原代和次級細胞包括，例如，成纖維細胞，角質(zhì)化細胞，上皮細胞(例如乳腺上皮細胞，腸上皮細胞)，內(nèi)皮細胞，神經(jīng)膠質(zhì)細胞，神經(jīng)細胞，血液的組成成分(例如淋巴細胞，骨髓細胞)，肌肉細胞和這些體細胞類型的前體包括胚胎干細胞。在細胞將被在基因治療中應(yīng)用時，原代細胞優(yōu)選從施予操作后的細胞的個體中獲得。然而，原代細胞能從相同物種的供體(而不是受體)獲得?？膳c本發(fā)明的DNA構(gòu)建物和方法一起應(yīng)用的永久的人細胞系實例包括但不限于HT-1080細胞(ATCC CCL 121)，HeLa細胞和HeLa細胞衍生物(ATCC CCL 2，2.1和2.2)，MCF-7乳腺癌細胞(ATCC BTH 22)，K-562白血病細胞(ATCC CCL 243)，KB癌細胞(ATCC CCL 17)，2780AD卵巢癌細胞(Van der Blick，A.M.等，Cancer Res，485927-5932(1988)，Raji細胞(ATCC CCL 86)，WiDr結(jié)腸腺癌細胞(ATCC CCL 218)，SW620結(jié)腸腺癌細胞(ATCC CCL 227)，Jurkat細胞(ATCC TIB 152)，Namalwa細胞(ATCC CRLl432)，HL-60細胞(ATCC CCL 240)，Daudi細胞(ATCC CCL 213)，RPMI 8226細胞(ATCCCCL 155)，U-937細胞(ATCC CRL 1593)，Bowes黑色素瘤細胞(ATCCCRL 9607)，WI-38VA13亞系2R4細胞(ATCC CLL 75.1)，和MOLT-4細胞(ATCC CRL 1582)，CHO細胞，和COS細胞，以及通過人細胞和另一物種細胞融合而產(chǎn)生的異雜交瘤細胞。次級人成纖維細胞株，如WI-38(ATCC CCL 75)和MRC-5(ATCC CCL 171)也可被應(yīng)用。對可在實踐本發(fā)明的方法中應(yīng)用的細胞類型的進一步討論，在U.S.Patents 5,641,670和6,270,989中被描述。無細胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)也可代替細胞。
本發(fā)明的細胞被保存在本領(lǐng)域已知的條件下，這將引起FGE蛋白或其功能性片段的表達。應(yīng)用所述方法，表達的蛋白可從細胞裂解物或細胞上清中純化。根據(jù)此方法制得的蛋白質(zhì)能被制成藥學(xué)上有用的配劑，并通過本領(lǐng)域中已知的傳統(tǒng)藥學(xué)途徑而遞送至人或非人的動物(例如口服，靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，鼻內(nèi)，氣管內(nèi)或皮下)。如本文其它部分所描述的，重組細胞可以是永生化的、原代的或次級的細胞，優(yōu)選人的細胞。來自其它物種的細胞的應(yīng)用可在一定的情形中是合意的，所述情形為非人細胞有利于在所產(chǎn)生的非人FGE在藥學(xué)上有用的情況下的蛋白產(chǎn)生的目的。
在本文中所用的編碼序列和調(diào)控序列，當它們以將編碼序列的表達或轉(zhuǎn)錄置于調(diào)控序列的影響或控制之下的方式而共價連接時，被表述成“可操作性地”連接。如果期望編碼序列被翻譯成功能性蛋白質(zhì)，而假如5’調(diào)控序列中的啟動子的誘導(dǎo)導(dǎo)致編碼序列的轉(zhuǎn)錄，并且兩個DNA序列間的連接(1)不會導(dǎo)致移碼突變的引入，(2)不會干擾啟動子區(qū)域指導(dǎo)編碼序列轉(zhuǎn)錄的能力，或(3)不會干擾相應(yīng)的RNA轉(zhuǎn)錄物被翻譯成為蛋白的能力，則兩個DNA序列被表述成“可操作性地”連接。因此，如果啟動子區(qū)域能影響那一DNA序列的轉(zhuǎn)錄從而所得的轉(zhuǎn)錄物可被翻譯成所期望的蛋白或多肽，則啟動子區(qū)域?qū)⒖刹僮餍缘剡B接編碼序列。
基因表達所需的調(diào)控序列的精確本質(zhì)可在物種或細胞類型間變動，但將一般性地包括，如所必需的，于轉(zhuǎn)錄和翻譯各自啟動有關(guān)的5’非轉(zhuǎn)錄和5’非翻譯序列，如TATA盒，加帽序列，CAAT序列和類似物。尤其是，這類5’非轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列將包括包含對可操控性連接的基因進行轉(zhuǎn)錄控制的啟動子序列的啟動子區(qū)域。調(diào)控序列也可包括所期望的增強子序列或上游激動子序列。本發(fā)明的載體可隨意包括5’前導(dǎo)或信號序列。對合適載體的選擇和設(shè)計是在本領(lǐng)域一般技術(shù)人員的能力和指導(dǎo)之內(nèi)。
