本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種靶向性抗腫瘤融合蛋白質(zhì)ala的制備方法和該融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

尿激酶型纖溶酶原激活物受體(upar)在惡性腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，成為評價腫瘤惡性化程度及預(yù)后的標(biāo)準(zhǔn)之一，也成為一個重要的抗癌藥物靶點。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜過程，主要包括以下幾個步驟：腫瘤細(xì)胞周圍細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的降解、腫瘤細(xì)胞的粘附與遷移、腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成。細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的降解主要由纖溶酶原激活劑系統(tǒng)及金屬蛋白酶系統(tǒng)兩個基質(zhì)降解酶系統(tǒng)完成。借助于upar，腫瘤細(xì)胞將其分泌的或細(xì)胞外的upa濃集于細(xì)胞表面；upa與upar特異性結(jié)合后，多條通路被激活，從而發(fā)揮其在腫瘤演進(jìn)中的多種功能。這些功能主要包括兩方面：一是細(xì)胞內(nèi)的多種信號通路被活化，包括癌基因表達(dá)的上調(diào)、刺激細(xì)胞粘附、調(diào)節(jié)化學(xué)趨化及mapk通路的激活；二是細(xì)胞外的蛋白水解作用。pro-upa被激活為upa，與upar結(jié)合的upa大大增強(qiáng)了激活纖溶酶原為纖溶酶的活性。纖溶酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的多種糖蛋白(如：纖連蛋白、層連蛋白等)以及蛋白多糖分子中的蛋白核心。此外，纖溶酶還能激活基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)中的前膠原酶、彈性蛋白酶和前基質(zhì)水解酶等，促進(jìn)膠原、彈性蛋白以及其它基質(zhì)蛋白成分的降解。細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的降解，使得腫瘤細(xì)胞能夠穿過基底膜進(jìn)入血管，而產(chǎn)生腫瘤轉(zhuǎn)移。

atf是upa的氨基末端片段，包括1-47位氨基酸的生長因子結(jié)構(gòu)域和48-134位氨基酸的kringle結(jié)構(gòu)域。atf包含了所有與upar結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，但不包括激活尿激酶型纖溶酶原激活物系統(tǒng)的催化結(jié)構(gòu)域，它能夠與upar高特異性的結(jié)合解離常數(shù)約為0.2nm。因此，atf不僅能夠靶向在腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的upar，而且能夠與upa競爭性的結(jié)合upar，抑制腫瘤環(huán)境中尿激酶型纖溶酶原激活物系統(tǒng)的過度活化。

東亞鉗蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤肽(analgesic-antitumorpeptide，agap)是由劉巖峰等人于2003年從東亞鉗蝎蝎毒中提取的一種多肽，為單一肽鏈的單純堿性多肽，等電點大于10。含有堿性氨基酸，還富含疏水性氨基酸。實驗證明agap具有良好的抗腫瘤作用，然而agap在蝎毒中的含量較低以及繁瑣的分離純化工藝很難滿足藥物開發(fā)的需要，近年來利用基因工程技術(shù)制備蛋白質(zhì)的研究有望能夠突破這一瓶頸。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提高抗腫瘤藥物的靶向性，降低藥物毒副作用，提供一種靶向性抗腫瘤融合蛋白及其制備方法，以及該融合蛋白在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的一種靶向性抗腫瘤融合蛋白ala，其氨基酸序列為seqidno：4。編碼上述融合蛋白的基因，其核苷酸序列為：seqidno：5。一種質(zhì)粒，含有上述融合蛋白的核苷酸序列。它是將編碼ala的核苷酸片段克隆至真核表達(dá)載體后獲得的重組子。一種畢赤酵母菌工程菌，含有上述的重組載體。是將重組子轉(zhuǎn)化至畢赤酵母菌中，構(gòu)建的表達(dá)ala融合蛋白的工程菌。

