本發(fā)明屬于化合物合成
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種靶向泛素化降解plk1和brd4蛋白的化合物，及其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物和以該化合物為活性成分的藥物組合，以及在制備plk1蛋白和brd4蛋白抑制劑及其用于治療和/或預(yù)防腫瘤中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitinproteasomepathway，upp)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑，參與細(xì)胞內(nèi)80％以上蛋白質(zhì)的降解。upp由泛素、泛素活化酶e1、泛素結(jié)合酶e2、泛素連接酶e3、蛋白酶體及其底物(蛋白質(zhì))構(gòu)成。upp特異性降解蛋白質(zhì)的過程分兩個階段：(1)蛋白底物泛素化：泛素分子由app提供能量，被e1激活轉(zhuǎn)移到e2，然后經(jīng)e3與特異性蛋白底物結(jié)合；(2)蛋白底物降解：被泛素化的蛋白分子能夠被蛋白酶體識別，并進(jìn)入蛋白酶體降解成短鏈的多肽分子。蛋白水解靶向嵌合分子(proteolysistargetingchimeras，protacs)技術(shù)是利用一種雙功能小分子將目標(biāo)蛋白和細(xì)胞內(nèi)的e3拉近，從而導(dǎo)致目標(biāo)蛋白質(zhì)的降解。protacs包含三部分功能結(jié)構(gòu)：(1)可以與蛋白底物相結(jié)合的部分；(2)能夠與e3相結(jié)合的部分；(3)前兩部分的連接鏈。在細(xì)胞內(nèi)protacs可以同時與靶蛋白及e3結(jié)合，使本來不能與e3結(jié)合的靶蛋白泛素化，進(jìn)而被蛋白酶體識別并降解。(angew.chem.int.ed.engl.,2016,55(6),1966-1973.)研究證明化合物a類似物可以與vhl蛋白結(jié)合，vhl蛋白為e3泛素連接酶復(fù)合體elonginb/c–cul2–vhl的組成部分。該復(fù)合物可利用泛素來標(biāo)記特定的蛋白，隨后水解這些蛋白。(angewchemintedengl.，2016，55(2):807–810.)技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種靶向泛素化降解plk1和brd4蛋白的化合物及其應(yīng)用，具體為具有化合物a類似物片段的化合物及其制備方法，以及該類化合物作為plk1和brd4蛋白抑制和降解劑在預(yù)防和/或治療腫瘤中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及通式ⅰ所示的化合物、及其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物：其中r1選自h、c1-c6烷基、c3-c6環(huán)烷基、任選取代的苯基，其中苯基取代基選自h，鹵素，硝基，氨基，c1-c6烷基，c1-c6烷氧基；r2選自h、c1-c6烷氧基，鹵素；r3選自h，c1-c6烷基；n為1、2、3、4、5或6。除非另外指出，本發(fā)明所用的術(shù)語“鹵素”是指氟、氯、溴或碘；c1-c6烷基是指甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、直鏈或帶支鏈的c5烷基、直鏈或帶支鏈的c6烷基；c1-c6烷氧基是指甲氧基，乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、叔丁氧基、直鏈或帶支鏈的c5烷氧基、直鏈或帶支鏈的c6烷氧基；c3-c6環(huán)烷基是指環(huán)丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊基，環(huán)己基；任選取代的苯基是指任選被h，鹵素，硝基，氨基，c1-c6烷基，c1-c6烷氧基單取代或多取代的苯基。其中烷基優(yōu)選c1-c6烷基、烷氧基優(yōu)選甲氧基。