本發(fā)明屬于醫(yī)療領(lǐng)域，具體涉及一種靶向缺血心肌的VEGF重組蛋白的構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

心肌梗死(myocardial infarction，MI)在全球是發(fā)病率和致死率最高的疾病之一(Go et al.,2014)，嚴(yán)重威脅人類的健康和生存，而針對(duì)心肌梗死的治療目前還沒(méi)有有效的方法。重建梗死部位的血循環(huán)系統(tǒng)，誘導(dǎo)心肌再生是心肌梗死治療策略中非常重要的方面。臨床上主要以血管成形術(shù)或側(cè)枝手術(shù)來(lái)恢復(fù)血供(van der Spoel et al.,2011)，用生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)治療性的血管再生也是一種極具潛力的方法。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelia growth factor，VEGF)是最有效的促進(jìn)血管再生的細(xì)胞因子之一，同時(shí)它也可以抑制細(xì)胞凋亡并介導(dǎo)心肌前體細(xì)胞的遷移和分化(Ramakrishnan et al.,2014；Yla-Herttuala et al.,2007)。但是VEGF在體內(nèi)極易擴(kuò)散，使得局部濃度降低，也增加了潛在的風(fēng)險(xiǎn)。在對(duì)心肌梗死的治療中，很多報(bào)道都證明了VEGF基因或重組蛋白在動(dòng)物模型中有效加強(qiáng)了側(cè)支灌注，減小了梗死面積，改善了心功能。但是在臨床試驗(yàn)中，VEGF重組蛋白因?yàn)闃O易擴(kuò)散而呈現(xiàn)出劑量依賴的效應(yīng)(Hendel et al.,2000；Henry et al.,2003；Jacquier et al.,2007；Lopez et al.,1998)，而高濃度的VEGF又可能會(huì)有副作用(Lee et al.,2000；Matsuno et al.,2002)。針對(duì)這些缺陷，如何進(jìn)行靶向治療，降低擴(kuò)散導(dǎo)致的風(fēng)險(xiǎn)，是有效安全地應(yīng)用VEGF所必需考慮的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種融合蛋白。

本發(fā)明提供的融合蛋白，命名為IMT-VEGF，為如下a或b：

a)、所述融合蛋白包括VEGF₁₆₅和靶向多肽IMT及用于連接二者的連接肽；

b)、所述融合蛋白為a)所示融合蛋白的C端融合標(biāo)簽蛋白得到的融合蛋白；

所述VEGF₁₆₅的氨基酸序列為序列表中序列2第1-166位氨基酸；

所述靶向多肽IMT的氨基酸序列為序列表中序列2第178-186位氨基酸。

上述融合蛋白中，a)、所述融合蛋白依次包括VEGF₁₆₅、連接肽和靶向多肽IMT；

b)、所述融合蛋白依次包括VEGF₁₆₅、連接肽、靶向多肽IMT和6個(gè)His標(biāo)簽。

上述融合蛋白為如下1)或2)或3)：

1)序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；

2)序列表中序列2第1-186位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)；

3)將1)或2)所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由1)或2)所示序列衍生的蛋白質(zhì)。

上述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加

編碼上述融合蛋白的DNA分子也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述DNA分子是如下1)-4)中任一種的DNA分子：

1)編碼區(qū)為序列表中序列1所示的DNA分子；

2)編碼區(qū)為序列表中序列1第4-558位核苷酸所示的DNA分子；

3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子；

4)與1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。

上述嚴(yán)格條件為在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下雜交,然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含上述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述重組載體為將上述DNA分子插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)上述蛋白的重組載體，在本發(fā)明的實(shí)施例中，重組載體為將序列表中序列1所示的融合蛋白IMT-VEGF編碼基因替換pET28a載體的XbaI和XhoI酶切位點(diǎn)間的DNA分子得到的載體，命名為pET28a-IMT-VEGF，表達(dá)融合蛋白IMT-VEGF。

擴(kuò)增上述DNA分子全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述融合蛋白、上述DNA分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備具有如下1)-9)中至少一種功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍：

1)刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖；

2)提高VEGF的心肌靶向性；

3)治療動(dòng)物心肌損傷；

4)提高α-smooth muscle actin陽(yáng)性的成熟血管數(shù)目，

5)提高von Willebrand Factor陽(yáng)性的毛細(xì)血管數(shù)目；

6)促進(jìn)心臟梗死區(qū)域血管再生；

7)提高心肌細(xì)胞的存活；

8)抑制心臟梗死邊緣區(qū)域的細(xì)胞凋亡；

9)增加VEGF有效的局部濃度。

上述心肌損傷為心肌梗死。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種具有如下1)-9)中至少一種功能的產(chǎn)品。

