本發(fā)明屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域，具體是一種優(yōu)化角蛋白酶ker高效分泌表達(dá)的信號(hào)肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

角蛋白是一類不溶性的硬質(zhì)蛋白，廣泛存在于生物體的組織中，是羽毛、毛發(fā)、羊毛、指甲、犄角、蹄和鱗片等的主要組成成分。

角蛋白作為家禽業(yè)的副產(chǎn)物，是一筆可觀的再生利用資源。由于角蛋白結(jié)構(gòu)的特殊性，角蛋白很難被一般蛋白酶如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶以及胰蛋白酶降解。傳統(tǒng)的角蛋白酶處理工藝主要為高溫加熱酸堿水解法，這不僅會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，而且還會(huì)破壞部分氨基酸，從而影響角蛋白的利用率。采用生物轉(zhuǎn)化法如利用角蛋白酶降解羽毛、毛發(fā)、羊毛，水解后的蛋白質(zhì)和多肽物質(zhì)可以作為飼料添加劑用于家禽飼料中，不僅可以達(dá)到資源回收利用和節(jié)約糧食的目的，而且也減少了環(huán)境污染。因此，發(fā)展生物轉(zhuǎn)化法對(duì)角蛋白進(jìn)行回收和處理是形勢(shì)所需。

角蛋白酶作為特異性降解角蛋白的酶類，在飼料、皮革、精化和醫(yī)藥等行業(yè)具有廣泛的用途，其獨(dú)有的性質(zhì)使其擁有其他商品化酶沒有的優(yōu)勢(shì)，因此角蛋白酶的應(yīng)用和研究?jī)r(jià)值巨大。目前角蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)以及應(yīng)用存在的主要問題是角蛋白酶的胞外表達(dá)量較低，難以滿足工業(yè)的需求。

枯草芽孢桿菌由于其安全性以及具有蛋白質(zhì)分泌能力強(qiáng)、無密碼子偏好性等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是理想的蛋白分泌表達(dá)宿主。如何提高角蛋白酶在枯草芽孢桿菌中的胞外表達(dá)量是目前的研究熱點(diǎn)。在角蛋白酶表達(dá)分泌過程中，表達(dá)載體上的信號(hào)肽影響角蛋白酶的分泌效率，因此選擇合適的信號(hào)肽能有效提高角蛋白酶的分泌水平。由于同一種蛋白質(zhì)在不同信號(hào)肽的引導(dǎo)下的分泌效率相差極大，因此目前提高蛋白質(zhì)的分泌效率的主要方法是篩選或者改造不同的信號(hào)肽。

本發(fā)明基于來源于地衣芽孢桿菌bacilluslicheniformisbbe11-1的角蛋白酶ker在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的平臺(tái)，通過篩選并改造信號(hào)肽，以期獲得優(yōu)化角蛋白酶ker高效分泌表達(dá)的信號(hào)肽，實(shí)現(xiàn)角蛋白酶ker在枯草芽孢桿菌中的高效分泌表達(dá)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，實(shí)現(xiàn)角蛋白酶ker在枯草芽孢桿菌中的高效分泌表達(dá)，本發(fā)明提供了一種優(yōu)化角蛋白酶ker高效分泌表達(dá)的信號(hào)肽及其應(yīng)用。

本發(fā)明所提供的信號(hào)肽的氨基酸序列如seqidno：1所示，此信號(hào)肽是通過對(duì)來源于枯草芽孢桿菌的三種信號(hào)肽改造獲得。其n端具有信號(hào)肽abna的前九個(gè)氨基酸殘基mkkkktwkr，h段具有信號(hào)肽yfkn的疏水序列thvenilrillppimilslilptppi，c端具有信號(hào)肽phob的后四個(gè)氨基酸殘基easa。

本發(fā)明還提供一種編碼上述的優(yōu)化角蛋白酶ker高效分泌表達(dá)的信號(hào)肽的基因；所述基因的核苷酸序列如seqidno：2所示。

本發(fā)明還提供一株角蛋白酶ker分泌能力增強(qiáng)的枯草芽孢桿菌基因工程菌。

所述枯草芽孢桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法具體如下：將編碼角蛋白酶ker的前肽和成熟酶的基因kerds與載體pstop1622連接，構(gòu)建重組載體pstop1622-kerds；合成核苷酸序列“5’-acaatggtccaaactagt+seqidno：2+gctcagccggcgaaaa-3’”；采用無縫克隆方法將信號(hào)肽基因融合到基因kerds的5’端，構(gòu)建重組質(zhì)粒pstop1622-24-kerds；轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌bacillussubtiliswb600，獲得枯草芽孢桿菌基因工程菌bacillussubtiliswb600/pstop1622-24-kerds。

