本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術領域，尤其涉及一種靶向PD-1的融合蛋白及其相關應用。

背景技術：

腫瘤可以通過多種抑制免疫系統(tǒng)及其效應因子的機制來達到免疫逃逸的目的。基于對腫瘤生物學和免疫學原則的不斷深入研究，提高抗腫瘤細胞免疫功能和消除腫瘤細胞對免疫細胞抑制性因素，已發(fā)展成為免疫治療的重要策略。在抗腫瘤免疫反應體系中，T細胞作為重要的參與者其反應效應和反應強度受多種共刺激信號和共抑制信號所調控，而其中介導抑制信號的即被稱為免疫檢查點。

近年來對于免疫檢查點與腫瘤免疫逃逸關系的研究越來越深入，包括免疫檢查點分子的結構與功能、信號通路、腫瘤表達譜與腫瘤預后等研究也越來越廣泛，而其中尤其以PD-1/PD-L為代表的臨床腫瘤免疫治療靶點研究更具應用前景。

作為負性免疫調節(jié)因子的PD-1及其配體PD-L分子，其對于腫瘤的治療效果以及腫瘤預后的重要作用與其受配體相互作用所傳遞的信號通路密切相關。PD-1是一種細胞膜蛋白受體，調節(jié)免疫細胞功能的一個關鍵點，主要表達于激活的T細胞和B細胞以及其他免疫細胞，PD-1在結構上與免疫球蛋白可變區(qū)結構域類似，包括胞外免疫球蛋白可變區(qū)(IgV)樣結構域、疏水跨膜區(qū)和胞內結構域三個部分，功能是抑制T細胞的過度激活，這是免疫系統(tǒng)的一種正常的自穩(wěn)機制，因為過度激活的T/B細胞會導致自身免疫病。腫瘤微環(huán)境會誘導腫瘤浸潤T細胞高表達PD-1分子，同時腫瘤細胞會通過高表達PD-1的配體PD-L1和PD-L2，導致腫瘤微環(huán)境中PD-1信號通路持續(xù)激活，從而抑制T細胞介導的抗腫瘤免疫反應。

免疫檢查點存在的作用是一方面參與維持對自身抗原的免疫耐受，避免自身免疫性疾病，另一方面避免免疫反應的過度激活對機體組織造成的損傷。更重要的是，以PD-1為代表的免疫檢查點分子作為負性免疫調節(jié)分子，在介導腫瘤細胞免疫逃逸中同樣發(fā)揮著重要的作用。由于在正常組織中這些檢查點能夠抑制T細胞的過度反應，而在腫瘤組織中則能夠被腫瘤利用形成免疫逃逸，即腫瘤可以通過免疫檢查點來抑制T細胞激活，從而逃避免疫殺傷反應；反之阻斷這種檢查點所傳到的信號則能解除免疫細胞的抑制狀態(tài)，使其發(fā)揮有效的抗腫瘤作用。

基于此，通過激活機體免疫反應以及解除腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制狀態(tài)是腫瘤免疫治療中的核心策略，其中針對以PD-1為代表的免疫檢查點分子的阻斷是激發(fā)免疫細胞活化的有效策略之一，也是近些年抗腫瘤藥物開發(fā)最熱門靶點。因此，通過構建靶向PD-1的蛋白制劑來有針對性地阻斷PD-1所介導的信號通路進而增強免疫細胞功能不僅是免疫治療的重要策略，也是當前腫瘤治療的急待解決的問題。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決上述技術問題，本發(fā)明的一個目的在于提供一種靶向PD-1的融合蛋白制劑，具體而言，一種能靶向并阻斷PD-1分子從而增強免疫細胞功能的融合蛋白制劑。

本發(fā)明第一方面提供一種靶向PD-1的融合蛋白制劑，所述融合蛋白分別包含氨基端的人程序性細胞死亡配體2胞外段區(qū)域和羧基端的人免疫球蛋白G亞型1恒定區(qū)片段；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本發(fā)明第二方面提供一種靶向PD-1的融合蛋白的編碼核酸，所述核酸序列如SEQ ID NO:2所示。由于一種氨基酸可以有多種密碼子編碼，因此在某些實施方案中，可以根據(jù)實際需要對上述編碼所述融合蛋白分子的DNA核酸序列的密碼子進行突變，特別是使用真核細胞偏好密碼子，但所編碼融合蛋白的氨基酸序列不變。

本發(fā)明第三方面提供一種靶向PD-1的融合蛋白的重組載體，所述重組載體包括SEQ ID NO:2所示的編碼核酸；重組載體可選用真核表達載體或者原核表達載體；優(yōu)選為pcDNA3真核表達載體。

