專利名稱：：通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因牛的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，尤其涉及一種通過敲除口蹄疫病毒受體整合素(Integrin)β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因牛的方法，屬于細胞工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：ΠSit^(Foot-and-mouthdisease,FMD)(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)引起的牛、羊、豬等偶蹄類動物發(fā)生的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，世界動物衛(wèi)生組織將其列為A類烈性傳染病之首，一旦暴發(fā)，必須撲殺感染及接觸感染的動物。2001年英國暴發(fā)口蹄疫損失約90億英鎊，占其國內(nèi)生產(chǎn)總值的1.1%；2005年我國部分地區(qū)暴發(fā)AsiaI型FMD，2009年初多個省區(qū)又發(fā)生了A型FMD，不僅造成了巨大的直接經(jīng)濟損失，而且嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的健康發(fā)展以及相關(guān)產(chǎn)品的對外貿(mào)易，對國家的政治、經(jīng)濟具有深遠的影響。目前，大多數(shù)流行FMD的國家以計劃免疫為主的措施預(yù)防FMD。盡管新型疫苗不斷涌現(xiàn)，但傳統(tǒng)滅活疫苗仍是預(yù)防FMD的基礎(chǔ)。FMDV變異快，血清型多，且不同血清型疫苗之間沒有交叉保護，故通過疫苗免疫的單一手段很難控制和根除FMD。因此，科學(xué)家們在注重疫苗研發(fā)的同時，開始關(guān)注病毒與宿主之間的關(guān)系，尤其是病毒受體在病毒感染過程中的作用，期望通過敲除、沉默或封閉病毒的關(guān)鍵受體阻斷病毒的感染，進而達到控制和根除FMD的目的。病毒受體是能夠被病毒識別并與之結(jié)合，進而導(dǎo)致病毒感染的宿主細胞表面分子，是病毒宿主特異性和組織嗜性的關(guān)鍵因素。FMDV體外感染的受體包括整合素(Integrin)及硫酸乙酰肝素(HSPGs)。一些FMDV弱毒及細胞培養(yǎng)適應(yīng)毒株可利用HSPGs感染體外培養(yǎng)的細胞(O'Dormell等，2008)，但HSPGs可能只作為一種附屬分子增強其它受體的效率，尚無證據(jù)表明其在FMDV野毒株感染細胞過程中起作用(Monaghan等，2005)。整合素αν亞家族成員中ανβ1、ανβ3、ανβ6及ανβ8是FMDV感染體外細■白勺(Gutierrez-Rivas^,2008；Berryman^,2005Jacksonφ,2000；Goodwin等，2009；Ruiz-Saenz等，2009Johns等，2009)，其中整合素受體β6亞基是啟動FMDV強毒自然感染的關(guān)鍵性β受體亞基，原因在于(I)FMDV主要經(jīng)上呼吸道感染動物，在口咽或相關(guān)淋巴組織的上皮細胞起始復(fù)制后迅速擴散到口部和蹄部的上皮細胞。在4種整合素受體中，只有ανβ6僅限于FMDV組織嗜性的上皮細胞表面持續(xù)且高水平的表達(Berryman等，2005；Monaghan等，2005；Brown等，2006)，感染病毒的上皮細胞可同時檢測出ανβ6和病毒抗原(0'Dormell等，2009)。(2)體外合成的ανβ6可與所有血清型的FMDV結(jié)合(Ferris等，2005)，并且親和力最強(Burman等，2006)，這不僅提高了FMDV的感染率(DiCara等，2008；Duque等，2004)，而且也使β6亞基成為FMDV整合素受體中利用率最高的β亞基(Duque等，2003)。(3)不僅FMDV非敏感細胞轉(zhuǎn)染β6亞基基因后可被病毒感染(Jackson等，2000)，而且抗β6抗體可抑制受體與病毒間的結(jié)合并阻斷病毒感染(Νεζ等，2007Jackson等，2000)。轉(zhuǎn)基因動物的制作方法主要有逆轉(zhuǎn)錄病毒法、受精卵原核顯微注射法、精子載體法、ES細胞技術(shù)和轉(zhuǎn)基因體細胞核移植技術(shù)等。其中受精卵原核顯微注射法和轉(zhuǎn)基因體細胞克隆是目前世界各國科學(xué)家比較常用的家畜轉(zhuǎn)基因技術(shù)，前者最早由美國人Gordon發(fā)明，是經(jīng)典的制作轉(zhuǎn)基因動物的方法。Hammer等利用該方法成功地制作了轉(zhuǎn)基因兔、綿羊和豬，這些研究被認為是動物轉(zhuǎn)基因研究歷程上的里程碑?？傮w上看顯微注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的效率較低，后代嵌合體比例較高，尤其是大動物，受體需要量大，維持大量動物的飼養(yǎng)成本與試驗成本昂貴，研發(fā)成本高，風(fēng)險大。轉(zhuǎn)基因體細胞克隆技術(shù)是基因組修飾技術(shù)與動物體細胞核移植技術(shù)有機結(jié)合而產(chǎn)生的一種新的轉(zhuǎn)基因動物制作技術(shù)，它部分地克服了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因動物外源基因整合率低、大動物生產(chǎn)成本高的技術(shù)瓶頸，代表當(dāng)前轉(zhuǎn)基因動物制作的主流方向。在該方法中，核供體細胞在核移植前要經(jīng)過轉(zhuǎn)染、篩選和鑒定等環(huán)節(jié)，提高了轉(zhuǎn)基因動物的陽性率。Schnieke等(1997)用新霉素抗性基因neo和用于治療血友病的人凝血因子IX共轉(zhuǎn)染綿羊胎兒成纖維細胞，以隨機整合的轉(zhuǎn)基因細胞為核供體生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因綿羊，凝血因子IX在乳中的表達量達到125μg/mL，這一研究成果為利用克隆技術(shù)迅速擴大轉(zhuǎn)基因動物開辟了一條新的途徑。隨后，轉(zhuǎn)基因克隆牛、山羊、豬等相繼誕生。外源基因隨機整合的缺點主要是容易引起被插入基因的突變、易受到插入位點臨近基因的影響而表達水平不穩(wěn)定、胎胚發(fā)育及出生后生長不正常等，為克服上述部分缺點，基因打革巴(genetargeting)技術(shù)應(yīng)運而生?；虼虬惺窃谂咛ジ杉毎屯粗亟M技術(shù)基礎(chǔ)上產(chǎn)生的，是改變生物體遺傳信息的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，包括通過同源重組將外源基因/修飾的自身基因定點整合到受體細胞基因組(knockin)及將宿主細胞特定基因區(qū)段敲除(knockout)。該技術(shù)在小鼠轉(zhuǎn)基因中被廣泛應(yīng)用，但是，由于大動物沒有公認的家畜ES干細胞系而無法在ES干細胞水平上進行基因打靶，1997年多莉羊的誕生為體細胞基因打靶制備轉(zhuǎn)基因動物開辟了新的途徑。用體細胞介導(dǎo)的基因打靶技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因動物突出的優(yōu)點是(1)可以避開復(fù)雜的ES細胞技術(shù)；(2)可以不經(jīng)過嵌合體中間步驟；(3)可以控制轉(zhuǎn)基因動物性別；(4)能夠在體細胞體外培養(yǎng)水平進行整合篩選和基因打靶，因而可以顯著降低制備轉(zhuǎn)基因動物，特別是轉(zhuǎn)基因家畜的成本，在生物
