小片段dna共轉(zhuǎn)化替換大片段dna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及合成生物學(xué)染色體合成領(lǐng)域，特別涉及小片段DNA共轉(zhuǎn)化替換大片段 DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物基因組攜帶了決定生物基本性狀的遺傳信息，人工DNA合成技術(shù)和DNA大片段 操作技術(shù)推動(dòng)了基因組人工合成研究的進(jìn)步。合成生物學(xué)的發(fā)展推動(dòng)了通過人工設(shè)計(jì)合成 來"寫"基因組信息標(biāo)志著"人造生命"的開始。
[0003] 近年來，丙型肝炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、X174噬菌體、T7噬菌體、水稻（Oryza sativa)葉綠體和小鼠 （Mus musculus)線粒體等基因組序列先后實(shí)現(xiàn)了人工改造與合成， 尤其是活性人工基因組設(shè)計(jì)與合成的成功使人工基因組合成工作受到了世界的極大關(guān)注， 即支原體基因組和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)染色體的合成。Venter研究組開 發(fā)了體外組裝和酵母體內(nèi)組裝相結(jié)合的方式進(jìn)行基因組合成，于2008年實(shí)現(xiàn)了生殖支原體 (Mycoplama genitalium)基因組的全化學(xué)人工合成，然后利用基因組轉(zhuǎn)移的技術(shù)于2010年 將人工合成的蕈狀支原體(Mycoplasma mycoides)基因組轉(zhuǎn)入移除自身染色體的山羊 (Capra aegagrus hircus)支原體(Mycoplasma capriolum)細(xì)胞中，得到了能夠發(fā)揮正常 功能的全新的支原體細(xì)胞。2011年，Boeke研究組分別對(duì)釀酒酵母VI號(hào)染色體左臂和IX號(hào)染 色體右臂進(jìn)行了人工設(shè)計(jì)，并于2014年成功合成了具有生物學(xué)活性的完整m號(hào)人工染色 體，標(biāo)志著基因組人工合成工作進(jìn)入真核生物領(lǐng)域。
[0004] 生物染色體的長(zhǎng)度較長(zhǎng)，尤其是真核生物。通過體外或體外組裝和染色體轉(zhuǎn)移的 技術(shù)來合成全新的、能夠發(fā)揮正常功能的真核生物染色體困難極大，操作可行性較小。因 此，一種能夠快速替換大片段真核生物染色體、并使之能夠發(fā)揮正常功能的大片段DNA替換 技術(shù)顯得極具開發(fā)價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明提供小片段DNA共轉(zhuǎn)化替換大片段DNA的方法。本發(fā)明的目的是 為了解決不大于30kb大片段釀酒酵母V號(hào)染色體的替換問題，提出利用多個(gè)小片段DNA共轉(zhuǎn) 化替換大片段DNA的方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了小片段DNA共轉(zhuǎn)化替換大片段DNA的方法，多個(gè)小片段DNA共轉(zhuǎn)化入 釀酒酵母細(xì)胞中，利用釀酒酵母的同源重組特性，實(shí)現(xiàn)大片段DNA的替換。
[0008] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述方法中所述小片段DNA為不大于4kb的DNA; 所述大片段DNA為不大于30kb的DNA。
[0009] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述方法中相鄰兩個(gè)所述小片段DNA之間存在 不大于750bp的重疊區(qū)域。
[0010] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述方法中采用兩個(gè)篩選標(biāo)記尿嘧啶(URA3)和 卡那霉素抗性(KanMX)的組合物或尿嘧啶(URA3)和亮氨酸(LEU2)的組合對(duì)所述大片段DNA 的替換進(jìn)行表型表征。
[0011] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述方法中所述大片段DNA為酵母染色體。
[0012] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述方法中所述大片段DNA為酵母V號(hào)染色體。 [0013]在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述方法中所述小片段DNA選自如SEQ ID No. 1 ~SEQ ID No. 17所示的的核苷酸序列。
[0014]本發(fā)明提供了所述方法制得釀酒酵母菌株。