本發(fā)明第四方面提供一種細胞株，所述細胞株經過基因工程改造，所述細胞株包括上述重組載體并能夠穩(wěn)定高效地分泌表達靶向PD-1的融合蛋白；細胞株可選用多種工程細胞株，優(yōu)選人胚腎細胞(293細胞)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)。

本發(fā)明第五方面提供一種靶向PD-1的融合蛋白的制備方法，具體包括如下步驟：

步驟一，將如SEQ ID NO:2所示的編碼核酸導入表達載體，構建重組表達載體；

步驟二，將所述步驟一獲得的重組表達載體轉入宿主細胞，進一步篩選獲得穩(wěn)定高效分泌表達融合蛋白的細胞株；

步驟三，將所述步驟二獲得的細胞株在合適條件下進行擴增培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清并純化獲得融合蛋白。

優(yōu)選地，所述步驟一中合適的載體可選用各種已知的載體，包括真核表達載體或者原核表達載體，進一步優(yōu)選為pcDNA3真核表達載體。

優(yōu)選地，所述步驟二中宿主細胞可選用多種工程細胞株，包括293細胞和CHO細胞，進一步優(yōu)選為CHO細胞。

本發(fā)明第六方面提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本發(fā)明所述的融合蛋白、核酸分子、載體或細胞株中的任一項或幾項；可選地，該組合物還包含藥學上可接受的載體、輔料或賦形劑。

本發(fā)明第七方面提供本發(fā)明所述融合蛋白或核酸分子或載體或細胞株或藥物組合物在制備PD-1靶向藥物以及制備增強免疫細胞功能藥物中的用途；上述免疫細胞主要包括淋巴細胞如T細胞、B細胞、自然殺傷細胞以及樹突狀細胞、單核巨噬細胞，優(yōu)選免疫細胞為T淋巴細胞。

本發(fā)明成功設計并制備了能夠有效靶向并阻斷PD-1分子的融合蛋白制劑，該融合蛋白制劑不僅顯示出特異性結合PD-1的活性，而且還能夠顯著增強免疫細胞本身的增殖活性以及活化水平。值得注意的是，本發(fā)明所述的融合蛋白組成來源于人源性成分，并且在制備過程中不引入其他外源成分，因此，該融合蛋白作為藥物使用沒有其他引起免疫反應的異源成分，對人體幾乎無副作用，具有高度種屬特異性。更為重要的是，該融合蛋白制劑能夠通過與PD-1配體競爭性結合，從而阻斷PD-1傳遞信號來解除免疫細胞的免疫抑制狀態(tài)，維持免疫細胞長效活性。同時，本發(fā)明所述的融合蛋白制劑以及相關的核酸分子、載體、細胞株以及藥物組合物均可用于制備PD-1靶向藥物以及制備增強免疫細胞功能的藥物，不僅為抗腫瘤藥物開發(fā)提供了新的藥物選擇，而且為臨床上以PD-1為靶點的腫瘤免疫治療途徑提供了新的方法與策略。

附圖說明

圖1為融合蛋白PDL2-Ig結構示意圖；

圖2為實施例中融合蛋白穩(wěn)定轉染細胞株的分泌表達鑒定結果；

圖3為實施例中融合蛋白的結合活性檢測結果；

圖4為實施例中融合蛋白的阻斷活性檢測結果；

圖5為實施例中融合蛋白對T細胞增殖活性影響的檢測結果；

圖6為實施例中融合蛋白對T細胞活化水平影響的檢測結果。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明進行詳細和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明，但是下述實施例并不限制本發(fā)明范圍。

實施例1.融合蛋白的設計及構建

本發(fā)明所涉及到的靶向PD-1的融合蛋白的設計結構示意圖如圖1所示，主要包含氨基端的PDL2胞外段序列和羧基端的IgG1Fc序列，融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其所對應的編碼核酸序列如SEQ ID NO:2所示。

