專(zhuān)利名稱(chēng)：脊髓灰質(zhì)炎病毒受體功能的調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是利用國(guó)家衛(wèi)生部所給予的CA81668政府資助完成的。因此，政府在本發(fā)明中享有一定的權(quán)利。
摘要本發(fā)明涉及干擾細(xì)胞上的脊髓灰質(zhì)炎病毒受體(PVR)所介導(dǎo)功能的分子的鑒定、分離及其用途。該分子可被用于治療有轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞、轉(zhuǎn)移灶和癌癥。本發(fā)明進(jìn)一步提供的方法有助于鑒定和分離能夠調(diào)節(jié)PVR介導(dǎo)的細(xì)胞粘附或侵襲潛能的分子。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤脫落的細(xì)胞會(huì)遷移至新組織并形成繼發(fā)瘤。生成繼發(fā)瘤的過(guò)程被稱(chēng)為轉(zhuǎn)移，這是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，其中腫瘤細(xì)胞移植位點(diǎn)遠(yuǎn)離了原發(fā)瘤。Liotta((1986)Cancer Res.46，1-7)曾對(duì)該轉(zhuǎn)移過(guò)程提出三步假設(shè)第一步是腫瘤細(xì)胞借助于細(xì)胞表面受體實(shí)現(xiàn)的附著。被錨定的腫瘤細(xì)胞緊接著分泌水解酶或誘導(dǎo)宿主細(xì)胞分泌可降解局部基質(zhì)的酶。基質(zhì)溶解最可能發(fā)生在被高度定位接近于所述腫瘤細(xì)胞表面的區(qū)域中。第三步是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)入經(jīng)由蛋白質(zhì)水解修飾的基質(zhì)區(qū)中。最近，研究集中于鑒定轉(zhuǎn)移所牽涉的特異性蛋白，這可以作為更好地診斷或改進(jìn)治療方案的基礎(chǔ)。介導(dǎo)了細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的細(xì)胞粘附分子(CAM’s)被認(rèn)為參與了上述轉(zhuǎn)移過(guò)程。正常細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞粘附包括許多細(xì)胞表面蛋白之間的相互作用。具體而言，已知粘附相互作用包括所述細(xì)胞周?chē)镔|(zhì)與胞外粘附受體之間的相互作用。同樣日漸清楚的是細(xì)胞粘附分子完成了更多可能導(dǎo)致細(xì)胞獲得增殖能力并侵襲宿主組織的復(fù)雜功能。細(xì)胞粘附受體包括諸如選擇蛋白、鈣粘附蛋白、整聯(lián)蛋白和免疫球蛋白的分子。
業(yè)已深入研究了整聯(lián)蛋白受體家族，且眾所周知粘附受體αvβ3整聯(lián)蛋白影響了腫瘤細(xì)胞功能，并潛在地參與了黑素瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Felding-Habermann等人(Clin Exp Metastasis (2002)19，427-36)的研究結(jié)果顯示整聯(lián)蛋白αvβ3的表達(dá)通過(guò)支持所述腫瘤細(xì)胞的特異性粘附、侵襲和遷移特性，從而促進(jìn)了人黑素瘤中的轉(zhuǎn)移表型。對(duì)黑素瘤細(xì)胞上表達(dá)的αvβ3的抑制顯著減少了轉(zhuǎn)移的發(fā)生，并進(jìn)一步延長(zhǎng)了動(dòng)物的存活時(shí)間。Haier等人的研究結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞粘附胞外基質(zhì)蛋白的能力是轉(zhuǎn)移形成的重要因素(Haier et al(2002)J.Exp.Ther.Oncol.2，237-45和Haier et al.(1999)Br.J.of Cancer 80，1867-74)。
轉(zhuǎn)移形成過(guò)程也取決于腫瘤細(xì)胞的侵襲力。侵襲力描述的是腫瘤細(xì)胞遷移的潛能，而忽略了胞外基質(zhì)。該胞外基質(zhì)由包括膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、糖蛋白和糖胺聚糖在內(nèi)的結(jié)締組織蛋白的超分子集合體組成。通常對(duì)組織的發(fā)育和組成具有支持和營(yíng)養(yǎng)功能，還充當(dāng)了可限制正常細(xì)胞遷移的物理障礙。盡管在腫瘤酶消化分離結(jié)締組織方面有大量資料可以利用，但與腫瘤細(xì)胞憑以穿透高度復(fù)雜的胞外基質(zhì)蛋白混合物的機(jī)制有關(guān)的信息卻較少。
發(fā)明目的因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是鑒定并分離可優(yōu)選地借助于被主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞上的受體，調(diào)節(jié)癌癥或轉(zhuǎn)移細(xì)胞的粘附和/或侵襲行為的物質(zhì)。
本發(fā)明發(fā)明者的成就是確定了一種試驗(yàn)設(shè)計(jì)，包括多種可鑒定并最終分離特定分子的功能測(cè)定試驗(yàn)，所述特定分子具有的主要特征是能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附和/或侵襲行為。在另一些試驗(yàn)中，發(fā)明者詳細(xì)說(shuō)明了參與細(xì)胞粘附和侵襲行為并受本發(fā)明所述分子調(diào)節(jié)的相關(guān)受體分子，即脊髓灰質(zhì)炎病毒受體(PVR)及其衍生物和/或類(lèi)似物。
PVR是具有N-末端信號(hào)序列、3個(gè)胞外免疫球蛋白(Ig)樣結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)的跨膜糖蛋白。也可被描述為特定免疫球蛋白超家族的成員，該免疫球蛋白超家族的分子大小約為80kDa，其特定結(jié)構(gòu)包括3個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域，具體而言是最外面的一個(gè)V樣結(jié)構(gòu)域及其后的兩個(gè)C2樣結(jié)構(gòu)域。PVR的可選名稱(chēng)是CD155。
最初，PVR被發(fā)現(xiàn)是脊髓灰質(zhì)炎的病原體，即脊髓灰質(zhì)炎病毒的細(xì)胞受體。業(yè)已相當(dāng)具體地研究了脊髓灰質(zhì)炎病毒與PVR之間的相互作用(參見(jiàn)，例如Koike et al.(1991)Proc.Nat.Acad.Sci.USA88，4104-08；Belnap et al.(2000)PNAS 97，73-78；Racaniello(1996)Structure 4，769-73；Racaniello(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，11378-81)。
盡管如此，PVR的生理學(xué)功能仍然存在大量未知，PVR的生物學(xué)重要性也剛開(kāi)始逐漸地得到闡明。Solecki等人((2002)J.Biol.Chem.277，25697-700)最近論述的是PVR/CD155參與介導(dǎo)了細(xì)胞與胞外基質(zhì)分子的粘附，并在神經(jīng)外胚層腫瘤內(nèi)被正調(diào)節(jié)。對(duì)CD155的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的分析表明存在兩種有效的CD155轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物(激活蛋白-2和核呼吸因子-1。兩種轉(zhuǎn)錄因子均在CNS發(fā)育期間被表達(dá)，并可能引導(dǎo)發(fā)展性CD155表達(dá)。CD155在神經(jīng)外胚層腫瘤內(nèi)的過(guò)量表達(dá)說(shuō)明神經(jīng)外胚層腫瘤中存在可再次激活CD155表達(dá)的基因調(diào)節(jié)途徑。
Mason等人((2001)Gut 49，236-40)的研究結(jié)果表明CD155基因在結(jié)直腸腫瘤內(nèi)也被過(guò)量表達(dá)，且該過(guò)量表達(dá)開(kāi)始于腫瘤發(fā)生的極早期，并持續(xù)至晚期。
Lange等人((2001)Virol.285，218-227)進(jìn)一步報(bào)導(dǎo)了多種脊髓灰質(zhì)炎受體相關(guān)(PRR)蛋白對(duì)細(xì)胞粘附的介導(dǎo)和特異性CD155/玻連蛋白相互作用，該相互作用似乎是在次級(jí)淋巴組織的生發(fā)中心內(nèi)建立正確免疫反應(yīng)所必需的。
但是，CD155/PVR的生理學(xué)功能尚未被完全理解。確定蛋白的生理學(xué)作用是判斷干擾該蛋白功能是否可能是治療疾病的途徑的前提。必須謹(jǐn)記的是在生理學(xué)環(huán)境中，即指例如在患者自然發(fā)生的腫瘤細(xì)胞內(nèi)，PVR被過(guò)量表達(dá)。這種過(guò)量表達(dá)可能使細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)不同，從而可以調(diào)節(jié)并改變生理學(xué)PVR功能。
相應(yīng)地，本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的目標(biāo)是提供調(diào)節(jié)PVR功能的方式和方法，從而有助于更好地理解PVR的作用。
此外，本發(fā)明的另一個(gè)進(jìn)一步的目的是研制可抑制PVR介導(dǎo)功能，諸如細(xì)胞的粘附性和/或侵襲力的藥物組合物或藥物。
發(fā)明概述本發(fā)明第一次提供了可調(diào)節(jié)對(duì)細(xì)胞粘附、運(yùn)輸、侵襲和/或轉(zhuǎn)移潛能而言必要的PVR功能的分子。這些分子選自小化合物、寡核苷酸、肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、抗體片段、抗獨(dú)特型抗體和/或生物偶聯(lián)物。
上述分子的一個(gè)特征在于它們均可特異性地與被表達(dá)在特定細(xì)胞上的PVR、CD155或其任意衍生物或類(lèi)似物的一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)或胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，所述特定細(xì)胞參與了增殖性疾病或失調(diào)，并具有轉(zhuǎn)移潛能或來(lái)源于自然發(fā)生的腫瘤。
該特異性結(jié)合本身和/或?qū)ι鲜龇肿铀B標(biāo)記的活化或誘導(dǎo)啟動(dòng)了對(duì)PVR功能的調(diào)節(jié)。換言之，由于對(duì)PVR中活性位點(diǎn)的阻斷和/或破壞，其介導(dǎo)的可影響細(xì)胞粘附、運(yùn)輸或侵襲行為的功能被誘導(dǎo)、增加、穩(wěn)定、加強(qiáng)、阻止、抑制、減少和/或削弱了。
在對(duì)可抑制自然發(fā)生的腫瘤細(xì)胞的粘附性和侵襲力的分子進(jìn)行的無(wú)偏篩選中，業(yè)已意外地鑒別出與PVR的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合并具有氨基酸序列SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的特異性抗體片段，可作為所述調(diào)節(jié)物。
本發(fā)明進(jìn)一步包括具有氨基酸序列LWLRRD(SEQ ID NO1)和/或WTGDFDY(SEQ ID NO2)的肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或抗體片段，它們均可特異性地結(jié)合PVR的胞外結(jié)構(gòu)域并抑制細(xì)胞的粘附和/或侵襲行為。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及可翻譯為SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的DNA序列(SEQ ID No.5或6)，SEQ ID NO5或6的DNA序列或同源的DNA序列，以及具有簡(jiǎn)并密碼但仍可翻譯為上述氨基酸序列的DNA序列。
本發(fā)明的一種進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及編碼本發(fā)明所述任意分子或多肽的核酸分子。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼上述任意DNA序列的表達(dá)載體，以及含有該載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了包括上述任意氨基酸序列、DNA序列或載體的藥物組合物、生物偶聯(lián)物或試劑盒。
本發(fā)明提供了可作為藥劑或藥物調(diào)節(jié)或抑制PVR功能和/或用于生產(chǎn)治療或預(yù)防自然發(fā)生的癌癥細(xì)胞的粘附、運(yùn)輸、侵襲和/或轉(zhuǎn)移潛能的藥劑或藥物的上述分子，其中所述癌癥細(xì)胞的粘附性、侵襲力和/或轉(zhuǎn)移潛能取決于PVR介導(dǎo)功能。
本發(fā)明的一種進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及鑒定有助于抑制自然發(fā)生的癌癥細(xì)胞的粘附性或侵襲力的配體的方法，尤其是對(duì)可結(jié)合PVR胞外結(jié)構(gòu)域的配體的鑒定。該方法包括的第一步是建立配體文庫(kù)。這種文庫(kù)提供的典型配體是小化合物、寡核苷酸、肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、抗體片段、抗獨(dú)特型抗體和/或生物偶聯(lián)物。該文庫(kù)隨后被用于篩選腫瘤特異性配體，進(jìn)一步檢驗(yàn)這些配體，可鑒別出在本發(fā)明進(jìn)一步提供的試驗(yàn)中調(diào)節(jié)了所述PVR功能的配體。
本發(fā)明的一種進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了若干種可確定自然發(fā)生的癌癥細(xì)胞的粘附性和/或侵襲力以及轉(zhuǎn)移潛能的診斷方法，包括分離自然發(fā)生的癌癥細(xì)胞、應(yīng)用所述試驗(yàn)以確定該細(xì)胞的粘附性或侵襲力，并分析與正常細(xì)胞相比的結(jié)果。
本發(fā)明的一種進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及治療或預(yù)防患者體內(nèi)細(xì)胞的粘附、運(yùn)輸、侵襲和/或轉(zhuǎn)移潛能的方法，其中該方法包括對(duì)需要該治療的人施用有效量的本發(fā)明所述分子、載體和/或藥物組合物。
發(fā)明詳述為使本文所述發(fā)明可以被更充分地理解，下文進(jìn)行了具體描述和定義。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目標(biāo)，即調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附、運(yùn)輸和/或侵襲行為的方案是由獨(dú)立權(quán)利要求的特征實(shí)現(xiàn)的。
業(yè)已被本發(fā)明者鑒別的上述分子具有共有特征，即它們均可特異性地結(jié)合所述PVR受體或其任意衍生物。特異性結(jié)合本發(fā)明所述PVR的分子或配體與所述PVR或其任意衍生物的結(jié)合與生理學(xué)環(huán)境無(wú)關(guān)，因而可以發(fā)生在天然存在的受體、分離受體以及柱結(jié)合受體上。
本文所用術(shù)語(yǔ)“PVR”包括最初發(fā)現(xiàn)的與CD155分子相關(guān)的脊髓灰質(zhì)炎病毒受體。本文所用的PVR進(jìn)一步包括已知相關(guān)PVR家族的任意成員，是通過(guò)可變RNA剪接產(chǎn)生的，或者是相關(guān)同源基因，即人PRR1、PRR2和PRR3基因的轉(zhuǎn)錄物(Racaniello(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.93 pp 11378-81；Lange et al.(2001)Virol.285，218-227)。下文描述的即使是完整的相關(guān)受體家族，例如CD155、PRR1-PRR3或它們的衍生物、類(lèi)似物或片段，仍采用縮寫(xiě)PVR。
本發(fā)明所述分子結(jié)合PVR的一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)或胞外區(qū)域或結(jié)構(gòu)域。PVR的胞外區(qū)被定義為PVR蛋白在細(xì)胞膜外的部分，具體而言是氨基酸26與氨基酸854之間的胞外氨基酸環(huán)。更具體而言，是V樣結(jié)構(gòu)域和2個(gè)C2樣結(jié)構(gòu)域。因此，本發(fā)明所述分子特異性地識(shí)別PVR的一個(gè)或多個(gè)表位，或上文所列PVR的保守變體的表位。
本文所用術(shù)語(yǔ)“表位”包括任何能夠特異性結(jié)合免疫球蛋白或抗體片段的蛋白決定簇。表位決定簇通常由聚集了諸如暴露的氨基酸、氨基糖的分子或其它糖側(cè)鏈的化學(xué)活性表面組成，并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，以及特定的電荷特征。應(yīng)當(dāng)理解的是，PVR是糖蛋白，所以，其上的氨基酸序列以及糖修飾均被認(rèn)為是PVR胞外區(qū)的表位或可識(shí)別部分。
本發(fā)明所述分子的特征在于另一種功能定義，即它們均具有可作為配體，例如位于活或固定細(xì)胞上的配體特異性結(jié)合PVR的能力。本文所述“特異性結(jié)合PVR”的配體可以是在實(shí)施例的指定緩沖條件下與PVR結(jié)合的配體。配體與PVR之間的解離常數(shù)可以測(cè)定，例如通過(guò)利用被稱(chēng)為BIACORE的系統(tǒng)(參見(jiàn)，例如Fivash et al.Curr OpinBiotechnol.(1998)9，97-101)，“特異性地結(jié)合”便可被理解為指如果在標(biāo)準(zhǔn)條件，例如20℃、環(huán)境壓力和在合適的緩沖液，例如含有20mM Tris、100mM NaCl和0,1mM EDTA且pH為7.0的緩沖液中進(jìn)行測(cè)定時(shí)，配體與PVR之間的解離常數(shù)小于10μM，優(yōu)選地小于1μm，更優(yōu)選地小于500、400、300、200、100、50、20nM，最優(yōu)選地是0,1nM-20nM。
此外，本發(fā)明所述分子具有調(diào)節(jié)PVR的生理學(xué)功能和/或相互作用的能力。“PVR功能調(diào)節(jié)分子”是可調(diào)節(jié)PVR的生物活性的分子，例如，是PVR表達(dá)細(xì)胞粘附胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的介導(dǎo)、是PVR表達(dá)細(xì)胞通過(guò)正常相鄰或遠(yuǎn)距組織、器官和/或胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)運(yùn)輸?shù)慕閷?dǎo)、和/或是PVR表達(dá)細(xì)胞侵襲進(jìn)入正常相鄰或遠(yuǎn)距組織、器官或胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的介導(dǎo)。通過(guò)測(cè)定一項(xiàng)或多項(xiàng)PVR生物活性指標(biāo)，諸如PVR依賴(lài)性侵襲力或PVR依賴(lài)性粘附性，可評(píng)估這種對(duì)PVR生物活性的調(diào)節(jié)。這些PVR生物活性指標(biāo)可通過(guò)體外或體內(nèi)試驗(yàn)(參見(jiàn)實(shí)例)評(píng)估。分子抑制PVR活性的能力主要通過(guò)抑制PVR誘導(dǎo)的粘附性，并與侵襲性人癌癥細(xì)胞(例如肉瘤細(xì)胞、乳癌細(xì)胞)的粘附進(jìn)行對(duì)比，從而得到評(píng)估。
本發(fā)明所述的PVR功能調(diào)節(jié)分子并非可作為普通的蛋白質(zhì)功能抑制劑的分子，如同蛋白酶、諸如脲或鹽酸胍的變性劑，以及重金屬原子或與生物分子(脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖)共價(jià)且非特異性反應(yīng)的小分子(例如醛或異氰酸鹽)。PVR功能調(diào)節(jié)分子的特征-尤其-在于其以特定濃度調(diào)節(jié)PVR功能的能力，該特定濃度下的所述分子不能抑制胰島素受體的功能(例如，在抗磷酸酪氨酸蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)中測(cè)定的，參見(jiàn)例如B.Cariou et al.(2002)J Biol Chem.，277，4845-52)，或乙酰膽堿受體的功能(例如，通過(guò)測(cè)定Ca流入所確定的，參見(jiàn)M.Montiel et al.(2001) Biochem Pharmacol.63，337-42.)或B-CAM細(xì)胞表面糖蛋白的功能(例如，通過(guò)如Udani et al.(1998)J.Clin.Irnvest.101，2550-2558第2551頁(yè)“流動(dòng)腔試驗(yàn)”部分所述方法測(cè)定血紅蛋白A紅細(xì)胞(AARBCs)與固定化層粘連蛋白的結(jié)合)。只有可以相同濃度調(diào)節(jié)PVR功能，而不顯著影響其它三種被提及受體的功能的分子才是本專(zhuān)利所采用的分子。