技術(shù)領(lǐng)域：
具廣闊前景。盡管體細胞體外培養(yǎng)傳代的有限性是體細胞基因打靶研究的難點并且成功率低，但是近年來體細胞基因打靶研究也獲得了一些突破性進展。2000年，McCreath等首次將α-抗胰蛋白酶(AAT)基因定位整合到綿羊胎兒成纖維細胞的al原膠原基因座上，獲得了AAT較高表達水平的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊。隨后，國內(nèi)外科學(xué)家相繼利用體細胞克隆和基因打靶手段研制出不同的轉(zhuǎn)基因動物。Yu等(2006)報道利用基因打靶技術(shù)獲得敲除了朊病毒一個PrP基因位點的體細胞克隆山羊，經(jīng)過3個月觀察這些基因敲除羊沒有異常表現(xiàn)。Richt等(2007)利用基因打靶技術(shù)滅活牛的PRNP基因，獲得生長發(fā)育正常、存活2年以上的轉(zhuǎn)基因牛，它們能夠很好地抵抗瘋牛病的傳染。參考文獻1.BerrymanS,ClarkS,MonaghanP,JacksonΤ.EarlyEventsinIntegrinαVβ6-MediatedCellEntryofFoot-and—MouthDiseaseVirus,JVirol.,2005,79(13)8519-34.2.BurmanA，ClarkS，AbresciaNGiFryEE,StuartDI,JacksonΤ.SpecificityoftheVPlGHloopofFoot—and—MouthDiseasevirusforalphavintegrins，JVirol.，2006，80(19):9798_810.3.BrownJK,McAleeseSM,ThorntonEM,PateJA,SchockA，MacraeAl，ScottPR，MillerHR,CollieDD.(2006).Integrin_alphavbeta6，aputativereceptorforfoot-and-mouthdiseasevirus,isconstitutivelyexpressedinruminantairways,JHistochemCytochem.，54(7):807_16·4.DicaraD,BurmanA,ClarkS,BerrymanS,HowardMJ,HartIR,MarshallJF,JacksonT..Foot-and-mouthdiseasevirusformsahighlystable，EDTA—resistantcomplexwithitsprincipalreceptor，integrinalphavbeta6!implicationsforinfectiousness，JVirol.，2008，82(3)1537-46.5.DuqueHandBaxtB.Foot-and-mouthdiseasevirusreceptors-comparisonofbovinealpha(V)integrinutilizationbytypeAand0viruses,JVirol.，2003，77(4):2500-ll.6.DuqueH，LaRoccoM，GoldeWT,BaxtB.Interactionsoffoot-and-mouthdiseaseviruswithsolublebovinealphaVbeta3andalphaVbeta6integrins,JVirol.，2004，78(18):9773_81·7.FerrisNP,AbresciaNG,StuartDI,JacksonT，BurmanA，KingDP，PatonDJ.Utilityofrecombinantintegrinalphaνbeta6asacapturereagentinimmunoassaysforthediagnosisoffoot-and-mouthdisease，JVirolMethods.，2005，127(1):69-79.8.GoodwinS，TuthillTJ，AriasA，KillingtonRA，andRowlandsDJ.Foot-and-mouthdiseasevirusassembly!processingofrecombinantcapsidprecursorbyexogenousproteaseinducesself-assemblyofpentamersinvitroinamyristoyIation-dependentmanner.JVirol.，2009，83(21):11275_82.9.Gutierrez-RivasMiPulidoMR，BaranowskiE,SobrinoF,SaizM.Tolerancetomutatiohsinthefoot-and-mouthdiseasevirusintegrin-bindingRGDregionisdifferentinculturedcellsandinvivoanddependsonthecapsidsequencecontext,JGenVirol.，2008，89(10):2531_9·10.JacksonT，SheppardD，DenyerM，BlakemoreW,KingAM.Theepithelialintegrinalphavbeta6isareceptorforfoot-and-mouthdiseasevirus,JVirol.，2000,74(11)4949-56.11.JohnsHL,BerrymanS，MonaghanP，BelshamGJ,JacksonT.Adominant-negativemutantofrab5inhibitsinfectionofcellsbyfoot-and-mouthdiseasevirusamplicationsforvirusentry,JVirol·，2009，83(12):6247_56·12.MonaghanP，GoldS,SimpsonJ,ZhangZ,WeinrebPH,VioletteSM,AlexandersenS，JacksonTTheaVβ6integrinreceptorforFoot-and-mouthdiseasevirusisexpressedconstitutivelyontheepithelialcellstargetedincattle，JGenVirol.,2005,86(Pt10):2769_80.13.NiifiezJI,MolinaN,BaranowskiΕ,DomingoΕ,ClarkS,BurmanA,BerrymanS,JacksonΤ,SobrinoF.Guineapig-adaptedfoot-and-mouthdiseaseviruswithalteredreceptorrecognitioncanproductivelyinfectanaturalhost,JVirol.,2007,81(16):8497-506.14.0'Donne11V,LaroccoM,BaxtB.Heparansulfate-bindingfoot-and-mouthdiseasevirusenterscellsviacaveola-mediatedendocytosis,JVirol.,2008,82(18):9075_85.15.0'DonnellV,PachecoJM,GreggD,BaxtB.Analysisoffoot-and-mouthdiseasevirusintegrinreceptorexpressionintissuesfromnaiveandinfectedcattle,JCompPathol.