本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種穩(wěn)定過表達lat3的β細胞株的制備方法，以及穩(wěn)定過表達lat3的β細胞株在研究支鏈氨基酸及其轉運載體lat3調控β細胞胰島素分泌中應用。

背景技術：

支鏈氨基酸(bcaas)作為營養(yǎng)信號直接或間接的影響代謝，bcaas包括亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸三種必需氨酸。富含bcaas的食品通過調節(jié)體重，肌肉蛋白的合成以及葡萄糖穩(wěn)態(tài)和機體健康代謝正相關。但是胰島素抵抗和ii型糖尿病的人和嚙齒類動物出現高水平bcaas，這種bcaas看似矛盾的現象會引發(fā)如下思考：一是bcaas或者富含高bcaas的食品對胰島素和葡萄糖的穩(wěn)態(tài)有利還是有害？二是bcaas是否是胰島素抵抗或ii型糖尿病的前兆或者誘因？三是胰島素抵抗或者病理狀態(tài)下，高水平的bcaas的產生的誘因？因此開展以bcaas為代表的信號氨基酸在ii型糖尿病中的重要作用以及作用機制的研究，有利于解釋富含bcaas的功能性食品對ii型糖尿病等典型代謝性疾病的改善。

bcaa參與正常機體蛋白質的合成，更重要的作用是作為信號因子參與調控細胞生長。l型氨基酸轉運載體(l-typeaminoacidtransporter，lat)將bcaa轉運到細胞內發(fā)揮作用，在四種l型轉運載體中，lat3和lat4轉運譜偏好性轉運bcaa以及蛋氨酸，且lat3主要在胰腺和肝臟中表達。研究表明在不同的癌細胞中，lats介導蛋白翻譯和細胞生長，在前列腺癌形成過程中l(wèi)at3高表達，在癌細胞遷移過程中l(wèi)at1高表達。在體外敲降lat3或lat1的表達能夠抑制mtorc1活性，細胞生長和細胞周期。然而lat3在胰島素分泌及抵抗中的作用尚不清楚。

技術實現要素：

本發(fā)明的一個目的是提供l型氨基酸轉運載體3(lat3)的新用途。

本發(fā)明提供了l型氨基酸轉運載體3在如下(1)-(4)中任一種中的應用：

(1)調控胰島素分泌；

(2)制備調控胰島素分泌的產品；

(3)調控胰島β細胞胰島素分泌；

(4)制備調控胰島β細胞胰島素分泌的產品；

本發(fā)明還提供了l型氨基酸轉運載體3和亮氨酸在共同調控胰島素分泌中的應用；

本發(fā)明還提供了l型氨基酸轉運載體3和亮氨酸在共同調控胰島β細胞胰島素分泌中的應用；

所述l型氨基酸轉運載體3是如下a)或b)或c)或d)的蛋白質：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白質；

b)在序列2所示的蛋白質的n端和/或c端連接標簽得到的融合蛋白質；

c)將序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質；

d)與序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白質。

本發(fā)明還提供了與l型氨基酸轉運載體3相關的生物材料的新用途。

本發(fā)明提供了與l型氨基酸轉運載體3相關的生物材料在如下(1)-(5)中任一種中的應用：

(1)調控胰島素分泌；

(2)制備調控胰島素分泌的產品；

(3)調控胰島β細胞胰島素分泌；

(4)制備調控胰島β細胞胰島素分泌的產品；

(5)制備胰島素分泌量提高的轉基因細胞；

上述應用中，所述生物材料為下述a1)至a12)中的任一種：

a1)編碼l型氨基酸轉運載體3的核酸分子；

a2)含有a1)所述核酸分子的表達盒；

a3)含有a1)所述核酸分子的重組載體；

a4)含有a2)所述表達盒的重組載體；

a5)含有a1)所述核酸分子的重組微生物；

a6)含有a2)所述表達盒的重組微生物；

a7)含有a3)所述重組載體的重組微生物；

a8)含有a4)所述重組載體的重組微生物；

a9)含有a1)所述核酸分子的轉基因細胞系；

a10)含有a2)所述表達盒的轉基因細胞系；

a11)含有a3)所述重組載體的轉基因細胞系；

a12)含有a4)所述重組載體的轉基因細胞系。

上述應用中，a1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其編碼序列是序列1的cdna分子或dna分子；