根據(jù)一種實(shí)施方案，所述PVR功能調(diào)節(jié)分子以特定方式結(jié)合PVR，優(yōu)選但并非專(zhuān)有地結(jié)合PVR的胞外部分，所述特定方式即完整受體或其至少一個(gè)或多個(gè)活性結(jié)構(gòu)域被所述分子覆蓋，并因此不可用于其它配體。相應(yīng)地，因?yàn)樵撌荏w或其活性結(jié)構(gòu)域被覆蓋了，所以無(wú)法發(fā)生受體介導(dǎo)功能。
根據(jù)另一種實(shí)施方案，所述PVR功能調(diào)節(jié)分子以特定方式結(jié)合PVR，優(yōu)選但并非專(zhuān)有地結(jié)合PVR的胞外部分，所述特定方式即所述受體只有一個(gè)或多個(gè)活性結(jié)構(gòu)域被所述分子結(jié)合，并因此不能與其它配體相互作用。相應(yīng)地，無(wú)法誘導(dǎo)任何自然發(fā)生的受體介導(dǎo)功能。
根據(jù)另一種實(shí)施方案，所述PVR功能調(diào)節(jié)分子以特定方式結(jié)合PVR，優(yōu)選但并非專(zhuān)有地結(jié)合PVR的胞外部分，所述特定方式即所述分子結(jié)合在活性結(jié)構(gòu)域附近，并因此干擾和/或破壞了其它配體的結(jié)合。相應(yīng)地，無(wú)法發(fā)生受體介導(dǎo)功能或僅發(fā)生已調(diào)節(jié)的受體介導(dǎo)功能。
根據(jù)另一種實(shí)施方案，所述PVR功能調(diào)節(jié)分子以特定方式結(jié)合PVR，優(yōu)選但并非專(zhuān)有地結(jié)合PVR的胞外部分，所述特定方式即所述分子通過(guò)結(jié)合使所述受體的胞外結(jié)構(gòu)域重排，并因此干擾和/或破壞了其它配體的結(jié)合。相應(yīng)地，無(wú)法發(fā)生受體介導(dǎo)功能或僅發(fā)生已調(diào)節(jié)的受體介導(dǎo)功能。
根據(jù)另一種實(shí)施方案，所述PVR功能調(diào)節(jié)分子以特定方式結(jié)合PVR，優(yōu)選但并非專(zhuān)有地結(jié)合PVR的胞外部分，所述特定方式即所述分子通過(guò)結(jié)合破壞了所述受體的一個(gè)或多個(gè)活性結(jié)構(gòu)域，或者甚至是整個(gè)受體，并因此干擾和/或破壞了其它配體的結(jié)合。相應(yīng)地，無(wú)法誘導(dǎo)受體介導(dǎo)功能或僅誘導(dǎo)已調(diào)節(jié)的受體介導(dǎo)功能。
根據(jù)另一種實(shí)施方案，所述PVR功能調(diào)節(jié)分子以特定方式結(jié)合PVR，優(yōu)選但并非專(zhuān)有地結(jié)合PVR的胞外部分，所述特定方式即所述分子通過(guò)結(jié)合活化并增強(qiáng)了上述受體介導(dǎo)功能。
根據(jù)另一種實(shí)施方案，所述PVR功能調(diào)節(jié)分子以特定方式結(jié)合PVR，優(yōu)選但并非專(zhuān)有地結(jié)合PVR的胞外部分，所述特定方式即所述分子通過(guò)結(jié)合促進(jìn)了分子與所述受體或其一個(gè)或多個(gè)活性結(jié)構(gòu)域的進(jìn)一步結(jié)合。在該情況中，受體介導(dǎo)功能被增強(qiáng)、促進(jìn)和/或延時(shí)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過(guò)篩選原初或免疫文庫(kù)，優(yōu)選噬菌體展示文庫(kù)以鑒定可特異性結(jié)合PVR的胞外區(qū)域的配體的方法，其中所述配體能夠影響PVR的生物學(xué)功能，諸如粘附性和侵襲力，該方法包括下述步驟a)使配體的噬菌體文庫(kù)與癌癥細(xì)胞接觸；b)使上述癌癥細(xì)胞及其結(jié)合的配體與未結(jié)合該細(xì)胞的配體分離；c)除去非特異性結(jié)合上述細(xì)胞的噬菌體，例如通過(guò)采用緩沖的去污劑溶液在所述細(xì)胞不會(huì)裂解的條件下洗滌該細(xì)胞；d)洗脫與上述細(xì)胞結(jié)合的噬菌體；并e)確定上述洗脫噬菌體所展示的配體的身份；f)利用生化或生物學(xué)試驗(yàn)檢驗(yàn)上述配體干擾PVR功能的能力。
展示了步驟e)所獲配體的噬菌體的身份可通過(guò)下述方法確定，例如，當(dāng)該配體為抗體或抗體片段時(shí)，對(duì)編碼該配體的DNA進(jìn)行測(cè)序，或者在商品配體文庫(kù)具有的噬菌體被網(wǎng)格定位或編號(hào)的情況中，則通過(guò)測(cè)定該噬菌體的網(wǎng)格位置或編號(hào)。該網(wǎng)格位置或編號(hào)可表明所述噬菌體展示的配體的身份。
步驟d)完成后，噬菌體庫(kù)富集了可結(jié)合PVR的噬菌體。這些PVR結(jié)合噬菌體可最終通過(guò)本領(lǐng)域已知的諸多方法而得以鑒別。噬菌體可以被分離，形成單個(gè)克隆，可利用標(biāo)記的PVR蛋白質(zhì)或PVR蛋白質(zhì)中被標(biāo)記的部分，例如PVR胞外區(qū)中至少有7個(gè)氨基酸長(zhǎng)的肽探測(cè)該噬菌體克隆。與這種探針結(jié)合的克隆被鑒定為PVR-結(jié)合物。還可利用純化PVR蛋白質(zhì)或重組PVR親和純化噬菌體。
可選地，當(dāng)所述配體是例如，抗體或抗體片段時(shí)，可從完整的富集庫(kù)中將編碼該抗體或抗體片段的可讀框再次克隆進(jìn)表達(dá)載體中，該抗體或抗體片段可隨后被表達(dá)在另一種宿主細(xì)胞的克隆中，而攜帶了特定表達(dá)載體的宿主細(xì)胞克隆可通過(guò)例如，上述鑒定相關(guān)噬菌體克隆的方法、實(shí)施例2和3所述方法或利用重組PVR進(jìn)行的親和純化方法得以鑒定，其中所述特定表達(dá)載體含有編碼可特異性結(jié)合PVR的抗體或抗體片段的核酸。
該方法的一個(gè)獨(dú)特優(yōu)勢(shì)在于獲得了對(duì)PVR胞外區(qū)的易接近部分具有特異性的配體，因?yàn)樽畛醯暮Y選步驟是利用完整細(xì)胞進(jìn)行的，而完整細(xì)胞為噬菌體結(jié)合提供了PVR胞外區(qū)的易接近部分。
在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括另一個(gè)利用重組PVR蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選的步驟。
該方法包括更改的步驟e)及其它步驟e)使分離的噬菌體與重組PVR接觸；f)采用緩沖去污劑和/或高鹽溶液洗滌該P(yáng)VR；并g)洗脫結(jié)合了PVR的噬菌體；并h)確定上述洗脫噬菌體所展示的配體的身份。
在某些實(shí)施方案中，被表達(dá)在上述噬菌體上的配體包括選自scFv、dsFv、Fab′、Fab、F(ab′)2、Fv、單結(jié)構(gòu)域抗體(DABs)和雙抗體之一的抗體或抗體片段，更具體而言是選自scFv、dsFv、Fv、單結(jié)構(gòu)域抗體或雙抗體之一的抗體或抗體片段，還要更具體而言是選自scFv、單結(jié)構(gòu)域抗體或雙抗體之一的抗體或抗體片段，還要更優(yōu)選的是scFv。
有助于噬菌體展示的噬菌體可以是所有可通過(guò)培養(yǎng)獲得的噬菌體，且這些噬菌體可以接受遺傳工程技術(shù)并能夠在其表面展示外源配體。Smith et al.(1985) Science，228，1315-17公開(kāi)了噬菌體展示技術(shù)，WO 91/17271則公開(kāi)了抗體的噬菌體展示技術(shù)。
步驟c)和f)所采用的“去污劑”指去污劑溶液，優(yōu)選緩沖的去污劑溶液，并且可以是濃度為0.001-0.5％，優(yōu)選為0.01-0.1％的Tween。步驟f)中的“高鹽”指高鹽溶液，優(yōu)選緩沖的高鹽溶液，且其離子強(qiáng)度為10mM-1M，優(yōu)選為20-500mM更優(yōu)選為50-350mM，還要更優(yōu)選為80-250mM。典型有用的陰離子是，例如，氯離子、檸檬酸根離子、磷酸根離子、磷酸氫根離子或硼酸根離子。典型有用的陽(yáng)離子是，例如，鈉離子、鉀離子、鋰離子、鈣離子或鎂離子。
上述緩沖溶液典型具有的pH為7-8。例如，可采用優(yōu)選地含有1-20％、更優(yōu)選地含有5-15％、還要更優(yōu)選地含有大約10％FCS的DMEM或PBS作為緩沖劑。
通過(guò)以200-300g持續(xù)3-20分鐘，優(yōu)選5-10分鐘的溫和離心，可分離結(jié)合了噬菌體的細(xì)胞。通過(guò)采用pH為0-2.5，優(yōu)選為1-2.5，更優(yōu)選為1.5-2.5的2-100mM，優(yōu)選為4-50mM，更優(yōu)選為5-20mM，還要更優(yōu)選地約為10mM的甘氨酸溶液，可洗脫同時(shí)結(jié)合了細(xì)胞和固定化PVR的噬菌體。
可干擾或抑制所述配體的功能性，尤其是所述抗體或抗體片段的功能性的PVR可如上所述，在體內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中得到鑒定。細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)包括確定本發(fā)明所述配體在實(shí)施例8和9、9.1-9.3或?qū)嵤├?1和12所述侵襲、遷移或粘附試驗(yàn)中的抑制效果的試驗(yàn)。附圖提供了不同試驗(yàn)的結(jié)果。
該方法有利地將基于結(jié)合細(xì)胞表面的篩選步驟與基于功能測(cè)定的篩選步驟結(jié)合在一起，可鑒別具有干擾或抑制PVR功能能力的配體。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述配體能夠抑制PVR的生物學(xué)功能。例如，PVR的生物學(xué)功能可以是侵襲、粘附、增殖或血管生成。侵襲或遷移試驗(yàn)測(cè)定的是細(xì)胞的侵襲力。侵襲試驗(yàn)是，例如本申請(qǐng)書(shū)中的實(shí)施例8和9、9.1和9.2進(jìn)行的試驗(yàn)，實(shí)施例9.3描述的是遷移試驗(yàn)。本申請(qǐng)書(shū)中的實(shí)施例11和12描述了粘附試驗(yàn)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“侵襲力”指細(xì)胞遷移通過(guò)其它細(xì)胞層或遷移通過(guò)胞外基質(zhì)的能力?？赏ㄟ^(guò)實(shí)施例中所描述的Matrigel試驗(yàn)評(píng)估侵襲力。根據(jù)本發(fā)明測(cè)定的侵襲指細(xì)胞在某一溫育期間抵達(dá)濾器底面。在侵襲試驗(yàn)，諸如實(shí)施例所描述的一種侵襲試驗(yàn)中，當(dāng)40％以上的細(xì)胞在6-12小時(shí)內(nèi)抵達(dá)濾器另一面并形成菌落時(shí)，便將自然發(fā)生的癌癥細(xì)胞定義為侵襲性。在相同時(shí)間內(nèi)僅形成5％菌落的對(duì)照細(xì)胞被定義為非侵襲性。
本文所用術(shù)語(yǔ)“粘附性”指細(xì)胞在與其曾經(jīng)賴(lài)以生長(zhǎng)的基質(zhì)分離、以單細(xì)胞(不與所述溶液中的其它細(xì)胞直接接觸)溶液形式重新懸浮并再次覆蓋在其可能粘附的基質(zhì)上后，重新附著的能力。在實(shí)施例所述試驗(yàn)中，如果40％以上的細(xì)胞在30-120分鐘的時(shí)間段內(nèi)實(shí)現(xiàn)粘附，便將該細(xì)胞定義為粘附性。與之相反，在相同時(shí)間段內(nèi)僅有5％實(shí)現(xiàn)粘附的細(xì)胞為對(duì)照細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“血管生成”指細(xì)胞誘導(dǎo)新血管在其附近形成的過(guò)程。血管生成可伴隨惡性組織的生長(zhǎng)，因而可作為惡性細(xì)胞的特性。就是說(shuō)惡性細(xì)胞可具有誘導(dǎo)血管生成的特性。
優(yōu)選地，通過(guò)本發(fā)明方法鑒定癌癥細(xì)胞將受配體，例如抗體或抗體片段抑制的生物學(xué)功能，諸如粘附性和侵襲力。
術(shù)語(yǔ)“抑制”正如PVR功能在上文提及的侵襲試驗(yàn)中所定義的，被理解為與除了無(wú)本發(fā)明所述分子外，其它試驗(yàn)條件均相同的陰性對(duì)照試驗(yàn)相比，功能降低了至少20％、優(yōu)選的是30％、更優(yōu)選的是50％，還要更優(yōu)選的是60％。如果受本發(fā)明所述分子影響的功能減量小于20％，更優(yōu)選的是小于15％，還要更優(yōu)選的是小于10％，則該分子被定義為沒(méi)有顯著影響其它三種受體的功能。
此外，如果在試驗(yàn)中可檢測(cè)到自然發(fā)生的癌癥細(xì)胞的粘附性和侵襲力減量大于20％，優(yōu)選的是大于60％，則本發(fā)明所述的多肽、抗體或抗體片段被認(rèn)為抑制了PVR的生物學(xué)功能。
此外，就本發(fā)明所述可抑制PVR的基因表達(dá)的分子而言，當(dāng)在被歸一化為β微管蛋白水平的定量蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)定時(shí)，當(dāng)該分子在試驗(yàn)中的濃度為10nM-100μm，優(yōu)選大約1μm，其中PVR的量是在兩個(gè)其它方面一致的樣品中進(jìn)行比較的，而其中一個(gè)樣品允許本發(fā)明所述分子抑制PVR表達(dá)時(shí)，這種分子將PVR表達(dá)降低了50％以上，優(yōu)選的是80％以上，還要更優(yōu)選的是90％以上，最優(yōu)選的是95％以上。在相同試驗(yàn)中，本發(fā)明所述分子不能將每個(gè)細(xì)胞上存在的β微管蛋白的量減少20％以上，且該分子不能將胰島素受體和B-CAM細(xì)胞表面糖蛋白的相對(duì)水平降低20％以上。
利用該方法，發(fā)明者首次提供了鑒定并隨后分離PVR功能調(diào)節(jié)分子的可能性。此外，通過(guò)與可在例如激光或光束的控制下被誘導(dǎo)的特定標(biāo)記相連，發(fā)明者能夠以特定方式修飾被選定的分子，該方式即上述被選定的分子能夠?qū)VR介導(dǎo)的細(xì)胞粘附行為抑制大約41％-55％(參見(jiàn)圖3)。此外，與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，PVR介導(dǎo)的細(xì)胞侵襲行為被抑制了至少25％(圖2a、2b、2c或2d)。
根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案，因具有特異性結(jié)合PVR的能力和調(diào)節(jié)PVR功能的能力而得以鑒定和/或分離的分子選自小化合物、寡核苷酸、肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、抗體片段、抗獨(dú)特型抗體和/或生物偶聯(lián)物。
本發(fā)明所用的“小化合物”指分子量介于50Da-10000Da，優(yōu)選地介于100Da-4000Da，更優(yōu)選地介于150Da-2000Da之間的分子或其生理學(xué)可接受鹽。此外，就本發(fā)明所述的小化合物而言，如果該化合物將自然侵襲性癌癥細(xì)胞的粘附性降低了30％以上，優(yōu)選降低60％以上，并未由此影響細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期進(jìn)展(通過(guò)碘化丙錠染色和FACS分析細(xì)胞群體的DNA含量而得以確定)，且未提高培養(yǎng)物中顯示凋亡跡象(通過(guò)采用例如通常所說(shuō)的隧道試驗(yàn)測(cè)定顯示了DNA斷裂的細(xì)胞的百分比而得以確定)的細(xì)胞的百分比，則該化合物被認(rèn)為調(diào)節(jié)或抑制了PVR的生物學(xué)功能。
本文所用“多肽”指含有多于10個(gè)，優(yōu)選地多于20個(gè)，最優(yōu)選地多于30個(gè)，并少于10000個(gè)，更優(yōu)選地少于2500個(gè)，最優(yōu)選地少于1000個(gè)氨基酸的分子。也包括含有低比例的修飾或非天然氨基酸的多肽。
對(duì)含有多于10000個(gè)殘基的氨基酸序列而言，下文采用了術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”，對(duì)含有少于10個(gè)殘基的氨基酸序列而言，則采用術(shù)語(yǔ)“肽”。也包括了含有低比例的修飾或非天然氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“抗體”和“免疫球蛋白”指所有的免疫學(xué)結(jié)合劑，包括多克隆和單克隆抗體。普通抗體具有一個(gè)共有核心結(jié)構(gòu)，即兩條一致輕鏈和兩條一致重鏈。一條輕鏈與一條重鏈對(duì)應(yīng)連接，兩條重鏈又彼此相連。輕鏈與重鏈均含有系列的重復(fù)、同源單位，每一單位的長(zhǎng)度約為110個(gè)氨基酸殘基，這些單位獨(dú)立地折疊在通常所說(shuō)的免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域中。為使抗抗原的抗體具有無(wú)限的和高的特異性，并使結(jié)構(gòu)具有相關(guān)多樣性，輕鏈和重鏈的N-末端包括了通常所說(shuō)的可變(V)區(qū)，以區(qū)分于各鏈其余部分中更為保守的恒定(C)區(qū)。各V區(qū)含有三個(gè)也被稱(chēng)為“互補(bǔ)性決定區(qū)”(CDR)的高變區(qū)，因?yàn)檫@些序列形成了一個(gè)與結(jié)合抗原的三維表面互補(bǔ)的表面?？贵w的CDRs是上述分子中決定其特異性并與特異性配體接觸的部分。CDRs是所述分子中最易變的部分，從而使這些分子具有了多樣性。在人IgG中，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上被定義為輕鏈的氨基酸24-41(CDR-L1)、50-57(CDR-L2)和90-101(CDR-L3)和重鏈的氨基酸26-38(CDR-H1)、51-70(CDR-L2)和100-125(CDR-H3)(參見(jiàn)Kabat et al.(1987)4th edn USDepartment of Health and Human Services，Public Health Service，NIH，Bethesda)?？贵w片段的CDR區(qū)可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)將抗體片段與所述人IgG進(jìn)行對(duì)比而得以確定，例如利用可運(yùn)行“Blast”的NCBI程序，使兩個(gè)序列相互對(duì)比，鑒別出與人IgG的CDRs對(duì)應(yīng)的抗體片段的氨基酸。
本發(fā)明所述抗體還可能選自修飾的免疫球蛋白，例如通過(guò)化學(xué)或重組方法生成的抗體、CDR嫁接抗體或人源化抗體、定位誘變抗體之一。
在一種進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述分子為抗體片段，具體而言是單鏈抗體片段(scFv)、dsFv、Fab′、Fab、F(ab′)2、Fv、單結(jié)構(gòu)域抗體和/或雙抗體。
所用術(shù)語(yǔ)“抗體片段”指具有抗原結(jié)合區(qū)的抗體樣分子的所有片段，該術(shù)語(yǔ)包括諸如scFv、dsFv、Fab′、Fab、F(ab′)2、Fv、單結(jié)構(gòu)域抗體(DABs)、雙抗體等的抗體片段。制備和利用多種以抗體為基礎(chǔ)的構(gòu)建體和片段的技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的(參見(jiàn)Kabat et al.(1991)J.Immunol.147，1709-19)。
“單鏈抗體片段”(scFv)含有抗體重鏈的可變結(jié)構(gòu)域(VH)和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域(VL)，其中這些結(jié)構(gòu)域均出現(xiàn)在單條多肽鏈中。通常，scFv多肽進(jìn)一步地在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間含有能夠使scFv形成抗原結(jié)合所需理想結(jié)構(gòu)的多肽接頭。
“Fv”片段是保留了完整抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段?！癲sFv”是二硫化穩(wěn)定Fv?！癋(ab′)2”片段是含有兩個(gè)通過(guò)二硫鍵連接在鉸鏈區(qū)的Fab片段的二價(jià)片段?！癋ab”片段是抗原結(jié)合片段，含有完全與重鏈的VH和CH1結(jié)構(gòu)域配對(duì)的輕鏈?！癋ab”片段是還原的F(ab′)2片段。
“單結(jié)構(gòu)域抗體”(DAB)是僅具有一條(而不是兩條)僅來(lái)源于所述抗體結(jié)構(gòu)的一個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)鏈的抗體。DABs開(kāi)拓了一個(gè)發(fā)現(xiàn)，即對(duì)某些抗體而言，抗體分子的一部分幾乎像完整分子一樣地結(jié)合了它的靶抗原(Davies et al.(1996)Protein Eng.9531-537)。