，2009，141(2-3):98_112.16.RichtJA,KasinathanP,HamirAN,CastillaJ,SathiyaseelanT,VargasF,SathiyaseelanJ,WuH,MatsushitaH,KosterJ,KatoS,IshidaI,SotoC,RoblJM,KuroiwaY.Productionofcattlelackingprionprotein,NatBiotechnol,2007,25(1):132-138.17.Ruiz-SaenzJ,GoezY,TabaresW,Lopez-HerreraA.Cellularreceptorsforfootandmouthdiseasevirus,Intervirology,2009,52(4)-.201-12.18.SchniekeAE,KindAJ,RitchieWA,MycockK,ScottAR,RitchieM,WilmutI,ColmanA,CampbellKH(1997).HumanfactorIXtransgenicsheepproducedbytransferofnucleifromtransfectedfetalfibroblasts,Science,278(5346)2130-2133.19.YuGH,ChenJQ,YuHQ,LiuSG,ChenJ,XuXJ,ShaHY,ZhangXF,WuGX,XuSFandChengGX(2006).Functionaldisruptionoftheprionproteingeneinclonedgoats(J).JournalofGeneralVirology,87:10191027.
發(fā)明內(nèi)容針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的發(fā)明人進行了研究，研究表明，整合素β6亞基基因被替換或敲除的雜合子或純合子轉(zhuǎn)基因牛低表達或不表達口蹄疫病毒受體β6亞基，使FMDV感染率明顯下降，具備了抗FMD的能力。因此，通過敲除整聯(lián)蛋白β6亞基的方法是獲得抗FMD的轉(zhuǎn)基因牛的最佳方法之一。本發(fā)明的目的是提供一種通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因牛的方法。通過本發(fā)明的方法獲得的轉(zhuǎn)基因牛低表達(雜合子)或不表達(純合子)口蹄疫病毒受體整合素β6亞基，其FMDV感染率明顯下降。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因牛的方法，是將堿基序列如序列表中序列1所示的線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的打靶載體轉(zhuǎn)染正常牛的牛胎兒成纖維細胞，通過同源重組獲得替換整合素β6亞基基因的核供體細胞，將核供體細胞核導(dǎo)入牛的去核卵母細胞中得到重構(gòu)胚，再將重構(gòu)胚移入代孕牛子宮中，得到的子代即為整合素β6亞基基因被敲除的雜合子轉(zhuǎn)基因牛。還包括以下方法雜合子轉(zhuǎn)基因牛經(jīng)二次打靶和體細胞克隆獲得純合子轉(zhuǎn)基因牛；或雜合子轉(zhuǎn)基因公牛和雜合子轉(zhuǎn)基因母牛正常交配繁殖而獲得純合子轉(zhuǎn)基因牛。所述牛為奶?；蛉馀?。所述牛胎兒成纖維細胞為45150日齡胎兒不同組織來源的胎兒成纖維細胞，包括耳成纖維細胞、皮膚成纖維細胞、輸卵管上皮細胞或卵丘細胞，優(yōu)選皮膚成纖維細胞。所述將線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的打靶載體轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細胞方法為電轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、病毒載體法或磷酸鈣沉淀法，優(yōu)選脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。所述脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的條件為線性化的載體DNA濃度不低于lyg/yL，DNA脂質(zhì)體LTX=1:3。所述將線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的核供體細胞核導(dǎo)入牛的去核卵母細胞的方法為顯微注射法。所述去核卵母細胞不帶有第一極體。本發(fā)明利用同源重組和體細胞克隆的方法將線性化的攜帶有突變的整合素β6亞基基因的第一次打靶載體轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細胞，獲得整合素β6亞基基因敲除的核供體細胞，將其細胞核導(dǎo)入牛的去核卵母細胞中得到重構(gòu)胚，再將重構(gòu)胚移入代孕牛子宮中，得到的子代即為整合素β6亞基基因敲除的雜合子轉(zhuǎn)基因牛。雜合子轉(zhuǎn)基因牛經(jīng)二次打靶和體細胞克隆獲得純合子轉(zhuǎn)基因牛。用本方法獲得的轉(zhuǎn)基因牛低表達(雜合子)或不表達(純合子)口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因，使FMDV感染率明顯下降，具備了抗FMD的能力。本發(fā)明打破了傳統(tǒng)的通過免疫學(xué)手段預(yù)防FMD的思維模式，為控制和消滅牛FMD開辟了新的途徑，具有較高的實用價值和廣闊的市場前景。圖1為體細胞克隆整合素β6亞基基因被敲除的轉(zhuǎn)基因牛的生產(chǎn)流程圖。圖2為整合素β6亞基基因打靶載體的構(gòu)建示意圖。圖3為整合素β6亞基基因左側(cè)同源臂重組克隆質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果，其中，Μ:DLmarkerlO,000；1:NotI/SalI酶切pMD19-Left載體；2:NotI/SalI酶切pMD19對照。圖4為整合素β6亞基基因右側(cè)同源臂重組克隆質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果，其中，Μ:DLmarkerlO,000；1:pMD19_T空載體；2:XhoI/EcoRI酶切pMD19_Right載體。圖5為整合素β6亞基基因第一次打靶載體的質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果，其中，M:DLmarkerlO,OOO；1:XhoI/EcoRI酶切pRui-β61001;2:NotI/Sall酶切pRui-β61001。圖6為打靶載體與牛細胞整合素β6亞基基因發(fā)生同源重組后β6基因敲除結(jié)構(gòu)示意，pRui-β61001第一次打靶后，Integinbeta6基因的第三外顯子至第十二外顯子被PGK-neo基因所替換；pRui-GFP-β6第二次打靶后，另一條染色體上的Integinbeta6基因的第三外顯子至第十二外顯子被PGK-neo基因所替換。圖7為用于β6基因發(fā)生第一次同源重組PCR鑒定方法中陽性模板質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果，其中，M:DLmarker10,000；1.NotI和Sail酶切鑒定pRui-ko-model；2:I.NotI和SalI酶切pRui對照。