[0015]本發(fā)明還提供了一種組合物，包括小片段DNA;所述小片段DNA為不大于4kb的DNA; 相鄰兩個(gè)所述小片段DNA之間存在不大于750bp的重疊區(qū)域；
[0016] 多個(gè)小片段DNA共轉(zhuǎn)化入釀酒酵母細(xì)胞中，利用釀酒酵母的同源重組特性，實(shí)現(xiàn)大 片段DNA的替換。
[0017] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述組合物中所述小片段DNA選自如SEQ ID No. 1~SEQ ID No. 17所示或如SEQ ID No.86~SEQ ID No. 103所示的的核苷酸序列。
[0018] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述組合物中還包括釀酒酵母細(xì)胞和/或篩選 標(biāo)記;所述篩選標(biāo)記為尿嘧啶(URA3)和卡那霉素抗性(KanMX)的組合或尿嘧啶(URA3)和亮 氨酸(LEU2)的組合。
[0019 ]本發(fā)明還提供了一種試劑盒，包括所述的組合物。
[0020] 本發(fā)明還提供了所述的組合物或所述的試劑盒在制備合成型染色體中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明的基本思想是利用釀酒酵母同源重組的特性，通過共轉(zhuǎn)化多個(gè)小片段DNA 實(shí)現(xiàn)對(duì)大片段釀酒酵母V號(hào)染色體的替換。
[0022]本發(fā)明對(duì)比已有成果具有以下有益效果：
[0023]利用小片段DNA對(duì)大片段釀酒酵母V號(hào)染色體進(jìn)行替換；
[0024]利用PCR方法對(duì)替換結(jié)果進(jìn)行快速驗(yàn)證。
【附圖說明】
[0025]為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0026]圖1示本發(fā)明得利用小片段DNA共轉(zhuǎn)化替換不大于30kb大片段酵母V號(hào)染色體策略 示意圖；利用釀酒酵母自身的高效同源重組特性，多個(gè)不大于4kb小片段DNA被共轉(zhuǎn)化至釀 酒酵母細(xì)胞中將不大于30kb大片段酵母V號(hào)染色體進(jìn)行替換；
[0027]圖2示本發(fā)明實(shí)施例1中PCR驗(yàn)證不大于30kb大片段酵母V號(hào)染色體替換正確的電 泳圖；替換正確后，SYN-PCR出現(xiàn)條帶，WT-PCR不出現(xiàn)條帶；
[0028]圖3示本發(fā)明實(shí)施例2中PCR驗(yàn)證不大于30kb大片段酵母V號(hào)染色體替換正確的電 泳圖；替換正確后，SYN-PCR出現(xiàn)條帶，WT-PCR不出現(xiàn)條帶；
[0029]圖4為實(shí)施例2中V號(hào)釀酒酵母菌株與野生型釀酒酵母菌株BY4741生長(zhǎng)曲線比較 圖；其中，線1示空白對(duì)照，線2示BY4741，線3示替換后菌株。
【具體實(shí)施方式】
[0030]本發(fā)明公開了小片段DNA共轉(zhuǎn)化替換大片段DNA的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒 本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技 術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較 佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的 方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0031]本發(fā)明的核心發(fā)明點(diǎn)是將多個(gè)不大于4kb的小片段DNA共轉(zhuǎn)化至釀酒酵母細(xì)胞中， 利用釀酒酵母自身高效的同源重組特性，實(shí)現(xiàn)對(duì)不大于30kb釀酒酵母V號(hào)染色體的替換工 作，替換的正確性通過PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證。
[0032]關(guān)鍵步驟:將~15個(gè)長(zhǎng)約3kb的小片段DNA共轉(zhuǎn)化至釀酒酵母細(xì)胞中對(duì)V號(hào)染色體 進(jìn)行替換，每?jī)蓚€(gè)相鄰小片段DNA之間存在一個(gè)不大于750bp的重疊區(qū)域，然后利用抗性標(biāo) 記或營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記篩選和PCR驗(yàn)證確保對(duì)不大于30kb釀酒酵母V號(hào)染色體替換的正確性。構(gòu)建策 略圖見圖3。
