本發(fā)明屬于工業(yè)微生物發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種利用木糖母液發(fā)酵產(chǎn)丁二酸所用的菌株及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
：丁二酸(Succinicacid)，又稱琥珀酸(butanedioicacid)，是一種常見的天然有機(jī)酸，最初1546年由Georgius從琥珀中分離發(fā)現(xiàn)，因而得名。丁二酸的分子式為C4H6O4，分子量為118.09，味酸，相對密度為1.572，熔點為188℃，沸點235℃(分解溫度)。丁二酸一種重要的C4平臺化合物，是1,4-丁二醇、四氫呋喃、γ-丁內(nèi)酯、N-甲基吡咯烷酮、己二酸等重要大宗化學(xué)品和專用化學(xué)品的基本原料，廣泛應(yīng)用于食品、塑料、醫(yī)藥、香料等工業(yè)，可以取代苯合成250種以上的化工產(chǎn)品。其中最具有發(fā)展前景的領(lǐng)域為合成塑料，它是合成聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚乙二醇丁二酸酯(PES)、聚丙二醇丁二酸酯(PPS)等可生物降解高分子材料的主要原料。目前，丁二酸的主要生產(chǎn)方法是以石油為原料化學(xué)法合成，不僅需要消耗大量不可再生的石化原料，生產(chǎn)成本較高，而且環(huán)境污染嚴(yán)重。與化學(xué)合成法相比，微生物發(fā)酵法具有以下優(yōu)點：(1)原料為價格低廉、可再生的生物質(zhì)資源；(2)發(fā)酵過程中可吸收大量CO2，綠色環(huán)保；(3)發(fā)酵條件溫和。因此，微生物發(fā)酵法近年來備受矚目，成為近年來國內(nèi)外的研究熱點。目前，有關(guān)發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的所用的原料除葡萄糖外，主要為糧食原料，如美國Argonne實驗室進(jìn)行了玉米生產(chǎn)丁二酸研究，日本味之素和三菱化學(xué)公司共同聯(lián)合開展以玉米淀粉為原料發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的研究。但由于近幾年糧食原料的生物工業(yè)的蓬勃發(fā)展，糧食出現(xiàn)短缺，價格上漲趨勢明顯，此外過度依賴糧食也會影響國家的糧食安全，所以使用價格低廉的農(nóng)業(yè)廢棄物為原料進(jìn)行丁二酸發(fā)酵是降低丁二酸生產(chǎn)成本的關(guān)鍵之一。非糧淀粉原料(木薯、芭蕉芋、浮萍等)、甘蔗糖蜜、乳清及纖維素等被用來生產(chǎn)丁二酸。目前，與化學(xué)合成法相比，微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的成本仍然偏高，需要進(jìn)一步探索更為低廉的原料。木糖母液是以玉米芯、甘蔗渣等纖維素原料提取木糖過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，價格十分低廉。通常狀況下，每生產(chǎn)1噸結(jié)晶木糖可產(chǎn)生1.5噸的木糖母液。木糖母液中含有高達(dá)60％左右的混合糖，主要是木糖、阿拉伯糖及少量的葡萄糖，具有較強(qiáng)的開發(fā)應(yīng)用潛力。中國專利CN104789606A公開了一種利用木糖母液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，其利用重組大腸桿菌(E.coli)發(fā)酵木糖母液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，發(fā)酵過程中需要對木糖母液進(jìn)行脫毒預(yù)處理，不僅增加了生產(chǎn)成本，而且預(yù)處理過程會造成糖類損失。此外，所采用的菌種為大腸桿菌基因工程菌株，存在菌株不穩(wěn)定性及發(fā)酵過程產(chǎn)生內(nèi)毒素等缺點，限制了其應(yīng)用范圍。中國專利201010310881.0公開了一種利用農(nóng)作物秸稈發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，以秸稈酶解液和木糖母液的混合液作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，由于秸稈酶解液制備需要經(jīng)過堿煮、分離、酶解等步驟，工藝復(fù)雜，酶解時間長，成本高，而且木糖母液使用的量少，濃度低，木糖母液的利用率不高。中國專利200910089501.0公開了一種利用玉米芯生產(chǎn)丁二酸的方法，利用玉米芯水解分離得到的第一糖液、第二糖液或第一糖液的母液中的一種或多種，采用丁二酸生產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵得到丁二酸。當(dāng)采用第一糖液的母液進(jìn)行發(fā)酵時，丁二酸的產(chǎn)率僅為5.46％，產(chǎn)率極低，不能達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有丁二酸發(fā)酵生產(chǎn)中原料成本高、產(chǎn)量低、工藝復(fù)雜的問題，提供一種利用木糖母液發(fā)酵產(chǎn)丁二酸所用的菌株及其生產(chǎn)方法，本發(fā)明的方法成本低、產(chǎn)量高，工藝簡單，丁二酸產(chǎn)量最高可達(dá)95g/L，丁二酸產(chǎn)率最高為85％。