圖8為轉(zhuǎn)基因奶牛雜合子胎兒成纖維細胞PCR鑒定結(jié)果，pRui-β61001打靶奶牛成纖維細胞后形成的單克隆，在跨Left小臂的引物P1，P2的引導(dǎo)下，PCR擴增3236bp的片段。圖9為β6基因敲除雜合子奶牛胎兒的Southern雜交鑒定結(jié)果，其中，1.普通荷斯坦奶牛胎兒，2、3為轉(zhuǎn)基因奶牛胎兒。圖10為轉(zhuǎn)基因雜合子奶牛β6基因mRNA的Real-timeRT-PCR檢測結(jié)果，正常及轉(zhuǎn)基因荷斯坦奶牛各6頭，以正常荷斯坦奶牛β6基因mRNA表達量的平均值為標(biāo)準(zhǔn)，計算轉(zhuǎn)基因牛mRNA的相對表達量。其中，1.正常荷斯坦奶牛，2為轉(zhuǎn)基因奶牛。圖11為接種病毒后奶牛出現(xiàn)臨床體癥時間的比較結(jié)果，接種病毒的正常奶牛組奶牛全部發(fā)病(3/3)，發(fā)病率100%，而接種病毒的轉(zhuǎn)基因奶牛組中抗病毒感染的奶牛(抗FMD奶牛)1頭，發(fā)病奶牛2頭(2/3)，發(fā)病率66.7%；接種病毒后，與正常奶牛比較，發(fā)病的轉(zhuǎn)基因奶牛出現(xiàn)臨床體癥時間明顯的滯后。其中，1.正常荷斯坦奶牛，2為轉(zhuǎn)基因奶牛。圖12為整合素β6亞基基因第二次打靶載體的質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果，其中，M:DLmarker10，000；1:ClaI酶切pRui—GFP—β6；2:ClaΙ/ΚρηI酶切pRui—GFP—β6。圖13為用于β6基因發(fā)生第二次同源重組PCR鑒定方法中陽性模板質(zhì)粒pRui-ko-model-2的酶切鑒定結(jié)果，其中，M:DLmarker15,000；1=NotI酶切pRui-ko-model-2；2:NotI/SalIpRui_ko_model_2。圖14為β6基因敲除雜合子黃牛胎兒的Southern雜交鑒定結(jié)果，其中，1.魯西黃牛胎兒，2、3為轉(zhuǎn)基因黃牛胎兒。具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步的說明。下述實施例中無特別說明均為常規(guī)方法，所用試劑及藥品如無特別說明均購自Sigma公司。實施例1體細胞克隆整合素β6亞基基因敲除的雜合子轉(zhuǎn)基因奶牛的生產(chǎn)及分子生物學(xué)檢測體細胞克隆整合素β6亞基基因敲除的雜合子轉(zhuǎn)基因奶牛的生產(chǎn)流程如圖1所示，具體過程包括如下步驟1.整合素β6亞基基因敲除的第一次打靶載體的構(gòu)建整合素β6亞基基因敲除第一次打靶載體的構(gòu)建如圖2所示，具體方法如下以荷斯坦奶牛胎兒成纖維細胞的基因組DNA為模板，在引物pLeftupper5，-ATAAGAATGCGGCCGCGCGAGAACTGAAACGGATG-3’(帶下劃線的堿基為限制性內(nèi)切酶NotI的識別位點)禾口弓丨物pLeftlower5，-ACGCGTCGACGGGCACTTTGTTAGACTGA-3，(帶下劃線的堿基為限制性內(nèi)切酶SalI的識別位點)引導(dǎo)下，PCR克隆片段為2021bp片段，反應(yīng)條件為94°C30s-MV20s55°C20s68°C2min,25個循環(huán)；68°C5min。反應(yīng)結(jié)束后對PCR產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收2021bp片段，TA克隆至pMD19-T(Takara公司)載體上，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選后搖菌，提取質(zhì)粒。酶切鑒定出含有Left片段的菌落命名為pMD19-Left(圖3)，將pMD19_Left用NotI和SalI酶切后回收Left片段與經(jīng)相同酶切的載體PRui連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，挑取單菌落搖菌、提質(zhì)粒，并進行酶切和測序鑒定，得到含有目的片段的重組載體，命名為PRui-β6-Left,該載體含有Integinbeta6基因啟動子區(qū)和第一、第二外顯子區(qū)與第一、第二內(nèi)含子區(qū)。以荷斯坦奶牛胎兒成纖維細胞的基因組DNA為模板，在引物pRightupper5，-CCGCTCGAGGGCCAGCGATCTGACGAGGAC-3，(帶下劃線的堿基為限制性內(nèi)切酶xhoI的識別位點)禾口弓I物pRightlower5，-CCGGAATTCATGGCCGCTTCTAATAGGT-3‘(帶下劃線的堿基為限制性內(nèi)切酶EcoRI的識別位點)引導(dǎo)下，PCR克隆片段為4323bp片段，反應(yīng)條件為94°C30s；94°C20s55°C20s68°C3min,25個循環(huán)；68°C7min。反應(yīng)結(jié)束后對PCR產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收4323bp片段，TA克隆至pMD19-T(Takara公司)載體上，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選后搖菌，提取質(zhì)粒，酶切鑒定出含有Right片段的菌落命名為pMD19-Right(圖4)，將pMD19-Right用XhoI和EcoRI酶切后回收Right片段與經(jīng)相同酶切的載體PRUI-β6-Left連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，挑取單菌落搖菌、提質(zhì)粒，并進行酶切和測序鑒定，得到含有目的片段的重組載體，命名為pRui-β61001，pRui-β61001的Right片段含有部分第十二內(nèi)含子、第十三外顯子和部分第十三內(nèi)含子。通過XhoI和EcoRI、NotI和SalI分別雙酶切pRui-061OOl，檢測結(jié)果顯示Left同源臂與Right同源臂片段均已插入pRui-β61001中(圖5)。pRui_i361001經(jīng)序列分析表明，載體上的Integinbeta6開放閱讀框獲得了插入突變(序列1)。將載體pRui-β61001經(jīng)過限制性內(nèi)切酶NotI線性化，用TaKaRaDNAFragmentPurificationKitVer.2.O(TaKaRa公司)回收濃縮純化13700bp的線性片段，將其溶解在滅菌的超純水中，_20°C保存。該片段自5，端第7-2001位DNA序列為Integinbeta6基因啟動子區(qū)和第一、第二外顯子區(qū)與第一、第二內(nèi)含子區(qū)’第2002-2035位DNA序列為Loxp位點；第2036-3855位DNA序列為PGK-Neo序列；第3856-3889位DNA序列為Loxp位點；第3896-8200位DNA序列為Integinbeta6基因部分第十二內(nèi)含子、第十三外顯子和部分第十三內(nèi)含子；第8201-10526位DNA序列為PGK-TK序列，見序列表1。pRui-β61001打靶后，Integinbeta6基因的第三外顯子至第十二外顯子將被PGK-neo基因所替換，如圖6所示。2.