一種靶向性抗腫瘤融合蛋白ala，其氨基酸序列如seqidno：4所示。

編碼所述的靶向性抗腫瘤融合蛋白ala的基因，其核苷酸序列如seqidno：5所示。

所述的靶向性抗腫瘤融合蛋白ala，n端由尿激酶型纖溶酶原激活劑的1-135位氨基酸組成，其氨基酸序列為seqidno：1。

所述的靶向性抗腫瘤融合蛋白ala，連接肽氨基酸序列為seqidno：3。

含有所述的如seqidno：5所示的核苷酸序列的表達(dá)質(zhì)粒。

含有所述質(zhì)粒的表達(dá)融合蛋白質(zhì)ala的工程菌。

一種制備所述的融合蛋白質(zhì)ala的方法，包括如下步驟：

(1)將seqidno：5所示的基因連接到畢赤酵母過表達(dá)載體上，獲得重組子；

(2)將重組子電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母菌中，構(gòu)建畢赤酵母工程菌；

(3)將工程菌接種在含博萊霉素的ypd培養(yǎng)基中，在28℃、250r條件下，搖床培養(yǎng)16-18小時，接種1％至表達(dá)培養(yǎng)基中28℃、250r搖瓶培養(yǎng)16-18小時，至od600為2-6，加入甲醇使終濃度為1％，誘導(dǎo)表達(dá)24小時，5000g，離心5min，收集上清；

(4)將收集到的上清置于平衡緩沖液中進(jìn)行透析過夜；

(5)將平衡好的上清液過ni柱，利用含有咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，收集250mm咪唑濃度下的蛋白洗脫液；

(6)將收集到的蛋白洗脫液用磷酸鹽緩沖液透析去除其它雜質(zhì)，得到有活性的ala融合蛋白。

所述的靶向性融合蛋白ala在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

所述的腫瘤為有upar受體表達(dá)的腫瘤。

所述的腫瘤細(xì)胞系為腸癌sg-7901、肺癌a549、乳腺癌mda-mb231或mcf-7。

在本發(fā)明的靶向性抗腫瘤融合蛋白質(zhì)ala中，尿激酶的egf樣區(qū)和kringle區(qū)合稱為atf，atf區(qū)可以靶向性結(jié)合到腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的尿激酶受體上。融合蛋白質(zhì)ala的連接肽中含有酶切位點，可以被腫瘤組織中的酶切割，從而發(fā)揮抗腫瘤肽的抑瘤作用，而對尿激酶受體不表達(dá)或低表達(dá)的正常細(xì)胞無毒，具有成為理想的靶向性抗腫瘤融合蛋白的潛力。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的靶向性抗腫瘤融合蛋白質(zhì)ala可在抗腫瘤藥物中應(yīng)用。實驗證實該融合蛋白質(zhì)對包括大腸癌sg-7901細(xì)胞、肺癌a549細(xì)胞、乳腺癌mda-mb231細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞系均有明顯的抑制作用，而對無upar受體的hek293和l029細(xì)胞則無明顯抑制作用。

附圖說明

圖1顯示用于表達(dá)融合蛋白的重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。

圖2顯示融合蛋白親和層析純化分步洗脫圖。其中1：marker；2：發(fā)酵液上清；3：穿過部分；4：0mm咪唑洗脫；5，6：20mm咪唑洗脫；7，8：50mm咪唑洗脫；9，10：100mm咪唑洗脫；11，12：200mm咪唑洗脫；13，14：250mm咪唑洗脫；15，16：500mm咪唑洗脫。

圖3是純化后融合蛋白的檢測結(jié)果圖：圖3a為融合蛋白純化后的sds-page圖，3b為westernblot結(jié)果圖。

圖4是融合蛋白抑制細(xì)胞增殖實驗結(jié)果圖：4a為融合蛋白對4種腫瘤細(xì)胞的生長抑制結(jié)果圖；4b為融合蛋白對兩種正常細(xì)胞株生長的影響圖。

圖5是融合蛋白體內(nèi)制腫瘤生長曲線圖：a為融合蛋白對肺癌a549細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長抑制作用圖；b為融合蛋白對乳腺癌mda-mb231細(xì)胞裸鼠移圖；c為融合蛋白對胃癌sgc-7901細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長抑制作用圖。

