本發(fā)明涉及微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種牛肉生物型嫩化劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著人們?nèi)馐辰Y(jié)構(gòu)的改變和生活水平的不斷提高，牛肉越來越受到消費者的青睞，而牛肉的嫩度是影響消費者評定牛肉質(zhì)量最重要的一個因素，所以肉類嫩化的相關(guān)研究逐漸成為人們關(guān)注的熱點之一。國內(nèi)外對宰后嫩化的研究比較多，尤其是酶法嫩化，目前運用最多并且取得成果的主要是木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶，可降解肌原纖維，從而提高肉的嫩度，但是這類蛋白酶由于受到原料的限制，實際應(yīng)用因成本問題有一定的困難。所以研制開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的微生物種質(zhì)資源和技術(shù)體系顯得尤為重要。我們將生物工程技術(shù)與我國傳統(tǒng)的腌制方法結(jié)合起來，研制開發(fā)新型食品嫩化劑，為肉類制品的嫩化提供新的方法和途徑。必定有良好的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種牛肉生物型嫩化劑及其制備方法和應(yīng)用，該牛肉生物型嫩化劑用于肉類制品的嫩化效果明顯、安全、可控。為解決上述技術(shù)問題，提供了一種牛肉生物型嫩化劑，由解淀粉芽孢桿菌菌株經(jīng)活化、發(fā)酵培養(yǎng)制備得到；所述解淀粉芽孢桿菌菌株為解淀粉芽孢桿菌D7(Bacillusamyloliquefaciens)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏時間為：2016年11月10日，保藏編號為CGMCCNo.13250。做為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了上述牛肉生物型嫩化劑的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：S1、將解淀粉芽孢桿菌菌株接種到肉湯培養(yǎng)基中活化得到活化液；S2、將所述活化液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)得到牛肉生物型嫩化劑。上述的制備方法，優(yōu)選的，所述制備方法還包括：將所述牛肉生物型嫩化劑進(jìn)行低溫冷凍干燥，制成活菌粉。上述的制備方法，優(yōu)選的，所述低溫冷凍干燥的溫度是﹣40℃，時間為8h～10h。上述的制備方法，優(yōu)選的，所述S1步驟中，所述活化具體為：在37℃下，以220r/min搖床培養(yǎng)12h～14h。上述的制備方法，優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分包括：10～20g/L的葡萄糖、10～20g/L的酵母浸出汁、1～3g/L的NaCl、2g/L的CaCl、5g/L的磷酸氫二鉀、1.25g/L的磷酸二氫鉀、0.01g/L的硫酸鎂、0.001g/L的硫酸鐵；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7.0～7.66。上述的制備方法，優(yōu)選的，所述S2步驟中，所述活化液的接種量為3％。上述的制備方法，優(yōu)選的，所述S2步驟中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的具體過程為：在30℃～37℃下以220r/min轉(zhuǎn)速搖床培養(yǎng)47h～49.2h。作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了上述牛肉生物型嫩化劑或上述制備方法制備得到牛肉生物型嫩化劑在嫩化牛肉中的應(yīng)用。上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述應(yīng)用方法為：在牛肉生物型嫩化劑中加入氯化鈉得到混合液，將牛肉浸漬在所述混合液中，30min～110min后取出，浸漬溫度為25℃～37℃，所述混合液中氯化鈉的濃度為0.01g/mL～0.05g/mL。