牛胎兒皮膚成纖維細胞系的建立選用2月齡的荷斯坦奶牛胎兒(購自山東奧克斯生物技術(shù)有限公司)，用70%酒精清洗包被奶牛胎兒的羊膜數(shù)次后，刺穿羊膜，取出奶牛胚胎，于PBS液中洗數(shù)遍，取胎兒皮膚組織，剪碎成小塊(體積小于Imm3)，再用PBS洗2遍后，加入IOmL的膠原酶和胰蛋白酶混合液37°C消化20-40min后，加入20mL含10%胎牛血清的DMEMF12營養(yǎng)液分散，IOOOrpmIOmin,再加入10%胎牛血清的DMEM:F12營養(yǎng)液重新懸浮，細胞計數(shù)，按3.OXIO5的細胞量接種于IOOmm的培養(yǎng)皿中，37°C、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2_3d，待細胞生長至單層后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代1次，液氮保存(凍存液成分為80%DMEM:F12，10%FBS和10%DMS0)，獲得牛胎兒皮膚成纖維細胞系。3.牛胎兒皮膚成纖維細胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和篩選處于對數(shù)生長期的牛胎兒皮膚成纖維細胞，用Opti-MEM洗1次細胞，將載體DNA線性化后，濃縮濃度不低于1μg/μL，經(jīng)脂質(zhì)體LTX轉(zhuǎn)染細胞(DNA脂質(zhì)體LTX=1:3)，24h后加入700μg/mLG418和8μΜGancvilor作為篩選壓力進行篩選，每3d換液1次，IOd后用0.25%胰蛋白酶消化形成的克隆細胞，培養(yǎng)2-3代，期間取部分細胞進行鑒定，其余細胞液氮保存、備用。4.卵母細胞的成熟培養(yǎng)將取自周邊地區(qū)屠宰場的成年奶牛和黃牛的卵巢，用37°C的PBS液清洗3遍后，用直徑為0.7mm的針頭抽取直徑為2-8mm的卵泡，回收形態(tài)均勻、結(jié)構(gòu)致密的卵丘_卵母細胞-復(fù)合體，將其用成熟液(M199培養(yǎng)液中添加10%FBS,0.01U/mLbFSH，0.01U/mLbLH和1μg/mL雌二醇)洗滌兩遍，然后將卵丘-卵母細胞-復(fù)合體按50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，置于38.55%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約20h，將成熟的卵母細胞放入含0.透明質(zhì)酸酶的管內(nèi)振蕩2-3min后，用玻璃管輕輕吹打，使卵丘細胞和卵母細胞完全脫離，選擇形態(tài)完整，細胞質(zhì)均勻，并排出第一極體的卵母細胞為胞質(zhì)受體。5.核移植和克隆胚胎的體外培養(yǎng)將步驟3獲得的第一極體的卵母細胞移入操作液(M199培養(yǎng)液中添加10%FBS,7.5μg/mL細胞松弛素B)中，在200倍顯微鏡下用玻璃針于極體上方的透明帶切一小口，再用內(nèi)徑20μm的玻璃管將第一極體及其下方的卵母細胞的染色體一并吸除，再用含20%的FBS的M199液體培養(yǎng)基洗3遍，置于38.5°C,5%CO2的培養(yǎng)箱中備用。將步驟2獲得的轉(zhuǎn)基因細胞活化至長滿單層，用0.25%胰蛋白酶消化，懸浮細胞，離心，再加微量的營養(yǎng)液懸浮，用玻璃針選擇直徑為10-12μm的胎兒皮膚成纖維細胞的細胞核，用20μm的玻璃管將其移入去核的卵母細胞的透明帶內(nèi)，然后將其放入0.3M甘露醇、0.15mmol/LCa2+和0.15mmol/LMg2+的溶液中，3-5min后放入融合槽內(nèi)，轉(zhuǎn)動卵母細胞使供體細胞核與卵母細胞接觸面與電場垂直，同時在直流脈沖的場強為2.5KV/cm、脈沖時間為10μs、脈沖次數(shù)為2次、脈沖間隔Is的條件下融合(融合儀為BTX公司的ECM-2001)后，迅速將重構(gòu)胚移入添加10%FBS的M199培養(yǎng)液中，放置0.5h后觀察融合率，挑選融合胚進行下一步的激活處理，將重構(gòu)胚放入5μmol/L離子霉素液中，4min后移至1.9mmol/L的6-DMAP液中，4h后再移入含5%FBS的CRIaa液中，在38.5°C,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在2d和7d后觀察胚胎的發(fā)育狀況。6.胚胎移植與妊娠檢測將形態(tài)優(yōu)良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受體牛的子宮角內(nèi)。在移植后的第30d對受體母牛進行B超檢測以確定受胎情況，并在移植后的第60d和90d進行直腸檢測以確定妊娠率。共移植受體牛48頭，移植60d后的直腸檢測表明，其中22頭懷孕。手術(shù)取2個胎兒進行鑒定，均為轉(zhuǎn)基因陽性，制備成纖維細胞，一部分用于體細胞克隆制備雜合子轉(zhuǎn)基因牛，一部分用于二次打靶和體細胞克隆制備純合子轉(zhuǎn)基因牛。7.轉(zhuǎn)基因雜合子陽性細胞、胎兒及克隆牛的分子生物學(xué)鑒定(I)PCR鑒定1)用于PCR鑒定的β6基因發(fā)生第一次同源重組的陽性模板質(zhì)粒的構(gòu)建克隆Integinbeta6基因Left片段5，上游-1817至+2231[NC_007300.4(37，386,594..37，390，642)]片段，以荷斯坦奶牛胎兒成纖維細胞的基因組DNA為模板，在引物pLeftupper-18175，-ATAAGAATGCGGCCGCGATCAGAGAGGCTGCGACTG-3，(帶下劃線的堿基為限制性內(nèi)切酶NotI的識別位點)與引物pLeftlower5，ACGCGTCGACGGGCACTTTGTTAGACTGA-3，的引導(dǎo)下，PCR克隆片段為4049bp片段，反應(yīng)條件為94V30s；94V20s55°C20s68°C3min，25個循環(huán)；68°C7min。反應(yīng)結(jié)束后對PCR產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段。將該片段用NotI和SalI酶切后回收與經(jīng)相同酶切的載體pRui連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，挑取單菌落搖菌、提質(zhì)粒，并進行酶切和測序鑒定，得到含有目的片段的重組載體，命名為pRui-ko-model(圖7)，該質(zhì)粒包含第一次打靶質(zhì)粒pRui-β61001的左側(cè)同源臂和報告基因neo，在pRui-ko-model:base1443-1455位點設(shè)計上游引物Pl:5，-TTCCCTAGCCTGCCTTCTATTAT-3，，在PGK-neo開放閱讀框，pRui-ko-modelbase4668-4647上設(shè)計下游引物P25，-CTTCCTCGTGCTTTACGGTATC-3，，PCR擴增產(chǎn)物為3236bp，可做pRui-β61001打靶后發(fā)生同源重組的細胞/胎兒/轉(zhuǎn)基因?？缭绞絇CR鑒定的模板。2)發(fā)生同源重組的跨越式PCR鑒定以經(jīng)pRui-β61001打靶獲得的牛胎兒成纖維neo抗性克隆、轉(zhuǎn)基因克隆胎兒或轉(zhuǎn)基因牛的基因組DNA為模板，在用于PCR鑒定的β6基因發(fā)生同源重組的陽性模板質(zhì)粒的構(gòu)建中的引物Pl，Ρ2的引導(dǎo)下，PCR擴增3236bp的片段為同源重組陽性。PCR反應(yīng)條件940C30s；94°C20s55°C20s68°C3min，35個循環(huán)；68°C7min。