具體實施方式

以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

實施例1：靶向性融合蛋白質(zhì)ala重組表達(dá)載體和工程菌的構(gòu)建

a.重組表達(dá)載體構(gòu)建：按照前文seqidno：5所述核酸序列，合成基因序列，上下游分別引入ecor1和xba1的酶切位點，合成序列直接克隆入南京金斯瑞公司提供的puc-57空載體中，并熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，經(jīng)菌落pcr鑒定篩選陽性克隆株，陽性克隆株擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒dna，利用ncoi、ecori雙酶切本質(zhì)粒和ppicaa-a空質(zhì)粒，回收目的片段和ppicaa-a載體粘性末端片段，在t4dna連接酶(takara)的存在下將目的片段插入到同樣酶切的質(zhì)?？蛰d體中，得到重組表達(dá)載體，命名為ppicaaa-ala，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α，進(jìn)菌落pcr挑選出陽性克隆進(jìn)行測序。結(jié)果表明，測序結(jié)果與預(yù)期完全一致。質(zhì)粒構(gòu)建示意圖見圖1。

b.融合蛋白表達(dá)工程菌的構(gòu)建：本發(fā)明使用的宿主菌為畢赤酵母菌株x-33是invitrogen公司的產(chǎn)品。將上述構(gòu)建好的重組表達(dá)載體ppicaaa-ala，大量提取后，用sac1單酶切線性化備用。制備畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，將備好的線性化重組表達(dá)載體通過電擊轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞中。28℃孵育半小時后，將電擊后的混合物涂在含博萊霉素的ypd平板中，28℃培養(yǎng)3天，篩選陽性克隆。-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2：atf-agap融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及產(chǎn)物純化

(1)將工程菌接種在含博萊霉素的ypd培養(yǎng)基中，在28℃、250r條件下，活化培養(yǎng)16-18小時；

(2)以1％接種量接種至bmgy培養(yǎng)基中，28℃、250r搖瓶培養(yǎng)16-18小時，至od600為2-6；

(3)離心收集菌體，用bmmy培養(yǎng)基重懸，加入終濃度為1％的甲醇，誘導(dǎo)表達(dá)24小時，5000g，離心5min，收集上清；

(4)融合蛋白c末端帶有his-tag標(biāo)簽，因此采用ge公司的ni-nta鎳柱純化，按試劑盒說明書進(jìn)行ni²⁺親和色譜純化。用含不同濃度咪唑(0mm、20mm、50mm、100mm、200mm、250mm和500mm)的緩沖液洗脫目的蛋白。將不同咪唑濃度下洗脫的樣品經(jīng)12％的sds-page電泳分離，westernblot分析鑒定目的蛋白與ni柱的結(jié)合情況，以及不同洗脫部位(圖2)。合并目的蛋白洗脫部位，sds-page檢測其純度達(dá)到了90％以上，分子量大小與理論分子量相符(圖3)，重組蛋白得率為4mg/l發(fā)酵液。

實施例3：融合蛋白體外對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

通過mtt細(xì)胞毒性測定法在4種腫瘤細(xì)胞系中進(jìn)行融合蛋白的體外抗腫瘤活性的測定。人肺癌細(xì)胞a549(atcc#ccl-185)、乳腺癌細(xì)胞mda-mb-231(atcc#htb-26)、乳腺癌細(xì)胞mcf-7(atcc#htb-22)和胃癌細(xì)胞sgc-7901，分別將培養(yǎng)后的細(xì)胞用胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為105個/ml。96孔板中，每孔加入100μl稀釋后的細(xì)胞懸浮液。將鋪好細(xì)胞的平板放置于在37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，樣品組分別加入融合蛋白至終濃度為10μm，空白對照組中只加入相應(yīng)體積的培養(yǎng)基。將細(xì)胞與測試蛋白孵育作用48小時，更換新鮮培養(yǎng)基，每孔分別加入20mlmtt溶液(5mg/ml)，并在37℃在5％co2中繼續(xù)培養(yǎng)3小時。棄掉含有mtt溶液的培養(yǎng)基，每孔加入100μldmso使甲瓚晶體充分溶解?；靹蚝?，測定570nm處的吸收值(reference波長690nm)。圖4a結(jié)果顯示：融合蛋白能有效的抑制胃癌、肺癌、乳腺癌細(xì)胞的增殖。在48小時，10um濃度下，對sg-7901抑制率達(dá)到33％，對肺癌a549抑制率達(dá)到48％，對乳腺癌mcf-7抑制率達(dá)到54％，對乳腺癌mda-mb-231抑制率達(dá)到67％。