本發(fā)明通過對(duì)來源于枯草芽孢桿菌的46種分泌信號(hào)肽進(jìn)行初步篩選，然后對(duì)其中6種明顯提高角蛋白酶分泌量的分泌信號(hào)肽進(jìn)行定向改造，從而獲得一種優(yōu)化角蛋白酶ker高效分泌表達(dá)的信號(hào)肽。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：通過在角蛋白酶ker的n端融合此信號(hào)肽，使重組枯草芽孢桿菌的角蛋白酶ker的分泌效率顯著提高，其胞外角蛋白酶酶活由3017u/ml提高至10231u/ml，提高了3.39倍，更利于工業(yè)化應(yīng)用。

附圖說明

圖1是本發(fā)明信號(hào)肽初篩-胞外角蛋白酶酶活檢測(cè)結(jié)果-1；

圖2是本發(fā)明信號(hào)肽初篩-胞外角蛋白酶酶活檢測(cè)結(jié)果-2；

圖3是本發(fā)明信號(hào)肽優(yōu)化-胞外角蛋白酶酶活檢測(cè)結(jié)果；

圖4是本發(fā)明高分泌能力角蛋白酶生產(chǎn)菌株的驗(yàn)證。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明一種優(yōu)化角蛋白酶高效分泌表達(dá)的信號(hào)肽及其應(yīng)用作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

實(shí)驗(yàn)條件：

1、菌株與載體

大腸桿菌dh5α(購自takara)，枯草芽孢桿菌bacillussubtiliswb600(本實(shí)驗(yàn)室保存)，枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pstop1622(購自mobitec公司)。

2、酶類及其他生化試劑

koddna聚合酶及kod-plus-neodna聚合酶購自toyobo公司，dna限制性內(nèi)切酶、t4dna連接酶購自fermentase公司，細(xì)菌基因組提取試劑盒、dna膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒e.z.n.a.購自omegabio-tek公司，gibsonassemblymastermix購自neb公司，可溶性角蛋白(來源于羊毛)購自上海百威靈化學(xué)技術(shù)有限公司，其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

3、培養(yǎng)基

lb培養(yǎng)基(g/l)：胰蛋白胨10、酵母提取物5、nacl10，ph7.0。篩選培養(yǎng)基采用含50μg/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基。

b.subtiliswb600分批發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：胰蛋白胨20、酵母提取物10、葡萄糖10、kh2po43、na2hpo46、mgso40.3，ph7.0。

b.subtiliswb600補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖500。

本發(fā)明中所用到的分子克隆技術(shù)和蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。在以下實(shí)施例中未作詳細(xì)介紹的技術(shù)，均按照如下實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中的相關(guān)部分來進(jìn)行。greenmr,sambrookj.molecularcloning:alaboratorymanual[m].newyork:coldspringharborlaboratorypress,2012。

實(shí)施例1信號(hào)肽的初步篩選

(1)基因ker的合成

根據(jù)來源于地衣芽孢桿菌bacilluslicheniformisbbe11-1的角蛋白酶ker的ncbi登錄號(hào)jx504681，搜索獲得其基因序列，交由上海博益生物科技有限公司進(jìn)行角蛋白酶ker的全基因合成。

(2)表達(dá)載體pstop1622-ker的構(gòu)建

根據(jù)ker的基因序列設(shè)計(jì)pcr引物p1、p2(表1)，以合成基因ker為模板，以p1、p2為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物ker(編碼ker的信號(hào)肽、前肽和成熟酶的核苷酸序列)；pcr擴(kuò)增條件為：98℃5min；98℃20sec，60℃40sec，74℃2min，30個(gè)循環(huán)；74℃，10min；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)spei和bamhi雙酶切，連接至載體pstop1622，構(gòu)建重組載體pstop1622-ker。

表1載體構(gòu)建所需引物

注：下劃線部分為限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)。

(3)信號(hào)肽篩選載體的構(gòu)建

根據(jù)ker的基因序列設(shè)計(jì)pcr引物p3(表1)，以合成基因ker為模板，以p3、p2為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物kerds(編碼ker的前肽和成熟酶的核苷酸序列)；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)spei和bamhi雙酶切，連接至載體pstop1622，構(gòu)建重組載體pstop1622-kerds。