轉(zhuǎn)基因牛胎兒成纖維細胞鑒定結(jié)果如圖8所示，M:DLmarker10，000(Takara公司)，第1泳道為發(fā)生同源重組的陽性模板質(zhì)粒pRui-ko-model，第24泳道為以非轉(zhuǎn)基因奶牛成纖維細胞DNA為模板的陰性對照，第2-23泳道為單克隆細胞基因組DNA，其中第5、14、16和23泳道為同源重組陽性轉(zhuǎn)基因細胞，將其依次命名為Tβ50L、Tβ65L、Tβ67L禾口Tβ82L，其余均為陰性。(2)Southern雜交鑒定取約IOyg轉(zhuǎn)基因克隆牛胎兒或新生犢牛耳部組織的基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶Eco065I酶切消化，30V低壓電泳，轉(zhuǎn)膜后，進行Southern雜交。雜交所用探針為利用rediprimerIIrandomprimerlabelingsystem(amersham)、由[α-32P]dCTP同位素標(biāo)記的、經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sail和XhoI酶切消化的pRUI載體neo基因(報告基因)回收產(chǎn)物，以普通荷斯坦奶牛胎兒或新生犢牛的基因組DNA作為陰性對照，雜交陽性信號為6.5kb片段，結(jié)果如圖9所示(泳道1為普通荷斯坦奶牛，泳道2、3為轉(zhuǎn)基因奶牛胎兒，轉(zhuǎn)基因結(jié)果為陽性)。上述結(jié)果表明，在整合素β6亞基基因座位上發(fā)生了預(yù)期的同源重組。(3)Real-timeRT-PCR鑒定利用Trizol(Invitrogen)提取正常和轉(zhuǎn)基因牛胎兒或新生犢牛的甲狀腺或舌上皮組織總RNA，按TaKaRAaRNAPCRKit(AMV)Verf.0反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作步驟反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA模板。反轉(zhuǎn)錄體系為:MgC122.0μ1,10XRTBuffer1.0μl,dNTPMixture1.0μ1,RNAseInhibitor0.25μ1,RNAseFreedH203.75μ1,AMVReverseTranscriptase0.5μ1，提取RNA1.Ομ1，01igo(dT)0.5μ1，總體系10.Ομ1。在上游弓|物Ρ55‘-GTTGGGGGTTTCGCTGGCTATTC-3‘和下游引物Ρ65‘-CAGTGGATTGGTTCCCGTTTG-3‘的引導(dǎo)下，RealTimePCR擴增β6片段為148bp；在上游引物P35'-GCACAATGAAGATCAAGATCATC-3‘和下游引物P4:5'-CTAACAGTCCGCCTAGAAGCA-3‘的引導(dǎo)下，RealTimePCR擴增β-actin片段173bp。RealTimePCR反應(yīng)條件是95°C30s；95°C5S，60°C31S，40個循環(huán)。根據(jù)其擴增曲線和融解曲線，制作PCR定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過求其平均值可以分析出轉(zhuǎn)基因胎兒或新生犢牛β6基因表達的變化，圖10顯示了6頭轉(zhuǎn)基因牛的β6基因mRNA的表達量明顯下降。8.轉(zhuǎn)基因牛的FMDV攻毒實驗(1)牛半數(shù)感染量(ID5tl)的測定選取未接種FMD疫苗、無FMDV中和抗體、6月齡荷斯坦奶牛12頭，分成4組，每組3頭，分別在舌上表面皮內(nèi)接種兩個點(每點接種0.ImL)，病毒接種劑量分別為0、IO5UO6和IO7TCID5tl，觀察8天，未接種病毒的對照組不發(fā)病，接種病毒的實驗組病牛表現(xiàn)為蹄、口腔及其周圍和母畜的乳頭等部位出現(xiàn)水泡。統(tǒng)計發(fā)病牛的數(shù)量，按照Reed-Muench方法計算ID5tl，該組織培養(yǎng)毒的ID5tl為4X106。(2)轉(zhuǎn)基因牛的FMDV攻毒實驗選取未接種FMD疫苗、無FMDV中和抗體、6月齡左右正常及轉(zhuǎn)基因荷斯坦奶牛各6頭，分為4組，每組3頭。正常及轉(zhuǎn)基因牛中，各有一組不接種病毒，另一組分別在舌上表面皮內(nèi)接種兩個點(每點接種0.ImL)，病毒接種劑量為IOOID5tl，觀察8天。未接種病毒的對照組不發(fā)病，接種病毒的正常奶牛組奶牛全部發(fā)病(3/3)，發(fā)病率100%，而接種病毒的轉(zhuǎn)基因奶牛組中抗病毒感染的奶牛(抗FMD奶牛)1頭，發(fā)病奶牛2頭(2/3)，發(fā)病率66.7%；接種病毒后，與正常奶牛比較，發(fā)病的轉(zhuǎn)基因奶牛出現(xiàn)臨床體癥時間明顯的滯后，見圖11。實施例2體細胞克隆整合素β6亞基基因敲除的純合子轉(zhuǎn)基因奶牛的生產(chǎn)及分子生物學(xué)檢測體細胞克隆整合素β6亞基基因敲除的純合子轉(zhuǎn)基因奶牛的生產(chǎn)流程如圖1所示，具體過程包括如下步驟1.整合素β6亞基基因敲除的二次打靶載體的構(gòu)建在整合素β6亞基基因敲除第一次打靶載體的基礎(chǔ)上用報告基因GFP替換neo，獲得第二次打靶載體。具體方法如下以pRui為模板，在引物pGKlupper5，-CggggTACCctcgagataacttcgtatagcatac-S，(帶下劃線的堿基為限制性內(nèi)切酶Kpnl的識別位點)與引物pGKllower5，-TGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATATTGGCTGCAGGTCGAAAG-3，(帶下劃線的堿基為GFP基因5’序列)的引導(dǎo)下，PCR克隆片段為556bp的pGK啟動子片段；以pEGFP_Nl為模板，在引物pGFPupper5，-CCGGGCCTTTCGACCTGCAGCCAATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT-3，(帶下劃線的堿基為PGK啟動子3’序列)與引物pGFPlower5，TTCTGCAGACTTACAGCGGATCCCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3，(帶下劃線的堿基為pGK終止子5’序列)，PCR克隆片段為700bp的GPF基因片段；以pRui為模板，在引物pGK2upper5，-CGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGGGGATCCGCTGTAAGTCTGCAG-3，與引物pGK2lower5，-CCCATCGATCTCGACGGTATCGAGCTTCTGATGG-3，(帶下劃線的堿基為限制性內(nèi)切酶ClaI的識別位點)PCR克隆片段為513bp的pGK終止子片段。將純化的556bpPCR產(chǎn)物與700bpPCR產(chǎn)物混合作為兩步法PCR反應(yīng)的拼接模板，在引物pGKlupper與引物pGFPlower的引導(dǎo)下，獲得1231bp的PCR產(chǎn)物。反應(yīng)條件為94°C30s；94°C20s56°C20s68°Clmin，25個循環(huán)；68°C5min。