實施例4：融合蛋白對2種正常細(xì)胞增殖的影響

調(diào)整hek293和lo29細(xì)胞濃度，以每孔5000個細(xì)胞的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃下培養(yǎng)過夜后加入終濃度為10um的融合蛋白，設(shè)置3個平行復(fù)孔，對照組加入相應(yīng)體積的pbs溶液。孵育48小時后，更換新鮮培養(yǎng)基，每孔分別加入20mlmtt溶液(5mg/ml)，并在37℃在5％co2中繼續(xù)培養(yǎng)3小時。棄掉含有mtt溶液的培養(yǎng)基，每孔加入100μldmso使甲瓚晶體充分溶解。混勻后，測定570nm處的吸收值(reference波長690nm)。圖4b結(jié)果顯示：ala對于hek293和lo29細(xì)胞的生長抑制率在10％以下。表明ala對于正常的(upar-/-)細(xì)胞不存在明顯毒性效應(yīng)。

實施例5：融合蛋白：對人肺癌a549細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長抑制作用

選取4-6周齡的雌性balb/c裸鼠20只，每只接種1×10⁵個非小細(xì)胞肺癌a549細(xì)胞于裸鼠背部皮下。待瘤塊長至50-100mm³大小，將成瘤的小鼠隨機(jī)分為2組，每組8只。

通過腹腔注射給藥，每兩天給藥一次，連續(xù)給藥14天，對照組給予相應(yīng)的pbs。給藥后每2天測量一次腫瘤大小，根據(jù)公式v＝0.5*a*b²計算腫瘤體積(a為腫瘤長徑，b為腫瘤短徑)，繪制腫瘤生長曲線。結(jié)果見圖5a，給藥30天后給藥組腫瘤體積約為對照組的50％，顯著小于對照組，**與對照組相比p<0.01。

實施例7：融合蛋白：對人乳腺癌mda-mb231細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長抑制作用

選取4-6周齡的雌性balb/c裸鼠20只，每只接種5×10⁶個細(xì)胞于裸鼠背部皮下。待瘤塊長至50-100mm³大小，將成瘤的小鼠隨機(jī)分為2組，每組8只。通過腹腔注射給藥，每兩天給藥一次，連續(xù)給藥14天，對照組給予相應(yīng)的pbs。給藥后每2天測量一次腫瘤大小，根據(jù)公式v＝0.5*a*b²計算腫瘤體積(a為腫瘤長徑，b為腫瘤短徑)，繪制腫瘤生長曲線。結(jié)果見圖5c，給藥30天后給藥組腫瘤體積顯著小于對照組，抑制率為34％，*與對照組相比p<0.05。

實施例6：融合蛋白：對人胃癌sgc-7901細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長抑制作用

取對數(shù)生長期的人胃癌sgc-790細(xì)胞，胰酶消化后離心收集細(xì)胞，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞密度至1×10⁶/ml，選取4-6周齡的雌性balb/c裸鼠20只，每只接種1×10⁵個細(xì)胞于裸鼠背部皮下。待瘤塊長至50-100mm³大小，將成瘤的小鼠隨機(jī)分為2組，每組8只。通過腹腔注射給藥，每兩天給藥一次，連續(xù)給藥14天，對照組給予相應(yīng)的pbs。給藥后每2天測量一次腫瘤大小，根據(jù)公式v＝0.5*a*b²計算腫瘤體積(a為腫瘤長徑，b為腫瘤短徑)，繪制腫瘤生長曲線。結(jié)果見圖5b，給藥30天后給藥組腫瘤體積顯著小于對照組，抑制率為64％，**與對照組相比p<0.01。