本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說是涉及一種基于Ion Torrent測序平臺的靶向葉綠體測序方法。

背景技術(shù)：

葉綠體是綠色植物進行光合作用和能量轉(zhuǎn)化的重要細胞器。1909年，Baur和Correns通過在三種枝條顏色不同的紫茉莉之間進行雜交，發(fā)現(xiàn)其葉片花斑性狀不符合孟德爾遺傳現(xiàn)象，推測葉綠體內(nèi)存在遺傳物質(zhì)。

葉綠體DNA大部分都是共價、閉合的雙鏈環(huán)狀分子，少數(shù)為線狀分子，葉綠體DNA大小一般在120kb-160kb之間，而藻類中葉綠體DNA大小差異很大。自1986年第一條完整葉綠體發(fā)表以來，葉綠體基因組的研究備受關(guān)注。葉綠體基因工程以及系統(tǒng)發(fā)育是其主要的研究方向，并且已被廣泛用于葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)及植物親緣關(guān)系鑒定的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究。葉綠體基因組研究除了對于揭示葉綠體DNA的結(jié)構(gòu)、起源、物種親緣關(guān)系、植物多樣性等具有重要意義，更重要的是葉綠體基因組研究還可以推動植物在分子育種、遺傳轉(zhuǎn)化等葉綠體基因工程方面的研究進程。

目前的葉綠體序列檢測的方法主要有基于第一代測序技術(shù)的方法和基于第二代測序技術(shù)的方法，但是無論應(yīng)用哪種方法，基因組的污染對葉綠體序列后續(xù)分析是一個很大的難題，因此一種特異性靶向葉綠體序列檢測及分析技術(shù)勢在必行。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種精準、快速、流程簡單的檢測葉綠體DNA序列的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種基于Ion Torrent測序平臺的靶向葉綠體測序方法，包括以下步驟：

步驟a、制備樣本切片并染色，涂片染色方法包括HE染色、健那綠染色；

步驟b、激光顯微切割捕獲葉綠體，通過激光顯微切割捕獲的葉綠體組織的數(shù)量為1-200個；

步驟c、提取出DNA；

步驟d、PCR擴增及產(chǎn)物檢測；

步驟e、對擴增好的產(chǎn)物進行文庫構(gòu)建及質(zhì)檢，所述文庫構(gòu)建包括DNA超聲波打斷；末端修復和純化DNA；連接接頭和純化連接的DNA：文庫擴增、純化及質(zhì)控；

步驟f、采用Ion Torrent測序平臺上機測序及分析結(jié)果，將制備好的文庫在Life technologies公司的Ion Torrent高通量測序儀上進行測序，讀長250bp，要求測序深度達到3000×，每個樣本產(chǎn)生約90M的數(shù)據(jù)量；測序數(shù)據(jù)經(jīng)過信息分析得到葉綠體全基因組序列資料，與葉綠體參考序列比對，即可獲得樣本葉綠體序列變異信息，包括點突變、缺失、插入等變異情況。

優(yōu)選地，所述通過激光顯微切割捕獲的葉綠體組織的數(shù)量為20-50個。

本發(fā)明的有益效果是所述基于Ion Torrent測序平臺的靶向葉綠體測序方法通過特異性染色技術(shù)，將葉綠體組織著色，利用激光顯微切割技術(shù)，靶向獲取葉綠體基因組，靶向獲得葉綠體組織，徹底去除基因組，通過微量DNA提取、擴增技術(shù)，得到葉綠體基因組并用于下游的文庫構(gòu)建及檢測；同時配合使用Life technologies公司的Ion Torrent個人化操作基因組測序儀，它是市場上相較其他測序技術(shù)，更簡單，經(jīng)濟和具有強大的可擴展性的測序平臺，可得到大量高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，測序的深度保證了結(jié)果的準確性；本發(fā)明所述方法設(shè)計嚴謹、流程簡單，檢測結(jié)果精準可靠，完全去除基因組的污染問題，最大程度的降低了葉綠體序列的分析難度。

附圖說明

圖1是本發(fā)明所述基于Ion Torrent測序平臺的靶向葉綠體測序方法的步驟流程圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。