包含所有表達必需的元件的表達載體可商業(yè)性地獲得，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。參見，例如Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989。細胞通過編碼FGE多肽或其片段或變體的異源性DNA(RNA)被引入而基因工程化。那一DNA(RNA)被置于轉(zhuǎn)錄元件的可操作性控制之下，以允許異源DNA在宿主細胞中的表達。
用于在哺乳動物細胞中表達mRNA的優(yōu)選系統(tǒng)例如包含選擇標記如給予G418抗性的基因(其促進對穩(wěn)定性轉(zhuǎn)染的細胞系的選擇)和人細胞巨化病毒(CMV)增強子-啟動子序列的pRc/CMV(可從Invitrogen，Carlsbad，CA得到)。此外，適合在靈長類和犬類細胞系中進行表達的類型有pCEP4載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)，其包含促進質(zhì)粒作為多拷貝的染色體外元件而保存的EB病毒(EBV)復(fù)制起點。另一表達載體是包含多肽延伸因子1α的啟動子的pEF-BOS質(zhì)粒，其有效刺激了體外的轉(zhuǎn)錄。質(zhì)粒被Mishizuma和Nagata(Nuc.Acids Res.185322，1990)描述，而其在轉(zhuǎn)染實驗中的應(yīng)用已得到公開，例如，Demoulin(Mol.Cell.Biol.164710-4716，1996)。又一優(yōu)選的表達載體是Stratford-Perricaudet所述的腺病毒，其E1和E3蛋白有缺陷(J，Clin.Invest.90626-630，1992)。腺病毒作為Adeno.P1A重組體的應(yīng)用被Warnier等所公開，用于在小鼠皮內(nèi)注射以得到抗P1A的免疫化(INt.J.Cancer，67303-310，1996)。
本發(fā)明也包括所謂的表達試劑盒，其允許技術(shù)人員制備所期望的表達載體或載體。這類表達試劑盒至少包括每一前面討論的編碼序列的單獨部分。其它成分可按需要添加，只要前面提到的所需的序列被包括在內(nèi)。
也應(yīng)認識到，本發(fā)明包含上述的包含表達FGE cDNA序列的載體轉(zhuǎn)染宿主細胞和細胞系的應(yīng)用，這些細胞是原核(例如大腸桿菌)或真核性(例如CHO細胞，COS細胞，酵母表達系統(tǒng)和在昆蟲細胞中表達的桿狀病毒)的。尤其有用的是哺乳動物細胞如人，小鼠，倉鼠，豬，山羊，靈長動物等的細胞。它們可以是多種組織類型，包括如本文其它部分所描述的原代細胞和永生化的細胞系。具體實例包括HT-1080細胞，CHO細胞，樹狀細胞，U293細胞，外周血白細胞，骨髓干細胞，胚胎干細胞，和昆蟲細胞。本發(fā)明也允許細胞和動物中的FGE基因“敲除”的構(gòu)建，為研究FGE活性的某些方面提供材料。
本發(fā)明也提供被前述FGE核酸編碼的分離的多肽(包括完整蛋白和部分蛋白)，也包括SEQ ID NO2的多肽和其獨特片段。這類多肽可用于，例如，單獨或作為融合蛋白的部分去產(chǎn)生作為免疫分析成分的抗體。多肽可以是從生物樣本包括組織或細胞勻漿中分離的，也可是在多種原核或真核表達系統(tǒng)中重組性表達的，所述重組性表達通過構(gòu)建適合于表達系統(tǒng)的表達載體，將表達載體引入表達系統(tǒng)，及分離重組性表達的蛋白而完成。短多肽，包括抗原性肽(如被MHC分子呈遞在細胞表面以進行免疫識別的)也能應(yīng)用已良好建立的肽合成方法化學(xué)合成。
一般而言，F(xiàn)GE多肽的獨特片段具有如上述討論的與核酸相關(guān)的獨特片段的特征和特性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到的，獨特片段的大小將依賴于一定的因素，例如片段是否組成了保守蛋白結(jié)構(gòu)域的一部分。因此，SEQ ID NO2的部分區(qū)域?qū)⑿枰L的片段以保證獨特，而其它的只需要短片段，典型的是在5和12個氨基酸之間(例如5，6，7，8，9，10，11和12氨基酸長或者更多，包括每一整數(shù)直到全長，287個氨基酸長)。