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：一種利用木糖母液發(fā)酵產(chǎn)丁二酸所用的菌株，該菌株為產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)PZ，保藏編號為：CCTCCNO:M2016396。本發(fā)明產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)PZ，保藏日期為2016年7月19日，保藏單位全稱為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱為CCTCC，保藏單位地址：中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCCNO:M2016396。本發(fā)明還提供一種利用木糖母液發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法，包括應(yīng)用保藏編號為CCTCCNO:M2016396的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。運用本發(fā)明得到的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌，將木糖母液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，包括以下步驟：將平板上的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌PZ單菌落接入種子培養(yǎng)基中，在厭氧培養(yǎng)箱或普通培養(yǎng)箱中36-38℃培養(yǎng)16-20h，菌數(shù)達(dá)3億以上，再按照5％(V/V)接種量進(jìn)行二級擴(kuò)繁培養(yǎng)8h，菌數(shù)達(dá)3億以上，即得到液態(tài)種子；按5-15％(V/V)的接種量將液態(tài)種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，利用pH緩沖劑調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH維持在6.5-7.0，在充滿N2或CO2的環(huán)境中，轉(zhuǎn)速100-200r/min，溫度為36-38℃，分批發(fā)酵或分批補料發(fā)酵30-72h，即得丁二酸。作為本發(fā)明的進(jìn)一步說明，所述種子培養(yǎng)基的成分及濃度為：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米漿4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。作為本發(fā)明的進(jìn)一步說明，分批發(fā)酵時所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及濃度為：木糖母液總糖30-100g/L，氮源5-20g/L，磷酸二氫鉀2-10g/L，碳酸氫鈉2-10g/L，氯化鈣0.3-1.0g/L，氯化鎂0.3-1.0g/L，所述木糖母液的總糖濃度為50-80％(W:V)。作為本發(fā)明的進(jìn)一步說明，分批補料發(fā)酵時所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及濃度為：木糖母液初始總糖30-40g/L，氮源5-20g/L，磷酸二氫鉀2-10g/L，碳酸氫鈉2-10g/L，氯化鈣0.3-1.0g/L，氯化鎂0.3-1.0g/L，發(fā)酵過程中間歇流加總糖濃度為200-300g/L的木糖母液，控制發(fā)酵液的總糖為30-35g/L，所述木糖母液的總糖濃度為50-80％(W:V)。作為本發(fā)明的進(jìn)一步說明，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源為玉米漿、酵母粉、大豆粉、花生餅粉中的一種或幾種以任意比例混合。作為本發(fā)明的進(jìn)一步說明，所述pH調(diào)節(jié)劑為堿式碳酸鎂、碳酸鈉、氫氧化鎂、氫氧化鈉中的一種或幾種以任意比例混合，總濃度為20-80g/L。作為本發(fā)明的進(jìn)一步說明，分批發(fā)酵時所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及濃度為：木糖母液總糖40g/L，玉米漿12g/L，磷酸二氫鉀6g/L，碳酸氫鈉6g/L，氯化鈣0.6g/L，氯化鎂0.7g/L，所述木糖母液的總糖濃度為60％(W:V)。