2)與1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼l型氨基酸轉運載體3的cdna分子或基因組dna分子；

3)在嚴格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼l型氨基酸轉運載體3的cdna分子或基因組dna分子。

上述應用中，所述調控為促進。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種制備胰島素分泌量提高的轉基因細胞的方法。

本發(fā)明提供的制備胰島素分泌量提高的轉基因細胞的方法包括提高受體細胞中l(wèi)型氨基酸轉運載體3的表達量和/或活性，得到轉基因細胞的步驟；所述轉基因細胞的胰島素分泌量高于受體細胞。

上述方法中，所述提高受體細胞中l(wèi)型氨基酸轉運載體3的表達量和/或活性的方法為在受體細胞中過表達l型氨基酸轉運載體3。

上述方法中，所述過表達的方法為將所述l型氨基酸轉運載體3的編碼基因導入受體細胞。

上述方法中，所述l型氨基酸轉運載體3的編碼基因通過過表達l型氨基酸轉運載體3的慢病毒質粒導入受體細胞。所述過表達l型氨基酸轉運載體3的慢病毒質粒的制備方法如下：將序列1所示的dna分子插入到pentr_l1-mcs-2a-egfp-2a-puro-l2載體的noti-hf和spei酶切位點間，得到中間質粒，然后將中間質粒、plv'-r4-ccdb-r2和pentr_l4_hef1a_r1病毒載體在lr酶作用下經過重組得到過表達l型氨基酸轉運載體3的慢病毒質粒phs-avc-yw246。

所述慢病毒質粒phs-avc-yw246與輔助質粒共同轉染包裝細胞hek293ft進行包裝，得到慢病毒液phs-avc-yw246，再將慢病毒液phs-avc-yw246轉染受體細胞，經過篩選，即可得到胰島素分泌量提高的轉基因細胞。

上述方法中，所述l型氨基酸轉運載體3的編碼基因的核苷酸序列是序列1所示的dna分子。

上述方法中，所述受體細胞為胰島β細胞；所述胰島β細胞具體為rin-m5f細胞。

上述方法制備得到的胰島素分泌量提高的轉基因細胞也屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種促進胰島素分泌的產品。

本發(fā)明提供的促進胰島素分泌的產品的活性成分為l型氨基酸轉運載體3或由l型氨基酸轉運載體3與亮氨酸組成的組合物。

本發(fā)明的最后一個目的是提供一種促進胰島素分泌的方法。

本發(fā)明提供促進胰島素分泌的方法包括在胰島β細胞中過表達l型氨基酸轉運載體3的步驟。

本發(fā)明將合成的全基因lat3序列成功插入慢病毒表達骨架質粒載體中，得到過表達lat3的慢病毒質粒，并通過慢病毒轉染獲得過表達lat3的β細胞株。實驗結果證明：過表達lat3的β細胞株可顯著、持續(xù)、穩(wěn)定的過表達lat3，并經亮氨酸處理后胰島素的分泌量顯著提高，說明亮氨酸依賴lat3基因參與調控β細胞胰島素分泌。本發(fā)明為研究lat3及支鏈氨酸在胰島素分泌中的作用提供一種有力的工具。

附圖說明

圖1為過表達lat3的慢病毒載體的雙酶切鑒定結果及測序結果。圖1(a)為3個過表達lat3的慢病毒載體的單克隆的酶切鑒定圖；其中，第一泳道為marker，從下至上依次是300bp、500bp、800bp、1000bp、1500bp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、6000bp、8000bp和10000bp。圖1(b)為lat3(slc43a1)基因測序比對結果。