多肽的獨特片段優(yōu)選保持明顯的多肽功能能力的那些片段?？杀槐３衷诙嚯牡莫毺仄沃械墓δ苣芰Πㄅc抗體的相互作用、與其它多肽或其片段的相互作用，與其它分子的相互作用等。一種重要的活性是作為鑒別多肽的標簽而起作用的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員很精通于選擇獨特氨基酸序列的方法，典型的是基于獨特片段從非家族成員中選擇性識別出目的序列的能力。片段的序列與那些數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比較即是所需的。
本發(fā)明包括上述FGE多肽的變體。在本文中所用的FGE多肽的“變體”是包含一種或更多對FGE多肽一級氨基酸序列的修飾的多肽。創(chuàng)造FGE多肽變體的修飾，典型的是被施加給編碼FGE多肽的核酸，可包括刪除、點突變、截斷、氨基酸置換和氨基酸或非氨基酸部分的添加，以1)減少或消除FGE多肽的活性；2)增強FGE多肽的性質(zhì)，如表達系統(tǒng)中的蛋白穩(wěn)定性或蛋白-配體結(jié)合的穩(wěn)定性；3)對FGE多肽提供新活性或性質(zhì)，如抗原性表位的添加或可探測部分的添加；或4)提供與FGE多肽受體或其它分子的相等或更好的結(jié)合。替代性地，修飾可直接施加給多肽，如通過切斷，連接分子的添加，可探測部分如生物素的添加，脂肪酸的添加和類似的方式。修飾也包括包含全部或部分FGE氨基酸序列的融合蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會熟悉預(yù)測蛋白序列變化對蛋白構(gòu)象的影響的方法，并能因此根據(jù)已知方法而“設(shè)計”FGE多肽的變體。這種方法的一個實例被Dahiyat和Mayo在Science27882-87，1997中描述，其中蛋白質(zhì)可被重新設(shè)計。此方法能被應(yīng)用于已知的蛋白，以僅改變多肽序列的一部分。通過應(yīng)用Dahiyat和Mayo的計算方法，具體的FGE多肽的變體可得到提議和被測試以測定變體是否保持了所期望的構(gòu)象。
變體可包括被專一修飾的FGE多肽，所述修飾是為了改變多肽的與其生理活性無關(guān)的特征。例如，半胱氨酸殘基能被置換或刪除以防止不必要的二硫鍵連接。類似地，一定的氨基酸可被改變以通過消除表達系統(tǒng)中由蛋白酶作用的蛋白水解而增強FGE多肽的表達(例如存在KEX2蛋白酶活性的酵母表達系統(tǒng)中的雙堿性氨基酸殘基)。
編碼FGE多肽的核酸的突變優(yōu)選保存編碼序列的氨基酸閱讀框，并優(yōu)選不在核酸中創(chuàng)造出很可能雜交以形成二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域，二級結(jié)構(gòu)例如發(fā)卡或環(huán)結(jié)構(gòu)能對變體多肽的表達有害。
突變可通過選擇氨基酸置換或多肽編碼核酸中選定位置的隨機突變而發(fā)生。變體多肽隨后得到表達，并進行對一種或更多活性的檢測，以測定哪個突變?yōu)樽凅w多肽提供了期望的性質(zhì)。進一步的對多肽的氨基酸序列而言沉默的突變可提供給變體(或非變體的FGE多肽)，但其提供在特定宿主中優(yōu)選的翻譯密碼子，或改變mRNA的結(jié)構(gòu)以，例如，增強穩(wěn)定性和/或表達。優(yōu)選的在例如大腸桿菌、哺乳動物細胞等中的核酸翻譯密碼子，對本領(lǐng)域中的一般技術(shù)人員而言眾所周知。其它突變也可提供給FGE基因或cDNA克隆的非編碼序列以增強多肽的表達。
技術(shù)人員將意識到保守氨基酸置換可發(fā)生在FGE多肽中以提供功能等同的前述多肽的變體，即，變體保持FGE多肽的功能能力。在本文中所用的“保守氨基酸置換”指不顯著改變?nèi)壗Y(jié)構(gòu)和/或多肽活性的氨基酸置換。變體可根據(jù)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的改變多肽序列的方法而制備，并包括那些在匯編這類方法的參考文獻中找到的類型，例如Molecular CloningA Laboratory Manual，J.Sambrook等編，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York，1989，或Current Protocols in MolecularBiology，F(xiàn).M.Ausubel等編，John Wiley & Sons，Inc.，New York。示例性的FGE多肽的功能等同性變體包括對SEQ ID NO2的保守氨基酸置換。保守氨基酸置換包括發(fā)生在下列組群內(nèi)部氨基酸中間的置換(a)M，I，L，V；(b)F，Y，W；(c)K，R，H；(d)A，G；(e)S，T；(f)Q，N；和(g)E，D.