采用neb公司的gibsonassemblymastermix構(gòu)建包含枯草芽孢桿菌信號(hào)肽和重組載體pstop1622-kerds的信號(hào)肽篩選載體。所需引物(表1中p4和p5、表2)按照該產(chǎn)品說明書的要求進(jìn)行設(shè)計(jì)，pcr等相關(guān)操作按照該產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

具體操作如下：

以pstop1622-kerds為模板，采用引物p4、p5(表1)，進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到載體片段；pcr擴(kuò)增條件為：94℃5min；94℃30sec，55℃20sec，68℃4min，35個(gè)循環(huán)；68℃，10min。以枯草芽孢桿菌bacillussubtiliswb600基因組為模板，用表2中相應(yīng)引物擴(kuò)增出編碼不同信號(hào)肽(表2)的基因序列。pcr擴(kuò)增得到的載體片段分別與不同的信號(hào)肽片段混合，采用gibsonassemblymastermix進(jìn)行無縫克隆，獲得包含不同信號(hào)肽的信號(hào)肽篩選載體。

表2信號(hào)肽篩選載體構(gòu)建所需引物

(4)重組角蛋白酶ker在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)

將構(gòu)建成功的信號(hào)肽篩選載體、pstop1622-ker轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌bacillussubtiliswb600感受態(tài)細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)化pstop1622作為陰性對(duì)照contr.，獲得重組枯草芽孢桿菌。

重組枯草芽孢桿菌的種子培養(yǎng)條件為：采用lb液體培養(yǎng)基，用250ml三角瓶進(jìn)行培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基的裝液量為20ml，培養(yǎng)溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)時(shí)間為10h。重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件為：采用lb液體培養(yǎng)基，用250ml三角瓶進(jìn)行培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基的裝液量為25ml，接種量為3％，培養(yǎng)溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為200rpm。當(dāng)培養(yǎng)至菌體od600nm達(dá)到1時(shí)，添加終濃度為0.5％的木糖，誘導(dǎo)時(shí)間為30h。

(5)胞外角蛋白酶酶活的測(cè)定

胞外角蛋白酶酶活的測(cè)定參照中華人民共和國專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)sb/t10317-1999：蛋白酶活力測(cè)定法，并通過適當(dāng)?shù)男薷倪M(jìn)行測(cè)定。其中，底物由酪蛋白改為角蛋白；適當(dāng)縮小反應(yīng)體系。具體測(cè)定步驟如下：將發(fā)酵液于4℃下10000×g離心10min，取上清液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，取200μl與300μl50mmgly-naoh緩沖液(ph9.0)溶解1％的角蛋白底物混勻，50℃反應(yīng)10min，加入500μl4mtca溶液終止反應(yīng)。離心10min，吸取200μl上清液，依次加入1ml0.5mna2co3和200μl福林酚試劑，50℃反應(yīng)10min。以零時(shí)間的反應(yīng)液作為空白對(duì)照，測(cè)定a660nm。以角蛋白為底物，每min催化分解角蛋白生成1μg酪氨酸所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位。

重組枯草芽孢桿菌的胞外角蛋白酶酶活測(cè)定結(jié)果如圖1和圖2所示。其中胞外角蛋白酶酶活高于300u/ml的六種重組枯草芽孢桿菌所對(duì)應(yīng)的六種信號(hào)肽如表3所示。

表3信號(hào)肽初篩結(jié)果

實(shí)施例2信號(hào)肽的優(yōu)化

(1)信號(hào)肽突變體的基因合成

信號(hào)肽初步篩選結(jié)果顯示，信號(hào)肽yfkn、bpr、mpr、phob、wapa、abna能有效提高角蛋白酶ker的分泌效率。根據(jù)信號(hào)肽的結(jié)構(gòu)特征對(duì)以上六種信號(hào)肽的氨基酸序列和核苷酸序列進(jìn)行分區(qū)，即n端、h段、c端，如表4～9所示。對(duì)這六種信號(hào)肽的三段區(qū)域進(jìn)行重新組合，共獲得216(6×6×6)種信號(hào)肽突變體(圖3)。根據(jù)這六種信號(hào)肽的基因序列，設(shè)計(jì)核苷酸序列“5’-acaatggtccaaactagt+信號(hào)肽突變體的核苷酸序列+gctcagccggcgaaaa-3’”，由上海博益生物科技有限公司進(jìn)行基因合成。