圖2為0.4ug/ml嘌呤霉素篩選細胞的結果。

圖3為嘌呤霉素篩選細胞后real-timepcr檢測lat3表達量。

圖4為嘌呤霉素篩選細胞后western-blotting檢測lat3表達量。

圖5為亮氨酸刺激穩(wěn)定細胞株胰島素分泌結果。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。

下述實施例中的krbh緩沖液(krebs-ringerbicarbonatebuffer，krbh)由溶劑和溶質組成，溶劑為水，各溶質及其濃度如下：129mmol/lnacl，4.8mmol/lkcl，1.2mmol/lmgso4，1.2mmol/lkh2po4，2.5mmol/lcacl2，5mmol/lnahco3，0.1％bsa，10mmol/lhepes；ph7.4。

下述實施例中的含葡萄糖krbh緩沖液是將葡糖糖與krbh緩沖液混勻得到的溶液，其中葡糖糖在含葡萄糖krbh緩沖液中的濃度為3mm。

下述實施例中的含葡萄糖和亮氨酸的krbh緩沖液是將葡糖糖、亮氨酸與krbh緩沖液混勻得到的溶液，其中葡糖糖在含葡萄糖和亮氨酸的krbh緩沖液中的濃度為3mm，亮氨酸在含葡萄糖和亮氨酸的krbh緩沖液中的濃度為10mm。

實施例1、一種穩(wěn)定過表達lat3的β細胞株的制備

一、穩(wěn)定過表達lat3的慢病毒質粒的構建及包裝

1、lat3基因序列的合成

利用美國國家生物技術信息中心(nationalcenterofbiotechnologyinformation，ncbi)網站數據庫，查詢獲得編碼lat3的基因mrna序列(mrnaid:nm_001107742)，根據lat3的mrna序列進行全基因合成，合成的lat3基因的核苷酸序列如序列1所示。

2、中間質粒的構建

使用noti-hf(neb，貨號：r3189v)和spei(neb，貨號：ro133v)酶切骨架載體pentr_l1-mcs-2a-egfp-2a-puro-l2(biogeek，phs-bvc-b027)，得到酶切后的骨架載體；然后將合成的lat3目的片段(序列1)和酶切后的骨架載體以等摩爾的比例加入到15ul的gibsonassemblymix(biogeek，bg14201s)中，水補足20ul體系，50℃放置1h，80℃失活20min進行gibson拼裝，得到中間質粒。最后將中間質粒轉化感受態(tài)dh5α，涂布于含amp抗性的lb培養(yǎng)基平板，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜；菌落pcr挑取陽性克隆，提取陽性克隆的質粒進行酶切鑒定，并送測序。

測序結果表明：中間質粒為將序列1所示的dna分子插入骨架載體pentr_l1-mcs-2a-egfp-2a-puro-l2的noti-hf和spei酶切位點間，且保持骨架載體pentr_l1-mcs-2a-egfp-2a-puro-l2其他序列不變后得到的質粒。

按照上述方法，將序列3所示的gfp的編碼基因插入骨架載體pentr_l1-mcs-2a-egfp-2a-puro-l2的noti-hf和spei酶切位點間，且保持骨架載體pentr_l1-mcs-2a-egfp-2a-puro-l2其他序列不變，得到中間對照質粒。

3、過表達lat3的慢病毒質粒的構建

將步驟2制備的中間質粒、plv'-r4-ccdb-r2(biogeek，pt590)和pentr_l4_hef1a_r1(biogeek，pz529)分別稀釋至濃度為20nm，然后各取0.5ul加入到0.5ul的iienzymemix(thermofisher，貨號：11791020)中，水補足2.5ul體系，室溫放置2-3h，得到混合物。然后將混合物轉化，涂板，挑取單克隆培養(yǎng)，并進行酶切鑒定，鑒定正確的克隆即為過表達lat3的慢病毒質粒，將其命名為phs-avc-yw246載體。phs-avc-yw246載體表達lat3蛋白，lat3蛋白的氨基酸序列如序列2所示。

酶切鑒定的具體步驟如下：取3個單克隆提取質粒，用限制性內切酶noti-hf和spei對phs-avc-yw246載體進行酶切鑒定。酶切體系如下：cutsmartbuffer1ul、plasmid500ng、noti-hf0.5ul、spei0.5ul、ddh2o補足10ul。