反應(yīng)結(jié)束后對PCR產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收1231bp片段；以純化的1231bpPCR產(chǎn)物與513bpPCR產(chǎn)物混合作為兩步法PCR反應(yīng)的拼接模板，在引物pGKlupper與引物pGK21ower的引導(dǎo)下，PCR克隆1736bp片段，將該片段用KpnI和ClaI酶切后回收該片段與經(jīng)相同酶切的載體pRui_i361001回收11946bp片段連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.ColiDH5a，挑取單菌落搖菌、提質(zhì)粒，并進行酶切(圖12)和測序鑒定，得到含有目的片段的重組載體，命名為pRui-GFP-β6(序列2)。2.雜合子轉(zhuǎn)基因奶牛胎兒皮膚成纖維細胞系的建立選取2月齡的實施例1中獲得的雜合子轉(zhuǎn)基因胎兒，其胎兒皮膚成纖維細胞系的制備方法與實施例1奶牛胎兒皮膚成纖維細胞系的制備方法相同。3.雜合子轉(zhuǎn)基因奶牛胎兒皮膚成纖維細胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和篩選處于對數(shù)生長期的雜合子轉(zhuǎn)基因牛胎兒皮膚成纖維細胞，用Opti-MEM洗1次細胞，將二次打靶載體pRui-GFP-β6DNA線性化后，濃縮濃度不低于1μg/μL，經(jīng)脂質(zhì)體LTX轉(zhuǎn)染大量細胞，24h后培養(yǎng)液中含有700yg/mLG418和8μΜGancvilor，每3d換液1次，96h后用0.25%胰蛋白酶消化細胞并進行流式細胞分選，含有GFP的細胞接種于細胞培養(yǎng)皿中，100個細胞/培養(yǎng)皿，用700μg/mLG418和8μΜGancvilor繼續(xù)進行正負篩選，培養(yǎng)IOd后，在熒光倒置顯微鏡下挑選有綠色熒光的細胞克隆(具備G418和Gancvilor抗性且產(chǎn)生綠色熒光的細胞可能是β6基因敲除的純合子細胞)，擴繁2-3代，期間取部分細胞進行鑒定，其余細胞液氮保存、備用。4.卵母細胞的成熟培養(yǎng)、去核與實施例1卵母細胞的成熟培養(yǎng)、去核方法相同。5.核移植和克隆胚胎的體外培養(yǎng)與實施例1核移植和克隆胚胎的體外培養(yǎng)方法相同。6.胚胎移植與妊娠檢測將形態(tài)優(yōu)良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受體牛的子宮角內(nèi)。在移植后的第30d對受體母牛進行B超檢測以確定受胎情況，并在移植后的第60d和90d進行直腸檢測以確定妊娠率。共移植受體牛36頭，移植后的第60d直腸檢測表明，其中17頭懷孕。7.轉(zhuǎn)基因純合子陽性細胞及克隆牛的分子生物學(xué)鑒定(I)PCR鑒定1)用于PCR鑒定的第二條染色體β6基因發(fā)生同源重組的陽性模板質(zhì)粒的構(gòu)建以荷斯坦奶牛胎兒成纖維細胞的基因組DNA為模板，在引物pLeftupper-18175，-ATAAGAATGCGGCCGCGATCAGAGAGGCTGCGACTG-3，(帶下劃線的堿基為限制性內(nèi)切酶NotI的識別位點)與弓丨物pLeftlower5，ACGCGTCGACGGGCACTTTGTTAGACTGA-3‘的引導(dǎo)下，PCR克隆片段為4049bp片段，反應(yīng)條件為94V30s；94V20s55°C20s68°C3min,25個循環(huán)；68°C7min。反應(yīng)結(jié)束后對PCR產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段。將該片段用NotI和SalI酶切后回收與經(jīng)相同酶切的載體pRui連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，挑取單菌落搖菌、提質(zhì)粒，并進行酶切和測序鑒定，得到含有目的片段的重組載體，命名為pRui-ko-model-2(圖13)，在pRui-ko-model-2base1433-1455設(shè)計上游弓丨物Pl:5，-TTCCCTAGCCTGCCTTCTATTAT-3，(同pRui-ko-model)，在pGK_GFP開放閱讀框上base5125-5106設(shè)計下游引物P45，-AGTTCACCTTGATGCCGTTC-3，，可做二次打靶載體pRui_GFP_β6打靶后發(fā)生同源重組的細胞/轉(zhuǎn)基因?？缭绞絇CR鑒定的模板。2)β6基因敲除純合子的跨越式PCR鑒定以二次打靶獲得的牛胎兒成纖維neo抗性及綠色熒光克隆或轉(zhuǎn)基因牛的基因組DNA為模板，跨越式PCR鑒定引物Pl和P2及Pl和P4的分別引導(dǎo)下，PCR擴增3236bp及3693bp的片段分別為第一次和第二次同源重組陽性。PCR反應(yīng)條件94°C30s；94°C20s55°C20s68°C3min，35個循環(huán)；68°C7min。(2)Southern雜交鑒定取約10μg轉(zhuǎn)基因克隆牛胎兒組織或轉(zhuǎn)基因牛耳部組織的基因組DNA，以普通荷斯坦奶牛或魯西黃牛的基因組DNA作為陰性對照，用限制性內(nèi)切酶Eco065I酶切消化，30V低壓電泳，轉(zhuǎn)膜后，進行Southern雜交。雜交所用探針分別為利用rediprimerIIrandomprimerlabelingsystem(amersham)、由[α-32P]dCTP同位素標(biāo)記的、經(jīng)限制性內(nèi)切酶SalI和XhoI酶切消化的pRUI載體neo基因或pRui-GFP-β6載體GFP基因回收產(chǎn)物，第一次打靶(β6被neo基因替換)的雜交陽性信號為6.5kb片段，第二次打靶(β6被GFP基因替換)的雜交陽性信號為6.4kb片段。(3)Real-timeRT-PCR鑒定與實施例IReal-timeRT-PCR方法相同。8.轉(zhuǎn)基因牛的FMDV攻毒實驗與實施例1轉(zhuǎn)基因牛的FMDV攻毒實驗方法相同。實施例3體細胞克隆整合素β6亞基基因敲除的雜合子轉(zhuǎn)基因黃牛的生產(chǎn)及分子生物學(xué)檢測體細胞克隆整合素β6亞基基因敲除的雜合子轉(zhuǎn)基因黃牛的生產(chǎn)流程如圖1所示，具體過程包括如下步驟1.整合素β6亞基基因敲除的打靶載體魯西黃牛和荷斯坦奶牛β6基因同源性很高，故本研究中使用了實施例1中所用的奶牛打靶載體。2.魯西黃牛胎兒皮膚成纖維細胞系的建立選取2月齡的魯西黃牛胎兒(購自山東省魯西黃牛原種場)，其胎兒皮膚成纖維細胞系的制備方法與實施例1奶牛胎兒皮膚成纖維細胞系的制備方法相同。3.魯西黃牛胎兒皮膚成纖維細胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和篩選與實施例1奶牛胎兒皮膚成纖維細胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和正負篩選方法相同。4.卵母細胞的成熟培養(yǎng)、去核與實施例1卵母細胞的成熟培養(yǎng)、去核方法相同。5.核移植和克隆胚胎的體外培養(yǎng)與實施例1核移植和克隆胚胎的體外培養(yǎng)方法相同。6.胚胎移植與妊娠檢測將形態(tài)優(yōu)良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受體牛的子宮角內(nèi)。在移植后的第30d對受體母牛進行B超檢測以確定受胎情況，并在移植后的第60d和90d進行直腸檢測以確定妊娠率。共移植受體牛討頭，移植后的第60d直腸檢測表明，其中沈頭懷孕。