表4信號(hào)肽yfkn

表5信號(hào)肽bpr

表6信號(hào)肽mpr

表7信號(hào)肽phob

表8信號(hào)肽wapa

表9信號(hào)肽abna

(2)信號(hào)肽突變體篩選載體的構(gòu)建

采用neb公司的gibsonassemblymastermix構(gòu)建包含信號(hào)肽突變體和重組載體pstop1622-kerds的信號(hào)肽突變體篩選載體。以pstop1622-kerds為模板，采用引物p4、p5(表1)，進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到載體片段。pcr擴(kuò)增得到的載體片段分別與不同的信號(hào)肽突變體片段混合，采用gibsonassemblymastermix進(jìn)行無縫克隆，獲得包含不同信號(hào)肽突變體的信號(hào)肽篩選載體。

(3)信號(hào)肽突變體的篩選

將構(gòu)建成功的信號(hào)肽突變體篩選載體、pstop1622-ker轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌bacillussubtiliswb600感受態(tài)細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)化pstop1622作為陰性對(duì)照contr.，獲得重組枯草芽孢桿菌。

重組枯草芽孢桿菌的種子培養(yǎng)條件為：采用lb液體培養(yǎng)基，用96深孔板進(jìn)行培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基的裝液量為1ml，培養(yǎng)溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)時(shí)間為10h。重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件為：采用lb液體培養(yǎng)基，用96深孔板進(jìn)行培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基的裝液量為1ml，接種量為3％，培養(yǎng)溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為200rpm。當(dāng)培養(yǎng)至菌體od600nm達(dá)到1時(shí)，添加終濃度為0.5％的木糖，誘導(dǎo)時(shí)間為30h。

胞外角蛋白酶酶活的測(cè)定參照實(shí)施例一進(jìn)行，測(cè)定結(jié)果如圖3所示。胞外角蛋白酶酶活最高的重組枯草芽孢桿菌對(duì)應(yīng)的信號(hào)肽突變體24號(hào)由信號(hào)肽abna的n端、信號(hào)肽yfkn的h段、信號(hào)肽phob的c端組成，其氨基酸序列為mkkkktwkrthvenilrillppimilslilptppieasa。

實(shí)施例3高分泌能力角蛋白酶生產(chǎn)菌株的驗(yàn)證

采用分批-補(bǔ)料發(fā)酵方式對(duì)實(shí)施例二中構(gòu)建的重組枯草芽孢桿菌bacillussubtiliswb600/pstop1622-24-kerds進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證。重組菌bacillussubtiliswb600/pstop1622-24-kerds和bacillussubtiliswb600/pstop1622-ker的種子培養(yǎng)條件為：采用lb液體培養(yǎng)基，用500ml三角瓶進(jìn)行培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基的裝液量為50ml，培養(yǎng)溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)時(shí)間為10h。重組菌的分批-補(bǔ)料發(fā)酵條件為：采用b.subtiliswb600分批發(fā)酵培養(yǎng)基，將種子接種于3l全自動(dòng)發(fā)酵罐，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，培養(yǎng)溫度為37℃，通氣量為1.5vvm，用氨水控制ph不低于7.0。在分批發(fā)酵6h后開始以6g/(l·h)恒速流加b.subtiliswb600補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基。當(dāng)培養(yǎng)至菌體od600nm達(dá)到15時(shí)，添加終濃度為0.5％的木糖，接種32h后發(fā)酵結(jié)束。重組菌的胞外角蛋白酶酶活的測(cè)定參照實(shí)施例一進(jìn)行，測(cè)定結(jié)果如圖4所示：重組菌bacillussubtiliswb600/pstop1622-ker的胞外角蛋白酶酶活為3017u/ml；bacillussubtiliswb600/pstop1622-24-kerds的胞外角蛋白酶酶活為10231u/ml，提高了3.39倍。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍的內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求所界定的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。

<110>江西省科學(xué)院微生物研究所

<120>一種優(yōu)化角蛋白酶ker高效分泌表達(dá)的信號(hào)肽及其應(yīng)用

<160>2

<210>1

<211>39

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

mkkkktwkrthvenilrillppimilslilptppieasa39

<210>2

<211>117

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atgaaaaagaaaaaaacatggaaacgcacacacgtcgaaaacattctccg50

tattcttttgcccccaattatgatacttagcctaatcctcccaacaccac100

ccattgaagccagcgcc117