本發(fā)明還選自：(2s,4r)-1-((s)-1-(4-(((s)-8-(3-溴芐基)-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氫喋啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯基)-15-(叔丁基)-1,13-二氧-5,8,11-三噁-2,14-二氮雜十六烷-16-?；?-4-羥基-n-(4-(4-甲基噻唑-5-基)芐基)吡咯烷-2-甲酰胺；(2s,4r)-1-((s)-15-(叔丁基)-1-(4-(((s)-8-環(huán)戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氫蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯基)-1,13-二氧-5,8,11-三噁-2,14-二氮雜十六烷-16-?；?-4-羥基-n-(4-(4-甲基噻唑-5-基)芐基)吡咯烷-2-甲酰胺；(2s,4r)-1-((s)-15-(叔丁基)-1-(4-(((s)-7-乙基-8-異丙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氫喋啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯基)-1,13-二氧-5,8,11-三噁-2,14-二氮雜十六烷-16-酰基)-4-羥基-n-(4-(4-甲基噻唑-5-基)芐基)吡咯烷-2-甲酰胺。此外，本發(fā)明包括藥物組合物，該組合物含有通式ⅰ化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物和藥物上可接受的賦形劑。所述藥物上可接受的賦形劑是指任何可用于藥物領(lǐng)域的稀釋劑、輔助劑和/或載體。本發(fā)明的化合物可以與其他活性成分組合使用，只要它們不產(chǎn)生其它不利作用，例如過敏反應(yīng)。本發(fā)明的藥物組合可配置成若干劑型，其中含有藥物領(lǐng)域中常用的一些賦形劑，例如，口服制劑(如片劑，膠囊劑，溶液或混懸液)；可注射的制劑(如可注射的溶液或混懸劑，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)；局部制劑(例如軟膏或溶液)。用于本發(fā)明藥物組合物的載體是藥物領(lǐng)域中可得到的常見類型，包括：口服制劑用的粘合劑、潤滑劑、崩解劑、助溶劑、稀釋劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、色素、矯味劑等；可注射制劑用的防腐劑、加溶劑、穩(wěn)定劑等；局部制劑用的基質(zhì)、稀釋劑、潤滑劑、防腐劑等。藥物制劑可以經(jīng)口服或胃腸外方式(例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或局部)給藥，如果某些藥物在胃部條件下是不穩(wěn)定的，可將其配制成腸衣片劑。通過體外抑酶試驗和酶降解試驗篩選，我們發(fā)現(xiàn)本化合物可抑制并降解plk1和brd4蛋白酶活力。因此，本發(fā)明化合物可用于與plk1和brd4蛋白酶活性異常表達(dá)相關(guān)的疾病中的應(yīng)用，如各種癌癥。通過體外活性篩選，我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明化合物具有抗腫瘤活性，因此本發(fā)明化合物可以用于制備治療和/或預(yù)防各種癌癥的藥物，如乳腺癌，結(jié)腸癌，前列腺癌，胰腺癌，非小細(xì)胞肺癌，甲狀腺乳頭狀癌，卵巢癌、黑色素瘤、或各種白血病，特別是急性髓性白血病。本發(fā)明化合物可作為唯一的抗癌藥物使用，或者與一種或多種其它抗腫瘤藥物聯(lián)合使用。聯(lián)合治療通過將各個治療組分同時，順序或隔開給藥來實現(xiàn)。本發(fā)明選用化合物a結(jié)構(gòu)類似物作為protacs中與e3連接酶進(jìn)行結(jié)合的部位，選用連接鏈將其于同時具有polo樣激酶1(plk1)和溴結(jié)構(gòu)域蛋白4(brd4)蛋白酶抑制劑活性的結(jié)構(gòu)相連接構(gòu)建protacs。同時因構(gòu)建的化合物針對plk1和brd4雙靶點，相對于單靶點藥物可降低其抗腫瘤活性的耐藥性。體外plk1和brd4蛋白酶抑制活性、體外抗腫瘤活性測試及體外plk1和brd4蛋白降解活性表明，該類靶向泛素化降解plk1和brd4蛋白的化合物(protacs)可將plk1和brd4靶向蛋白降解，具有良好的抗腫瘤活性，并表現(xiàn)出優(yōu)異的plk1和brd4抑制作用。