如圖所示，本發(fā)明公開一種基于Ion Torrent測序平臺的靶向葉綠體測序方法，包括以下步驟：步驟a、制備樣本切片并染色，涂片染色方法包括HE染色、健那綠染色；步驟b、激光顯微切割捕獲葉綠體，通過激光顯微切割捕獲的葉綠體組織的數(shù)量為1-200個；優(yōu)選數(shù)量為20-50個；步驟c、提取出DNA；步驟d、PCR擴增及產(chǎn)物檢測；步驟e、對擴增好的產(chǎn)物進行文庫構(gòu)建及質(zhì)檢，所述文庫構(gòu)建包括DNA超聲波打斷；末端修復和純化DNA；連接接頭和純化連接的DNA：文庫擴增、純化及質(zhì)控；步驟f、采用Ion Torrent測序平臺上機測序及分析結(jié)果，將制備好的文庫在Life technologies公司的Ion Torrent高通量測序儀上進行測序，讀長250bp，要求測序深度達到3000×，每個樣本產(chǎn)生約90M的數(shù)據(jù)量；測序數(shù)據(jù)經(jīng)過信息分析得到葉綠體全基因組序列資料，與葉綠體參考序列比對，即可獲得樣本葉綠體序列變異信息，包括點突變、缺失、插入等變異情況。

實施例一

采用本發(fā)明的基于Ion Torrent測序平臺的靶向葉綠體測序方法進行荷葉的葉綠體測序

步驟a、葉子制備樣本切片并染色，涂片染色方法包括HE染色、健那綠染色；具體操作方法為：首先將葉子放清水中浸泡30分鐘，待葉片舒展開并吸足水分；然后選擇一些葉片，進行徒手切片；接著進行健那綠染色，利用1％健那綠染液，將葉子切片染色；

步驟b、激光顯微切割捕獲葉綠體，通過激光顯微切割捕獲的葉綠體組織的數(shù)量為1-200個；具體操作方法為：首先激光顯微切捕獲細胞質(zhì)，將玻片置于顯微切割儀的載物臺上相應(yīng)位置，10倍鏡下尋找細胞匯集區(qū)，將該區(qū)域設(shè)置為切割目標范圍，在高倍鏡下，精準切割藍綠色的葉綠體；切割完畢后，下降玻片上方的ep管蓋至膜片切割部位表面，吸附切割目標，完成一次切割，重復操作5-50次，完成線粒體的收集；切割完畢后，蓋上ep管，4℃保存；

步驟c、提取出DNA；利用磁珠提取DNA，提取切割得到的葉綠體樣本DNA基因組；

步驟d、PCR擴增及產(chǎn)物檢測；利用微量樣本DNA擴增試劑盒(QIAGEN)，將提取的DNA基因組產(chǎn)物擴增；利用磁珠進行PCR產(chǎn)物純化；利用Qubit檢測純化產(chǎn)物濃度，進行PCR產(chǎn)物質(zhì)檢；

步驟e、對擴增好的產(chǎn)物進行文庫構(gòu)建及質(zhì)檢，所述文庫構(gòu)建包括DNA超聲波打斷；末端修復和純化DNA；連接接頭和純化連接的DNA：文庫擴增、純化及質(zhì)控；首先，利用超聲打斷儀，將葉綠體基因組DNA隨機打斷，條帶小于800bp，主帶集中在300bp；再利用磁珠法，將片段純化；利用“DNASeqLibraryPreparationKit”，完成葉綠體DNA文庫的構(gòu)建，具體流程包括：末端修復及純化；兩端加街頭及純化；文庫擴增及純化；利用Qubit檢測線粒體DNA基因組文庫的濃度；

步驟f、采用Ion Torrent測序平臺上機測序及分析結(jié)果，將制備好的線粒體DNA文庫，在Life technologies公司的Ion Torrent高通量測序儀上進行測序，讀長250bp，要求測序深度達到3000×，每個樣本產(chǎn)生約90M的數(shù)據(jù)量；將讀段拼接成scaffolds；拼接后的片段與緊源參考葉綠體基因組做對比，將拼接得到的scaffolds定位；然后補GAP：GAP的上下游序列區(qū)域設(shè)計引物，以樣本全基因組為摸板，進行PCR擴增并測序；對葉綠體基因組做注釋和進化分析，測序數(shù)據(jù)經(jīng)過信息分析得到葉綠體全基因組序列資料，與葉綠體參考序列比對，即可獲得樣本葉綠體序列變異信息，包括點突變、缺失、插入等變異情況。

本發(fā)明的基于Ion Torrent測序平臺的靶向葉綠體測序方法通過特異性染色技術(shù)，將葉綠體組織著色，利用激光顯微切割技術(shù)，靶向獲取葉綠體基因組，靶向獲得葉綠體組織，徹底去除基因組，通過微量DNA提取、擴增技術(shù)，得到葉綠體基因組并用于下游的文庫構(gòu)建及檢測；同時配合使用Life technologies公司的Ion Torrent個人化操作基因組測序儀，它是市場上相較其他測序技術(shù)，更簡單，經(jīng)濟和具有強大的可擴展性的測序平臺，可得到大量高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，測序的深度保證了結(jié)果的準確性；本發(fā)明所述方法設(shè)計嚴謹、流程簡單，檢測結(jié)果精準可靠，完全去除基因組的污染問題，最大程度的降低了葉綠體序列的分析難度。

盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的圖例。