手術(shù)取2個胎兒進行鑒定，均為轉(zhuǎn)基因陽性(圖14)，制備成纖維細胞，一部分用于體細胞克隆制備雜合子轉(zhuǎn)基因牛，一部分用于二次打靶和體細胞克隆制備純合子轉(zhuǎn)基因牛。7.轉(zhuǎn)基因雜合子陽性細胞、胎兒及克隆牛的分子生物學(xué)鑒定(I)PCR鑒定具體方法同實施例1。(2)Southern雜交鑒定具體方法同實施例1。(3)Real-timeRT-PCR鑒定具體方法同實施例1。8.轉(zhuǎn)基因牛的FMDV攻毒實驗具體方法同實施例1。實施例4體細胞克隆整合素β6亞基基因敲除的純合子轉(zhuǎn)基因黃牛的生產(chǎn)及分子生物學(xué)檢測體細胞克隆整合素β6亞基基因敲除的純合子轉(zhuǎn)基因黃牛的生產(chǎn)流程如圖1所示，具體過程包括如下步驟1.整合素β6亞基基因敲除的二次打靶載體魯西黃牛整合素β6亞基基因敲除的二次打靶載體同實施例2中所用的奶牛打靶載體。2.魯西黃牛轉(zhuǎn)基因雜合子胎兒皮膚成纖維細胞系的建立選取2月齡的魯西黃牛轉(zhuǎn)基因雜合子胎兒(由實施例3獲得)，其胎兒皮膚成纖維細胞系的制備方法與實施例2轉(zhuǎn)基因奶牛胎兒皮膚成纖維細胞系的制備方法相同。3.魯西黃牛轉(zhuǎn)基因雜合子胎兒皮膚成纖維細胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和篩選與實施例2轉(zhuǎn)基因雜合子奶牛胎兒皮膚成纖維細胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和正負篩選方法相同。4.卵母細胞的成熟培養(yǎng)、去核與實施例1卵母細胞的成熟培養(yǎng)、去核方法相同。5.核移植和克隆胚胎的體外培養(yǎng)與實施例1核移植和克隆胚胎的體外培養(yǎng)方法相同。6.胚胎移植與妊娠檢測將形態(tài)優(yōu)良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受體牛的子宮角內(nèi)。在移植后的第30d對受體母牛進行B超檢測以確定受胎情況，并在移植后的第60d和90d進行直腸檢測以確定妊娠率。共移植受體牛M頭，移植60d后直腸檢測表明，其中沈頭懷孕。7.轉(zhuǎn)基因純合子陽性細胞、胎兒及克隆牛的分子生物學(xué)鑒定(I)PCR鑒定具體方法同實施例2。(2)Southern雜交鑒定具體方法同實施例2。(3)Real-timeRT-PCR鑒定具體方法同實施例1。8.轉(zhuǎn)基因牛的FMDV攻毒實驗具體方法同實施例1。權(quán)利要求1.一種通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因牛的方法，其特征在于是將堿基序列如序列表中序列1所示的線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的打靶載體轉(zhuǎn)染正常牛的牛胎兒成纖維細胞，通過同源重組獲得替換整合素β6亞基基因的核供體細胞，將核供體細胞核導(dǎo)入牛的去核卵母細胞中得到重構(gòu)胚，再將重構(gòu)胚移入代孕牛子宮中，得到的子代即為整合素β6亞基基因被敲除的雜合子轉(zhuǎn)基因牛。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因牛的方法，其特征在于，還包括以下方法雜合子轉(zhuǎn)基因牛經(jīng)二次打靶和體細胞克隆獲得純合子轉(zhuǎn)基因牛；或雜合子轉(zhuǎn)基因公牛和雜合子轉(zhuǎn)基因母牛正常交配繁殖而獲得純合子轉(zhuǎn)基因牛。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因牛的方法，其特征在于所述牛為奶牛或肉牛。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因牛的方法，其特征在于所述牛胎兒成纖維細胞為45150日齡胎兒不同組織來源的成纖維細胞。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因牛的方法，其特征在于所述牛胎兒成纖維細胞為耳成纖維細胞、皮膚成纖維細胞、輸卵管上皮細胞或卵丘細胞。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因牛的方法，其特征在于所述將線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的打靶載體轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細胞方法為電轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、病毒載體法或磷酸鈣沉淀法。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因牛的方法，其特征在于所述將線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的打靶載體轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細胞方法為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因牛的方法，其特征在于所述脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的條件為線性化的載體DNA濃度不低于1μg/μL,DNA月旨質(zhì)體LTX=13。9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因牛的方法，其特征在于所述將線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的核供體細胞核導(dǎo)入牛的去核卵母細胞的方法為顯微注射法。10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因牛的方法，其特征在于所述去核卵母細胞不帶有第一極體。全文摘要本發(fā)明公開了一種通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因牛的方法，是將線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的打靶載體轉(zhuǎn)染牛體細胞，通過同源重組獲得替換整合素β6亞基基因的核供體細胞，將核供體細胞核導(dǎo)入牛的去核卵母細胞中得到重構(gòu)胚，再將重構(gòu)胚移入代孕牛子宮中，得到的子代即為整合素β6亞基基因被敲除的雜合子轉(zhuǎn)基因牛。雜合子轉(zhuǎn)基因牛經(jīng)二次打靶和體細胞克隆獲得純合子轉(zhuǎn)基因牛。用本方法獲得的轉(zhuǎn)基因牛低表達或不表達口蹄疫病毒受體整合素β6亞基，使FMDV感染率明顯下降，其具備了抗FMD的能力。該發(fā)明打破了傳統(tǒng)的通過免疫學(xué)手段預(yù)防FMD的思維模式，為控制和消滅牛FMD開辟了新的途徑。文檔編號C12N15/877GK102321609SQ20111026168公開日2012年1月18日申請日期2011年9月6日優(yōu)先權(quán)日2010年9月9日發(fā)明者仲躋峰,何洪彬,劉曉,武建明,王洪梅,陳莉莉,高運東申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心