本發(fā)明制備方法操作簡單，條件溫和，所得化合物均具有plk1和brd4蛋白酶抑制和降解活性，抗腫瘤作用顯著。具體實施方式下文中提供的實施例和制備例進(jìn)一步闡明和舉例說明本化合物及其制備方法，應(yīng)當(dāng)理解，下述實施例和制備例的范圍并不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。下面的合成路線描述了本發(fā)明的通式i化合物的制備，所有的原料都是通過這些路線中描述的方法、通過有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法制備的或者可商購。本發(fā)明的全部最終化合物都是通過這些路線中描述的方法或通過與其類似的方法制備的，這些方法是有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。這些路線中應(yīng)用的全部可變因數(shù)如下文的定義或如權(quán)利要求中的定義。反應(yīng)試劑及反應(yīng)條件:(a)nabh(oac)3,na2co3(b)k2co3,丙酮；(c)zn,nh4cl(d)nah,ch3i；(e)meoh,hcl；(f)hatu,dipea。按照本發(fā)明的通式i化合物，合成路線中各取代基如
發(fā)明內(nèi)容部分所定義?；衔?1)的制備d-2-氨基丁酸甲酯5g，苯甲醛衍生物43mmol加入到二氯甲烷50ml中，冰浴下加入三乙酰氧基硼氫化鈉10g，室溫反應(yīng)24h,加飽和碳酸氫鈉水溶液50ml,二氯甲烷萃取，合并有機(jī)相，無水硫酸鎂干燥，過濾蒸干得淡黃色液體化合物(1)。(r)-甲基2-(3-溴芐氨基)丁酸甲酯(1a)產(chǎn)率：82％；1h-nmr(cdcl3，400mhz)，δ:0.96(t,3h，ch3),1.56-1.66(m,2h,ch2),3.24-3.28(m,1h,ch),3.56(d,1h,ch),3.68(s,3h,ch3),3.70(d,1h,ch),7.16-7.27(m,2h,arh),7.34-7.39(m,1h,arh),7.48(s,1h,arh)。(r)-甲基-2-(異丙胺基)丁酸甲酯(1b)產(chǎn)率：95％；1h-nmr(cdcl3，400mhz)，δ：0.82-0.88(m,9h,ch3×3)，1.51-1.59(m,3h,ch，ch2),2.14-2.17(m,1h,ch),2.25-2.32(m,1h,ch),3.06(t,1h,ch),3.62(s,3h,ch3)。(r)-甲基2-(環(huán)戊胺基)丁酸甲酯(1c)產(chǎn)率：92％；1hnmr(cdcl3，400mhz),δ:0.87(t,3h,ch3),1.24-1.26(m,2h,ch2),1.46(dd,2h,ch2),1.54-1.83(m,6h,ch2×3),2.92-2.96(m,1h,ch),3.17(t,1h,ch),3.68(s,3h,ch3)?；衔?2)的制備化合物(1)(54mmol),k2co37.5g加入到丙酮180ml中，0℃下加入2,4-二氯-5-硝基嘧啶10.5g的丙酮溶液20ml,室溫反應(yīng)24h,過濾，蒸干，硅膠柱層析(乙酸乙酯：石油醚1：20)，得化合物(2)。(r)-甲基2-(n-(3-溴芐基)-n-(2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)丁酸甲酯(2a)產(chǎn)率：74％；1hnmr(400mhz,cdcl3)，δ:1.04(t,3h,ch3),2.02-2.08(m,1h,ch),2.20-2.28(m,1h,ch),3.84(s,3h，ch3),4.58(d,1h,ch),4.66-4.78(m,2h,2×ch),7.16-7.27(m,2h,2×arh),7.34-7.39(m,1h,arh),7.48(s,1h,arh),8.68(s,1h,pyrimidine-h)。(r)-甲基-2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)(異丙氨基)丁酸甲酯(2b)產(chǎn)率：72％；1hnmr(400mhz,cdcl3)，δ:0.68(d,3h,ch3),0.78(d,3h,ch3),0.92(t,3h,ch3),1.88-2.06(m,3h,ch,ch2),2.98-3.05(m,1h,ch),3.13-3.18(m,1h,ch),3.62(s,3h,ch3),4.38(t,1h,ch),8.84(s,1h,pyrimidine-h)。