因此FGE多肽的功能等同的變體，即，保持天然FGE多肽功能的FGE多肽的變體被本發(fā)明所涉及。FGE多肽氨基酸序列中產(chǎn)生功能等同性變體的保守氨基酸置換，典型地是通過編碼FGE多肽的核酸(SEQ IDNOs1，3)的改變所提供。這類置換可通過多種本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的方法而得到。例如，氨基酸置換可通過PCR導(dǎo)向突變，根據(jù)Kunkel的方法(Kunkel，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.82488-492，1985)的定點突變，或編碼FGE多肽的基因的化學(xué)合成而得到。FGE多肽的功能等同片段的活性能通過將編碼改變后的FGE多肽的基因克隆進細菌或哺乳動物表達載體，將載體引入合適的宿主細胞，表達改變后的FGE多肽，和測試在本文中公開的FGE多肽的功能能力(例如Cα-甲酰甘氨酸生成活性等)，而得到測試。
在本文中所述的發(fā)明具有許多應(yīng)用，其中的一部分在本文其它部分被描述。首先，本發(fā)明允許對FGE多肽的分離。技術(shù)從業(yè)人員眾所周知的多種方法能被用于得到分離的FGE分子。多肽可從天然產(chǎn)生多肽的細胞中通過層析方式或免疫識別而純化。替代性地，表達載體可被引入細胞以引起多肽的產(chǎn)生。在另一方法中，mRNA轉(zhuǎn)錄物可被微注射或另外地被引入細胞以引起被編碼的多肽的產(chǎn)生。FGE mRNA在無細胞抽提物如網(wǎng)織紅細胞降解系統(tǒng)中的翻譯也可被用于產(chǎn)生FGE多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可容易地遵循已知的分離FGE多肽的方法。這些包括但不限于免疫層析，HPLC，大小排阻層析，離子交換層析和免疫親和層析。
在一定的實施方案中，本發(fā)明也提供來源于FGE多肽的“顯性失活”多肽。顯性失活多肽是蛋白質(zhì)的失活變體，其通過與細胞機制相互作用而從活性蛋白與細胞機制的相互作用中取代了活性蛋白，或與活性蛋白競爭，而減小了活性蛋白的效應(yīng)。例如，與配體結(jié)合但不會轉(zhuǎn)導(dǎo)響應(yīng)于配體結(jié)合的信號的顯性失活受體能減小配體表達的生物學(xué)效應(yīng)。同樣地，與靶蛋白正常相互作用但不磷酸化靶蛋白的顯性失活催化惰性激酶，能減少靶蛋白響應(yīng)于細胞信號的磷酸化。類似地，結(jié)合到基因調(diào)控區(qū)域的啟動子位置但不增加基因轉(zhuǎn)錄的顯性失活轉(zhuǎn)錄因子能通過占據(jù)啟動子結(jié)合位置而不增加轉(zhuǎn)錄來減小正常轉(zhuǎn)錄因子的效應(yīng)。
顯性失活多肽在細胞中表達的最終結(jié)果是活性蛋白質(zhì)的功能的減少。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員能評估顯性失活蛋白變體的潛力，并用標準突變技術(shù)創(chuàng)造一種或更多顯性失活變體蛋白。參見，例如U.S.PatentNo.5,580,723和Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。技術(shù)人員隨后能測試經(jīng)誘變的蛋白群體的選定活性的減少和/或?qū)@種活性的保持力。其它類似的用于創(chuàng)造和測試蛋白的顯性失活變體的方法對本領(lǐng)域一般技術(shù)人員將是很顯然的。