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：(1)本發(fā)明提供了一種牛肉生物型嫩化劑，通過解淀粉芽孢桿菌D7發(fā)酵培養(yǎng)得到，該菌株分離自貴州傳統(tǒng)豆豉和甜酒曲中，可產(chǎn)生透明圈，這就說明說明此菌株具有產(chǎn)蛋白酶的能力，對牛肉嫩化效果明顯，具有較高的食用安全性，有較大的潛力開發(fā)成商業(yè)化的食品嫩化劑。(2)本發(fā)明提供了牛肉生物型嫩化劑的制備方法，將解淀粉芽孢桿菌D7接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，所采用的發(fā)酵培養(yǎng)基可顯著提高解淀粉芽孢桿菌D7的活性，進(jìn)而提高牛肉生物型嫩化劑的嫩化效果。(3)本發(fā)明提供了一種牛肉生物型嫩化劑在牛肉嫩化中的應(yīng)用，對浸泡牛肉的溫度、時間、氯化鈉添加量進(jìn)行考察，以蒸餾水浸泡的牛肉為對比例組，顯示在合適的溫度、浸泡時間和綠化鈉添加量的條件下，對解淀粉芽孢桿菌D7的活性有顯著提高，進(jìn)而提高牛肉生物型嫩化劑的嫩化效果。解淀粉芽孢桿菌D7(Bacillusamyloliquefaciens)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.13250，保藏日期：2016年11月10日；保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。具體實施方式以下結(jié)合具體優(yōu)選的實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實施例以下實施例中所采用的材料和儀器均為市售。其中解淀粉芽孢桿菌D7(Bacillusamyloliquefaciens)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.13250，保藏日期：2016年11月10日；保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。實施例1一種牛肉生物型嫩化劑的制備方法，包括以下步驟：(1)從貴州傳統(tǒng)豆豉和甜酒曲中分離解淀粉芽孢桿菌。該菌株呈白色，光滑濕潤菌落，稍隆起，菌落中間有褶皺，為有芽孢革蘭氏陽性桿菌，且周邊會產(chǎn)生清晰可見的透明圈。在斜面上呈薄膜狀，表面白色。(2)將菌株用分離培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)，37℃生化培養(yǎng)基箱培養(yǎng)24h，而后將其進(jìn)行斜面保存。分離培養(yǎng)基配方：蛋白胨：10g、葡萄糖：1g、NaCl：5g、CaCl：0.1g、L-酪氨酸：0.1g、瓊脂：15g、干酪素：5g、蒸餾水：1000ml；pH值：7.2～7.4。(3)挑取斜面培養(yǎng)基中解淀粉芽孢桿菌菌株，接種到肉湯培養(yǎng)基中，在37℃下，以220r/min搖床培養(yǎng)12h，活化得到活化液。(4)將活化液按照接種量為3％接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃下以220r/min搖床培養(yǎng)48h，得到牛肉生物型嫩化劑，該牛肉生物型嫩化劑的酶活達(dá)到101.26U/g。發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖：20g、酵母浸出汁：10g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氫二鉀：5g、磷酸二氫鉀：1.25g、硫酸鎂：0.01g、硫酸鐵：0.001g、蒸餾水：1000mL、pH值：7.0。實施例2一種牛肉生物型嫩化劑的制備方法，其中發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖：10g、酵母浸出汁：15g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氫二鉀：5g、磷酸二氫鉀：1.25g、硫酸鎂：0.01g、硫酸鐵：0.001g、蒸餾水：1000mL、pH值：7.0。其余步驟與實施例1相同，培養(yǎng)后得到的牛肉生物型嫩化劑的酶活為108.29U/g。