[0033]本發(fā)明的目的是通過下屬技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0034] 1.多個(gè)不大于4kb小片段DNA被共轉(zhuǎn)化至釀酒酵母細(xì)胞中，每?jī)蓚€(gè)相鄰小片段DNA 之間存在一個(gè)不大于750bp的重疊區(qū)域，最后一個(gè)小片段DNA上攜帶URA3或者LUE2營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記 基因。
[0035] 2.根據(jù)所轉(zhuǎn)化小片段DNA所攜帶的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因，將轉(zhuǎn)化后的菌株涂布于相應(yīng)固 體培養(yǎng)基上，然后利用PCR對(duì)所獲得的單菌落進(jìn)行驗(yàn)證。
[0036] 3.挑選存在全部PCR條帶的菌株，該菌株中上的不大于30kb釀酒酵母V號(hào)染色體被 替換。
[0037]本發(fā)明對(duì)比已有成果具有以下有益效果：
[0038]利用小片段DNA對(duì)大片段釀酒酵母V號(hào)染色體進(jìn)行替換；
[0039]利用PCR方法對(duì)替換結(jié)果進(jìn)行快速驗(yàn)證。
[0040] 本發(fā)明提供的小片段DNA共轉(zhuǎn)化替換大片段DNA的方法中所用質(zhì)粒、菌株、原料及 試劑均可由市場(chǎng)購(gòu)得。
[0041] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0042] 實(shí)施例1
[0043] DNA共轉(zhuǎn)化替換大片段釀酒酵母V號(hào)染色體的方法，包括以下步驟：
[0044] 1、準(zhǔn)備下述小片段 DNA 各 200ng: A1 · 01，A1 · 02，A1 · 03，A2 · 01，A2 · 02，A2 · 03，A2 · 04， △3.0143.0243.0344.0144.0244.0345.0145.0245.03和厶5.04(核苷酸序列分別如 SEQ ID No.l~SEQ ID吣.17所示）。制備方法如下：
[0045] 1)準(zhǔn)備質(zhì)粒？厶1.01，？厶1.02，？厶1.03，？厶2.01，？厶2.02，？厶2.03，？厶2.04，？厶3.01， 口八3.02，？厶3.03，？厶4.01，？厶4.02，？厶4.03，？厶5.01，？厶5.02，？厶5.03和？厶5.04。上述質(zhì)粒均為 連接有步驟1中所述片段的pEASY-Blunt載體。
[0046] 2)利用限制性內(nèi)切酶 PstI 對(duì)質(zhì)粒 ρΑ1·01，ρΑ1·02，ρΑ1·03，ρΑ3·01，ρΑ3·02，ρΑ3·03 進(jìn)行消化，利用限制性內(nèi)切酶)(h〇I對(duì)質(zhì)粒ρΑ2.01，ρΑ2.02，ρΑ2.03，ρΑ2.04進(jìn)行消化，利用限 制性內(nèi)切酶Κρη I對(duì)質(zhì)粒ρΑ4.01，ρΑ4.0 2，ρΑ4.0 3進(jìn)行消化，利用限制性內(nèi)切酶BamHI對(duì) pA5 · 01，pA5 · 02，pA5 · 03，pA5 · 04 進(jìn)行消化。
[0047] 3)將步驟2)中酶切消化的質(zhì)粒DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)目標(biāo)長(zhǎng)度的條帶進(jìn)行 DNA膠回收，條帶長(zhǎng)度分別見表1:
[0049]
[0048] 表1小片段DNA
[0050]
[00511 2、將上述DNA片段進(jìn)行混合，進(jìn)行釀酒酵母轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化菌株為單敲庫菌株BY4741 Δ YEL067C: :KanMX，轉(zhuǎn)化方法如下所示：
[0052] a)挑取釀酒酵母單菌落于YH)液體培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)；
[0053] b)測(cè)量過夜培養(yǎng)的釀酒酵母培養(yǎng)液0D6QQ，接種過夜培養(yǎng)液到5mL YPD中 (0· 1250D6QQ/ml)，30°C、220rpm條件下培養(yǎng)至0D6QQ達(dá)到0·5(約需要3.5-4.5hrs);
[0054] c)吸取1.5mL釀酒酵母培養(yǎng)液至1.5mL EP管內(nèi)，5000rpm離心lmin，收集細(xì)胞；用 lmL無菌水重懸并清洗細(xì)胞，同上離心，收集細(xì)胞；用lmL 0.1M LiOAc重懸細(xì)胞，同上離心， 收集細(xì)胞；用移液器吸除900yL上清，剩余的100yL LiOAc重懸細(xì)胞，置于冰上，得到感受態(tài) 細(xì)胞。
[0055] d)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化體系：
[0056]
[0057] e)將100yL感受態(tài)細(xì)胞加入至轉(zhuǎn)化體系中，吹吸均