“雙抗體(diabodies)”是二價(jià)或雙特異性抗體，其中的VH和VL結(jié)構(gòu)域被表達(dá)在單條多肽鏈上，但利用了過(guò)短以至于不能使相同鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的接頭，從而迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，并形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(Holliger et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，6444-6448)。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明所述分子為多克隆或單克隆抗體，在又一種實(shí)施方案中，所述抗體為人或人源化抗體。在另外一種實(shí)施方案中，所述抗體可能包括的輕鏈?zhǔn)潜景l(fā)明所述的一個(gè)或兩個(gè)scFv抗體片段。在又一種實(shí)施方案中，所述抗體為抗人PVR結(jié)合抗體，該抗體可能選自修飾的免疫球蛋白，例如通過(guò)化學(xué)或重組法制備的抗體或人源化抗體，基本上保留了對(duì)PVR的相同親和力的定位誘變抗體。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽為人抗體，選自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM之一，尤其是IgG和IgM，更具體而言是IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4。
通過(guò)利用本發(fā)明所述的合適分子，尤其是所述抗體片段或抗體，進(jìn)一步可能制備本發(fā)明所述的抗獨(dú)特型抗體。這種抗-獨(dú)特型抗體可利用眾所周知的雜交瘤技術(shù)制備(Kohler et al.(1975)Nature，256495)?？躬?dú)特型抗體是可識(shí)別另一種抗體上存在的獨(dú)特決定簇的抗體。這些決定簇位于所述抗體的高變區(qū)中。正是該區(qū)域結(jié)合了特定表位并從而使抗體具有了特異性?？躬?dú)特型抗體可通過(guò)用所述被關(guān)注的多肽，尤其是所述被關(guān)注的抗體片段或抗體使動(dòng)物免疫而得以制備。該免疫動(dòng)物將識(shí)別和應(yīng)答該免疫抗體的獨(dú)特型決定簇，并生成抗這些獨(dú)特型決定簇的抗體。通過(guò)利用抗獨(dú)特型抗體，有可能鑒別出可表達(dá)具有相同表位特異性的單克隆抗體的其它雜交瘤。本發(fā)明所述的抗獨(dú)特型抗體可被用于篩選抗體并檢驗(yàn)該抗體是否具有與本發(fā)明所述分子一樣的結(jié)合特異性和功能性。
利用抗獨(dú)特型技術(shù)制備可模擬表位的單克隆抗體也是可能的。例如，被制備用于抗第一種單克隆抗體的抗獨(dú)特型單克隆抗體在高變區(qū)中應(yīng)具有結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這是被所述第一種抗體結(jié)合的表位的“像”。因此，該抗獨(dú)特型單克隆抗體可被用于免疫接種，因?yàn)樵摽躬?dú)特型單克隆抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域有效地充當(dāng)了抗原。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明所述分子可分別地與另一種蛋白質(zhì)、可與自身形成多聚體的固體基質(zhì)(例如珠子)、可進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)被靶定細(xì)胞的毒性的細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑、前體藥物或能夠改變PVR表達(dá)細(xì)胞或募集免疫細(xì)胞的效應(yīng)分子共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合和/或偶聯(lián)。所有這些結(jié)合物均是本發(fā)明所述的“生物偶聯(lián)物”。
本發(fā)明所述術(shù)語(yǔ)“生物偶聯(lián)物”包括本發(fā)明所述分子，尤其是本發(fā)明所述抗體片段或抗體，連同一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞毒性部分，是利用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑制備的。這種試劑的若干實(shí)例是N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫)-丙酸酯(SPDP)、亞胺酯的雙功能衍生物，諸如二甲基己二酰亞胺酯HC1、諸如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯的活化酯、諸如戊二醛的醛、諸如組氨酸(R-疊氮苯甲?；?己二胺的雙疊氮化合物、諸如雙-(R-重氮苯甲?；?乙二胺的雙重氮衍生物、諸如2，6-二異氰酸甲苯酯的二異氰酸酯，以及諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯的雙活化氟化合物。有助于制備生物偶聯(lián)物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，被具體描述于March′s Advanced Organic ChemistryReactions，Mechanisms and Structure，5th Edition，Wiley-Interscience或Bioconjugate Techniques，Ed.Greg Hermanson，Academic Press中。
可與本發(fā)明所述生物偶聯(lián)物連接的優(yōu)選細(xì)胞毒性劑包括，但不限于道諾紅菌素、紫杉醇、阿霉素、氨甲蝶呤、5FU、長(zhǎng)春滅瘟堿、放線(xiàn)菌素D、表臼亞乙苷、順式鉑氨、阿霉素、染料木黃酮和核糖體抑制劑(例如天花粉蛋白)或多種細(xì)菌毒素(例如假單胞菌外毒素、金黃色葡萄球菌A蛋白)。
在一種實(shí)施方案中，這種分子是可通過(guò)抑制PVR的基因表達(dá)從而調(diào)節(jié)PVR功能的分子或寡核苷酸，例如反義寡核苷酸或干擾性雙鏈RNAs(siRNAs)或可使細(xì)胞生成這種siRNAs的載體。此外，這種分子特異性地結(jié)合已表達(dá)的PVR并抑制與細(xì)胞的粘附性、侵襲力和/或轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)的PVR功能。
反義寡核苷酸是本領(lǐng)域熟知的，是降低特定基因的基因表達(dá)的方法(參見(jiàn)例如，Probst J.C.(2000)Methods 22(3)271-281；HeasmanJ.(2002)Dev.Biol.243(2)209-214；Castanotto et al.(2000)Methods Enzymol.313401-420，以及Jen and Gewirtz(2000)Stem Cells.18(5)307-319)。最近，業(yè)已發(fā)現(xiàn)短雙鏈RNAs有效并特異性地抑制具有互補(bǔ)外顯子序列的mRNA的表達(dá)。該現(xiàn)象被稱(chēng)為RNA干擾(RNAi)。這些雙鏈RNAs被稱(chēng)為siRNAs，即小干擾RNAs，具有含至少18個(gè)、優(yōu)選至少19個(gè)核苷酸的配對(duì)區(qū)(該配對(duì)雙鏈區(qū)使其靶定具有互補(bǔ)外顯子序列的mRNA)，并具有20-25個(gè)核苷酸，優(yōu)選21-23個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度(Elbashir et al.(2001)Nature 411，428-429)。這些siRNAs可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法化學(xué)合成，并可通過(guò)商業(yè)渠道獲得(參見(jiàn)例如在上述Elbashir等人的報(bào)導(dǎo)和Elbashiret al.，(2002)Methods 26，199-213中提供的供應(yīng)商)，或者通過(guò)利用合適的DNA模板進(jìn)行T7轉(zhuǎn)錄獲得(參見(jiàn)Yu et al.(2002)PNAS99，6047-6052)。它們可被送遞給廣泛的細(xì)胞類(lèi)型，通過(guò)例如，合成兩條RNA鏈，使它們退火并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其中需要抑制某些基因的基因表達(dá)(參見(jiàn)上述Elbashir等人和Yu等人的報(bào)導(dǎo))。Elbashir et al.，(2002)Methods 26，199-213描述了應(yīng)用siRNAs的具體方法。
另一種影響RNA干擾的方法是轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，使細(xì)胞生成siRNAs或在RNAi中也起作用的siRNA樣發(fā)夾RNAs。這可通過(guò)利用同時(shí)具有siRNA的有義和反義鏈的質(zhì)粒而得以實(shí)現(xiàn)，該siRNA受哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人或小鼠的U6啟動(dòng)子的控制，該啟動(dòng)子可使雙鏈在被轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄，一部分質(zhì)粒在被轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)退火形成功能性雙鏈siRNAs(Miyagishi andTaira(2002)Nature Biotech.19，497-500)。可選地，由U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的RNA可以是由含19個(gè)堿基對(duì)的siRNA莖區(qū)與兩條通過(guò)反義鏈末端的結(jié)構(gòu)環(huán)和U1-43′突出端連接在一起的鏈組成的siRNA樣發(fā)夾RNAs(Paul et al.(2002)Nature Biotech.19，505-508)?？蛇x地，由U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的RNA可以是短發(fā)夾RNAs，該RNA被轉(zhuǎn)錄為小的臨時(shí)RNAs，即含有大約70個(gè)核苷酸的短發(fā)夾前體，并被加工進(jìn)其轉(zhuǎn)錄所在細(xì)胞內(nèi)的活化siRNAs中(Paddison et al.(2002)Genes andDevelopment 16，948-958)。所有這些基于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法均具有共同點(diǎn)，即它們使細(xì)胞生成siRNAs，進(jìn)而抑制了具有特定外顯子區(qū)的基因，該外顯子區(qū)與所述siRNA中至少18個(gè)核苷酸長(zhǎng)的堿基配對(duì)區(qū)互補(bǔ)。應(yīng)當(dāng)清楚的是還將有其它可影響siRNAs在細(xì)胞中的存在的方法，可產(chǎn)生抑制PVR功能的理想效果，并且屬于本發(fā)明范疇。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明所述分子被標(biāo)記了可檢測(cè)標(biāo)記。術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”或“被標(biāo)記的”分別指可檢測(cè)標(biāo)記或下述物質(zhì)的摻入，例如，通過(guò)摻入熒光團(tuán)-、發(fā)色團(tuán)-或放射標(biāo)記的氨基酸，或者使熒光團(tuán)-、發(fā)色團(tuán)-或放射性標(biāo)記附著多肽，或者附著可被含有熒光標(biāo)記的另一種標(biāo)記分子檢測(cè)到的部分或可通過(guò)光學(xué)或比色法檢測(cè)的酶促活性。這種兩步檢測(cè)體系的實(shí)例是眾所周知的生物素-抗生物素蛋白體系。有多種標(biāo)記多肽和糖蛋白的方法是本領(lǐng)域已知的，并且可以被應(yīng)用(Lobl et al.(1988)Anal.Biochem.，170，502-511)。具體而言，本發(fā)明所述可檢測(cè)標(biāo)記的實(shí)例有放射性同位素、發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)、酶或放射性同位素。
根據(jù)另一種實(shí)施方案，本發(fā)明所述分子被標(biāo)記和/或化學(xué)修飾有可誘導(dǎo)標(biāo)記，從而提高了生物學(xué)活性。該化學(xué)標(biāo)記的誘導(dǎo)可通過(guò)溫度升高、激光誘導(dǎo)或其它任意高能波而得以活化。根據(jù)本發(fā)明的一種進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述分子被化學(xué)標(biāo)記有例如，上述一種或多種生色劑，結(jié)合發(fā)色團(tuán)輔助激光鈍化(CALI)提高了配體的生物學(xué)活性。
CALI的原理是基于可導(dǎo)致生成短命反應(yīng)物的光化學(xué)反應(yīng)的局部引發(fā)，反過(guò)來(lái)選擇性地修飾了靶分子，并使其功能失活。高特異性而無(wú)抑制性的配體(例如抗體、抗體片段、小分子)被標(biāo)記有合適的發(fā)色團(tuán)(例如孔雀綠、熒光素、亞甲藍(lán)、伊紅)。靶分子(例如蛋白質(zhì))與所述配體形成復(fù)合物后，采用合適波長(zhǎng)的光(激光或可見(jiàn)光)照射該復(fù)合物以激發(fā)發(fā)色團(tuán)。該激發(fā)引發(fā)了可起動(dòng)生成短命反應(yīng)物(例如羥基或高反應(yīng)性氧物質(zhì))的光化學(xué)反應(yīng)。這些反應(yīng)物在其生成位點(diǎn)周?chē)男》秶鷥?nèi)修飾了所述蛋白質(zhì)。因?yàn)閴勖?，反?yīng)物可活動(dòng)的距離非常短。因此，對(duì)所述蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的修飾發(fā)生在接近所述配體結(jié)合位點(diǎn)的地方。所述破壞作用局限于15-40的范圍，恰好小于細(xì)胞中兩個(gè)蛋白質(zhì)的平均距離，即大約80，(假設(shè)平均胞質(zhì)蛋白濃度為300mg/ml，蛋白質(zhì)平均大小為50kDa)確保了對(duì)所述過(guò)程而言的高空間分辨率。當(dāng)所述配體的結(jié)合位點(diǎn)接近所述蛋白質(zhì)的重要功能結(jié)構(gòu)域或在其內(nèi)時(shí)，被誘導(dǎo)產(chǎn)生的修飾導(dǎo)致了所述蛋白質(zhì)的永久失活。該蛋白質(zhì)的功能失活是在合適的讀出試驗(yàn)中測(cè)定的，并在諸如細(xì)胞侵襲、細(xì)胞粘附、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)或凋亡的疾病相關(guān)生理學(xué)功能范疇內(nèi)得到評(píng)估。因此，這些配體可被用于調(diào)節(jié)抑制性配體的作用。
在一種實(shí)施方案中，當(dāng)采用粘附試驗(yàn)或侵襲試驗(yàn)(參見(jiàn)實(shí)施例)進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)，與人PVR結(jié)合的本發(fā)明所述修飾多肽或生物偶聯(lián)物將人癌癥細(xì)胞的粘附性和/或侵襲力降低了20-60％，或優(yōu)選的30-55％、40-50％或者甚至至少60％。
進(jìn)一步的實(shí)例是，抗特定蛋白質(zhì)的修飾抗體即使在未進(jìn)行CALI時(shí)并沒(méi)有顯示抑制功能，通常仍可在CALI后選擇性地抑制該特定蛋白質(zhì)的功能。當(dāng)所述配體的結(jié)合位點(diǎn)接近所述蛋白質(zhì)的重要功能結(jié)構(gòu)域或在其內(nèi)時(shí)，這些被誘導(dǎo)產(chǎn)生的修飾導(dǎo)致了所述蛋白質(zhì)的永久失活。該蛋白質(zhì)的功能失活是在合適的讀出試驗(yàn)中測(cè)定的，并在諸如細(xì)胞侵襲、細(xì)胞粘附、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)或凋亡的疾病相關(guān)生理學(xué)功能范疇內(nèi)得到評(píng)估。發(fā)明者證實(shí)CALI能夠?qū)⒕哂刑禺愋远鵁o(wú)抑制性的配體轉(zhuǎn)化為阻斷試劑(參見(jiàn)實(shí)施例)。
根據(jù)本發(fā)明的一種進(jìn)一步的實(shí)施方案，表達(dá)CD155、PVR或其任意衍生物的細(xì)胞優(yōu)選屬于增殖性失調(diào)或疾病的一部分或參與其中的增殖細(xì)胞。例如，這種細(xì)胞是癌癥細(xì)胞，來(lái)源自原發(fā)或轉(zhuǎn)移性腫瘤的細(xì)胞或微量轉(zhuǎn)移的細(xì)胞。此外，本發(fā)明所述增殖細(xì)胞是具有轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞，例如進(jìn)入或入侵遠(yuǎn)程組織的準(zhǔn)備狀態(tài)得到加強(qiáng)的細(xì)胞。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，表達(dá)PVR、CD 155或它們的任意衍生物的細(xì)胞產(chǎn)生或來(lái)源于自然發(fā)生的腫瘤或癌癥。
本文所用“產(chǎn)生或來(lái)源于自然發(fā)生的癌癥的細(xì)胞”指在實(shí)驗(yàn)室中未被轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或通過(guò)其它方式遺傳改造過(guò)的細(xì)胞。這種細(xì)胞不含任何人工DNA序列，例如被發(fā)現(xiàn)僅存在于其它物種，而通常不存在于自然發(fā)生的癌癥細(xì)胞所來(lái)源的物種中的載體或DNA序列。不過(guò)，自然發(fā)生的癌癥細(xì)胞可能包括通常未被發(fā)現(xiàn)存在于其來(lái)源的物種中的序列，條件是這些序列是因?yàn)樵谒鲎匀话l(fā)生的癌癥細(xì)胞來(lái)源的個(gè)體內(nèi)發(fā)生的突變、病毒感染和/或選擇過(guò)程而出現(xiàn)的，和/或在連續(xù)培養(yǎng)該自然發(fā)生的癌癥細(xì)胞期間獲得的。
本文所用“轉(zhuǎn)移性腫瘤”包括位于能夠轉(zhuǎn)移的原發(fā)部位上的腫瘤和位于繼發(fā)部位的轉(zhuǎn)移腫瘤。這種轉(zhuǎn)移性腫瘤可來(lái)源于任意器官或組織，諸如腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肺、胃、較低位置的腸、肝、胸，前列腺，腎或胰腺等。
本文所用的“轉(zhuǎn)移潛能”指腫瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)距其來(lái)源的原發(fā)腫瘤的部位形成新腫瘤的能力(轉(zhuǎn)移)。轉(zhuǎn)移潛能可通過(guò)下述方法測(cè)定，即將例如1×106個(gè)細(xì)胞注射進(jìn)無(wú)胸腺裸鼠的側(cè)尾靜脈，并在例如注射后2個(gè)月確定肺內(nèi)的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量，例如，正如Huang et al(1996)Oncogene13，2339-2347中第2346頁(yè)“腫瘤細(xì)胞注射”部分或Radinsky et al.(1994)Oncogene 91877-1883中第1882頁(yè)“動(dòng)物與腫瘤的生成”和“對(duì)鈣化基質(zhì)的組織化學(xué)分析”部分所描述的方法。該試驗(yàn)中，在肺內(nèi)形成多于3個(gè)，優(yōu)選地多于8個(gè)，更優(yōu)選地多于20個(gè)腫瘤結(jié)節(jié)的細(xì)胞系被認(rèn)為具有轉(zhuǎn)移性。
“微量轉(zhuǎn)移”指腫瘤細(xì)胞小于2mm的積聚，通常僅可通過(guò)組織學(xué)方法檢測(cè)到。
根據(jù)一種進(jìn)一步的實(shí)施方案，本發(fā)明所述的增殖細(xì)胞來(lái)源于諸如下列的選定癌癥細(xì)胞類(lèi)型。
優(yōu)選地根據(jù)本發(fā)明所述方法篩選并優(yōu)選地根據(jù)本發(fā)明治療的選定“癌癥細(xì)胞類(lèi)型”選自星形細(xì)胞瘤、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、室管膜細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、原始神經(jīng)外胚層腫瘤(PNET)、軟骨肉瘤、骨肉瘤、胰管腺癌、小和大細(xì)胞肺腺癌、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、支氣管肺泡癌、上皮腺癌、及它們的肝轉(zhuǎn)移、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、肝細(xì)胞瘤、黑素瘤、膽管癌、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、基層細(xì)胞癌、汗腺瘤、乳頭狀癌、皮脂腺癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、維耳姆斯氏瘤、睪丸瘤、前列腺、乳房、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜細(xì)胞瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽(tīng)神經(jīng)瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腦膜瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤、Waldenstrom氏巨球蛋白血癥、重和輕鏈病，以及子宮頸、子宮的腺癌和卵巢上皮癌、膀胱的移行細(xì)胞癌、B和T細(xì)胞淋巴瘤(結(jié)節(jié)性和彌散性)漿細(xì)胞瘤、急性和慢性白血病、軟組織肉瘤、平滑肌肉瘤或其它任意具有高PVR表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。