實施例3一種牛肉生物型嫩化劑的制備方法，其中發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖：20g、酵母浸出汁：10g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氫二鉀：5g、磷酸二氫鉀：1.25g、硫酸鎂：0.01g、硫酸鐵：0.001g、蒸餾水：1000mL、pH值：7.5。其余步驟與實施例1相同，培養(yǎng)后得到的牛肉生物型嫩化劑的酶活為93.21U/g。實施例4一種牛肉生物型嫩化劑的制備方法，其中發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖：16.8g、酵母浸出汁：20g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氫二鉀：5g、磷酸二氫鉀：1.25g、硫酸鎂：0.01g、硫酸鐵：0.001g、蒸餾水：1000mL、pH值：7.66。其余步驟與實施例1相同，培養(yǎng)后得到的牛肉生物型嫩化劑的酶活為111.96U/g。分別將牛肉浸泡在實施例1～4的牛肉生物型嫩化劑中，并以蒸餾水作為對比，測定牛肉的硬度值，測定結(jié)果參見表1。表1：不同培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的牛肉生物型嫩化劑對牛肉硬度值的影響組別蒸餾水組實施例1實施例2實施例3實施例4硬度12392.6±651.18712.0±143.28380.3±186.88848.2±700.77537.0±339.86從表1的結(jié)果可知：實施例1至4的牛肉生物型嫩化劑可顯著降低牛肉的硬度，其中實施例1中牛肉的硬度相對于蒸餾水組下降了29.7％、實施例2下降了32.4％、實施例3下降了28.6％、實施例4下降了38.8％。實施例5一種牛肉生物型嫩化劑的制備方法，包括以下步驟：(1)挑取實施例1斜面培養(yǎng)基中解淀粉芽孢桿菌菌株，接種到肉湯培養(yǎng)基中，在37℃下，以220r/min搖床培養(yǎng)12h，活化得到活化液。(2)將活化液按照接種量為3％接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中得到混合液，取50mL上述混合液于250mL的錐形瓶中(即裝液量為50mL)，在31℃下以220r/min搖床培養(yǎng)48h得到牛肉生物型嫩化劑。該牛肉生物型嫩化劑的酶活達(dá)到100.72U/g。發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖：20g、酵母浸出汁：10g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氫二鉀：5g、磷酸二氫鉀：1.25g、硫酸鎂：0.01g、硫酸鐵：0.001g、蒸餾水：1000mL、pH值：7.0。實施例6一種牛肉生物型嫩化劑的制備方法，其中步驟(3)的搖床培養(yǎng)條件是：接種量3％、轉(zhuǎn)速220r/min、裝液量50mL、時間48h、溫度37℃，其余步驟與實施例5一致。培養(yǎng)后得到的牛肉生物型嫩化劑的酶活為88.34U/g。實施例7一種牛肉生物型嫩化劑的制備方法，其中步驟(3)的搖床培養(yǎng)條件是：接種量3％、轉(zhuǎn)速220r/min、裝液量70mL、時間48h、溫度37℃，其余步驟與實施例5一致。培養(yǎng)后得到的牛肉生物型嫩化劑的酶活為89.7U/g。實施例8一種牛肉生物型嫩化劑的制備方法，其中步驟(3)的搖床培養(yǎng)條件是：接種量3％、轉(zhuǎn)速220r/min、裝液量71.3mL、時間49.2h、溫度30.8℃，其余步驟與實施例5一致。培養(yǎng)后得到的牛肉生物型嫩化劑的酶活為125.55U/g。分別牛肉浸泡在實施例5～8的牛肉生物型嫩化劑中，并以蒸餾水作為對比，測定牛肉的硬度值，測定結(jié)果參見表2。表2：不同培養(yǎng)條件得到的牛肉生物型嫩化劑對牛肉硬度值的影響組別蒸餾水組實施例5實施例6實施例7實施例8硬度13209.7±142.99058.7±121.69501.6±736.49091.4±199.57299.83±522.1從表2的結(jié)果可知：實施例5至8的牛肉生物型嫩化劑可顯著降低牛肉的硬度，其中實施例5中牛肉的硬度相對于蒸餾水組下降了31.4％、實施例6下降了28.1％、實施例7下降了31.2％、實施例8下降了45.9％。