將上述設計的融合蛋白全長序列進行合成并且構建入pcDNA3真核表達載體中，進一步通過測序驗證融合基因插入正確，由此得到構建好的重組表達載體。

實施例2.融合蛋白的穩(wěn)定轉染細胞株的構建

將上述構建好的重組表達載體以及對照載體轉染入CHO-K1細胞中，轉染后2天觀察GFP陽性細胞達到20-40％，并使用含G418抗生素的培養(yǎng)基進行加壓篩選培養(yǎng)，每兩天更換含抗生素的新鮮培養(yǎng)基。兩周后觀察GFP陽性細胞率顯著增加，將轉染細胞通過有限稀釋方法進行限定稀釋后按每孔一個細胞接種至多個96孔板中并繼續(xù)加壓篩選培養(yǎng)，培養(yǎng)一周后共得到60～80個單克隆穩(wěn)轉細胞群落。將這些單克隆細胞群落按熒光表達強弱的不同從中挑取20個熒光表達最高的單克隆群落至24孔板以及6孔板中繼續(xù)擴大培養(yǎng)。

將擴大培養(yǎng)的20個單克隆進行流式分析后顯示所有20個單克隆細胞GFP陽性表達率都在99.9％以上，說明這些單克隆細胞具有很好的均一性；同時流式分析結果顯示所有20個單克隆細胞中目的融合蛋白表達陽性率也均在99％以上，說明這20個單克隆穩(wěn)轉細胞株均能夠有效表達目的融合蛋白。

由此已構建好20株表達目的融合蛋白的單克隆穩(wěn)定轉染細胞株。優(yōu)選地，從中挑取A9、C6、D12和G10共四株單克隆細胞株進行后續(xù)蛋白表達工作。

實施例3.融合蛋白的分泌表達及鑒定

收集上述實施例2中所挑選的四株單克隆穩(wěn)轉細胞株，每種細胞計數(shù)后取等量細胞接種至24孔板中，待貼壁后換成不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并分別在培養(yǎng)后40h、44h、48h以及52h等四個不同的時間點收集無血清培養(yǎng)上清樣品并進行目的融合蛋白的Western Blot檢測，檢測結果顯示四株單克隆穩(wěn)轉細胞株在培養(yǎng)40小時后均能有效分泌目的蛋白，并且目的蛋白表達量由強到弱依次為A9>G10>C6>D12。

選取表達量最高的A9和G10兩株單克隆細胞株進行無血清培養(yǎng)以及上清分泌的表達檢測，結果如圖2所示。兩株細胞在四個時間點均能檢測到較高的目的蛋白表達，進一步細化后分析A9單克隆細胞株表達量高于G10單克隆細胞株，而且兩株細胞均在48小時時間點表達量最高。由此，優(yōu)先選擇A9單克隆細胞株作為后續(xù)蛋白表達體系。

進一步地，將A9單克隆細胞株大量擴增后進行無血清培養(yǎng)，48小時候后收集培養(yǎng)上清，使用ProteinA層析柱進行親和層析后得到純化的融合蛋白。

實施例4.融合蛋白的結合活性檢測

為了檢測所制備的融合蛋白與靶分子PD-1是否存在相互作用，首先使用夾心法ELSIA實驗來檢測融合蛋白的結合活性。將PD-1蛋白鋪板后加入適量融合蛋白或對照蛋白溶液，進一步使用融合蛋白的特異性抗體以及辣根過氧化物酶標記的二抗來進行特異性標記，最后加入TMB顯色底物進行顯色后使用酶標儀檢測對照組以及實驗組OD450值。綜合多次重復實驗的統(tǒng)計結果如圖3所示，相比空白組(Blank)和對照蛋白組(Control)的OD450值(0.15±0.01)，融合蛋白組(PDL2-Ig)顯示出很強的結合活性(1.75±0.05)，說明融合蛋白與PD-1靶蛋白存在很強的特異性結合。

實施例5.融合蛋白的阻斷活性檢測

為進一步驗證融合蛋白與細胞膜表面PD-1受體的特異性結合活性，首先將來源于人外周血單個核細胞(PBMC)中的T細胞使用鋪板的CD3抗體進行激活，收集細胞并分別使用對照蛋白和融合蛋白預先處理，最后使用PD-1特異性熒光抗體標記并進行流式檢測。代表性檢測結果如圖4所示，對比對照組和實驗組，活化的T細胞高表達PD-1分子(80％±7％)，經過融合蛋白預先處理后PD-1標記率則降低為(60％±5％)，說明融合蛋白的預先處理能夠部分阻斷PD-1特異性抗體的標記。綜上，融合蛋白不僅顯示出與PD-1靶蛋白較強的結合活性，還能特異性阻斷PD-1抗體與細胞表面PD-1分子的結合，說明這種較強的結合活性能夠發(fā)揮與PD-1配體競爭性結合PD-1分子的作用，從而阻斷T細胞表面PD-1分子所傳遞的免疫抑制信號。