根據(jù)一種進(jìn)一步的實(shí)施方案，并且如本文和實(shí)例所述一種試驗(yàn)設(shè)計(jì)的例證結(jié)果所示，分離出了具有氨基酸序列SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.69或SEQ ID No.70的scFv，或具有氨基酸序列LWLRRD(SEQ ID No.1)或WTGDFDY(SEQ ID No.2)且特異性結(jié)合PVR并調(diào)節(jié)其功能的CDR。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明所述分子、多肽和/或生物偶聯(lián)物被用于鑒別其它可在篩選試驗(yàn)中特異性結(jié)合人PVR的分子。這些方法需要使參照抗-PVR分子或抗體片段在假定競(jìng)爭(zhēng)劑試驗(yàn)-結(jié)合劑的存在情況下與含有所述PVR結(jié)構(gòu)域的靶物質(zhì)接觸。該接觸步驟是在特定條件下進(jìn)行的，該條件適合參照抗體片段與所述靶物質(zhì)在試驗(yàn)結(jié)合劑的存在情況下形成復(fù)合物。存在試驗(yàn)結(jié)合劑的情況下，所述參照抗體片段與靶物質(zhì)之間形成復(fù)合物是作為該試驗(yàn)結(jié)合劑與PVR的特異性結(jié)合活性的指標(biāo)被檢測(cè)的。該篩選方法有助于高通量地篩選例如，其它抗體文庫(kù)或抗體片段文庫(kù)、反義寡核苷酸文庫(kù)或肽和小分子文庫(kù)，以鑒別并表征其它可特異性結(jié)合PVR的分子。競(jìng)爭(zhēng)是通過(guò)特定試驗(yàn)測(cè)定的，該試驗(yàn)中的被檢抗體片段或其它結(jié)合劑基本上抑制了參照抗體片段與含有所述PVR結(jié)構(gòu)域的靶物質(zhì)的特異性結(jié)合。這是可以確定的，例如通過(guò)測(cè)定所述參照抗體片段在假定競(jìng)爭(zhēng)劑，即在適合復(fù)合物形成的條件下可特異性結(jié)合PVR的分子存在和缺乏情況下與含有PVR結(jié)構(gòu)域的靶物質(zhì)的結(jié)合。許多類(lèi)型的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)是已知并可被常規(guī)應(yīng)用于本發(fā)明的，正如US 4,376,110中的實(shí)例所述。這種試驗(yàn)典型地包括利用含有PVR結(jié)構(gòu)域的靶物質(zhì)(例如純化PVR或表達(dá)PVR抗原的細(xì)胞系)、特異性結(jié)合PVR的未標(biāo)記分子和標(biāo)記的參照抗體片段或其它結(jié)合劑。競(jìng)爭(zhēng)抑制是通過(guò)測(cè)定在PVR特異性結(jié)合分子存在條件下與所述靶物質(zhì)結(jié)合的標(biāo)記量而得以確定的。通常，PVR特異性結(jié)合分子過(guò)量存在。由上述競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)鑒別的PVR特異性結(jié)合分子(“競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合劑”)包括可與所述參照抗體片段所結(jié)合的表位或結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的抗體、抗體片段、肽、反義寡核苷酸、小分子及其它結(jié)合劑，以及與基本上鄰近參照抗體片段所結(jié)合表位的表位或結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的PVR特異性結(jié)合分子。優(yōu)選地，本發(fā)明的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合劑過(guò)量存在時(shí)，將參照抗體片段與選定靶物質(zhì)的特異性結(jié)合抑制了至少10％，優(yōu)選的是至少25％，更為優(yōu)選的是至少50％，還要更為優(yōu)選的是至少75％-90％或更高。除了本發(fā)明所述多肽，尤其是本發(fā)明所述的修飾抗體片段或修飾抗體，還可應(yīng)用能夠特異性導(dǎo)向人PVR的天然或人工配體、肽、反義或其它小分子。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)重組技術(shù)擴(kuò)增本發(fā)明所述分子，包括抗體片段，更具體而言是本發(fā)明所述的scFv、dsFv、Fv、單結(jié)構(gòu)域抗體或雙抗體的方法。這些技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的(Skerra et al.(1993)，Curr.Opin.Immunol.5，256-62；Chadd et al.(2001)，Curr.Opin.Biotechnol.12，188-94)。
例如，編碼本發(fā)明多肽，尤其是抗體片段或抗體的核酸序列(例如編碼SEQ ID No.1-4的基因)可被分離并克隆進(jìn)一種或多種表達(dá)載體中，該載體可被轉(zhuǎn)化進(jìn)用于表達(dá)本發(fā)明所述重組多肽的合適宿主細(xì)胞系中。編碼本發(fā)明所述多肽的基因的表達(dá)使該多肽的產(chǎn)量提高，還通過(guò)將氨基酸替代、缺失、添加及其它修飾，例如人源化修飾(Rapley(1995)Mol.Biotechnol.3139-154)導(dǎo)入本發(fā)明所述抗體片段或抗體的可變和恒定區(qū)中，并且沒(méi)有臨界損失結(jié)合特異性或PVR阻斷功能，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)該多肽的常規(guī)修飾(Skerra et al.(1993)Curr.Opin.Immunol.5，256-262)。
因此，本發(fā)明的一種進(jìn)一步的實(shí)施方案包括來(lái)源于本發(fā)明所述分離分子的核酸序列。在另一種進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.71或SEQ ID No.72所示的核酸序列以及同源DNA序列，或具有簡(jiǎn)并密碼但仍可翻譯成與SEQ IDNo.1-4或SEQ ID No.69或SEQ ID No.70基本上一致的氨基酸序列的DNA序列。本文所用“大體的氨基酸序列同一性”指至少70％，優(yōu)選的是至少75％、80％、85％、90％，更為優(yōu)選的是兩個(gè)對(duì)比氨基酸序列，尤其是對(duì)比CDRs的全部氨基酸中僅有5個(gè)，還要更為優(yōu)選的是僅有3個(gè)，還要更為優(yōu)選的是僅有1個(gè)氨基酸不同。
本發(fā)明在另一種實(shí)施方案中進(jìn)一步涉及含有本發(fā)明所述核酸的原核或真核表達(dá)載體。該載體例如，質(zhì)粒、噬菌?；蛘沉?。這些表達(dá)載體含有至少一個(gè)啟動(dòng)子、至少一個(gè)用于翻譯起始的信號(hào)、至少一個(gè)本發(fā)明所述的核酸序列以及，在原核表達(dá)載體情況中的用于翻譯終止的信號(hào)，而真核表達(dá)載體的情況則優(yōu)選用于轉(zhuǎn)錄終止和用于聚腺苷酸化的其它信號(hào)。
用于在大腸桿菌中表達(dá)的原核表達(dá)載體實(shí)例是例如，US 4,952,496所述以可被T7 RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子為基礎(chǔ)的表達(dá)載體，用于在釀酒酵母中表達(dá)的真核表達(dá)載體的實(shí)例則例如，載體p426Met25或526GAL1(Mummberg et al.(1994)Nucl.Acids Res.，22，5767-5768)，用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的載體例如，EP-B1-0 127 839或EP-B1-0 549 721所述的桿狀病毒載體，用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的載體例如載體Rc/CMV和Rc/RSV或SV40-載體，這些載體通常是已知的，并可通過(guò)商業(yè)渠道獲得。
擴(kuò)增上述表達(dá)載體的分子生物學(xué)方法和轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞并培養(yǎng)被轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的方法，以及由該轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞生成并獲得本發(fā)明所述多肽的條件均是熟練技術(shù)人員熟知的。例如，本發(fā)明所述的核酸分子可通過(guò)合適的方式被克隆進(jìn)Sambrook等人所述的表達(dá)載體中(1989)(“Molecular cloninga laboratory manual(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè))”第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有本發(fā)明所述核酸和/或載體的宿主細(xì)胞，具體而言，其中的宿主細(xì)胞是諸如酵母或其它真菌、大腸桿菌、枯草桿菌或其它細(xì)菌的微生物。該宿主細(xì)胞還可以是高等真核起源的細(xì)胞，諸如昆蟲(chóng)細(xì)胞，優(yōu)選病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞，更優(yōu)選的是桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞，或者是諸如HeLa、COS、MDCK 293-EBNA1、NS0或雜交瘤細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了生成并復(fù)制本發(fā)明所述多肽，尤其是本發(fā)明所述抗體片段的方法，包括培養(yǎng)經(jīng)過(guò)含有本發(fā)明所述DNA的重組載體轉(zhuǎn)化的微生物，并從培養(yǎng)基中回收本發(fā)明所述的相應(yīng)多肽，尤其是本發(fā)明所述的抗體片段或含有該抗體片段的融合蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的一種進(jìn)一步的實(shí)施方案，PVR在細(xì)胞表面的表達(dá)可在采用了含有序列列表所列SEQ ID No.1-4或SEQ ID No.69或SEQID No.70中的任一序列的分子、生物偶聯(lián)物或多肽、抗體或抗體片段的試驗(yàn)中被檢測(cè)出來(lái)。該試驗(yàn)的樣品取自被試者，例如活檢標(biāo)本取自被懷疑患有增殖性疾病的組織。通常，該樣品在進(jìn)行試驗(yàn)前通過(guò)眾所周知的方法被處理過(guò)?？蓱?yīng)用的試驗(yàn)包括ELISA、RIA、EIA、蛋白質(zhì)印跡分子、免疫組織學(xué)染色等。根據(jù)被采用的試驗(yàn)方法，可以酶、熒光團(tuán)或放射性同位素標(biāo)記所述抗原或抗體(參見(jiàn)例如Coligan et al.(1994)Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons Inc.，New York，New York；and Frye et al.(1987)Oncogene 4，1153-1157)。該試驗(yàn)尤其有助于鑒定對(duì)利用PVR調(diào)節(jié)劑進(jìn)行的治療易感的患者，因?yàn)閺乃麄兊脑l(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤來(lái)源的細(xì)胞顯示了PVR表達(dá)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了調(diào)節(jié)并確定自然發(fā)生的PVR表達(dá)癌癥細(xì)胞的粘附性的方法。該方法測(cè)定了靶的粘附性，例如細(xì)胞對(duì)其它物質(zhì)，例如另一種細(xì)胞、病毒、復(fù)雜生物學(xué)混合物，例如胞外基質(zhì)或基底層的粘附性。該方法包括下述步驟
a.使細(xì)胞與PVR功能調(diào)節(jié)分子接觸；b.使癌癥細(xì)胞在適合其生長(zhǎng)的條件下與ECM蛋白層接觸；c.分析該癌癥細(xì)胞與ECM蛋白層的粘附；d.任選地，將附著所述分子的可誘導(dǎo)標(biāo)記活化，并再次進(jìn)行步驟c)；并e.確定與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，步驟c)和任選步驟d)中再次附著的細(xì)胞的百分比。
本文所用術(shù)語(yǔ)“ECM蛋白層”被理解為一層半干的蛋白質(zhì)溶液，能夠培養(yǎng)與該蛋白層接觸的癌癥細(xì)胞并使侵襲性癌癥細(xì)胞附著該蛋白層。該“ECM蛋白層”的厚度介于0,1mm-1mm之間，優(yōu)選0,3mm厚。ECM蛋白的實(shí)例是胞外基質(zhì)的物質(zhì)。具體而言，ECM蛋白選自蛋白質(zhì)膠原蛋白、觸覺(jué)蛋白、巢蛋白、玻連蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白。更具體而言，ECM蛋白選自I型膠原蛋白S、IV型膠原蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟a)的干擾分子是特異性結(jié)合PVR的胞外表位的分子，具體而言是本發(fā)明所述的修飾分子，更具體而言是本發(fā)明所述的修飾抗體或被修飾的抗體片段，還要更具體而言是被修飾的抗體片段，甚至還要更具體而言是被修飾的scFv、dsFv、Fv、單結(jié)構(gòu)域抗體或雙抗體。
另一種實(shí)施方案中，所述方法的步驟a)包括利用抗PVR的反義寡核苷酸、抗PVR的siRNA或siRNA樣發(fā)夾RNA，或可使細(xì)胞出現(xiàn)抗PVR的siRNA或抗PVR的siRNA樣發(fā)夾RNA的載體。尤其優(yōu)選的是利用抗PVR的siRNA或siRNA樣發(fā)夾RNA或可使細(xì)胞出現(xiàn)抗PVR的siRNAs或抗PVR的siRNA樣發(fā)夾RNA的載體。
在本發(fā)明的該特定實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸分子抑制PVR的基因表達(dá)。優(yōu)選地，抑制PVR的基因表達(dá)的分子可以是抗PVR的反義寡核苷酸、通常被稱(chēng)為siRNA(小干擾RNA)的抗PVR的干擾性雙鏈RNA、作為基因表達(dá)抑制劑抗PVR功能的siRNA樣發(fā)夾RNAs，或可使細(xì)胞出現(xiàn)抗PVR的siRNA或抗PVR的siRNA樣發(fā)夾RNA的載體。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟d)被引入所述方法中，以將附著于本發(fā)明所述的PVR特異性結(jié)合分子的可誘導(dǎo)標(biāo)記活化。如果，例如所連標(biāo)記為發(fā)色團(tuán)，則通過(guò)前述CALI的活化可能破壞PVR的臨近活性結(jié)構(gòu)域，并從而提高對(duì)PVR功能性的調(diào)節(jié)和/或抑制。之前顯示僅具有適度調(diào)節(jié)PVR功能性的能力，例如僅具有抑制能力或者甚至僅具有PVR結(jié)合能力的分子可以因此成為PVR功能的高度潛在調(diào)節(jié)劑或抑制劑。該方法通過(guò)將癌癥細(xì)胞與未活化分子所結(jié)合細(xì)胞和/或未經(jīng)處理的細(xì)胞進(jìn)行比較，可量化對(duì)該癌癥細(xì)胞的粘附性的調(diào)節(jié)或抑制。
業(yè)已認(rèn)為腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞或胞外基質(zhì)之間的粘附相互作用是轉(zhuǎn)移形成過(guò)程中的基礎(chǔ)步驟。因此，利用粘附阻斷劑對(duì)腫瘤細(xì)胞粘附潛能的干擾是有希望阻止轉(zhuǎn)移的方法。本發(fā)明的成就不僅在于提供了可與PVR結(jié)合并如Lange et al.((2000)Virology，285，218-227)所述可能具有抑制能力的分子，還在于通過(guò)復(fù)雜和組合的篩選、選擇和任選的誘導(dǎo)方法鑒定、分離并提供了可基本上調(diào)節(jié)或破壞特定細(xì)胞上的PVR功能的分子，該特定細(xì)胞來(lái)源于增殖性失調(diào)或疾病和/或自然發(fā)生的癌癥。優(yōu)選的調(diào)節(jié)是對(duì)腫瘤相關(guān)粘附行為的抑制，進(jìn)一步優(yōu)選的調(diào)節(jié)是通過(guò)破壞PVR的活性結(jié)構(gòu)域?qū)δ[瘤相關(guān)粘附行為的阻止。
不過(guò)，本發(fā)明還提供了對(duì)所述粘附行為的活化或增強(qiáng)，例如增強(qiáng)對(duì)選定的免疫細(xì)胞，諸如天然殺傷細(xì)胞或特定合成成分的粘附行為，所述特定合成成分可以，例如在血液透析中提取所述腫瘤細(xì)胞?？傊景l(fā)明提供了可通過(guò)與活性結(jié)構(gòu)域結(jié)合或?qū)⑵淦茐?，有效阻止腫瘤相關(guān)PVR功能，即例如癌癥細(xì)胞的粘附行為的分子或經(jīng)過(guò)修飾或標(biāo)記的分子。
腫瘤細(xì)胞遷移進(jìn)入組織也是轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要步驟?？衫每鐑?nèi)皮模型研究該侵襲過(guò)程(參見(jiàn)Woodward et al.(2002)InyestOphthalmol Vis Sci 43，1708-14 and Vachula et al.(1992)Invasion Metastasis 12，66-81)。類(lèi)似的跨內(nèi)皮模型提供了進(jìn)一步有助于鑒定上述分子和篩選可調(diào)節(jié)或抑制PVR介導(dǎo)的侵襲過(guò)程的分子的體外試驗(yàn)方法。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了調(diào)節(jié)并確定自然發(fā)生的PVR表達(dá)癌癥細(xì)胞的侵襲力的方法。該方法包括下述步驟a.使所述細(xì)胞與PVR功能調(diào)節(jié)分子接觸；b.使所述癌癥細(xì)胞在適合其生長(zhǎng)的條件下與凝膠樣基質(zhì)接觸；并c.分析該癌癥細(xì)胞通過(guò)所述凝膠形成基質(zhì)的遷移；d.任選地，將附著所述分子的可誘導(dǎo)標(biāo)記活化并再次進(jìn)行步驟c)；并e.確定與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，步驟c)和任選步驟d)中遷移的細(xì)胞百分比。
本文所用術(shù)語(yǔ)“凝膠樣基質(zhì)”指含水量至少90％的半固態(tài)物質(zhì)，允許培養(yǎng)與該基質(zhì)接觸的癌癥細(xì)胞，并允許侵襲性癌癥細(xì)胞遷移通過(guò)0,1mm-1mm，優(yōu)選0,3mm厚度的“凝膠樣基質(zhì)”層，但不允許非侵襲性細(xì)胞遷移。這種“凝膠樣基質(zhì)”的實(shí)例是與蛋白質(zhì)中的胞外基質(zhì)和糖類(lèi)組合物類(lèi)似的物質(zhì)，具體而言是通過(guò)商業(yè)渠道可獲得的“Matrigel”。具體而言，該“凝膠樣基質(zhì)”含有選自蛋白質(zhì)IV型膠原蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白之一的蛋白質(zhì)。更具體而言，該凝膠樣基質(zhì)含有蛋白質(zhì)IV型膠原蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白。更優(yōu)選的凝膠樣基質(zhì)含有蛋白質(zhì)IV型膠原蛋白、層粘連蛋白、觸覺(jué)蛋白、巢蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖或IV型膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、巢蛋白、觸覺(jué)蛋白和玻連蛋白。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟a)的干擾分子是特異性結(jié)合PVR的胞外表位的分子，具體而言是本發(fā)明所述的修飾多肽，更具體而言是本發(fā)明所述的修飾抗體或經(jīng)過(guò)修飾的抗體片段，還要更具體而言是經(jīng)過(guò)修飾的抗體片段，還要更具體而言是經(jīng)過(guò)修飾的scFv、dsFv、Fv、單結(jié)構(gòu)域抗體或雙抗體。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法的步驟a)包括利用抗PVR的反義寡核苷酸、抗PVR的siRNA或siRNA樣發(fā)夾RNA或可使細(xì)胞出現(xiàn)上述抗PVR的siRNA或抗PVR的siRNA樣發(fā)夾RNA的載體。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟d)被引入所述方法中，以將附著本發(fā)明所述PVR特異性結(jié)合分子的可誘導(dǎo)標(biāo)記活化。如果，例如所連標(biāo)記為發(fā)色團(tuán)，則通過(guò)下文所述CALI的活化可能破壞PVR的鄰近活性結(jié)構(gòu)域，并從而增強(qiáng)對(duì)PVR功能性的調(diào)節(jié)和/或抑制。之前顯示僅具有適度調(diào)節(jié)PVR功能性的能力，例如僅具有抑制一種功能而不抑制其它功能的能力或者甚至僅具有PVR結(jié)合能力的分子可以因此成為PVR功能的高度潛在調(diào)節(jié)劑或抑制劑。該方法通過(guò)將癌癥細(xì)胞與未活化分子所結(jié)合細(xì)胞和/或未經(jīng)處理的細(xì)胞進(jìn)行比較，可量化對(duì)該癌癥細(xì)胞的侵襲力的調(diào)節(jié)或抑制。本發(fā)明所述對(duì)癌癥細(xì)胞的侵襲行為的調(diào)節(jié)或抑制大于20％、大于40％、大于60％或者甚至大于80％的分子是優(yōu)選的。