酶切鑒定結果如圖1(a)所示。從圖中可以看出：phs-avc-yw246載體預期酶切電泳條帶為1277bp/1835bp/2368bp/7084bp。從圖中可以看出：所挑選的3個單克隆，酶切鑒定均正確，選擇1號單克隆載體用于下述實驗。

慢病毒質粒pt080制備方法與過表達lat3的慢病毒質粒的制備方法相同，僅將中間質粒替換為中間對照質粒，即得到過表達gfp的慢病毒質粒，將其命名為慢病毒質粒pt080。

二、慢病毒包裝

1、hek293ft細胞準備

將(3-5)×10⁶個hek293ft細胞(biogeek，bg23002)傳代接種至100mm細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16-24h。傳代過程中將細胞充分消化為單細胞懸液，以獲得較好的包裝效果。

2、慢病毒包裝系統(tǒng)轉染

①使用ddh2o分別將慢病毒包裝試劑盒(biogeek，bg20401s)中的包裝質?；旌衔?packageplasmidmix)及慢病毒表達質粒(過表達lat3的慢病毒質粒phs-avc-yw246)稀釋為終濃度1.0μg/μl的質粒溶液；

②取1支1.5ml離心管(標記為a管)，加入300μlopti-mem培養(yǎng)基(lifetechnologies，31985-070)及40μlepfecttmtransfectionreagent(biogeek，bg20201s)，混勻后室溫靜置5min；

③取1支1.5ml離心管(標記為b管)，加入2.5μl終濃度為1.0μg/μl的慢病毒表達質粒溶液及7.5μl的包裝質粒混合物(packageplasmidmix)，充分混勻；

④將a管中溶液加入b管中，得到混合溶液，充分混勻，室溫靜置15-30min；

⑤將混合溶液逐滴接種至含有hek293ft細胞培養(yǎng)液(hek293ft細胞培養(yǎng)液是將hek293ft細胞和dmem完全培養(yǎng)基混勻得到的，hek293ft細胞接合度為80％-85％)的培養(yǎng)皿中，輕微水平震蕩培養(yǎng)皿以混勻，得到培養(yǎng)體系；然后將培養(yǎng)體系置于37℃，5％co2培養(yǎng)6h；再將培養(yǎng)體系中的培養(yǎng)基更換為37℃水浴預熱新鮮的rpmi-1640完全培養(yǎng)基。rpmi-1640完全培養(yǎng)基是將血清和rpmi-1640培養(yǎng)基(22400089，gibco)混勻得到的培養(yǎng)基，其中，血清的體積分數為15％。

3、慢病毒收集及濃縮

①轉染48h后，收集含有慢病毒的上清液；向培養(yǎng)皿中補充10-15ml新鮮的rpmi-1640完全培養(yǎng)基(22400089，gibco)，繼續(xù)培養(yǎng)24h，進行第二次病毒上清液收集；

②將兩次收集的病毒上清液混合，并使用0.45μm濾器進行過濾，過濾后的病毒液可以進行濃縮或直接感染目的細胞；

③按照病毒上清液：濃縮試劑(biogeek，bg201001l)＝5：1的比例進行混合，得到混合液，4℃放置2h或過夜；

④將混合液按照4℃，4000g離心30min，可見管底有米白色沉淀；

⑤小心移去上清，切勿碰觸沉淀物，加入適量體積pbs溶液(solarbio，p1020-500)，用微量移液器輕輕吹打重懸沉淀物，得到病毒濃縮液，即慢病毒液phs-avc-yw246；

⑥將病毒濃縮液分裝，保存于-80℃，即取即用，切忌反復凍融。

對照慢病毒液pt080的制備方法與慢病毒液phs-avc-yw246制備方法相同，只是轉染時將慢病毒表達質粒phs-avc-yw246替換成慢病毒質粒pt080。

四、慢病毒轉導rin-m5f細胞

①將生長狀態(tài)良好的rin-m5f細胞(atcc編號為crl-11605)消化計數后，稀釋至3×10⁵個/ml，按照2.5ml/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-24h；