(r)-甲基-2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)(環(huán)戊烷基)氨基)丁酸甲酯(2c)產(chǎn)率，60％；1hnmr(400mhz,cdcl3)，δ:1.04(t,3h，ch3),1.46-1.88(m,6h，ch2×3),2.02-2.09(m,2h，ch2),2.12-2.28(m,1h,ch),2.32-2.48(m,1h,ch),3.45-3.61(m,1h,ch),3.63-3.81(m,4h,ch,ch3),8.65(s,1h,pyrimidine-h)?；衔?3)的制備化合物(2)(50mmol),還原鋅粉30g，nh4cl8.1g加入甲醇200ml中，加熱回流24h.過濾蒸干，硅膠柱層析(乙酸乙酯：石油醚1：4)得化合物(3)。(r)-8-(3-溴芐基)-2-氯-7-乙基-7，8-二氫蝶啶-6(5h)-酮(3a)產(chǎn)率：72％，1hnmr(400mhz,cdcl3)，δ:0.76(t,3h,ch3),1.76-1.82(m,2h,ch2),4.16-4.19(m,1h,ch),4.48(d,1h,ch),5.14-5.18(m,1h,ch),7.16-7.27(m,2h,arh),7.34-7.39(m,1h,arh),7.48(s,1h,arh),7.69(s,ch，pyrimidine-h),10.86(s,1h,nh)。(r)-2-氯-7-乙基-8異丙基-7,8-二氫蝶啶-6(5h)-酮(3b)產(chǎn)率：60％；1hnmr(400mhz,cdcl3)，δ:0.78(t,3h,ch3),0.83(d,3h,ch3),0.92(d,3h,ch3),1.78-1.86(m,2h,ch2),2.03-2.09(m,1h,ch),2.83-2.88(m,1h,ch),3.90-3.96(m,1h,ch),4.16-4.18(m,1h,ch),7.57(s,1h,pyrimidine-h),10.88(s,1h,nh)。(r)-2-氯-8-環(huán)戊基-7-乙基-7,8-二氫蝶啶-6(5h)-酮(3c)產(chǎn)率：60％；1hnmr(400mhz,cdcl3)，δ：0.92(t,3h,ch3),1.56-1.69(m,2h,ch2),1.78(t,2h,ch2),1.82-2.00(m,5h,ch,ch2×2),2.00-2.16(m,1h,ch),4.20(dd,1h,ch),4.24-4.38(m,1h,ch),7.72(s,1h,pyrimidine-h),10.03(s,1h,nh)?；衔?4)的制備化合物(3)(20mmol)，碘甲烷3.4g,加入dmf50ml，-15℃下加入60％氫化鈉1.2g,室溫反應(yīng)3h,加入冰水100ml,乙酸乙酯萃取，蒸干，硅膠柱層析(乙酸乙酯：石油醚1：4)得化合物(4)。(r)-8-(3-溴芐基)-2-氯-7-乙基-7，8-二氫-5-甲基蝶啶-6(5h)-酮(4a)產(chǎn)率：72％，1hnmr(400mhz,cdcl3)，δ:0.73(t,3h,ch3),1.78-1.82(m,2h,ch2),3.26(s,3h,ch3),4.28(t,1h,ch),4.46(d,1h,ch),5.18(d,1h,ch),7.16-7.27(m,2h,arh),7.34-7.39(m,1h,arh),7.48(s,1h,arh),7.68(s,1h，pyrimidine-h)。(r)-2-氯-7-乙基-8-異丙基-5-甲基-二氫-5-甲基蝶啶-6(5h)-酮(4b)產(chǎn)率：68％,1hnmr(400mhz,cdcl3),δ:0.82(t,3h,ch3),0.86(d,3h,ch3),0.96(d,3h,ch3),1.74-1.80(m,1h,ch),1.86-1.90(m,1h,ch),1.92-2.08(m,1h,ch),2.64(dd,1h,ch),3.32(s,3h,ch3),4.12-4.18(m,2h,ch×2),7.62(s,1h,pyrimidine-h).