作為本發(fā)明的進(jìn)一步說明，分批補料發(fā)酵時所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及濃度為：木糖母液初始總糖40g/L，玉米漿20g/L，磷酸二氫鉀10g/L，碳酸氫鈉10g/L，氯化鈣1.0g/L，氯化鎂1.0g/L，發(fā)酵過程中間歇流加總糖濃度為300g/L的木糖母液，控制發(fā)酵液的總糖為35g/L，所述木糖母液的總糖濃度為80％(W:V)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果為：1、本發(fā)明利用工業(yè)廢棄物木糖母液代替昂貴的葡萄糖或者糧食作物作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，一方面節(jié)約了大量的糧食，保障我國糧食安全，降低生產(chǎn)成本，另一方面實現(xiàn)了木糖母液高效資源化利用，對資源的優(yōu)化和環(huán)境保護(hù)方面具有重要的意義。2、本發(fā)明以木糖母液為原料發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，不需要進(jìn)行脫毒處理，也不需要配合其他碳源共同發(fā)酵，生產(chǎn)方法簡單、高效，丁二酸產(chǎn)量最高可達(dá)95g/L，丁二酸產(chǎn)率最高為85％。附圖說明圖1為發(fā)酵培養(yǎng)基中不同氮源發(fā)酵產(chǎn)丁二酸及其副產(chǎn)物的產(chǎn)量圖。具體實施方式以下是產(chǎn)琥珀酸放線桿菌CCTCCNO:M2016396的選育、鑒定、利用木糖母液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的具體實施例。實施例1產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的選育和鑒定1、產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的定向進(jìn)化選育的方法為：先利用10g/L的甘油替換種子液的葡萄糖為碳源作為定向進(jìn)行的培養(yǎng)基，接種后放置于厭氧培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)12-18h進(jìn)行傳代，培養(yǎng)7-10天后甘油濃度增加至20g/L，依次類推，大約馴化90天后，培養(yǎng)基的甘油濃度可提高至80g/L，選育獲得一株產(chǎn)琥珀酸放線桿菌PZ，該菌株可在甘油濃度80g/L培養(yǎng)集中生長良好。同時發(fā)現(xiàn)產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)PZ可以在100g/L的木糖母液中生長較好，并可以發(fā)酵產(chǎn)高濃度丁二酸。2、將上述選育得到的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌PZ進(jìn)行16SrDNA基因鑒定，以及按照《伯杰式細(xì)菌鑒定手冊》進(jìn)行生理生化鑒定，鑒定結(jié)果為：產(chǎn)琥珀酸放線桿菌PZ與菌株產(chǎn)琥珀酸放線桿菌GXAS137相似度為100％，與菌株產(chǎn)琥珀酸放線桿菌130Z相似度為99.5％。經(jīng)過形態(tài)及生理、生化鑒定：產(chǎn)琥珀酸放線桿菌PZ屬于革蘭氏陰性菌，兼性厭氧，細(xì)胞呈短桿狀，無鞭毛，無芽孢，不運動，也不產(chǎn)生孢子，能利用常見的大多數(shù)碳源產(chǎn)丁二酸。由以上鑒定結(jié)果，可以認(rèn)定產(chǎn)琥珀酸放線桿菌PZ屬于巴斯德菌屬科(Pasteurellaceae)放線桿菌屬(Actinobacillus)的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)?，F(xiàn)已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱為CCTCC，保藏單位地址：中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCCNO:M2016396，保藏日期為2016年7月19日。實施例2一種利用木糖母液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，包括以下步驟：將平板上的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌PZ單菌落接入種子培養(yǎng)基中，在厭氧培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)16h，菌數(shù)達(dá)3億以上，再按照5％(V/V)接種量進(jìn)行二級擴(kuò)繁培養(yǎng)8h，菌數(shù)達(dá)3億以上，即得到液態(tài)種子；按5％(V/V)的接種量將液態(tài)種子接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL厭氧瓶中，裝液量為150mL，利用pH緩沖劑調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH維持在6.5-7.0，在充滿N2的環(huán)境中，轉(zhuǎn)速100r/min，溫度為36℃，分批發(fā)酵30h，即得丁二酸。