②待細胞匯合度達到70-80％，將rpmi-1640完全培養(yǎng)基替換為使用37℃水浴預熱的新鮮的rpmi-1640完全培養(yǎng)基；

③向含有新鮮的rpmi-1640完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中分別加入最優(yōu)moi(moi為10)的慢病毒液phs-avc-yw246和對照慢病毒液pt080，同時加入終濃度為8μg/ml的促感染試劑polybrene(biogeek，bg20301s)；

④感染24h后，將rpmi-1640完全培養(yǎng)基替換為使用37℃水浴預熱的新鮮的rpmi-1640完全培養(yǎng)基；

⑤感染48-72h后，根據細胞狀態(tài)每24-48h更換新鮮的rpmi-1640完全培養(yǎng)基，并向培養(yǎng)基中添加嘌呤霉素(a1113802，thermofisher)，使其在培養(yǎng)基中的濃度為0.4ug/ml，篩選5-7天，分別得到過表達lat3的rin-m5f細胞和對照細胞(圖2)，分別將其命名為rin-m5f-yw246細胞和rin-m5f-pt080細胞，凍存?zhèn)溆谩?/p>

五、real-timepcr檢測lat3mrna表達量

分別接種rin-m5f-pt080細胞(對照組)、rin-m5f-yw246細胞(lat3基因過表達組)于六孔板中，待細胞密度為80-90％時，收集細胞。分別提取對照組和lat3基因過表達組的rna，反轉錄cdna并進行real-timepcr，檢測lat3mrna表達量。引物序列如下：

hs-avc-zy029：gagttcctcgtgactggtgg；

hs-avc-zy030：tcccatctctggcatctcca。

反轉錄體系(總體積為10μl)：mgcl22μl、10×rtbuffer1μl、rnasefreedh2o3.75μl、dntpmixture1μl、rnaseinhibitor0.25μl、amv0.5μl、oligodt0.5μl、rna1μl；上述反轉錄體系混勻后放入pcr儀，執(zhí)行以下程序：42℃，20min；99℃，5min；5℃，5min；4℃保存。

real-timepcr反應體系(總體積為25μl)：模板2μl、sybrpremixextaqtm12.5μl、上游引物0.5μl(10μmol/l)、下游引物0.5μl(10μmol/l)、去離子水10.5μl。上述real-timepcr反應體系混勻后放入abi7500realtimepcr儀，執(zhí)行以下程序：stage1，95.0℃，10s；stage2，95.0℃，5s，58℃，15s；stage3，95.0℃，15s，60℃，1h，95.0℃，15s。

結果如圖3所示。從圖中可以看出：rin-m5f-yw246細胞(lat3基因過表達組)中的目的基因lat3的表達量顯著高于對照組，lat3表達量提高了18倍左右，實現了lat3基因在β細胞中顯著、持續(xù)、穩(wěn)定的表達。

六、western-blotting檢測lat3蛋白表達量

1、細胞蛋白提取

分別接種rin-m5f-pt080細胞(對照組)、rin-m5f-yw246細胞(lat3基因過表達組)于六孔板中，待細胞密度為80-90％時，收集細胞。分別提取對照組和lat3基因過表達組蛋白。具體步驟如下：將75μlripa裂解液直接加入到6孔細胞培養(yǎng)板，細胞刮將細胞刮下，轉移至1.5ml離心管中混勻，超聲儀進行細胞超聲波破碎(一次3s，每次間隔1s，超3次)；細胞破碎后，4℃，12000g離心5min，上清轉移到新的1.5ml離心管中并置于-20℃保存。

2、蛋白濃度的測定

1)bca蛋白濃度測定試劑盒檢測，首先將標準蛋白稀釋為濃度為0.5mg/ml的標準品；

2)按照bca試劑a:bca試劑b為50：1配置工作液；

3)將蛋白樣品稀釋10倍備用；

4)標準品按0，1，2，4，8，12，16，20μl加到96孔板中，不足20μl的pbs補齊；

5)取20μl已稀釋蛋白樣品加入96孔板，每個樣品重復3次

6)每孔加入200μl已配置的bca工作液；

7)恒溫培養(yǎng)箱，37℃孵育30min；

8)酶標儀測定在波長570nm處od值；

9)根據標準品od值與濃度做標準曲線，計算對照組和lat3基因過表達組蛋白濃度分別為22.78μg/ml和24.29μg/ml。

3、蛋白變性

根據本研究中上樣為40μg蛋白樣品，20μl體積，計算蛋白上樣量。加入1/5終體積的5×sds蛋白上樣緩沖液，其余用裂解液補充至終體積(20μl)，本研究中每次變性10次量上樣次數，據此換算相應添加量，混勻，分裝，100℃加熱5min，-20℃保存。