所述方法還可選擇最適合個(gè)體患者的本發(fā)明所述分子，以避免任何會(huì)干擾治療方法的個(gè)體失配。
血管生成試驗(yàn)測(cè)定了細(xì)胞誘導(dǎo)血管形成的能力，該血管形成是通常伴隨惡性組織生長(zhǎng)的過(guò)程。血管生成試驗(yàn)可如上述Kanda et al(2002)J.Natl.Cancer Inst.94，1311-9所述方法進(jìn)行。
該試驗(yàn)一方面被包括在鑒定本發(fā)明所述合適分子的方法中，該合適分子除與PVR結(jié)合外還可調(diào)節(jié)其功能。不過(guò)，這些方法與鑒定本發(fā)明所述分子的方法分開(kāi)也是非常有用的，因?yàn)樗鼈兲峁┝司哂懈叨冗x擇性的工具，可篩選患者來(lái)源的癌癥細(xì)胞(例如通過(guò)活組織檢查)，以選擇本發(fā)明所述的合適分子，該分子與患者的個(gè)體PVR反應(yīng)最佳，從而顯示對(duì)該患者來(lái)源的癌癥細(xì)胞的調(diào)節(jié)最有效。優(yōu)選的，體外試驗(yàn)中鑒定的用于后續(xù)治療的分子應(yīng)將所述患者來(lái)源腫瘤細(xì)胞的粘附、運(yùn)輸或侵襲行為抑制大約20％、優(yōu)選40％、50％、60％、80％或者高達(dá)90％。因此，后續(xù)治療可經(jīng)過(guò)特定調(diào)整，以避免在受體結(jié)合活性方面的個(gè)體偏差。
在令一種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，該藥物組合物含有有效量的至少一種，但不限定為本發(fā)明所述的一種分子，具體而言是可調(diào)節(jié)PVR功能的小化合物、抗體、抗體片段或生物偶聯(lián)物，或至少一種可抑制PVR的基因表達(dá)的分子，更具體而言，其中的分子是抗PVR的反義寡核苷酸、抗PVR的干擾性dsRNA(siRNA)或siRNA樣發(fā)夾RNA或可使細(xì)胞出現(xiàn)抗PVR的siRNA或抗PVR的siRNA樣發(fā)夾RNA的載體，該藥物組合物還組合含有藥學(xué)可接受載體和/或稀釋劑。PVR功能抑制分子還可作為單個(gè)有效化合物被用作藥物或治療組合物。
“治療有效量”指可消除或減輕患者的腫瘤負(fù)擔(dān)，或可預(yù)防、延遲或抑制轉(zhuǎn)移的量。該劑量應(yīng)取決于許多參量，包括腫瘤的性質(zhì)、既往病史、患者情況、可能共用的細(xì)胞毒性劑以及給藥方法。給藥方法包括注射(例如腸胃外、皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)等)，就該方法而言，PVR功能抑制分子是被提供無(wú)毒的藥學(xué)可接受載體中。
“藥學(xué)可接受載體”通常指為了不顯著削弱結(jié)合劑的生物學(xué)活性(例如結(jié)合特異性、親和性或穩(wěn)定性)而選擇的合適載體和稀釋劑，諸如水、鹽水、林格液、葡萄糖溶液、5％人血清白蛋白、不揮發(fā)性油、油酸乙酯或脂質(zhì)體。可接受載體可能包括生物適合的惰性或生物可吸收鹽、緩沖劑、寡或多糖、聚合物、諸如透明質(zhì)酸的粘彈性化合物、粘性改良劑、防腐劑等。此外，藥物組合物或配方還可包括其它載體、佐劑或無(wú)毒、無(wú)治療性、無(wú)免疫原性的穩(wěn)定劑、稀釋劑等。典型劑量的范圍可以是大約0.01到大約20mg/kg或者更具體而言是大約1到大約10mg/kg。
藥物組合物可被用于治療與人PVR過(guò)量表達(dá)或異常表達(dá)相關(guān)的病癥，尤其是治療腫瘤，具有轉(zhuǎn)移潛能和/或微量轉(zhuǎn)移的腫瘤，尤其是來(lái)源于上述癌癥細(xì)胞類(lèi)型的轉(zhuǎn)移性腫瘤。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防患者體內(nèi)的任何增殖性失調(diào)或疾病、原發(fā)或繼發(fā)性腫瘤以及轉(zhuǎn)移的方法，該方法包括施用藥學(xué)可接受組合物中所含特定量的PVR功能抑制分子，該量可有效治療，即抑制、延遲或預(yù)防PVR介導(dǎo)的粘附和/或侵襲的轉(zhuǎn)移，具體而言，其中的分子抑制PVR的基因表達(dá)，更具體而言，其中的分子是抗PVR的反義寡核苷酸、抗PVR的干擾性dsRNA(siRNA)或siRNA樣發(fā)夾RNA或可使細(xì)胞出現(xiàn)抗PVR的siRNA或抗PVR的siRNA樣發(fā)夾RNA的載體?？蛇x地，具體而言，PVR功能抑制分子可以是可結(jié)合PVR胞外區(qū)的分子，可通過(guò)鑒定特異性結(jié)合PVR胞外區(qū)的配體的方法得以鑒定，更具體而言，其中的分子是本發(fā)明所述的小化合物或抗體或抗體片段或修飾多肽，或本發(fā)明所述的生物偶聯(lián)物，還要更優(yōu)選的是其中的分子是本發(fā)明所述經(jīng)過(guò)修飾的scFv或本發(fā)明所述來(lái)源于這種scFv的修飾抗體。此外，該分子可被發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)、酶或放射性同位素標(biāo)記，可通過(guò)例如施用化學(xué)誘導(dǎo)物或暴露于光化學(xué)活化劑而被體內(nèi)誘導(dǎo)或活化。治療或預(yù)防增殖性失調(diào)、癌癥、轉(zhuǎn)移性腫瘤、微量轉(zhuǎn)移和/或轉(zhuǎn)移的方法可有效減少或抑制特定癌癥細(xì)胞中自然發(fā)生的癌癥細(xì)胞的粘附和/或侵襲，所述特定癌癥細(xì)胞來(lái)源于上述選定癌癥細(xì)胞類(lèi)型的轉(zhuǎn)移性腫瘤，因?yàn)樵摲椒@示對(duì)PVR功能的阻斷抑制了上述選定類(lèi)型來(lái)源的癌癥細(xì)胞的粘附性和/或侵襲力。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，采用一種或多種經(jīng)過(guò)修飾的抗體片段對(duì)根據(jù)本發(fā)明具有自然發(fā)生的PVR表達(dá)癌癥細(xì)胞的患者進(jìn)行的治療引起或?qū)е铝藢?duì)人肉瘤細(xì)胞的粘附和/或侵襲能力的降低或抑制。
本文所用的“治療轉(zhuǎn)移性腫瘤”或“治療微量轉(zhuǎn)移”指本發(fā)明所述分子以單一藥物形式或與其它藥物組合應(yīng)用，穩(wěn)定、阻止、延遲或抑制了具有轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞或腫瘤的轉(zhuǎn)移。穩(wěn)定的疾病或“無(wú)變化”(NC)描述的是在至少4周后無(wú)轉(zhuǎn)移變化或減輕程度小于50％或加重程度小于25％的病程。阻止可以指例如，在治療開(kāi)始后未檢測(cè)到新的轉(zhuǎn)移。這可使經(jīng)過(guò)治療的患者與未經(jīng)治療的患者相比，具有了2-3倍的中位值和/或5年的存活期。延遲可以指在治療開(kāi)始后至少8周、3個(gè)月、6個(gè)月或者甚至一年的時(shí)間內(nèi)未檢測(cè)到新的轉(zhuǎn)移。抑制可以指與未經(jīng)處理的試驗(yàn)組相比，經(jīng)由本發(fā)明所述分子治療的試驗(yàn)組的新轉(zhuǎn)移的平均尺寸或總數(shù)量減小了至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或者甚至90％。腫瘤學(xué)領(lǐng)域的熟練醫(yī)師遵循已被普遍接受的轉(zhuǎn)移檢測(cè)實(shí)踐和診斷方法，例如Harrisons Principles of Internal Medicine 15th ed2001 Mc Graw Hill所概述的方法，可檢測(cè)轉(zhuǎn)移的數(shù)量、尺寸和流行率。
根據(jù)一種進(jìn)一步的實(shí)施方案，本發(fā)明所述的治療方法可與多種治療方法組合。在本文中，所述治療與術(shù)語(yǔ)“治療方法”的組合指根據(jù)腫瘤類(lèi)型、患者情況、其它健康問(wèn)題和多種因素，將利用PVR功能抑制分子進(jìn)行的治療方法與化學(xué)療法、外科和放射療法組合應(yīng)用。
因此，本發(fā)明的一種實(shí)施方案是利用至少一種可結(jié)合PVR胞外區(qū)的分子，該分子可通過(guò)鑒定特異性結(jié)合PVR胞外區(qū)的配體的方法得以鑒定，更具體而言，其中的分子是本發(fā)明所述的小化合物或抗體或抗體片段或修飾多肽，或本發(fā)明所述的生物偶聯(lián)物，還要更為優(yōu)選的是，其中的分子是本發(fā)明所述經(jīng)過(guò)修飾的scFv或本發(fā)明所述來(lái)源于這種scFv的修飾抗體，以及本發(fā)明所述的標(biāo)記分子，該標(biāo)記分子可通過(guò)施用或應(yīng)用特定誘導(dǎo)物而被體內(nèi)誘導(dǎo)或活化，所述特定誘導(dǎo)物可用于生產(chǎn)可治療或預(yù)防自然發(fā)生的癌癥細(xì)胞的粘附、侵襲和/或任何轉(zhuǎn)移潛能的藥物，其中所述癌癥細(xì)胞的粘附性、侵襲力和/或轉(zhuǎn)移潛能受PVR功能的影響。
本發(fā)明因而提供了制備藥物組合物或藥物的方法，包括將本發(fā)明所述分子或配體摻入治療、預(yù)防或診斷組合物中的步驟。這可以通過(guò)例如，將已確定的配體或修飾配體與本領(lǐng)域已知的藥學(xué)可接受載體混合而得以實(shí)現(xiàn)，其中配體的含量是治療有效量。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明包括了診斷試劑盒。該試劑盒包括本發(fā)明所述的至少一種生物偶聯(lián)物和/或至少一種標(biāo)記分子或多肽和/或本發(fā)明所述的抗體片段或抗體，或它們的標(biāo)記形式，此外還包括進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)或夾心試驗(yàn)所必需的試劑和材料。該診斷試劑盒可被用于測(cè)定生物學(xué)樣品，尤其是某些癌癥細(xì)胞類(lèi)型的生物學(xué)樣品的侵襲潛能。試劑盒典型地進(jìn)一步包括容器。
包括所進(jìn)行試驗(yàn)和所獲結(jié)果在內(nèi)的下述實(shí)例僅用于例證，對(duì)本發(fā)明不構(gòu)成限制。
附圖簡(jiǎn)述

圖1所示為染色的HT1080細(xì)胞侵襲通過(guò)Matrigel包被的8μm濾器。37℃.溫育6小時(shí)后定量熒光。所示數(shù)據(jù)為n＝3個(gè)孔的平均值+/-SD。
圖2a所示為scFv1對(duì)HT1080細(xì)胞侵襲的抑制作用。侵襲是在利用Matrigel包被的細(xì)胞遷移池進(jìn)行的趨化性試驗(yàn)中測(cè)定的。該侵襲是在激光照射(進(jìn)行CALI)后測(cè)定的。HT1080細(xì)胞在缺乏所有抑制分子條件下的侵襲被用作對(duì)照(左柱)。分子scFv1將HT1080細(xì)胞的侵襲抑制了大約22％(p-值＜0.05)圖2b所示為商品抗PVR抗體(D171)、scFv3和scFv4對(duì)HT1080細(xì)胞侵襲的抑制作用。侵襲是在利用Matrigel包被的細(xì)胞遷移池進(jìn)行的趨化性試驗(yàn)中測(cè)定的。該侵襲是在光照射之前和之后測(cè)定的(黑柱表示未進(jìn)行CALI，灰柱表示進(jìn)行了CALI)。HT1080細(xì)胞在缺乏所有抑制分子(0)條件下的侵襲被用作對(duì)照(左柱)。分子scFv3和scFv4將HT1080細(xì)胞的侵襲抑制了大約30％(p-值＜0.001)圖2c所示為scFv3和scFv4對(duì)MDA-MD231細(xì)胞侵襲的抑制作用。侵襲是在利用Matrigel包被的細(xì)胞遷移池進(jìn)行的趨化性試驗(yàn)中測(cè)定的。該侵襲是在光照射之前和之后測(cè)定的(黑柱表示未進(jìn)行CALI，灰柱表示進(jìn)行了CALI)。HT1080細(xì)胞在缺乏所有抑制分子(0)條件下的侵襲被用作對(duì)照(左柱)。scFv3和scFv4將MDA-MD231細(xì)胞的侵襲抑制了大約23％(p-值＜0.001)圖2d所示為scFv3*和scFv4*對(duì)兩種不同成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系(U87MG細(xì)胞＝左側(cè)柱組，A172＝右側(cè)柱組)遷移的抑制作用。遷移是在光照射之前和之后測(cè)定的(黑柱表示未進(jìn)行CALI，灰柱表示進(jìn)行了CALI)。細(xì)胞在缺乏所有抑制分子(對(duì)照)條件下的遷移被用作對(duì)照(各組的左柱)。符號(hào)“*”表示由圖10和圖11所示編號(hào)區(qū)分的各scFv被克隆成IgG形式。
圖3所示為scFv1和scFv2對(duì)HT1080細(xì)胞粘附I型膠原蛋白S的抑制作用。該粘附是在激光照射(進(jìn)行CALI)后測(cè)定的。HT1080細(xì)胞在缺乏所有抑制分子條件下的粘附被用作對(duì)照(左柱)。分子scFv1將該粘附抑制了大約56％，分子scFv2則抑制了42％(p-值＜0.05)。
圖4所示為FACS分析結(jié)果。例證了scFv1和scFv2與HT1080細(xì)胞(粗線(xiàn))和對(duì)照HS-27細(xì)胞(虛線(xiàn))的結(jié)合活性。也例證了scFv1與PC3-細(xì)胞、KHOS-細(xì)胞和肝細(xì)胞的結(jié)合。
圖5所示為免疫沉淀試驗(yàn)的結(jié)果。scFv1和scFv2與HT1080細(xì)胞和對(duì)照HS-27細(xì)胞的裂解產(chǎn)物一起溫育。通過(guò)SDS-PAGE和銀染色分離免疫復(fù)合物。圖示指出了scFv條帶以及PVR特異性條帶。
圖6所示為從利用scFv1免疫沉淀所得大約75kDa大小的條帶獲得的肽混合物的MALDI-MS圖譜。兩個(gè)被標(biāo)為T(mén)的胰蛋白酶自身消化峰被用于內(nèi)部校準(zhǔn)。共計(jì)6個(gè)被標(biāo)記以星號(hào)的峰與PVR匹配(SwissProt，P15151)，質(zhì)量偏差小于10ppm。匹配肽占所述蛋白質(zhì)的18％(74/417個(gè)殘基)。
圖7所示為scFv展示載體pXP10的載體圖和對(duì)應(yīng)序列(SEQ ID No.7)圖8所示為scFv表達(dá)載體pXP14的載體圖和對(duì)應(yīng)序列(SEQ ID NO.8)圖9所示為scFv1的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)和核苷酸序列(SEQ ID NO.5)圖10所示為scFv2的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)和核苷酸序列(SEQ ID NO.6)圖11所示為scFv3的氨基酸序列(SEQ ID NO.69)和核苷酸序列(SEQ ID NO.71)圖12所示為scFv4的氨基酸序列(SEQ ID NO.70)和核苷酸序列(SEQ ID NO.72)圖13所示為發(fā)色團(tuán)輔助激光鈍化(CALI)的原理圖14所示為引物SEQ ID No.9-52、63-68的序列。
實(shí)施例實(shí)施例1免疫文庫(kù)的構(gòu)建采用2×107個(gè)多聚甲醛固定的HT1080細(xì)胞(人纖維肉瘤細(xì)胞系；ATCC，CCL-121)皮內(nèi)免疫接種兩只BALB/c小鼠。初次免疫后，在39天內(nèi)重復(fù)注射2次，處死小鼠，分離脾臟并冷凍在液氮中。
從兩份脾臟制備物中各取出一半，利用RNeasy Midi試劑盒(QIAGEN #75142)并參照生產(chǎn)商所述方法分離總RNA。RNA濃度和純度是通過(guò)變性甲醛凝膠和光度測(cè)定而得以確定的。
利用SuperscriptTMII試劑盒(GibcoBRL Life Technologies#18064-014)和8.9μg新鮮制備的RNA和10pmol引物混合物(IgG1-c(SEQ ID NO.63)、IgG2a-c(SEQ ID NO.64)、IgG2b-c(SEQ ID NO.65)、IgG3-c(SEQ ID NO.66)、VLL-c(SEQ ID NO.67)、VLK-c(SEQ ID NO.68))合成cDNA。這些引物退火至編碼κ和λ家族的IgG重鏈(VH)基因和輕鏈(VL)基因的RNA上。VH基因是利用9種正向引物(M-VH1(SEQ ID NO.9)、M-VH2(SEQ ID NO.10)、M-VH3(SEQ ID NO.11)、M-VH4(SEQ ID NO.12)、M-VH5(SEQ ID NO.13)、M-VH6(SEQ ID NO.14)、M-VH7(SEQ ID NO.15)、M-VH8(SEQ ID NO.16)、M-VH9(SEQ ID NO.17))和4種無(wú)限制位點(diǎn)的反向引物(M-JH1(SEQ ID NO.18)、M-JH2(SEQ ID NO.19)、M-JH3(SEQ ID NO.20)、M-JH4(SEQ ID NO.21))的36種個(gè)體組合，通過(guò)PCR由1μl cDNA擴(kuò)增而得。VL是利用一種無(wú)限制位點(diǎn)的引物混合物(M-VK1(SEQ ID NO.22)、M-VK2(SEQ ID NO.23)、M-VK3(SEQ ID NO.24)、M-VK4(SEQ ID NO.25)、M-VL1(SEQ ID NO.26)、M-JK1(SEQ ID NO.27)、M-JK2(SEQ ID NO.28)、M-JK3(SEQ ID NO.29)、M-JL1(SEQ ID NO.30))通過(guò)PCR擴(kuò)增而得。經(jīng)過(guò)凝膠純化(QIAquick GelExtraction Kit，#28706)PCR產(chǎn)物后，利用9種正向引物(MVH1 SfiI(SEQ ID NO.31)、MVH2 SfiI(SEQ ID NO.32)、MVH3 SfiI(SEQ ID NO.33)、MVH4 SfiI(SEQ ID NO.34)、MVH5 SfiI(SEQ ID NO.35)、MVH6 SfiI(SEQ ID NO.36)、MVH7 SfiI(SEQ ID NO.37)、MVH8 SfiI(SEQ ID NO.38)、MVH9 SfiI(SEQ ID NO.39))和4種具有用于VH的限制位點(diǎn)的反向引物(M-JH1SalI(SEQ ID NO.40)、M-JH2 SalI(SEQ ID NO.41)、M-JH3 SalI(SEQ ID NO.42)、M-JH4 SalI(SEQ ID NO.43))的個(gè)體組合和一種具有用于VL的限制位點(diǎn)的引物混合物(M-VK1 ApaLI(SEQ ID NO.44)、M-VK2 ApaLI(SEQ ID NO.45)、M-VK3 ApaLI(SEQ ID NO.46)、M-VK4 ApaLI(SEQ ID NO.47)、M-VL1 ApaLI(SEQ ID NO.48)、M-JK1 NotI(SEQ ID NO.49)、M-JK2 NotI(SEQ ID NO.50)、M-JK3 NotI(SEQ ID NO.51)、M-JL1 NotI(SEQ ID NO.52))再次將其擴(kuò)增。凝膠純化(QIAquick GelExtraction Kit，#28706)PCR產(chǎn)物后，利用用于VH的限制位點(diǎn)SfiI/SalI和用于VL的限制位點(diǎn)ApaLI/NotI將其克隆進(jìn)噬菌體展示載體pXP10(SEQ ID No.7)中。通過(guò)電穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)染進(jìn)大腸桿菌TG-1中，獲得大小為107個(gè)可表達(dá)不同單鏈抗體片段(scFv)的獨(dú)立克隆(噬菌體)的文庫(kù)。
實(shí)施例2對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性scFv的選擇(基于固定細(xì)胞進(jìn)行的選擇)如下選擇可表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞具有高親和力的scFv的噬菌體利用0.05％EDTA收獲HT1080細(xì)胞，用多聚甲醛將其固定，在PBS中稀釋至1×107個(gè)細(xì)胞/ml，并固定在96孔UV交聯(lián)板(Corning Costar)的孔上。采用溶解在PBS(MPBS)中的5％脫脂奶粉(#70166，F(xiàn)luka)封閉該UV交聯(lián)板的孔。用MPBS在25℃條件下將1012cfu(菌落形成單位)的噬菌體文庫(kù)/106個(gè)細(xì)胞預(yù)封閉1小時(shí)，并隨后與細(xì)胞一起在室溫(RT)下溫育1.5小時(shí)。用PBS+0.05％Tween-20將該UV交聯(lián)板的孔洗滌6次后，再用PBS洗滌6次。通過(guò)加入pH2.2的10mM甘氨酸，并以pH7.4的1M Tris/HCl中和，洗脫已結(jié)合的噬菌體。典型地，在第一輪選擇中洗脫了103-106cfu，因此，與原始的所有組成成分相比，富集的所有組成成分的多樣性降低了。通過(guò)感染指數(shù)生長(zhǎng)的大腸桿菌TG1，擴(kuò)增含有富集的所有組成成分的洗脫物。選擇含有噬菌粒的大腸桿菌，并使其于30℃條件下，在補(bǔ)充有100μg/ml氨芐青霉素和1％葡萄糖的LB瓊脂平板上過(guò)夜(o/n)生長(zhǎng)，以增殖。在該步驟后，或者將富集的所有組成成分作為多克隆集合擴(kuò)增，并用于以反復(fù)方式進(jìn)行進(jìn)一步選擇，直到實(shí)現(xiàn)預(yù)期特性的會(huì)聚為止，或者是被空間分離并在單克隆水平進(jìn)行篩選。用于下一輪選擇的噬菌體顆粒是通過(guò)下述步驟制備的，即采用輔助噬菌體VCS-M13(Stratagene，La Jolla，CA)超感染前一輪選擇的指數(shù)生長(zhǎng)培養(yǎng)物，并使該培養(yǎng)物于20℃條件下在補(bǔ)充有100μg/ml氨芐青霉素(amp)和50μg/ml卡那霉素(kan)的2xTY中生長(zhǎng)過(guò)夜。利用0.5M NaCl/4％PEG-6000，從澄清的細(xì)菌上清液中沉淀出選擇所獲噬菌體，并使其再次懸浮于PBS中。進(jìn)行一輪選擇后，如實(shí)施例3所述方法在單克隆水平上進(jìn)行篩選。