本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其包括上述融合蛋白、上述DNA分子、上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌：

1)刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖；

2)提高VEGF的心肌靶向性；

3)治療動(dòng)物心肌損傷；

4)提高α-smooth muscle actin陽(yáng)性的成熟血管數(shù)目，

5)提高von Willebrand Factor陽(yáng)性的毛細(xì)血管數(shù)目；

6)促進(jìn)心臟梗死區(qū)域血管再生；

7)提高心肌細(xì)胞的存活；

8)抑制心臟梗死邊緣區(qū)域的細(xì)胞凋亡；

9)增加VEGF有效的局部濃度。

所述產(chǎn)品為試劑盒。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明設(shè)計(jì)并驗(yàn)證了一個(gè)全新的缺血心肌靶向的重組VEGF蛋白IMT-VEGF，它能夠通過(guò)靜脈注射靶向到梗死區(qū)域從而增加VEGF有效的局部濃度。在體外檢測(cè)了它的生物學(xué)活性并在體內(nèi)驗(yàn)證了它募集到缺血損傷部位的靶向能力。利用大鼠的心臟缺血再灌注模型，證明了靜脈注射該融合蛋白可以有效減少梗死面積，增加梗死區(qū)域的血管再生和心肌存活，促進(jìn)心功能的恢復(fù)。這是一種很有應(yīng)用前景的可用于靶向療法的重組VEGF蛋白，可通過(guò)靜脈注射靶向到缺血的心肌組織，促進(jìn)損傷的修復(fù)和心臟功能的恢復(fù)。

附圖說(shuō)明

圖1為IMT-VEGF蛋白的表達(dá)及活性檢測(cè)。

圖2為IMT-VEGF蛋白在缺血心肌組織富集。

圖3為IMT-VEGF蛋白靶向到缺血心肌。

圖4為IMT-VEGF蛋白靜脈顯著減小大鼠心肌梗死面積。

圖5為IMT-VEGF蛋白促進(jìn)大鼠心梗后的血管再生并抑制細(xì)胞凋亡。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、融合蛋白IMT-VEGF的獲得

1、融合蛋白IMT-VEGF

融合蛋白IMT-VEGF包括VEGF₁₆₅和靶向多肽IMT及連接二者的連接肽；

融合蛋白IMT-VEGF也可以包括VEGF₁₆₅、連接肽、靶向多肽IMT和6個(gè)His標(biāo)簽(圖1A)。

融合蛋白IMT-VEGF的氨基酸序列為序列2，序列2第1-166位為VEGF₁₆₅、序列2第167-177位為連接肽、序列2第178-186位為靶向多肽IMT、序列2第187-188位為XhoI酶切識(shí)別位點(diǎn)編碼的氨基酸殘基、序列2第189-194位為6個(gè)His標(biāo)簽。

融合蛋白IMT-VEGF編碼基因的核苷酸序列為序列1，序列1第4-498位為VEGF₁₆₅編碼基因、序列1第499-531位為連接肽編碼基因、序列1第532-558位為靶向多肽IMT編碼基因、序列1第559-564位為XhoI酶切識(shí)別位點(diǎn)、序列1第565-582位為6個(gè)His標(biāo)簽編碼基因。

融合蛋白IMT-VEGF編碼基因可以人工合成。

2、表達(dá)融合蛋白IMT-VEGF的重組載體的構(gòu)建

根據(jù)已知的pET28a-CBD-VEGF的核苷酸序列(序列5)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物并在反向引物中引入靶向多肽的編碼序列“CSTSMLKAC”。

引物序列如下：

正向引物：5’TCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGA 3’(序列3)

反向引物：5’TACTCGAGGCACGCTTTCAGCATGCTGGTGCTGCAACCGCCAGAACCCGCAGCAC 3’(序列4)

以序列5所示的DNA分子為模板，用正向引物和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到766bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

回收766bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶XbaI和XhoI雙酶切，得到的酶切產(chǎn)物與經(jīng)同樣酶切pET28a(Novagen)骨架載體連接，得到重組載體。