(r)-2-氯-8-環(huán)戊基-7-乙基5-甲基-二氫-5-甲基蝶啶-6(5h)-酮(4c)產(chǎn)率：70％,1hnmr(400mhz,cdcl3),δ:0.86(t,3h,ch3),1.54-2.00(m,9h,ch,ch2×4),2.00-2.13(m,1h,ch),3.32(s,3h,ch3),4.26(dd,1h,ch),4.26-4.40(m,1h,ch),7.68(s,1h,pyrimidine-h)。化合物(5)的合成化合物(4)(7.2mmol),4-氨基-3-甲氧基苯甲酸1.2g,加入甲醇3ml,水12ml和濃鹽酸1.5ml，回流48h.減壓蒸干溶劑，甲醇和乙醚重結(jié)晶得化合物(5)。4-((r)-8-(3-溴芐基)-7-乙基-5,6,7,8-四氫-5-甲基-6-氧蝶啶-2-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(5a)產(chǎn)率：82％，1hnmr(400mhz,cdcl3)，δ:0.72(t,3h,ch3),1.78-1.82(m,2h,ch2),3.26(s,3h,ch3),3.92(s,3h,ch3),4.29(t,1h,ch),4.44(d,1h,ch),5.14(d,1h,ch),7.16-7.27(m,2h,arh),7.34-7.39(m,1h,arh),7.48(s,1h,arh),7.58(d,1h，arh)，7.61(dd,1h，arh),7.88(s,1h，arh)，9.86(d,1h，arh)。(r)-4-(8-異丙基-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氫喋啶-2-氨基)-3-甲氧基苯甲酸(5b)產(chǎn)率，65％，1hnmr(400mhz,cdcl3),δ:0.82(t,3h,ch3),0.86(d,3h,ch3),0.92(d,3h,ch3),1.72-1.80(m,1h,ch),1.86-1.90(m,1h,ch),1.92-2.06(m,1h,ch),2.64(dd,1h,ch),3.32(s,3h,ch3),4.11-4.18(m,2h,ch×2),7.56(d,1h,arh),7.62(dd,1h,arh),7.84(s,1h,arh),7.89(d,1h,arh),9.62(s,1h,arh)。(r)-4-(8-環(huán)戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氫喋啶-2-氨基)-3-甲氧基苯甲酸(5c)產(chǎn)率：60％，1hnmr(400mhz,cdcl3)，δ:0.75(t,3h,ch3),1.36-1.58(m,4h,ch2×2),1.66-2.03(m,6h,ch2×3),3.22(s,3h,ch3),3.54(s,1h,ch),3.92(s,3h,ch3),4.12-4.19(m,1h,ch),4.44-4.49(m,1h,ch),7.58(d,1h,arh),7.61(dd,1h,arh),7.87(s,1h,arh),7.94(d,1h,arh),9.65(s,1h,arh)?；衔?6a)的合成路線叔丁基-4-溴氨基甲酸芐酯(8)的制備對溴苯乙胺4.0g，nahco32.0g，加入水20ml，乙酸乙酯20ml,冰浴下加入(boc)2o5.5g，冰浴反應(yīng)2h。過濾，干燥得白色固體化合物(8)6g。1hnmr(400mhz,cd4od)，δ：1.49(s,9h，ch3×3),4.26(s,2h，ch2),7.15(d,2h，arh),7.44(d,2h,arh×2).(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)甲胺鹽酸鹽(9)的制備化合物(8)4.0g，4-甲基噻唑2.8g,醋酸鈀30mg,醋酸鉀2.8g加入dmf10ml,n2保護(hù)下90℃反應(yīng)24h。冷卻到室溫過濾，濾液加水50ml水，室溫攪拌4h。過濾，干燥得白色固體3.5g。上述固體溶解到20ml飽和鹽酸甲醇溶液中，室溫攪拌3h，過濾，干燥得固體化合物(9)2.5g。1hnmr(400mhz,cd4od)，δ:2.47(s,3h,ch3),3.85(s,2h,ch2),7.42-7.52(m,4h,arh×4),8.87(s,1h,thiazole-h).(2s,4r)-1-{(s)-2-[(叔丁氧羰)氨基]-3,3-二甲基丁?；鶀-4-羥基吡咯烷-2-羧酸(10)的制備hatu2.5g，n-boc-l-叔亮氨酸1.25g,反式-4-羥基-l-脯氨酸甲酯鹽酸鹽1.0g，dipea2.5g加入到dmf10ml中。