4、westernblotting檢測

westernblotting方法參照laemrnli(1970)的方法，具體步驟如下：

1)分離膠和濃縮膠配置：配置本研究所需7.5％、12％的分離膠和4％的濃縮膠，灌膠備用；

2)sds-page電泳，電流18ma電泳2h，后調電流為20ma再電泳2h，直至溴酚藍剛跑出膠時停止電泳；

3)轉膜，準備濾紙和硝酸纖維素膜，膜用甲醇活化0.5h，轉移膠和膜，200ma轉移2h；

4)轉膜后，將膜移出至平皿，封閉液室溫搖床封閉1h；

5)孵育一抗，1:1000稀釋后的一抗(ab70117，abcam)10ml加入膜中，4℃過夜孵育后，tbst洗滌三次，每次10min；

6)孵育二抗，1:1000稀釋后的二抗(a0208，beyotime)加入上述洗后的膜中，4℃孵育4h，tbst洗滌三次，每次10min；

7)顯色，ecl顯色液覆蓋膜1min，置于蛋白凝膠成像儀器下成像；

8)fusion軟件進行分析成像結果。

結果如圖4所示。從圖中可以看出：和對照組相比，穩(wěn)定過表達lat3的細胞株的lat3蛋白水平顯著提高。

實施例2、l型氨基酸轉運載體3在調控胰島素分泌水平中的應用

該實施例通過用亮氨酸處理rin-m5f-pt080和rin-m5f-yw246細胞，研究亮氨酸對穩(wěn)定過表達lat3的細胞株的胰島素分泌水平的影響。具體步驟如下：

1、分別接種實施例1制備得到的rin-m5f-pt080和rin-m5f-yw246細胞于六孔板中，待細胞密度為70-80％時，收集細胞。

2、用krbh緩沖液清洗2遍，然后在含葡萄糖krbh緩沖液中37℃平衡20min，再用含葡萄糖和亮氨酸的krbh緩沖液處理細胞1h，收集上清。

3、采用大鼠胰島素elisa試劑盒(mlbil，ml302840-2)檢測亮氨酸處理后細胞中的胰島素分泌水平。具體檢測方法如下：

(1)標準品的加樣

設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μl；

(2)加樣

分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

(3)溫育

用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

(4)配液

將30(48t的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48t的20倍)倍稀釋后備用。

(5)洗滌

小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

(6)加酶

每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

(7)溫育

操作同(3)。

(8)洗滌

操作同(5)。

(9)顯色

每孔先加入顯色劑a50μl，再加入顯色劑b50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。

(10)終止

每孔加終止液50μl，終止反應(此時藍色立轉黃色)，依序測量450nm波長下各孔的吸光度。

結果如圖5所示。從圖中可以看出：和對照組細胞相比，亮氨酸處理后的過表達lat3的β細胞中的胰島素分泌量顯著提高，說明亮氨酸依賴lat3基因參與調控β細胞胰島素分泌。

序列表

<110>中國農業(yè)大學

<120>穩(wěn)定過表達lat3的β細胞株的制備方法及其應用

<160>3

<210>1

<211>1879bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gagaattccaattggcggccgcgccaccatgcggtttggaattgggatcctgggtctccg60

gagatccggagtgtggaagcgccgcggagacactgtgttaccccgggtgtcaacagctgt120

gggaggcaagtttgtcggggacagagtctcggccaccatggcccccacgctgaagcaggc180

gtaccgcaggcgctggtggatggcttgcaccgctgtggtggagaacctcttcttctccgc240

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