實施例6.融合蛋白對T細胞增殖活性影響的檢測

為檢測融合蛋白對T細胞增殖活性的影響，將人PBMC來源的T細胞使用一定濃度的CFSE進行標記，對照組與實驗組設計平行孔，分別加入等量的CFSE標記細胞與對照蛋白或融合蛋白進行共孵育，培養(yǎng)1天、2天以及3天后將對照組及實驗組同時進行流式檢測，統(tǒng)計結果如圖5所示。由于CFSE檢測細胞增殖原理為具有熒光活性的CFSE能夠在母代細胞增殖過程中均分到子代細胞中，相應地增殖的子代細胞的熒光強度也會因為CFSE的均分而減弱，采用流式細胞儀分析的時候，通過檢測到細胞熒光強度不斷的降低，進一步分析得出細胞分裂增殖的情況。從圖5結果中可以看到，對照組(Control)和融合蛋白處理組(PDL2-Ig)中T細胞在第1天到第3天過程中CFSE的平均熒光強度(MFI)值持續(xù)降低，說明兩組中的T細胞都處于持續(xù)增殖狀態(tài)；同時相較于對照組，融合蛋白處理組CFSE的MFI值在三個時間點均存在明顯的降低，說明融合蛋白的處理能夠較為明顯地增強T細胞的增殖活性和抑制T細胞凋亡。

實施例7.融合蛋白對T細胞活化水平影響的檢測

為進一步檢測融合蛋白對T細胞活化水平的影響，取等量人PBMC來源的T細胞分別加入對照蛋白和融合蛋白進行共孵育，同時加入CD3抗體處理組作為陽性對照組，共孵育24小時后收集細胞并使用T細胞活化表面分子CD279、CD69以及CD107a的熒光抗體(BioLegend)進行標記，采用流式細胞儀檢測三組中相關分子的表達水平，代表性結果如圖6所示。

從圖6結果中可以看到，相較于對照組(Control)，CD3抗體處理組(Anti-CD3)中CD279+、CD69+以及CD107a+細胞比例達到55％±5％、90％±3％和77％±9％，相比對照組分別提升30％、29％和40％，說明CD3抗體的處理能明顯增強T細胞活化水平。相較而言，融合蛋白處理組中三群陽性細胞比例相比對照組則分別提升25％、10％以及27％，雖然提升幅度不及陽性對照組，但相比對照組的本底水平這種提升同樣顯著。

綜上，本發(fā)明成功設計并制備了能夠有效靶向并阻斷PD-1分子的融合蛋白制劑，該融合蛋白制劑不僅顯示出特異性結合PD-1的活性，同時還能夠顯著增強T細胞本身的增殖活性以及活化水平。該融合蛋白能與PD-1配體競爭性結合PD-1受體，通過阻斷免疫抑制信號來增強免疫細胞功能，在天然免疫及適應性免疫所介導的腫瘤免疫治療中具有良好的應用前景。

以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發(fā)明的范圍內。

SEQUENCE LISTING

<110> 上?？漆t(yī)聯(lián)創(chuàng)生物科技有限公司

<120> 一種靶向PD-1的融合蛋白及其相關應用

<130> IPI170277

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 靶向PD-1的融合蛋白氨基酸序列

<400> 1

Leu Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Glu Leu Tyr Ile Ile Glu His Gly

1 5 10 15

Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn Phe Asp Thr Gly Ser His Val Asn

20 25 30

Leu Gly Ala Ile Thr Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn Asp Thr Ser

35 40 45

Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu Pro Leu Gly

50 55 60

Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Gln Val Gln Val Arg Asp Glu Gly Gln

65 70 75 80

Tyr Gln Cys Ile Ile Ile Tyr Gly Val Ala Trp Asp Tyr Lys Tyr Leu

85 90 95

Thr Leu Lys Val Lys Ala Ser Tyr Arg Lys Ile Asn Thr His Ile Leu

100 105 110

Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu Thr Cys Gln Ala Thr Gly

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Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Pro Asn Val Ser Val Pro Ala Asn

130 135 140

Thr Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val Thr Ser Val

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Leu Arg Leu Lys Pro Pro Pro Gly Arg Asn Phe Ser Cys Val Phe Trp

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Asn Thr His Val Arg Glu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Asp Leu Gln Ser

180 185 190

Gln Met Glu Pro Arg Thr His Pro Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

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Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

210 215 220

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

225 230 235 240

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

245 250 255

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

260 265 270

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

275 280 285

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

290 295 300

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

305 310 315 320

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

325 330 335

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

340 345 350

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

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Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

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<212> DNA

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<223> 靶向PD-1的融合蛋白核酸編碼序列

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