室溫反應(yīng)18h。加入水50ml,乙酸乙酯萃取。有機(jī)相先后用飽和氯化銨水溶液，飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和食鹽水清洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓蒸干得油狀物1.8g。該油狀物加入氫氧化鋰2.5g，thf20ml和水10ml。室溫攪拌過夜。將thf蒸干，加入10ml冰水,3nhci調(diào)ph2-3。過濾，濾餅水洗，干燥得白色固體化合物(10)1.5g。1hnmr(400mhz,dmso-d6)，δ：0.94(s,9h,ch3×3)，1.38(s,9h,ch3×3),1.85-1.91(m,1h,ch)，2.08-2.13(m,1h,ch),3.57-3.66(m,2h,ch2),4.16(d,1h,ch),4.25(t,1h,ch),4.32(brs,1h,nh),5.19(brs,1h，oh),6.50(d,1h，cooh).(2s,4r)-1-((s)-2-氨基-3,3-二甲基丁?；?-4-羥基-n-(4-(4-甲基噻唑-5-基)芐基)吡咯烷-2-甲酰胺鹽酸鹽(11)的制備hatu4.0g,化和物(10)3.0g,化合物(9)2.0g,dipea3.0g,加入無水thf50ml。室溫攪拌2h,蒸干加50ml水,攪拌4h，過濾，固體烘干。取上述固體3.0g溶解到10ml飽和hci甲醇溶液中,室溫攪拌3h。過濾，干燥得化合物(11)2.0g。1hnmr(400mhz,cd4od):δ0.93(s,9h,ch3×3),2.09-2.14(m,1h),2.49-2.52(m,4h,ch2×2),2.60(s,2h,ch2),3.58-3.62(m,1h,ch),4.07(d,1h,ch),4.33(dd,1h,ch),4.48-4.56(m,3h,ch×3),4.71(t,1h,ch),7.35(dd,4h,arh×4),8.67(s,1h,thiazole-h).(2s,4r)-1-((s)-14-疊氮-2-(叔丁基)-4-氧-6,9,12-三噁-3-氮雜十四?；?-4-羥基-n-(4-(4-甲基噻唑-5-基)芐基)吡咯烷-2-甲酰胺(13)的制備化合物(11)2.0g化合物(12)11-疊氮基-3,6,9-三氧代十一酸(cas：172531-37-2)1.2g，加入dmf20ml，hatu2.0g,dipea2.0g。室溫攪拌4h,加水200ml,乙酸乙酯萃取，有機(jī)相減壓蒸干，硅膠柱層析(甲醇：二氯甲烷1：10)，得化合物(13)2.4g。1h-nmr(cdcl3,400mhz)，δ:0.95(s,9h，ch3×3),2.09-2.14(m,1h,ch),2.52(s,3h,ch3),2.58-2.63(m,1h,ch),2.85(s,1h,ch),3.37(t,2h,ch2),3.60(dd,1h,ch),3.64-3.69(m,10h,ch2×5),3.96-4.05(m,2h,ch2),4.12-4.14(m,1h,ch),4.34(dd,1h,ch),4.46(d,1h,ch),4.53-4.59(m,2h,ch2),4.75(t,1h,ch),7.33-7.38(m,4h,arh×4),8.86(s,1h,thiazole-h)；(2s,4r)-1-((s)-14-氨基-2-(叔丁基)-4-氧-6,9,12-三噁-3-氮雜十四酰基)-4-羥基-n-(4-(4-甲基噻唑-5-基)芐基)吡咯烷-2-甲酰胺(6a)的制備化合物(13)1.0g加入甲醇20ml,10％pd/c0.1g,常壓下通氫氣室溫反應(yīng)6h,過濾，蒸干得化合物(6a)0.9g。實施例1：(2s,4r)-1-((s)-1-(4-(((s)-8-(3-溴芐基)-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氫喋啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯基)-15-(叔丁基)-1,13-二氧-5,8,11-三噁-2,14-二氮雜十六烷-16-?；?-4-羥基-n-(4-(4-甲基噻唑-5-基)芐基)吡咯烷-2-甲酰胺(7a)的制備化合物(6a)0.5g,化合物(5a)0.45g加入10mlofdmf中，然后加入hatu0.4g,dipea0.4g,室溫反應(yīng)3h。