實施例9一種牛肉生物型嫩化劑的制備方法，包括以下步驟：(1)挑取實施例1斜面培養(yǎng)基中解淀粉芽孢桿菌D7菌株，接種到肉湯培養(yǎng)基中，在37℃下，以220r/min搖床培養(yǎng)12h，活化得到活化液。(2)將活化液按照接種量為3％接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中得到混合液，在30.8℃下以220r/min搖床培養(yǎng)49h得到牛肉生物型嫩化劑。該牛肉生物型嫩化劑的酶活達(dá)到125.55U/g。發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖：20g、酵母浸出汁：10g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氫二鉀：5g、磷酸二氫鉀：1.25g、硫酸鎂：0.01g、硫酸鐵：0.001g、蒸餾水：1000mL、pH值：7.0?？疾旖n時間對牛肉嫩化效果的影響：將實施例9的牛肉生物型嫩化劑應(yīng)用于牛肉嫩化，具體步驟為：將牛肉浸漬于牛肉生物型嫩化劑中30min、50min、70min、90min、110min(浸泡過程中溫度為27℃)；并以蒸餾水作為空白對照?？疾炫Ｈ獾挠捕取？疾旖Y(jié)果參見表3。表3：不同浸泡時間對牛肉硬度的影響組別蒸餾水組30min50min硬度15159.24±476.92a13212.39±619.1b9920.63±453.48d組別70min90min110min硬度10872.49±197.98cd12745.5±622.5bc13445.28±264.99b表3中a、b、c、d表示差異顯著(p<0.05)。從表3的結(jié)果可知：將牛肉浸泡在牛肉生物型嫩化劑中，當(dāng)浸泡時間在50min以后，其牛肉的嫩化效果明顯，相比于浸泡在蒸餾水中的牛肉，其硬度降低了34.6％?？疾旖n溫度對牛肉嫩化效果的影響：將實施例9的牛肉生物型嫩化劑應(yīng)用于牛肉嫩化，具體步驟為：將牛肉分為6份，取5份牛肉分別浸漬于溫度為25℃、28℃、31℃、34℃、37℃的牛肉生物型嫩化劑中，并以蒸餾水作為空白對照。于50min后取出，考察牛肉的硬度，考察結(jié)果參見表4。表4：不同浸泡溫度對牛肉硬度的影響組別蒸餾水組25℃28℃硬度15159.24±476.92a11382.24±300.32bc10738.5±915.5c組別31℃34℃37℃硬度11885.3±959.1bc11579.02±340.6bc12561.5±270.23b表4中a、b、c表示同一數(shù)列上差異顯著(p<0.05)。從表4的結(jié)果可知，將牛肉浸泡在牛肉生物型嫩化劑中，當(dāng)浸泡溫度在28℃時，其牛肉的嫩化效果明顯，相比于蒸餾水組的牛肉，其硬度降低了29.2％?？疾炻然c添加量對牛肉硬度的影響：將實施例9的牛肉生物型嫩化劑應(yīng)用于牛肉嫩化，具體步驟為：將牛肉平均分為5份，分別加入1％(W/V)、2％(W/V)、3％(W/V)、4％(W/V)、5％(W/V)的氯化鈉，分別將牛肉浸泡于其中，浸泡溫度為27℃，浸泡時間為50min，并以蒸餾水作為空白對照?？疾炫Ｈ獾挠捕?，考察結(jié)果參見表5。表5：不同氯化鈉添加量對牛肉硬度的影響組別蒸餾水組1％2％硬度15159.24±476.92a14503.26±430.42b12481.89±413.99c組別3％4％5％硬度10179.18±706.0d12408.56±350.72c14671.12±125.81b表5中a、b、c、d表示同一數(shù)列上差異顯著(p<0.05)。從表5的結(jié)果可知，將牛肉浸泡在牛肉生物型嫩化劑中，當(dāng)氯化鈉的添加量為3％時，其牛肉的嫩度效果明顯，相比于蒸餾水組的牛肉，其硬度了32.9％。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制。雖然本發(fā)明已以較佳實施例揭示如上，然而并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神實質(zhì)和技術(shù)方案的情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實施例。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所做的任何簡單修改、等同替換、等效變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3