實(shí)施例3scFv的篩選(基于固定細(xì)胞進(jìn)行的篩選)為進(jìn)行篩選，將噬菌體展示載體所含編碼選定scFv的基因再次克隆進(jìn)表達(dá)載體pXP14(SEQ ID No.8)中。該載體引導(dǎo)了融合有Strep-標(biāo)記和E-標(biāo)記的scFv的表達(dá)，并且不含絲狀噬菌體基因-3。使含有單菌落來(lái)源的大腸桿菌TG1的表達(dá)載體生長(zhǎng)在微量滴定板的獨(dú)立孔中，使各孔僅含一個(gè)scFv克隆。在30℃條件下，使細(xì)菌生長(zhǎng)在96孔微量滴定板(#9297，TPP)各孔內(nèi)補(bǔ)充有100μg/ml氨芐青霉素和0.1％葡萄糖的2xTY中，直到OD600為0.7為止。利用最終濃度為0.5mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并于25℃持續(xù)表達(dá)過(guò)夜。通過(guò)加入雞蛋溶菌酶(#L-6876，Sigma)至最終濃度50μg/ml，在25℃條件下溫育1小時(shí)，并以3000xg離心15分鐘，制備出含有單鏈Fv的澄清裂解產(chǎn)物。進(jìn)行篩選ELISA之前，通過(guò)加入等體積DMEM+10％FCS，將上述澄清裂解產(chǎn)物封閉1小時(shí)。為進(jìn)行篩選ELISA，采用0.05％EDTA收獲HT1080細(xì)胞，用多聚甲醛固定，在PBS中稀釋至1×107個(gè)細(xì)胞/ml，并將其固定在96孔UV交聯(lián)板(Corning Costar)的孔內(nèi)。采用MPBS封閉該UV交聯(lián)板的各孔，加入含有scFv的已封閉澄清裂解產(chǎn)物并于25℃溫育1.5小時(shí)。采用PBS+0.1％Tween-20洗滌該板2次后，再用PBS洗滌1次，與結(jié)合了HRP的α-E-標(biāo)記(#27-9413-01，Pharmacia Biotech；利用含有0.1％Tween-20的MPBS將其1∶5000稀釋)一起溫育1小時(shí)，利用PBS+0.1％Tween-20將其洗滌3次后，再用PBS洗滌3次，用POD(#1 484 281，Roche)顯影，并于370nm讀出信號(hào)。
利用上述ELISA篩選方法再次檢驗(yàn)抗HT1080細(xì)胞的陽(yáng)性克隆和抗對(duì)照人成纖維細(xì)胞Hs-27(ATCC CRL-1634)的克隆，并將它們保存在甘油凍存管中。在典型的篩選中，對(duì)2760(30×92)個(gè)克隆進(jìn)行篩選，與HT1080細(xì)胞的結(jié)合有5％為陽(yáng)性的克隆被定義為可提供背景扣除信號(hào)＞0.1的克隆。再次檢驗(yàn)155個(gè)陽(yáng)性克隆與HT1080細(xì)胞的特異性結(jié)合，并與Hs-27對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行比較，28％的結(jié)合為陽(yáng)性的克隆被定義為可提供的基于HT1080的背景扣除信號(hào)值是基于Hs-27對(duì)照細(xì)胞的信號(hào)值的至少2倍的克隆。
實(shí)施例4對(duì)已確定的scFv的測(cè)序及其大規(guī)模表達(dá)對(duì)scFv1-scFv4及它們的基因的測(cè)序是由德國(guó)的Sequiserve GmbH，Vaterstetten利用引物pXP2 Seq2(5’-CCCCACGCGGTTCCAGC-3’(SEQID No.53)和pXP2 Seq1(5′TACCTATTGCCTACGGC-3′(SEQ ID No.54)進(jìn)行的。附圖顯示了它們的氨基酸序列和核苷酸序列。
將通過(guò)測(cè)序鑒定的獨(dú)特克隆從甘油凍存管中劃取出來(lái)，并劃線(xiàn)接種至LB/Amp(100μg/ml)/1％葡萄糖瓊脂平板上，于30℃溫育過(guò)夜。將單菌落接種進(jìn)10ml LB/Amp/Glu(1％)培養(yǎng)基中，使其在30℃和200rpm震蕩條件下生長(zhǎng)過(guò)夜。第二天早晨，在接種進(jìn)2L椎形瓶中補(bǔ)充有100μg/ml氨芐青霉素和0.1％葡萄糖的1L 2xTY培養(yǎng)基之前，將過(guò)夜培養(yǎng)物置于冰上。該培養(yǎng)物于25℃震蕩條件下生長(zhǎng)至OD600 0.5-0.6后，用最終濃度為0.1mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。加入50μg/ml的新鮮氨芐青霉素，并于22℃震蕩條件下繼續(xù)溫育過(guò)夜。第二天早晨，于4℃、5000xg條件下離心該培養(yǎng)物15分鐘，拋棄上清液，并在冰上利用吸液管小心地將沉淀重新懸浮在含有完全蛋白酶抑制劑(#1697498，Roche)的10ml預(yù)冷PBS-0.5M Na緩沖液中。重新懸浮完成后，將細(xì)菌懸液轉(zhuǎn)移進(jìn)20ml的akrodge離心管中，加入雞蛋溶菌酶(#L-6876，Sigma)至最終濃度50μg/ml，并于冰上放置1小時(shí)。在4℃和20000xg條件下離心裂解的細(xì)菌15分鐘，并將上清液(裂解產(chǎn)物)轉(zhuǎn)移進(jìn)15ml的塑料管中。為進(jìn)行親和純化，借助于平行蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)，以1ml/min的速率將上述裂解產(chǎn)物上樣至經(jīng)由10倍柱體積(CV)的PBS-0.5M Na緩沖液平衡過(guò)的1ml StrepTactin(#2-1505-010，IBA)柱上。采用10CV的PBS進(jìn)行洗滌，并采用5CV的PBS/5mM Desthiobiotin(#D-1411，Sigma)進(jìn)行洗脫，收集1ml洗脫組分。在UV280波長(zhǎng)檢測(cè)該洗脫組分，將含有蛋白質(zhì)的洗脫組分混合，并利用Amicon超離心濾器裝置10.000 MWCO(#UFC801024，Millipore)以4700xg將其濃縮。
在經(jīng)由考馬斯藍(lán)染色的12％Bis-Tris SDS-PAGE凝膠上檢查濃縮scFv的純度，并將其分為等分試樣與20％甘油一起-80℃冷凍保存。
實(shí)施例4.1鼠scFv重構(gòu)進(jìn)入嵌合IgG(人-鼠)及其表達(dá)鼠scFvs由通過(guò)接頭序列連接在一起的可變輕鏈和重鏈的序列組成。該可變輕鏈和可變重鏈?zhǔn)欠謩e利用引物通過(guò)PCR而得以擴(kuò)增的，含有限制位點(diǎn)。這些限制位點(diǎn)還存在于特定載體中，該載體含有適合用于所述重和輕鏈的鼠恒定結(jié)構(gòu)域。采用限制酶切割擴(kuò)增的可變結(jié)構(gòu)域，并將其克隆進(jìn)已切割的載體中。通過(guò)測(cè)序證實(shí)序列正確。
利用4種載體，其中一種載體含有用于IgG1形式的重鏈的鼠恒定結(jié)構(gòu)域。第二種載體含有用于IgG4形式的重鏈的鼠恒定結(jié)構(gòu)域，另外兩種載體分別含有λ和κ輕鏈的鼠恒定結(jié)構(gòu)域。不同的限制位點(diǎn)可使對(duì)這些載體的切割和將這些載體中的可變結(jié)構(gòu)域連接得以實(shí)現(xiàn)。
為使所述嵌合IgGs在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)，上述載體含有埃-巴二氏病毒復(fù)制起點(diǎn)(oriP序列)，可提高在293-EBNA-HEK細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平，因?yàn)镋BNA蛋白可引起游離型載體的復(fù)制。
利用用于所述重鏈的載體和用于所述輕鏈的載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，使細(xì)胞表達(dá)兩條鏈，并實(shí)現(xiàn)IgG在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的裝配。隨后，已裝配的IgG被分泌進(jìn)培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染方法采用的是磷酸鈣轉(zhuǎn)染法，其中形成了磷酸鈣與所述DNA的沉淀，將其整合進(jìn)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后，將上述培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基。每3天收獲一次IgG，每種IgG取三份樣品。無(wú)菌過(guò)濾上清液(培養(yǎng)基)并于4℃保存。
為了純化IgGs，借助于A蛋白瓊脂糖，根據(jù)上清液的體積，或者通過(guò)重力流動(dòng)或者通過(guò)HPLC純化上清液。對(duì)于高達(dá)200ml的體積而言，采用重力流動(dòng)方法。對(duì)這兩種類(lèi)型的純化方法而言，均是將上清液上樣在A蛋白柱上，采用pH7的50mM Tris緩沖液洗滌，并采用pH約2-3的0.1M檸檬酸鹽進(jìn)行洗脫。將pH9的0.25M Tris加入洗脫組分中，使其pH值為5.5-6.0。根據(jù)IgGs的進(jìn)一步用途，用PBS緩沖液對(duì)它們進(jìn)行透析并于-80℃或4℃保存。
實(shí)施例5針對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合的FACS分析為了檢驗(yàn)純化抗HT1080 scFv特異性結(jié)合靶細(xì)胞的能力，我們采用HT1080細(xì)胞(ATCC CCL-121)和對(duì)照細(xì)胞系Hs-27細(xì)胞(106個(gè)細(xì)胞/ml)進(jìn)行熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)分析(參見(jiàn)圖4)。還檢驗(yàn)了ScFv與KHOS細(xì)胞(ATCC CRL-1544)、PC-3細(xì)胞(ATCC CRL-1435)，以及張氏肝細(xì)胞(含有Hela細(xì)胞雜質(zhì)的DSMZ ACC-57)(均為106個(gè)細(xì)胞/ml)的結(jié)合，與HT1080細(xì)胞進(jìn)行比較。4℃條件下，溫育CellWash(BD(Becton，Dickinson and Company)#349524)中的細(xì)胞和10μg/ml純scFv 20分鐘，洗滌后，利用次級(jí)FITC標(biāo)記的抗E-標(biāo)記mab(Amersham #27-9412-01)檢測(cè)已結(jié)合的scFv’s。洗滌樣品并利用Becton Dickinson FACSscan對(duì)其進(jìn)行分析。圖4(上圖)所示為與scFv1和scFv2反應(yīng)的細(xì)胞的對(duì)數(shù)熒光強(qiáng)度(FL1-H；x-軸)與相對(duì)細(xì)胞數(shù)量(計(jì)數(shù)；y-軸)的關(guān)系曲線(xiàn)。細(xì)線(xiàn)代表對(duì)照細(xì)胞系(HS-27)，粗線(xiàn)則代表HT1080細(xì)胞。scFv1和scFv2特異性地使腫瘤細(xì)胞系著色，其信號(hào)強(qiáng)度比對(duì)照細(xì)胞系高達(dá)10倍。圖4的下圖所示為scFv1與PC3、KHOS和張氏肝細(xì)胞的結(jié)合，相比較于其與HT1080細(xì)胞的結(jié)合。scFv1可與全部這三種細(xì)胞系結(jié)合，但與HT1080細(xì)胞相比，這些結(jié)合的程度較低(PC3、KHOS或張氏肝細(xì)胞＝虛線(xiàn))。
實(shí)施例6通過(guò)FACS進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)性分析為檢驗(yàn)純化抗PVR-scFv阻斷靶細(xì)胞上共有PVR表位的能力，用0,5mM EDTA/PBS收獲HT1080的單細(xì)胞懸液。4℃條件下，在含有10μg/ml scFv的CellWash(BD，#349524)中溫育大約1×106個(gè)細(xì)胞1小時(shí)。用Cell Wash洗滌后，加入10μg/ml的FITC標(biāo)記scFv，并于4℃溫育20分鐘。利用Becton Dickinson FACSscan對(duì)經(jīng)過(guò)和未經(jīng)過(guò)其它PVR結(jié)合劑預(yù)先溫育的已結(jié)合FITC標(biāo)記scFvs的信號(hào)進(jìn)行分析。
實(shí)施例7采用FITC對(duì)抗體片段的標(biāo)記通過(guò)下述方法，采用異硫氰酸熒光素(FITC)(Molecular Probes，Eugene，USA #F1906)標(biāo)記scFv將FITC在二甲基亞砜中形成的10mg/ml溶液的等分試樣加入由100μg scFv以30∶1(FITC∶scFvl)的比率溶解于pH 9.5的PBS/0.5M NaHCO3所形成的溶液中。室溫?cái)嚢钘l件下溫育樣品2小時(shí)，利用脫鹽柱(2 Micro Spin G-25，Pharmacia27-5325-01)分離游離的FITC。標(biāo)記比率是通過(guò)質(zhì)譜分析法和UV/VIS光譜法確定的，由此可計(jì)算280nm的蛋白質(zhì)濃度和494nm的FITC濃度。
實(shí)施例8用于鑒定抑制性分子的侵襲試驗(yàn)可采用ChemoTx系統(tǒng)(Neuro Probe Inc.#106-8，Gaithersburg)作為一次性使用的趨化性/細(xì)胞遷移池，該系統(tǒng)為具有8μm濾器的96孔形式，刻痕聚碳酸酯材質(zhì)，孔徑為5.7mm直徑/位。
將稀釋于Dulbeccos PBS(Gibco #14040-091)中的13,3μl0.3mg/ml Matrigel(Matrigel是從富含胞外基質(zhì)蛋白的腫瘤，即Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取的增溶性基底膜制劑。其主要成分為層粘連蛋白，其次是膠原蛋白IV、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、觸覺(jué)蛋白和巢蛋白。它還含有TGF-α成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、組織纖溶酶原激活物及其它自然發(fā)生于EHS腫瘤內(nèi)的生長(zhǎng)因子)(Becton Dickenson，BD #356234)應(yīng)用在上述96孔板B-H排的膜濾器上，用0,05M HCl(Sigma #945-50)稀釋A排中1，2μg/位的I型膠原蛋白S(Roche #10982929)，并在干燥器內(nèi)20℃溫育過(guò)夜，使其凝膠化。HT1080細(xì)胞在補(bǔ)充有GlutamaxI(862mg/1(Gibco#31966-021))和10％FCS(Gibco #10270106)的DMEM中生長(zhǎng)至70-80％鋪滿(mǎn)。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(Sigma #A-7030)洗滌該細(xì)胞2次后，用Bisbenzimide H 33342(Sigma #B-2261)原位標(biāo)記，并以1∶100稀釋于DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA，在37℃和7,5％CO2條件下溫育15分鐘。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA洗滌細(xì)胞2次，加入DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA，于37℃和7,5％CO2條件下溫育15分鐘，使細(xì)胞恢復(fù)。用無(wú)Ca2+，Mg2+的(PBSGibco，10010-015)洗滌細(xì)胞2次后，用0.5mM EDTA(Sigma #E8008)使細(xì)胞脫離，并用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes(Gibco #15630-056)收集，用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes洗滌2次，將細(xì)胞懸浮于DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes中，用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes將其稀釋至6,7×106個(gè)細(xì)胞/ml。在冰上溫育1小時(shí)比率為1∶1的6,7×106個(gè)細(xì)胞/ml和40μg/ml作為抑制侵襲的陰性對(duì)照的對(duì)照scFv，以及比率為1∶1的6,7×106個(gè)細(xì)胞/ml和HT1080特異性scFv。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA將細(xì)胞稀釋至6,7×105個(gè)細(xì)胞/ml后，將HT1080細(xì)胞和HT1080細(xì)胞/scFv稀釋液吸取三份，轉(zhuǎn)移至趨化池(B-H排)，密度為3,4×104個(gè)細(xì)胞/孔，并于37℃和7,5％CO2條件下溫育6小時(shí)。用含有5％FCS的DMEM/GlutamaxI作為后幾排池中的化學(xué)吸引劑。在I型膠原蛋白S包被的A排趨化池作出1×104-4×104個(gè)細(xì)胞/位的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。在后幾排池中應(yīng)用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(細(xì)胞未遷移)。將未遷移細(xì)胞從膜上部刮下后(除了A排的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn))，利用Fluostar Galaxy(bMG)微量滴定板讀出器以及370/460nm的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)，測(cè)定遷移通過(guò)膜(在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的情況中未遷移)的細(xì)胞的熒光性(圖1)。
實(shí)施例9利用CALI鑒定靶的侵襲試驗(yàn)該實(shí)例的原理與實(shí)例8一致，但在侵襲試驗(yàn)中利用了FITC-標(biāo)記的scFv并另外綜合了CALI方法。在CALI方法中，scFv標(biāo)記有CALI可誘導(dǎo)標(biāo)記。
可采用ChemoTx系統(tǒng)(Neuro Probe Inc.#106-8，Gaithersburg)作為一次性使用的趨化性/細(xì)胞遷移池，該系統(tǒng)為具有8μm濾器的96孔形式，刻痕聚碳酸酯材質(zhì)，孔徑為5.7mm直徑/位。
將稀釋于Dulbeccos PBS(Gibco #14040-091)中的13,3μl0.3mg/ml Matrigel(參見(jiàn)實(shí)例8)應(yīng)用在上述96孔板B-H排的膜濾器上，用0,05M HCl(Sigma #945-50)稀釋A排中1,2μg/位的I型膠原蛋白S(Roche #10982929)，并在干燥器內(nèi)20℃溫育過(guò)夜，使其凝膠化。HT1080細(xì)胞在補(bǔ)充有GlutamaxI(862mg/l(Gibco#31966-021))和10％FCS(Gibco #10270106)的DMEM中生長(zhǎng)至70-80％鋪滿(mǎn)。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(Sigma #A-7030)洗滌該細(xì)胞2次后，用Bisbenzimide H 33342(Sigma #B-2261)原位標(biāo)記，并以1∶100稀釋于DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA，在37℃和7,5％CO2條件下溫育15分鐘。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA洗滌細(xì)胞2次，加入DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA，于37℃和7,5％CO2條件下溫育15分鐘，使細(xì)胞恢復(fù)。用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS(Gibco，10010-015)洗滌細(xì)胞2次后，用0.5mM EDTA(Sigma #E8008)使細(xì)胞脫離，并用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes(Gibco #15630-056)收集，用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes洗滌2次后，將細(xì)胞懸浮于DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes中，并用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mMHepes將其稀釋至6,7×106個(gè)細(xì)胞/ml。在冰上溫育1小時(shí)比率為1∶1的6,7×106個(gè)細(xì)胞/ml和40μg/ml作為CALI后抑制侵襲的對(duì)照的FITC-標(biāo)記抗β整聯(lián)蛋白單克隆抗體(JB1，Chemicon #MAB1963)，以及比率為1∶1的6,7×106個(gè)細(xì)胞/ml和HT1080特異性FITC標(biāo)記scFv。將1,3×105個(gè)HT1080細(xì)胞/孔或HT1080細(xì)胞/scFv或Ab稀釋液吸取三份，轉(zhuǎn)移進(jìn)兩個(gè)具有超薄透明的特殊光學(xué)平底的黑色96-孔板中(Costar #3615)。將一塊板保持在黑暗處的冰上，另一塊板則在冰塊上接受488nm的連續(xù)波激光的照射(0.5W、30秒)。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA將細(xì)胞稀釋至6,7×105個(gè)細(xì)胞/ml后，將HT1080細(xì)胞和HT1080細(xì)胞/scFv的稀釋液吸取三份(未接受照射的三份和接受照射的三份)，轉(zhuǎn)移至趨化池(B-H排)，密度為3,4×104個(gè)細(xì)胞/孔，并于37℃和7,5％CO2條件下溫育6小時(shí)。用含有5％FCS的DMEM/GlutamaxI作為后幾排池中的化學(xué)吸引劑。在I型膠原蛋白S包被的A排趨化池作出1×104-4×104個(gè)細(xì)胞/位的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。后幾排池中應(yīng)用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(細(xì)胞未遷移)。將未遷移細(xì)胞從膜上部刮下后(除了A排的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn))，利用Fluostar Galaxy(bMG)微量滴定板讀出器以及370/460nm的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)，測(cè)定遷移通過(guò)膜(在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的情況中未遷移)的細(xì)胞的熒光性。在激光照射情況下進(jìn)行的侵襲試驗(yàn)的結(jié)果如圖2a所示。scFv1將侵襲抑制了大約22％。