所述種子培養(yǎng)基的成分及濃度為：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米漿4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及濃度為：木糖母液總糖30g/L，氮源5g/L，磷酸二氫鉀2g/L，碳酸氫鈉2g/L，氯化鈣0.3g/L，氯化鎂0.3g/L，所述木糖母液的總糖濃度為50％(W:V)。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源為玉米漿、酵母粉、大豆粉、花生餅粉以任意比例混合。所述pH調(diào)節(jié)劑為堿式碳酸鎂和碳酸鈉以任意比例混合，總濃度為20g/L。本實施例丁二酸的產(chǎn)量為22.73g/L，產(chǎn)率為75.77％。丁二酸產(chǎn)率(％)定義為：每消耗1g木糖所產(chǎn)生丁二酸的克數(shù)。本發(fā)明分析方法：樣品處理：發(fā)酵液在室溫下12000r/min，離心10min，取上清，然后用孔徑為0.22μm的無菌濾膜過濾，用高效液相色譜(HPLC)檢測發(fā)酵液丁二酸及殘還原糖濃度。有機(jī)酸測定：HPLC法，戴安Utimat3000，自動進(jìn)樣器，色譜柱：RezexROA-organicacid300×7.8mm，流動相2.5mmol/LH2SO4，pH2.5，柱溫45℃，進(jìn)樣量10uL，流速0.6mL/min，紫外檢測器波長210nm。生物量測定：采用分光光度計(DU800UV/VISSpectrophotometer,Beckman,USA)在660nm進(jìn)行測定，樣品先用0.2MHCl進(jìn)行處理，溶解所含的MgCO3，12000r/min離心10min，再用蒸餾水洗三次，以除去所含的色素及雜質(zhì)。實施例3一種利用木糖母液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，包括以下步驟：將平板上的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌PZ單菌落接入種子培養(yǎng)基中，在普通培養(yǎng)箱中38℃培養(yǎng)20h，菌數(shù)達(dá)3億以上，再按照5％(V/V)接種量進(jìn)行二級擴(kuò)繁培養(yǎng)8h，菌數(shù)達(dá)3億以上，即得到液態(tài)種子；按15％(V/V)的接種量將液態(tài)種子接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL厭氧瓶中，裝液量為150mL，利用pH緩沖劑調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH維持在6.5-7.0，在充滿CO2的環(huán)境中，轉(zhuǎn)速200r/min，溫度為38℃，分批發(fā)酵72h，即得丁二酸。所述種子培養(yǎng)基的成分及濃度為：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米漿4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及濃度為：木糖母液總糖100g/L，氮源20g/L，磷酸二氫鉀10g/L，碳酸氫鈉10g/L，氯化鈣1.0g/L，氯化鎂1.0g/L，所述木糖母液的總糖濃度為80％(W:V)。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源為玉米漿和酵母粉以任意比例混合。所述pH調(diào)節(jié)劑為堿式碳酸鎂、碳酸鈉、氫氧化鎂、氫氧化鈉以任意比例混合，總濃度為80g/L。本實施例丁二酸的產(chǎn)量為33.65g/L，產(chǎn)率為33.65％。實施例4一種利用木糖母液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，包括以下步驟：將平板上的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌PZ單菌落接入種子培養(yǎng)基中，在普通培養(yǎng)箱中36℃培養(yǎng)18h，菌數(shù)達(dá)3億以上，再按照5％(V/V)接種量進(jìn)行二級擴(kuò)繁培養(yǎng)8h，菌數(shù)達(dá)3億以上，即得到液態(tài)種子；按10％(V/V)的接種量將液態(tài)種子接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL厭氧瓶中，裝液量為150mL，利用pH緩沖劑調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH維持在6.5-7.0，在充滿CO2的環(huán)境中，轉(zhuǎn)速200r/min，溫度為37℃，分批發(fā)酵40h，即得丁二酸。所述種子培養(yǎng)基的成分及濃度為：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米漿4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及濃度為：木糖母液總糖40g/L，氮源12g/L，磷酸二氫鉀6g/L，碳酸氫鈉6g/L，氯化鈣0.6g/L，氯化鎂0.7g/L，所述木糖母液的總糖濃度為60％(W:V)。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源為玉米漿。所述pH調(diào)節(jié)劑是堿式碳酸鎂，總濃度為50g/L。