加50ml水，乙酸乙酯萃取，萃取液飽和食鹽水清洗，無水硫酸鎂干燥，減壓蒸干，硅膠柱層析(甲醇：二氯甲烷1:10)得化合物(7a)0.75g。1hnmr(400mhz,cdcl3)，δ:0.72(t,3h,ch3),0.95(s,9h，ch3×3),1.78-1.82(m,2h,ch2),2.09-2.14(m,1h,ch),2.52(s,3h,ch3),2.58-2.63(m,1h,ch),2.85(s,1h,ch),3.26(s,3h,ch3),3.37(t,2h,ch2),3.60(dd,1h,ch),3.64-3.69(m,10h,ch2×5),3.92(s,3h,ch3),3.96-4.05(m,2h,ch2),4.12-4.14(m,1h,ch),4.29(t,1h,ch),4.34(dd,1h,ch),4.44(d,1h,ch),4.46(d,1h,ch),4.53-4.59(m,2h,ch2),4.75(t,1h,ch),5.14(d,1h,ch),7.16-7.27(m,2h,arh),7.34-7.39(m,5h,arh×5),7.48(s,1h,arh),7.58(d,1h,arh)，7.61(dd,1h，arh),7.88(s,1h，arh)，8.86(s,1h,thiazole-h),9.86(d,1h，arh)。實施例2：(2s,4r)-1-((s)-15-(叔丁基)-1-(4-(((s)-8-環(huán)戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氫蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯基)-1,13-二氧-5,8,11-三噁-2,14-二氮雜十六烷-16-?；?-4-羥基-n-(4-(4-甲基噻唑-5-基)芐基)吡咯烷-2-甲酰胺(7b)的制備化合物(6a)0.5g,化合物(5b)0.35g加入10mlofdmf中，然后加入hatu0.4g,dipea0.4g,室溫反應(yīng)3h。加50ml水，乙酸乙酯萃取，萃取液飽和食鹽水清洗，無水硫酸鎂干燥，減壓蒸干，硅膠柱層析(甲醇：二氯甲烷1:10)得化合物(7b)0.6g。1hnmr(400mhz,cdcl3),δ:0.75(t,3h,ch3),0.95(s,9h，ch3×3),1.59-1.36(m,4h,ch2×2),1.67-2.03(m,6h,ch2×3),2.09-2.14(m,1h,ch),2.52(s,3h,ch3),2.58-2.63(m,1h,ch),2.85(s,1h,ch),3.22(s,3h,ch3),3.37(t,2h,ch2),3.54(s,1h,ch),3.60(dd,1h,ch),3.64-3.69(m,10h,ch2×5),3.91(s,3h,ch3),3.96-4.05(m,2h,ch2),4.12-4.14(m,1h,ch),4.19(m,1h,ch),4.34(dd,1h,ch),4.46-4.49(m,2h,ch×2),4.53-4.59(m,2h,ch2),4.75(t,1h,ch),7.33-7.38(m,4h,arh×4),7.58(d,1h,arh),7.61(dd,1h,arh),7.87(s,1h,arh),7.94(d,1h,arh),8.86(s,1h,thiazole-h),9.65(s,1h,arh)。實施例3：(2s,4r)-1-((s)-15-(叔丁基)-1-(4-(((s)-7-乙基-8-異丙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氫喋啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯基)-1,13-二氧-5,8,11-三噁-2,14-二氮雜十六烷-16-?；?-4-羥基-n-(4-(4-甲基噻唑-5-基)芐基)吡咯烷-2-甲酰胺(7c)的制備化合物(6a)0.5g,化合物(5c)0.35g加入10mlofdmf中，然后加入hatu0.4g,dipea0.4g,室溫反應(yīng)3h。加50ml水，乙酸乙酯萃取，萃取液飽和食鹽水清洗，無水硫酸鎂干燥，減壓蒸干，硅膠柱層析(甲醇：二氯甲烷1:10)得化合物(7c)0.6g。