實(shí)施例9.1利用CALI(采用濾去藍(lán)光的光)鑒定靶的侵襲試驗(yàn)該實(shí)例的原理與實(shí)例9一致，但照射樣品的是濾去藍(lán)光的300W光，而非激光照射。
用20μg/mL異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記抗體溫育HT-1080細(xì)胞1小時(shí)后，由濾去藍(lán)光的300瓦光另外照射1小時(shí)。接著分析細(xì)胞6小時(shí)通過(guò)Matrigel包被多孔膜(Neuro Probe Inc.)的侵襲力。柱狀圖表示被歸一化為無(wú)照射條件下的侵襲百分比±標(biāo)準(zhǔn)誤差，并表示至少2個(gè)各平行3次的獨(dú)立試驗(yàn)。圖2b(0)中的左柱所示為未經(jīng)任何抗體處理的細(xì)胞的侵襲，D171(NeoMarker #MS-465)是通過(guò)商業(yè)渠道可獲得的直接抗PVR/CD155的單克隆抗體。scFv3和scFv4這兩種scFV均將HT1080細(xì)胞的侵襲抑制了大約30％。參見(jiàn)圖2b。
實(shí)施例9.2利用乳癌細(xì)胞進(jìn)行的侵襲試驗(yàn)該實(shí)例的原理與實(shí)例9.1一致，但利用了MDA-MD231乳癌細(xì)胞以取代HT1080細(xì)胞。scFv3和scFv4均顯示將MDA-MD231細(xì)胞的侵襲抑制了大約23％。參見(jiàn)圖2c。
實(shí)施例9.3利用成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞(U87MG和A172細(xì)胞)進(jìn)行的遷移試驗(yàn)該實(shí)例的原理與實(shí)例9.1一致，但利用了Beckton Dickinson板以取代ChemoTx系統(tǒng)。這些Beckton Dickinson板包括由PET膜和藍(lán)色染料(Fluoroblok)組成的嵌入部分，有助于測(cè)定僅來(lái)源于頂部或底部的熒光。各孔含有25,000個(gè)細(xì)胞(U87MG和A172)。scFv1顯示將U87MG細(xì)胞的遷移抑制了大約15％(數(shù)據(jù)未顯示)。scFv1*和scFv2*顯示對(duì)U87MG細(xì)胞的抑制分別為16％和17％，對(duì)A172細(xì)胞的抑制分別為20％和18％(符號(hào)“*”指由圖10和圖11所示編號(hào)區(qū)分的對(duì)應(yīng)scFv被克隆為I gG形式，參見(jiàn)圖4.1)，結(jié)果如圖2d所示。
該實(shí)例進(jìn)一步研究了不同細(xì)胞系的PVR表達(dá)是如何變化的，及其與遷移行為的關(guān)聯(lián)。PVR表達(dá)水平是通過(guò)對(duì)4個(gè)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)細(xì)胞系的免疫印跡分析而得以確定的，該表達(dá)水平隨后被用于分析遷移試驗(yàn)中的遷移行為。PVR在HT1080細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)最高，在U87和U251GBM細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)中等，在SNB19和A172 GBM細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)最低。該表達(dá)水平與GBM細(xì)胞系當(dāng)中的遷移行為無(wú)關(guān)，因?yàn)閁87(中等)和A172(差)的侵襲速度比SNB19(差)或U251(中等)快得多。(數(shù)據(jù)未顯示)。眾所周知，HT1080細(xì)胞通過(guò)過(guò)量表達(dá)N-ras而無(wú)限增殖化，且U87和U251 GBM細(xì)胞均被報(bào)導(dǎo)具有高組成水平的ras活性。由于這些觀察結(jié)果與PVR表達(dá)水平相關(guān)，因此，對(duì)ras在調(diào)節(jié)PVR表達(dá)方面可能以某種方式發(fā)揮作用的推測(cè)是令人感興趣的。
實(shí)施例10MTS生存力測(cè)定通過(guò)測(cè)定從四氮唑染料MTS(MTS，Celltiter Aqueous one，Promega#G4000)到甲的轉(zhuǎn)化，以檢測(cè)活細(xì)胞。將HT1080細(xì)胞和HT1080細(xì)胞/scFv稀釋液(由上述粘附試驗(yàn)中制備的稀釋液獲得)吸取三份，轉(zhuǎn)移進(jìn)96-孔板(黑色、超薄透明平底，特殊光學(xué)，Costar #3615)中，密度為3,4×104個(gè)細(xì)胞/孔。將10μl MTS加入各孔，并于37℃和7,5％CO2條件下溫育1小時(shí)。利用Fluostar Galaxy(bMG)微量滴定板讀出器測(cè)定492nm的吸光度。對(duì)被檢的scFv1和scFv2而言，未發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的生存力有任何影響。
實(shí)施例11用于鑒定抑制性抗體片段的細(xì)胞-基質(zhì)粘附試驗(yàn)4℃條件下，將96-孔平底板(Costar #3614)中的21個(gè)孔包被以選自下列之一的基質(zhì)蛋白過(guò)夜，即分別溶于Dulbeccos PBS(Gibco#14040-091)的I型膠原蛋白S 1μg/孔(Roche #10982929)、IV型膠原蛋白1μg/孔(Rockland 009-001-106)、纖連蛋白1μg/孔(SigmaF2518)和層粘連蛋白1μg/孔(Roche 1243217)。同時(shí)將A排中的3個(gè)孔包被以2％BSA(Sigma #A-7030)/Dulbeccos PBS，作為空白。用Dulbeccos PBS洗滌各孔2次，于37℃用2％BSA(Sigma #A-7030)/Dulbeccos PBS封閉1小時(shí)，并用Dulbeccos PBS洗滌。收獲HT1080細(xì)胞，用2,5mM(最終濃度)鈣黃綠素AM(Molecular Probes C-3099)染色后，用無(wú)CaCl2無(wú)MgCl2的PBS(Gibco 10010-015)洗滌2次，并在緩沖液(0,5％BSA(Sigma #A-7030)+10mM Hepes+DMEM(Gibco31966-02))中稀釋至1,5×105/ml。將HT1080細(xì)胞與10μg/ml scFv混合，并于冰上溫育30分鐘。將單獨(dú)的HT1080細(xì)胞和HT1080/scFv稀釋液吸取三份轉(zhuǎn)移進(jìn)96孔板中，密度為1,5×104個(gè)細(xì)胞/孔，并于37℃和7,5％CO2條件下溫育1小時(shí)。用Dulbeccos PBS另外洗滌2次，將未粘附細(xì)胞洗去后，可基于A排一式三份的樣品作出用DulbeccosPBS稀釋所獲的3,7×103-1,5×104個(gè)染色細(xì)胞/孔的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將洗滌后的各孔充滿(mǎn)100μl Dulbeccos PBS，并利用Fluostar Galaxy(bMG)微量滴定板讀出器和485/520nm的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)定粘附細(xì)胞的吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的吸光度。
實(shí)施例12利用CALI鑒定靶的細(xì)胞-基質(zhì)粘附試驗(yàn)在4℃條件下，將96孔板(TPP #9296)(經(jīng)由細(xì)胞培養(yǎng)物處理的)的B-H排孔包被以溶于Dulbeccos PBS(Gibco #14040-091)的I型膠原蛋白S 1μg/孔(Roche #10982929)，A排的孔10-12則包被以2％BSA(Sigma #A-7030)/Dulbeccos PBS，過(guò)夜。用Dulbeccos PBS洗滌該板，并于37℃，用2％BSA/Dulbeccos PBS將B-H排和A排的孔10-12封閉1小時(shí)，再次用Dulbeccos PBS洗滌。HT1080細(xì)胞在補(bǔ)充有GlutamaxI(862mg/1(Gibco #31966-021))和10％FCS(Gibco#10270106)的DMEM中生長(zhǎng)至70-80％鋪滿(mǎn)。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(Sigma #A-7030)洗滌該細(xì)胞2次，用Bisbenzimide H 33342(Sigma #B-2261)原位標(biāo)記后，以1∶100的比率稀釋于DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA中，并于37℃和7,5％CO2條件下溫育15分鐘。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA洗滌細(xì)胞2次，并加入DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA，于37℃和7,5％CO2條件下溫育15分鐘，使細(xì)胞恢復(fù)。用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS(Gibco，10010-015)洗滌2次后，用0.5mM EDTA(Sigma #E8008)使細(xì)胞脫離，用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes(Gibco #15630-056)收集，用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes洗滌2次后，使細(xì)胞懸浮于DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes中，并用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mMHepes將其稀釋至6,7×106個(gè)細(xì)胞/ml。在冰上溫育1小時(shí)比率為1∶1的6,7×106個(gè)細(xì)胞/ml和40μg/ml作為CALI后抑制粘附對(duì)照的FITC-標(biāo)記抗β1整聯(lián)蛋白單克隆抗體(JB1，Chemicon #MAB1963)，以及比率為1∶1的6,7×106個(gè)細(xì)胞/ml和HT1080特異性FITC標(biāo)記scFv。將1,3×105個(gè)HT1080細(xì)胞/孔或HT1080細(xì)胞/scFv或Ab稀釋液吸取三份，轉(zhuǎn)移進(jìn)兩個(gè)具有超薄透明的特殊光學(xué)平底的黑色96-孔板中(Costar #3615)。將一塊板保持在黑暗處的冰上，另一塊板則在冰塊上接受488nm的連續(xù)波激光的照射(0.5W、30秒)。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA將細(xì)胞稀釋至6,7×105個(gè)細(xì)胞/ml后，將HT1080細(xì)胞和HT1080細(xì)胞/scFv的稀釋液吸取三份(未接受照射的三份和接受照射的三份)，轉(zhuǎn)移至已包被和封閉的板中。在A排的孔10-12中，加入用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA稀釋后獲得的6,7×105個(gè)細(xì)胞/ml作為背景對(duì)照。于37℃和7,5％CO2條件下溫育該板1小時(shí)，并用Dulbeccos PBS洗滌2次，將未粘附細(xì)胞洗去。在A排孔1-9，作1×104-4×104個(gè)細(xì)胞/孔的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，在其它孔中則加入50μlDulbeccos PBS。利用Fluostar Galaxy(bMG)微量滴定板讀出器和370/460nm的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)定與I型膠原蛋白S粘附(在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的情況中未粘附)的細(xì)胞的熒光性。scFv1將粘附抑制了55.5％，scFv2則將該粘附抑制了42％。與這兩種scFv對(duì)應(yīng)的結(jié)果如圖3所示。
實(shí)施例13免疫沉淀使HT1080和Hs-27細(xì)胞(108)裂解在3ml含有150mM NaCl、1％Triton X-100(v/v)、蛋白酶抑制劑混合物(50ml緩沖液1丸)(Boehringer Mannheim，Cat.-No.1697498)和100μM Pefablock(Roth，Cat.-No.A154.1)的50mM Tris-HCl，pH 8.0中。4℃條件下，將裂解產(chǎn)物與Streptactin-偶聯(lián)磁珠一起預(yù)先溫育2小時(shí)，并將上清液用于免疫沉淀反應(yīng)。將HT1080特異性scFv(50μg/1mg細(xì)胞提取物)加入澄清的裂解產(chǎn)物中，于4℃攪拌樣品2小時(shí)，將其置于磁鐵上，以收集管壁上的磁珠，將該磁珠洗滌4次，每次用1ml體積的PBS+0.1％Tween緩沖液，之后，通過(guò)用pH 3.1的20μl 0.1M檸檬酸鹽溶液進(jìn)行洗脫，使復(fù)合物與streptactin磁珠分離。立即加入5μl1M Tris-HCl pH 8.0，以中和洗脫物。通過(guò)SDS-PAGE分離該免疫復(fù)合物，銀染色后用于MS分析。
scFv1和scFv2均可捕獲一種蛋白質(zhì)，通過(guò)銀染色可使該蛋白質(zhì)在SDS-PAGE上大約70kDa分子量處形成一個(gè)可檢測(cè)的條帶。該條帶被發(fā)現(xiàn)僅出現(xiàn)在HT1080細(xì)胞提取物中，在Hs-27細(xì)胞(對(duì)照細(xì)胞)中未出現(xiàn)，參見(jiàn)圖5。
實(shí)施例14通過(guò)質(zhì)譜分析進(jìn)行的蛋白質(zhì)鑒定37℃條件下，對(duì)先后通過(guò)免疫沉淀和SDS PAGE所獲得的凝膠條帶進(jìn)行胰蛋白酶膠內(nèi)消化過(guò)夜。利用5％甲酸提取肽，并用ZipTip μC18(Millipore)將獲得的肽混合物脫鹽，首先用2μl的30％ACN/0.1％TFA進(jìn)行洗脫后，再用2μl的70％ACN/0.1％TFA洗脫。將兩份洗脫組分合并，將1微升所獲肽混合物與α-氰-4-羥基肉桂酸溶液(3mg/ml)以1∶1的比率混合，在Teflon包被的不銹鋼靶上共結(jié)晶，并利用MALDI-TOF設(shè)備進(jìn)行分析，獲得質(zhì)量范圍是m/z 800-3000的肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)。獲得的PMF被用于研究NCBI和SwissProt資料庫(kù)中與智人有關(guān)的所有條目。在所有情況中，僅考慮鑒定與特定蛋白質(zhì)匹配且質(zhì)量偏差小于10ppm的肽。
對(duì)與資料庫(kù)中的PVR匹配的4-6種肽進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定值與實(shí)際質(zhì)量之間的差值始終在+/-10ppm范圍內(nèi)。在某些實(shí)驗(yàn)中，將這4種肽分為2對(duì)進(jìn)行觀測(cè)，每一對(duì)均代表由于甲硫氨酸氧化而有或無(wú)+16Da的肽。當(dāng)對(duì)該肽混合物進(jìn)行去糖基化時(shí)，觀測(cè)到另一種肽，該肽含有Asn120，在資料庫(kù)中被注解為糖基化的。圖譜如圖6所示。
通過(guò)納諾ES-MSMS還測(cè)定了另一個(gè)樣品。用該方法檢測(cè)了4種肽。通過(guò)CID(碰撞誘導(dǎo)解離)將其中的三種片段化，用于MSMS分析。獲得與每一個(gè)片段對(duì)應(yīng)的序列標(biāo)記，并將其用于資料庫(kù)研究。這三種肽與已知的脊髓灰質(zhì)炎病毒受體匹配，其中的一種具有氧化的甲硫氨酸。
實(shí)施例15表位作圖方法表位作圖可根據(jù)下述方法之一進(jìn)行實(shí)施例15.1“經(jīng)典”表位作圖將cDNA用于被關(guān)注抗原的定義片段作為重組融合蛋白或蛋白質(zhì)表達(dá)，并在諸如蛋白質(zhì)印跡法或ELISA的多種試驗(yàn)中對(duì)其進(jìn)行探測(cè)。
實(shí)施例15.2噬菌體展示技術(shù)利用隨機(jī)肽噬菌體展示文庫(kù)進(jìn)行表位作圖的技術(shù)被發(fā)展用于將cDNA中用于被關(guān)注抗原的小隨機(jī)片段克隆進(jìn)絲狀噬菌體的噬菌體蛋白pIII中，并將它們展示在該噬菌體的表面(Fack et al.，(1997)J.Immunol.Methods 7，43-52)。在被稱(chēng)為“生物淘選”的操作中，可利用抗體捕獲表位展示噬菌體。對(duì)相應(yīng)噬菌體的插入片段的測(cè)序提供了有關(guān)所述表位的若干信息。該方法被用于鑒定構(gòu)象性表位。
實(shí)施例15.3肽篩選技術(shù)該技術(shù)的基礎(chǔ)是利用Fmoc化學(xué)在活化膜上合成固定化肽。將氨基酸溶液應(yīng)用于該活化膜，使該膜(用PEG活化該膜)上的氨基與所應(yīng)用氨基酸的活化羧基之間形成肽鍵。在每一個(gè)特異性洗滌操作循環(huán)之后，對(duì)游離氨基進(jìn)行乙?；?、脫保護(hù)和監(jiān)測(cè)。與體內(nèi)蛋白質(zhì)合成相比，膜結(jié)合寡肽鏈?zhǔn)菑腃-到N-末端逐步合成的。含有天然以及修飾氨基酸的寡肽可被合成的長(zhǎng)度可達(dá)20個(gè)氨基酸。合成完成后，平衡該膜并封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。在用被關(guān)注抗體進(jìn)行溫育和若干個(gè)洗滌步驟后，利用HRP結(jié)合的次級(jí)抗體并結(jié)合ECL-系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)抗體的情況，可將膜剝離、再生并重新使用達(dá)10次。在固體支持物上合成理想地包括了被關(guān)注抗原的完整氨基酸序列的小重疊寡肽。該方法被用于鑒定氨基酸水平的線(xiàn)型表位。也被用于快速突變研究。
實(shí)施例16利用抗PVR mRNA的RNAi對(duì)細(xì)胞PVR蛋白的排除下述核糖寡核苷酸可購(gòu)自例如，Proligo(Hamburg，Germany，wWW.proligo.com)、Pierce Chemical(part of Perbio Science，Rockford，Illinois，WWW.perbio.com)或RNA寡核苷酸的其它供應(yīng)商1A(5′-CCAGTCACTTGTCTGGAGCTT-3′)(SEQ ID No.55)，2A(5′-GAGCTTGAAGAAGTGGGTATT-3′)(SEQ ID No.56)，1B(5′-TGCTGGTGGCATTACTGGTGC-3′)(SEQ ID No.57)，2B(5′-GCTGTCCTGGCCACCCCGTGGAA-3′)(SEQ ID No.58)，3A(5′-GGCGCGGAGCTGCGGAATGCCT-3′)
(SEQ ID No.59)，4A(5′-CCTCGCTGAGGATGTTCGGGTT-3′)(SEQ ID No.60)，3B(5′-CCCGTGAACACAGCTGAGGTT-3′)(SEQ ID No.61)，4B(5′-CAAGGTGGACCCACGAGAGCTTT-3′)(SEQ ID No.62)，5A(5’-CAACUUUAAUCUGCAACGUTT-3’)(SEQ ID No.73)，5B(5’-TTGUUGAAAUUAGACGUUGCA-3’)(SEQ ID No.74).