本實施例丁二酸的產(chǎn)量為33.72g/L，產(chǎn)率為84.30％。實施例5一種利用木糖母液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，包括以下步驟：將平板上的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌PZ單菌落接入種子培養(yǎng)基中，在厭氧培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)16h，菌數(shù)達(dá)3億以上，再按照5％(V/V)接種量進(jìn)行二級擴(kuò)繁培養(yǎng)8h，菌數(shù)達(dá)3億以上，即得到液態(tài)種子；按5％(V/V)的接種量將液態(tài)種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，采用2L發(fā)酵罐發(fā)酵，裝液量為1200mL，利用pH緩沖劑調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH維持在6.5-7.0，在充滿N2的環(huán)境中，轉(zhuǎn)速100r/min，溫度為36℃，分批補料發(fā)酵30h，即得丁二酸。所述種子培養(yǎng)基的成分及濃度為：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米漿4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及濃度為：木糖母液初始總糖為30g/L，氮源5g/L，磷酸二氫鉀2g/L，碳酸氫鈉2g/L，氯化鈣0.3g/L，氯化鎂0.3g/L，發(fā)酵過程中間歇流加總糖濃度為200g/L的木糖母液，控制發(fā)酵液的總糖為30g/L，所述木糖母液的總糖濃度為50％(W:V)。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源為玉米漿和大豆粉以任意比例混合。所述pH調(diào)節(jié)劑為堿式碳酸鎂和氫氧化鎂以任意比例混合，總濃度為20g/L。本實施例丁二酸的產(chǎn)量為23.01g/L，產(chǎn)率為76.70％。實施例6一種利用木糖母液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，包括以下步驟：將平板上的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌PZ單菌落接入種子培養(yǎng)基中，在普通培養(yǎng)箱中38℃培養(yǎng)20h，菌數(shù)達(dá)3億以上，再按照5％(V/V)接種量進(jìn)行二級擴(kuò)繁培養(yǎng)8h，菌數(shù)達(dá)3億以上，即得到液態(tài)種子；按15％(V/V)的接種量將液態(tài)種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，采用2L發(fā)酵罐發(fā)酵，裝液量為1200mL，利用pH緩沖劑調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH維持在6.5-7.0，在充滿CO2的環(huán)境中，轉(zhuǎn)速200r/min，溫度為37℃，分批補料發(fā)酵72h，即得丁二酸。所述種子培養(yǎng)基的成分及濃度為：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米漿4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及濃度為：木糖母液初始總糖為40g/L，氮源20g/L，磷酸二氫鉀10g/L，碳酸氫鈉10g/L，氯化鈣1.0g/L，氯化鎂1.0g/L，發(fā)酵過程中間歇流加總糖濃度為300g/L的木糖母液，控制發(fā)酵液的總糖為35g/L，最終發(fā)酵液的總糖濃度達(dá)到120g/L，所述木糖母液的總糖濃度為80％(W:V)。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源為玉米漿、酵母粉、大豆粉和花生餅粉以任意比例混合。所述pH調(diào)節(jié)劑為堿式碳酸鎂、碳酸鈉、氫氧化鎂、氫氧化鈉以任意比例混合，總濃度為80g/L。本實施例丁二酸的產(chǎn)量為94.34g/L，產(chǎn)率為78.62％。實施例7一種利用木糖母液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，包括以下步驟：將平板上的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌PZ單菌落接入種子培養(yǎng)基中，在普通培養(yǎng)箱中36℃培養(yǎng)18h，菌數(shù)達(dá)3億以上，再按照5％(V/V)接種量進(jìn)行二級擴(kuò)繁培養(yǎng)8h，菌數(shù)達(dá)3億以上，即得到液態(tài)種子；按10％(V/V)的接種量將液態(tài)種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，采用2L發(fā)酵罐發(fā)酵，裝液量為1200mL，利用pH緩沖劑調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH維持在6.5-7.0，在充滿CO2的環(huán)境中，轉(zhuǎn)速200r/min，溫度為37℃，分批補料發(fā)酵70h，即得丁二酸。