1hnmr(400mhz,cdcl3),δ:0.81(t,3h,ch3),0.85(d,3h,ch3),0.93(d,3h,ch3),0.95(s,9h，ch3×3),1.73-1.80(m,1h,ch),1.85-1.90(m,1h,ch),1.91-2.07(m,1h,ch),2.09-2.14(m,1h,ch),2.52(s,3h,ch3),2.58-2.65(m,2h,ch×2),2.85(s,1h,ch),3.31(s,3h,ch3),3.37(t,2h,ch2),3.60(dd,1h,ch),3.64-3.69(m,10h,ch2×5),3.96-4.05(m,2h,ch2),4.12-4.18(m,3h,ch×3),4.34(dd,1h,ch),4.46(d,1h,ch),4.53-4.59(m,2h,ch2),4.75(t,1h,ch),7.33-7.38(m,4h,arh×4),7.56(d,1h,arh),7.62(dd,1h,arh),7.84(s,1h,arh),7.89(d,1h,arh),8.86(s,1h,thiazole-h),9.62(s,1h,arh)。實施例4：plk1蛋白抑制活性測定用elsia方法測定化合物對plk1蛋白的抑制活性，96孔微板孔中依次加入plk1純化蛋白，2.5μldmso稀釋的不同濃度抑制劑，150mm底物、10mmatp、90μl反應(yīng)緩沖液，，同時設(shè)立空白和本底對照組，室溫孵育30min。洗板，加入100μlppt-07,室溫孵育30min。洗板，每孔中加入100μl抗兔的辣根連接的二抗，室溫下孵育30min。洗板，每孔中加入100ul顯色劑，室溫下孵育15min。每孔加入100ul反應(yīng)終止液，以激發(fā)光450nm，測定各孔熒光計數(shù)，計算抑制率ic50。實施例5：brd4蛋白抑制活性測定方法采用時間分辨熒光(tr-fret)法通過brd4bromodomain1tr-fretassaykit(caymanchemical，usa)測定化合物對brd4蛋白的抑制活性。將10uldmso溶解的不同濃度的抑制劑加入384微孔板中中，加入5ul含10nmbrd4的蛋白反應(yīng)緩沖液。室溫孵育15分鐘。隨后每孔加入5ulac-h4肽和tr-fret檢測試劑[anti-6his-xl665和streptavidin-eu]混合液，黑暗中室溫孵育1h。測量在330-350nm下激發(fā)后在620nm和665nm處的熒光發(fā)射。將在665nm和622nm處的發(fā)射的比率作為所形成的brd4/ac-h4復(fù)合物的量的指示，計算化合物對brd4蛋白的抑制活性ic50?；衔锞幪杙lk1ic50(nm)brd4ic50(nm)7a40.610.87b20.442.67c12.2207.6實施例6：mtt法測定腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性方法的建立以及化合物活性測定將處于細(xì)胞對數(shù)生長期的要進(jìn)行實驗的腫瘤細(xì)胞(hepg2、a549、hela、mv4-11)按一定的細(xì)胞量接種于培養(yǎng)板內(nèi)，培育24h,加入不同濃度抑制劑，細(xì)胞在37℃、5％co2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48小時，每孔加入20ulmtt溶液繼續(xù)培養(yǎng)4小時，用dmso溶解結(jié)晶，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長處測定其od值計算ic50。實施例7：western-blot測定plk1和brd4蛋白降解方法將藥物干預(yù)過的hela或mv4-11細(xì)胞收集，用預(yù)冷的pbs洗滌2次，pmsf與ripa裂解液以1：100的比例混合，冰上裂解細(xì)胞20min，4℃，12000r/min×20min離心，取上清，即細(xì)胞總蛋白，用bca法定量檢測蛋白量，用5×蛋白上樣緩沖液稀釋蛋白后100℃變性5min。蛋白在sds－page電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉2h，一抗4℃孵育過夜。tbst洗膜，二抗1:1000孵育2h，化學(xué)發(fā)光后x膠片顯影，用imagej軟件分析每個條帶的灰度值，計算蛋白降解50％時抑制劑濃度dc50。化合物編號helaplk1dc50(nm)mv4-11brd4dc50(nm)7a66.418.67b14.824.27c17.8256.8當(dāng)前第1頁12