寡核苷酸1A和2A退火形成直接抗所述PVR mRNA的siRNA，寡核苷酸1B和2B退火形成上一對(duì)寡核苷酸的陰性對(duì)照，下有劃線(xiàn)的核苷酸與所述PVR mRNA失配。同樣，下有劃線(xiàn)的寡核苷酸3A和4A退火形成直接抗所述PVR mRNA的siRNA，寡核苷酸3B和4B則退火形成3A/4A-對(duì)的陰性對(duì)照，黑體所示核苷酸與所述PVR mRNA失配。5A/B的靶是PVR mRNA序列(GI 19923371)的1094位。
采用Elbashir et al.，Methods(2002)26199-213中第203頁(yè)所述方案2使寡核苷酸對(duì)1A/2A、1B/2B、3A/4A、3B/4A退火。當(dāng)用RNA進(jìn)行研究時(shí)，需特別注意，以避免RNAse污染寡核苷酸。經(jīng)過(guò)DEPC處理的水被用于制備緩沖劑。始終戴著手套以避免因皮膚接觸導(dǎo)致的RNAse污染。有關(guān)RNA-相關(guān)研究的具體說(shuō)明可參考例如ColdSpring Harbor Laboratory Press出版的Sambrook等人的“Molecular CloningA Laboratory Manual”(1989)第二版第7.3和7.4章。
HT1080細(xì)胞在補(bǔ)充有Glutamax(Gibco# 31966-021)和10％FCS(Gibco #10270106)的DMEM中生長(zhǎng)至大約90％鋪滿(mǎn)。利用上述退火的寡核苷酸對(duì)轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，從175ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中收獲上述90％鋪滿(mǎn)的細(xì)胞，例如用10ml胰蛋白酶-EDTA溶液(Life Technologies)將其胰蛋白酶化、溫和離心并重新懸浮于10ml DMEM中。用含有10％FCS而無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基將該細(xì)胞懸液1∶10稀釋?zhuān)⒎殖?00μl的等分試樣，轉(zhuǎn)移進(jìn)24孔培養(yǎng)板的各孔內(nèi)。接種該細(xì)胞后24小時(shí)，獲得大約50％的鋪滿(mǎn)。
根據(jù)Elbashir et al.，Methods(2002)26，199-213第207頁(yè)所述的方案5，利用上述退火的寡核苷酸對(duì)轉(zhuǎn)染各孔內(nèi)的細(xì)胞。
根據(jù)上述方案5的第5步進(jìn)行2天的溫育后，收獲各孔的細(xì)胞，并對(duì)各孔的細(xì)胞進(jìn)行加工，用于蛋白質(zhì)印跡分析，例如，將來(lái)源于未經(jīng)寡核苷酸轉(zhuǎn)染的孔(未經(jīng)處理的細(xì)胞)、經(jīng)由寡核苷酸對(duì)1A/2A、1B/2B(陰性對(duì)照1/2)、3A/4A和3B/4B(陰性對(duì)照3/4)轉(zhuǎn)染的孔的樣品(對(duì)應(yīng)相同細(xì)胞數(shù)量)加樣在丙烯酰胺凝膠上，電泳結(jié)束后，例如，利用半干印跡儀器，將蛋白質(zhì)印跡到例如，硝化纖維素上，并用抗PVR抗體對(duì)該硝化纖維素膜進(jìn)行探測(cè)。
與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，在樣品1A/2A或3A/4A中檢測(cè)到的PVR蛋白質(zhì)的量降低了75％以上。與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，在陰性對(duì)照1B/2B和3B/4B中未檢測(cè)到PVR蛋白質(zhì)水平的顯著降低。
實(shí)施例17抗PVR的RNAi對(duì)粘附和侵襲的抑制HT1080細(xì)胞在補(bǔ)充有Glutamax(Gibco #31966-021)和10％FCS(Gibco #10270106)的DMEM中生長(zhǎng)至大約90％撲滿(mǎn)。利用上述退火寡核苷酸對(duì)轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，用10ml胰蛋白酶-EDTA溶液(LifeTechnologies)將從175ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中收獲的90％鋪滿(mǎn)的細(xì)胞胰蛋白酶化。用含有10％FCS而無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基將該細(xì)胞懸液1∶10稀釋?zhuān)⒎殖?00μl的等分試樣，轉(zhuǎn)移進(jìn)24孔培養(yǎng)板的各孔內(nèi)。接種該細(xì)胞后24小時(shí)，獲得大約50％的鋪滿(mǎn)。
根據(jù)Elbashir et al.，Methods(2002)26，199-213第207頁(yè)所述的方案5，利用上述退火寡核苷酸對(duì)轉(zhuǎn)染各孔內(nèi)的細(xì)胞。
根據(jù)上述方案5的第5步進(jìn)行2天的溫育后，于37℃和7,5％CO2條件下用Bisbenzimide H 33342(Sigma #B-2261)原位標(biāo)記細(xì)胞15分鐘。洗滌后，用0.5mM EDTA/PBS(Sigma #E8008)使細(xì)胞解離，洗滌后使其懸浮于0.1％BSA(Sigma #A7030)/DMEM中。接著用0.1％BSA/DMEM將細(xì)胞稀釋至6,7×105個(gè)細(xì)胞/ml，將HT1080細(xì)胞加入實(shí)例8所述的趨化池或?qū)嵗?1所述的96孔板。接著如實(shí)例8所述確定侵襲力，如實(shí)例11所述確定粘附性。
與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，在至少一個(gè)樣品1A/2A或3A/4A中測(cè)定的粘附性或侵襲力降低了40％以上。與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，在陰性對(duì)照1B/2B和3B/4B中未檢測(cè)到侵襲力的顯著降低。
實(shí)施例17.1抗PVR的RNAi對(duì)遷移的抑制在類(lèi)似試驗(yàn)中，HT1080細(xì)胞在6孔培養(yǎng)板中生長(zhǎng)至大約75％鋪滿(mǎn)，利用Oligofectamine和200nM 5A/B進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后，用細(xì)胞追蹤劑橙黃染料標(biāo)記細(xì)胞，并用EGTA/Versene收獲細(xì)胞。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行記數(shù)，并調(diào)整至預(yù)期濃度以根據(jù)實(shí)例9.3進(jìn)行遷移試驗(yàn)。
實(shí)施例18針對(duì)石蠟載玻片的免疫組織化學(xué)方案IHC是在LifeSpan BioSciences，Inc.，Seattle，USA進(jìn)行的。利用切片機(jī)獲得4-5微米厚的組織切片。使該組織切片漂浮在水浴上，并轉(zhuǎn)移至載玻片上。利用二甲苯和乙醇使含有石蠟切片的載玻片脫蠟，再水化，并對(duì)其實(shí)施蒸發(fā)法以提取靶(DAKO試劑 #S1700)。利用DAKO自動(dòng)染色儀并遵循DAKO研發(fā)的操作和試劑進(jìn)行IHC試驗(yàn)。具體而言，將上述載玻片封閉20分鐘(用DAKO無(wú)血清蛋白質(zhì)封閉劑#X0909)，應(yīng)用生物素-人初級(jí)抗體，并于室溫溫育2小時(shí)，在TBST中漂洗該載玻片。應(yīng)用載體ABC-AP(AK-5000)試劑。以載體Red(SK-5100)作為底物。所用抗體濃度為200μg/ml。在腎上腺、膀胱、腦、乳房、結(jié)腸、新、胰腺、胎盤(pán)、前列腺、皮膚、骨骼肌、小腸上皮、脾、胃、胸腺、甲狀腺或子宮的正常組織內(nèi)，未檢測(cè)到與scFv2*對(duì)應(yīng)的著色。在腎、漿細(xì)胞、肝、肺、卵巢內(nèi)膜、睪丸和扁桃腺中的罕有生發(fā)中心細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到與scFv2*對(duì)應(yīng)的適度著色。在癌的情況中，與scFv2*對(duì)應(yīng)的從微弱到適度的著色被鑒定為結(jié)腸癌2、非小細(xì)胞肺癌1、卵巢癌2、前列腺癌4、胰腺癌7和腎細(xì)胞癌4。
實(shí)施例19通過(guò)CALI進(jìn)行的FasL-介導(dǎo)凋亡試驗(yàn)概要發(fā)色團(tuán)輔助光鈍化(CALI)可被用于鈍化HT1080細(xì)胞表面上的蛋白質(zhì)(例如PVR)。CALI后，利用Fas配體(FasL)(或以緩沖劑作為對(duì)照)攻擊細(xì)胞，以誘導(dǎo)凋亡。與對(duì)照緩沖劑攻擊相比，4小時(shí)后測(cè)定到半胱氨酸蛋白酶活性的提高。半胱氨酸蛋白酶活性是利用僅在被活性半胱氨酸蛋白酶裂解后才產(chǎn)生熒光的熒光底物測(cè)定的。如果通過(guò)CALI鈍化與凋亡相關(guān)的蛋白，在加入FasL后未出現(xiàn)凋亡。
通過(guò)FasL處理鑒定scFv1抑制半胱氨酸蛋白酶活化的能力。在CALI后，觀測(cè)到對(duì)FasL_的半胱氨酸蛋白酶反應(yīng)的增強(qiáng)。這可通過(guò)鈍化PVR進(jìn)行解釋。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)將HT-1080人纖維肉瘤細(xì)胞分配進(jìn)微量滴定板(MTP)中，并用與異硫氰酸熒光素(FITC)結(jié)合的scFv1進(jìn)行溫育。CALI利用該FITC-結(jié)合的scFv以引導(dǎo)白熾光鈍化特異性蛋白質(zhì)。CALI是利用濾去藍(lán)光的漫射光進(jìn)行的。用黑暗條件處理的MTP進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。在CALI后，用凋亡誘導(dǎo)劑(FasL)處理細(xì)胞。短時(shí)間溫育后，根據(jù)“均相Caspase檢測(cè)”(Roche，Cat-No.2-236-869)所述方法，裂解細(xì)胞的同時(shí)用半胱氨酸蛋白酶的前熒光底物進(jìn)行溫育。裂解的游離羅丹明-110的量反映了凋亡的特異性早期/中期標(biāo)記半胱氨酸蛋白酶的活性。半胱氨酸蛋白酶活性是利用自動(dòng)熒光MTP讀出器測(cè)定的。
利用與熒光素結(jié)合的商品抗-Fas抗體(UB2)對(duì)Fas受體(Fas)進(jìn)行的CALI導(dǎo)致Fas的功能特異性喪失，阻斷了FasL-介導(dǎo)的發(fā)信號(hào)。對(duì)scFv1而言的半胱氨酸蛋白酶活性大幅降低(大于20％的抑制)。無(wú)任何scFv的情況下則無(wú)CALI影響。將樣品分為三份進(jìn)行評(píng)估，數(shù)據(jù)為三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種特異性結(jié)合CD155(分化簇155)、脊髓灰質(zhì)炎病毒受體(PVR)或其任意衍生物的至少一個(gè)胞內(nèi)或胞外結(jié)構(gòu)域的分子，其中該分子具有調(diào)節(jié)表達(dá)CD155、PVR或其任意衍生物的細(xì)胞的受體介導(dǎo)的粘附、運(yùn)輸和/或侵襲行為的能力。
2.權(quán)利要求1所述的分子，其中該分子包括小化合物、寡核苷酸、肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、抗體片段、抗獨(dú)特型抗體和/或生物偶聯(lián)物。
3.權(quán)利要求1或2所述的分子，其中該分子是與可檢測(cè)和/或可誘導(dǎo)標(biāo)記物理相連。
4.上述權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的分子，其中調(diào)節(jié)能力包括誘導(dǎo)、增加、穩(wěn)定、加強(qiáng)、阻止、抑制、減少、通過(guò)凋亡破壞和/或削弱表達(dá)CD155、PVR或其任意衍生物的細(xì)胞的粘附、運(yùn)輸和/或侵襲行為。
5.上述權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的分子，其中表達(dá)CD155、PVR或其任意衍生物的細(xì)胞參與了增殖性疾病或失調(diào)，具有轉(zhuǎn)移潛能或者來(lái)源于自然發(fā)生的腫瘤。
6.上述權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的分子，其中該分子，優(yōu)選肽、多肽、抗體、抗體片段或生物偶聯(lián)物，含有氨基酸序列LWLRRD(SEQID No.1)和/或WTGDFDY(SEQ ID No.2)。
7.上述權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的分子，其中該分子，優(yōu)選肽、多肽、抗體、抗體片段或生物偶聯(lián)物，含有氨基酸序列SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.69或SEQ ID No.70。
8.上述權(quán)利要求6或7所述的分子，其中該分子，優(yōu)選肽、多肽、抗體、抗體片段或生物偶聯(lián)物，含有DNA序列SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.71或SEQ ID No.72，或同源DNA序列或具有簡(jiǎn)并密碼但仍可翻譯為SEQ ID No.1-SEQ ID No.4、SEQ ID No.69或SEQ ID No.70的任意氨基酸序列的DNA序列。
9.上述權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的分子，其中該分子優(yōu)選為寡核苷酸，尤其是含有選自SEQ ID No.55-62、73或74的序列的RNA。
10.鑒定并分離權(quán)利要求1-9所述分子的方法，包括下述步驟a)使配體的噬菌體文庫(kù)與癌癥細(xì)胞接觸；b)使該癌癥細(xì)胞及其結(jié)合的配體與未結(jié)合該細(xì)胞的配體分離；c)除去非特異性結(jié)合該細(xì)胞的噬菌體，例如通過(guò)在所述細(xì)胞不裂解的條件下，用緩沖的去污劑溶液洗滌細(xì)胞；d)洗脫與所述細(xì)胞結(jié)合的噬菌體；并e)確定由上述洗脫噬菌體所展示的配體的身份；e)利用生化或生物學(xué)試驗(yàn)檢驗(yàn)該配體干擾PVR功能的能力。
11.編碼上述任意一項(xiàng)或若干項(xiàng)權(quán)利要求所述分子或可根據(jù)權(quán)利要求10所述方法鑒定的配體的核酸分子。
12.含有權(quán)利要求11所述核酸分子的載體。
13.包括權(quán)利要求1-9所述分子、可根據(jù)權(quán)利要求10所述方法鑒定的分子或配體、權(quán)利要求11所述核酸分子、權(quán)利要求12所述載體和/或藥學(xué)可接受載體和/或稀釋劑的藥物組合物。
14.權(quán)利要求1-9所述分子、可根據(jù)權(quán)利要求10所述方法鑒定的分子或配體、權(quán)利要求11所述核酸分子、權(quán)利要求12所述載體和/或權(quán)利要求13所述藥物組合物作為用于預(yù)防和/或治療增殖性失調(diào)、癌癥或轉(zhuǎn)移的藥物的用途。
15.體外調(diào)節(jié)表達(dá)CD155、PVR或其任意衍生物的細(xì)胞的粘附行為的方法，該方法包括a)使該細(xì)胞與權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述分子接觸；b)使該細(xì)胞在適合其生長(zhǎng)的條件下與ECM蛋白層接觸；c)對(duì)該細(xì)胞與ECM蛋白層的粘附進(jìn)行分析；d)任選地，在本發(fā)明所述經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的分子被誘導(dǎo)提高其生物學(xué)活性之后，分析該細(xì)胞與ECM蛋白層的粘附；并e)測(cè)定與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，被本發(fā)明所述未修飾分子結(jié)合的細(xì)胞和/或被本發(fā)明所述已修飾和誘導(dǎo)分子結(jié)合的細(xì)胞再次附著的百分比。
16.體外調(diào)節(jié)表達(dá)CD155、PVR或其任意衍生物的細(xì)胞的侵襲行為的方法，該方法包括a)使該細(xì)胞與權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的分子接觸；b)使該細(xì)胞在適合其生長(zhǎng)的條件下與凝膠樣基質(zhì)接觸；c)分析該細(xì)胞通過(guò)凝膠樣基質(zhì)的遷移；f)任選地，在本發(fā)明所述經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的分子被誘導(dǎo)提高其生物學(xué)活性之后，分析上述細(xì)胞通過(guò)所述凝膠樣基質(zhì)的遷移；并g)測(cè)定與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，被本發(fā)明所述未修飾分子結(jié)合的細(xì)胞和/或被本發(fā)明所述已修飾和誘導(dǎo)分子結(jié)合的細(xì)胞遷移的百分比。
17.治療或預(yù)防增殖性失調(diào)或疾病、癌癥和/或轉(zhuǎn)移的方法，該方法包括對(duì)有需要的患者施用特定量的權(quán)利要求1-9所述的分離分子、根據(jù)權(quán)利要求10鑒定的分子或配體、權(quán)利要求11所述核酸分子、權(quán)利要求12所述載體和/或權(quán)利要求13所述藥物組合物，所述的特定量是可有效調(diào)節(jié)受CD155、PVR或其任意衍生物介導(dǎo)的粘附、運(yùn)輸和/或侵襲行為的量。
18.包括權(quán)利要求1-9所述分子、可根據(jù)權(quán)利要求10所述方法鑒定的分子或配體、權(quán)利要求11所述核酸分子、權(quán)利要求12所述載體和合適的試驗(yàn)容器的試劑盒。
19.檢測(cè)和/或分離表達(dá)CD155、PVR或其任意衍生物的細(xì)胞的方法，包括下述步驟a)使權(quán)利要求6或7所述分子與患者來(lái)源的癌癥細(xì)胞接觸；b)分離與本發(fā)明所述分子結(jié)合的細(xì)胞c)分離與本發(fā)明所述分子結(jié)合的細(xì)胞；并d)檢驗(yàn)所述分子是否檢測(cè)并選擇了表達(dá)PVR的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及干擾細(xì)胞上的脊髓灰質(zhì)炎病毒受體(PVR)所介導(dǎo)功能的分子的鑒定、分離及其用途。該分子可被用于治療有轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞、轉(zhuǎn)移灶和癌癥。本發(fā)明進(jìn)一步提供的方法可用于鑒定和分離能夠調(diào)節(jié)PVR介導(dǎo)的細(xì)胞粘附或侵襲潛能的分子。
文檔編號(hào)A61K31/7105GK1777622SQ200480010611
公開(kāi)日2006年5月24日 申請(qǐng)日期2004年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月24日
發(fā)明者C·M·翁格爾, G·貝斯特, C·策赫特邁爾, B·萊因, C·托雷拉, D·G·杰伊, B·K·尤斯塔斯, K·E·斯洛安 申請(qǐng)人:施里昂藥品股份公司, 塔夫茲大學(xué)