所述種子培養(yǎng)基的成分及濃度為：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米漿4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及濃度為：木糖母液初始總糖為35g/L，氮源12g/L，磷酸二氫鉀6g/L，碳酸氫鈉6g/L，氯化鈣0.7g/L，氯化鎂0.8g/L，發(fā)酵過程中間歇流加總糖濃度為250g/L的木糖母液，控制發(fā)酵液的總糖為35g/L，最終發(fā)酵液的總糖濃度達(dá)到100g/L，所述木糖母液的總糖濃度為65％(W:V)。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源為玉米漿、。所述pH調(diào)節(jié)劑是堿式碳酸鎂，濃度為60g/L。本實施例丁二酸的產(chǎn)量為79.56g/L，產(chǎn)率為79.56％。實施例8產(chǎn)琥珀酸放線桿菌CCTCCNO:M2016396木糖母液耐受性試驗將不同編號的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌菌株接入種子培養(yǎng)基中，在厭氧培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)16h，再按照5％(V/V)接種量接入含不同濃度的木糖母液的種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h后，觀察不同編號產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的生長狀況，結(jié)果如表1。表1不同產(chǎn)琥珀酸放線桿菌菌株木糖母液耐受性試驗總糖(g/L)A.succinogenesPZA.succinogenesGXAS137A.succinogenes130Z30+++++++++40+++++++++50++++++++60++++++70++++-80+++--90++--100++--其中：+++表示生長良好，++表示生長較好，+表示略有生長，—表示無法生長。從表1可以看出：產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)PZ對木糖母液的耐受性較好，在木糖母液初始總糖為100g/L時，仍生長較好，而菌株A.succinogenesGXAS137和A.succinogenes130Z無法生長。實施例9最適木糖母液初始總糖濃度試驗將產(chǎn)琥珀酸放線桿菌PZ菌株接入種子培養(yǎng)基中，在厭氧培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)16h，再按照5％(V/V)接種量進(jìn)行二級擴(kuò)繁培養(yǎng)8h，即得到液態(tài)種子。按8％(V/V)的接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL厭氧瓶中，裝液量為150mL，分別添加不同總糖濃度的木糖母液，再添加酵母粉14g/L、磷酸二氫鉀6g/L、碳酸氫鈉6g/L、氯化鈣0.7g/L、氯化鎂0.8g/L，添加50g/L的堿式碳酸鎂調(diào)節(jié)pH在6.5-7.0，置于培養(yǎng)箱中37℃分批發(fā)酵60h。實驗結(jié)果如表2。表2不同總糖濃度的木糖母液對丁二酸產(chǎn)量的影響從表2可以看出：不同總糖濃度的木糖母液對分批發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸產(chǎn)量影響較大，初始總糖濃度為70g/L時，丁二酸的產(chǎn)量最高，達(dá)到48.06g/L。實施例10不同氮源發(fā)酵試驗按照實施例9中產(chǎn)琥珀酸放線桿菌PZ發(fā)酵木糖母液產(chǎn)丁二酸的方法，初始總糖濃度為70g/L，添加不同種類的氮源，總氮添加量為15g/L，對照不添加任何氮源，接種量為8％(V/V)，接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL厭氧瓶中，裝液量為150mL，置于培養(yǎng)箱中37℃分批發(fā)酵60h，丁二酸及主要副產(chǎn)物含量，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出：木糖母液不添加氮源進(jìn)行丁二酸發(fā)酵時，丁二酸產(chǎn)量只有2.36g/L，最適氮源為酵母粉和玉米漿，丁二酸產(chǎn)量分別為46.68g/L、45.37g/L，其次為蛋白胨產(chǎn)量為29.98g/L、牛肉膏產(chǎn)量為22.08g/L，尿素為氮源時效果較差，丁二酸產(chǎn)量只有2.57g/L?？紤]到丁二酸生產(chǎn)成本及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)等因素，選取玉米漿為氮源，與酵母粉為氮源相比，可顯著降低丁二酸的生產(chǎn)成本。當(dāng)前第1頁1 2 3