FGE cDNA的分離也使技術(shù)人員可能診斷以FGE異常表達為特征的疾病。這些方法包括測定FGE基因和/或源于其的FGE多肽的表達。在前者的情形下，這類測定能通過任何標準的核酸測定分析而進行，包括聚合酶鏈式反應(yīng)，或如下面作為例子的采用標記性雜交探針的分析。在后者的情形下，這類測定能通過任何標準的(應(yīng)用例如結(jié)合到分泌出的FGE蛋白的抗體的)免疫分析而進行。優(yōu)選的可根據(jù)本發(fā)明診斷的疾病是多種硫酸酯酶缺乏癥。
本發(fā)明也包括分離的肽結(jié)合試劑，所述試劑，例如，可以是具有選擇性結(jié)合到FGE多肽的能力的抗體或抗體片段(“結(jié)合性多肽”)。抗體包括根據(jù)傳統(tǒng)方法制備的多克隆和單克隆抗體。在一定的實施方案中，本發(fā)明排除了與SEQ ID NO4的核酸所編碼的多肽結(jié)合的結(jié)合性試劑(例如抗體)。
值得注意的是，如本領(lǐng)域中眾所周知的，只有抗體分子的一小部分，即抗原互補位，涉及抗體與其表位的結(jié)合(參見，一般地，Clark，W.R.(1986)The Experimental Foundations of Modern ImmunologyWiley & Sons，Inc.，New York；Roitt，I.(1991)EssentialImmunology，7th Ed.，Blackwell Scientific Publications，Oxford)。例如，pFc’和Fc區(qū)域是補體級聯(lián)的效應(yīng)子但不涉及抗原結(jié)合。pFc’區(qū)域已被酶切掉的抗體或產(chǎn)生時不含pFc’區(qū)域的抗體，它們被稱為F(ab’)2片段，保持了完整抗體的兩個抗原結(jié)合位點。類似地，F(xiàn)c區(qū)域已被酶切掉的抗體或產(chǎn)生時不含F(xiàn)c區(qū)域的抗體，它們被稱為Fab片段，保持了完整抗體分子的一個抗原結(jié)合位點。進一步地，F(xiàn)ab片段由共價結(jié)合的抗體輕鏈和被表示為Fd的抗體重鏈的一部分所組成。Fd片段是抗體專一性的主要決定因素(單一Fd片段可與多達10條的不同輕鏈相連而不改變抗體專一性)，并且Fd片段在分離后保持表位-結(jié)合能力。
如本領(lǐng)域中眾所周知的，在抗體的抗原結(jié)合部分內(nèi)部有直接與抗原表位相互作用的互補性決定區(qū)域(CDRs)，也有保持抗體結(jié)合部位三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)架區(qū)域(FRs)(參見，一般地，Clark，1986；Roitt，1991)。在IgG免疫球蛋白重鏈Fd片段和輕鏈中，有通過三個互補決定區(qū)域(CDR1到CDR3)分別分開的四個構(gòu)架區(qū)域(FR1到FR4)。CDRs尤其是CDR3區(qū)域，更尤其是重鏈CDR3，很大程度上對抗體專一性負責。
現(xiàn)在在本領(lǐng)域中已很好地認識到，哺乳動物抗體的非CDR區(qū)域可被同種或異種特異性抗體的類似區(qū)域所替代，而保持原始抗體的表位專一性。這在制備和應(yīng)用“人源化”抗體中表現(xiàn)得最清晰，其中非-人CDRs共價連接到人FR和/或Fc/pFc’區(qū)域以產(chǎn)生功能抗體。參見，例如U.S.patents 4,816,567，5,225,539，5,585,089，5,693,762和5,859,205。因此，例如，PCT國際
發(fā)明者K·馮菲古拉, B·施密特, T·蒂爾克斯, M·W·希爾特萊恩, A·巴拉比奧, M·P·考斯瑪 申請人:核轉(zhuǎn)移治療公司