經(jīng)過(guò)測(cè)序，重組載體為將序列表中序列1所示的融合蛋白IMT-VEGF編碼基因替換pET28a載體的XbaI和XhoI酶切位點(diǎn)間的DNA分子得到的載體，命名為pET28a-IMT-VEGF，表達(dá)融合蛋白IMT-VEGF。

對(duì)照載體pET28a-VEGF為將序列5第5071-5568位核苷酸所示的VEGF蛋白編碼基因替換pET28a載體的XbaI和XhoI酶切位點(diǎn)間的DNA分子得到的載體，命名為pET28a-IMT-VEGF，表達(dá)融合蛋白IMT-VEGF。

3、融合蛋白IMT-VEGF的表達(dá)和純化

將構(gòu)建的具有組氨酸親和標(biāo)簽的上述2獲得的重組載體pET28a-IMT-VEGF轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到重組菌BL21(DE3)/pET28a-IMT-VEGF(提取質(zhì)粒，測(cè)序的確為pET28a-IMT-VEGF，證明為陽(yáng)性克隆)。

將對(duì)照載體pET28a-VEGF轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞得到重組菌BL21(DE3)/pET28a-VEGF。

重組菌BL21(DE3)/pET28a-IMT-VEGF在37℃下培養(yǎng)。挑選單克隆轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)16小時(shí)，然后以2％比例轉(zhuǎn)入擴(kuò)增LB培養(yǎng)基中。測(cè)得菌液OD值在0.6-0.8之間時(shí)，加入終濃度為1mM的IPTG，37℃下繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，8,000rpm離心收集菌體，用PBS洗滌3次。用PBS(含0.5M NaCl)菌體，超聲處理(100W，總時(shí)間15min，單次超聲時(shí)間5s，單次間隔時(shí)間5s)，13,000g離心30分鐘收集沉淀即為包涵體。包涵體用洗滌液洗滌3次，每次室溫輕搖5分鐘，12,000rpm，4℃收集包涵體。用溶解液溶解6-12個(gè)小時(shí)，12,000rpm 4℃離心收集上清。以1:10的比例滴加復(fù)性液(20mM Tris,0.5M NaCl,1mM氧化型谷胱甘肽，5mM還原型谷胱甘肽，pH＝8.0)，輕搖120個(gè)小時(shí)。

復(fù)性完的溶液pH調(diào)至7.2-7.6，0.22μm濾膜過(guò)濾，經(jīng)蛋白質(zhì)純化儀進(jìn)行柱上(HiTrap親和柱)純化。以1ml/min的速度上樣，用35倍柱體積洗脫液進(jìn)行梯度洗脫(PBS+0.5M NaCl,咪唑濃度0-250mM)，在第二個(gè)峰值處收集樣品(6個(gè)柱體積)進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，如圖1B所示，可以看出，22KD為目標(biāo)蛋白IMT-VEGF，表明重組菌BL21(DE3)/pET28a-IMT-VEGF表達(dá)目標(biāo)蛋白IMT-VEGF。

收集6個(gè)柱體積的洗脫液，經(jīng)PD-10脫鹽柱(GE)后即為純化融合蛋白IMT-VEGF。

以重組菌BL21(DE3)/pET28a為對(duì)照，進(jìn)行表達(dá)純化，SDS檢測(cè)，沒(méi)有目標(biāo)蛋白。

以重組菌BL21(DE3)/pET28a-VEGF為對(duì)照，進(jìn)行表達(dá)純化，SDS檢測(cè)，得到20KD的蛋白VEGF。

實(shí)施例2、融合蛋白IMT-VEGF的生物活性檢測(cè)

1、IMT-VEGF刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖

將原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Merck Millipore，SCCE001)接種到48孔板內(nèi)，將實(shí)施例1得到的純化IMT-VEGF和作為對(duì)照的VEGF稀釋成不同梯度濃度，分別加入48孔板中。培養(yǎng)72小時(shí)后進(jìn)行MTT檢測(cè)。

結(jié)果如圖1C所示，IMT-VEGF與VEGF刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖的能力沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明了融合了靶向多肽的IMT-VEGF并不影響VEGF本身的生物活性。

2、IMT-VEGF的靶向能力檢測(cè)

1)正常心肌、缺血心肌以及外周血血清中VEGF的含量

構(gòu)建大鼠心臟的缺血再灌注模型：SD大鼠(維通利華)胸骨左側(cè)2mm切開(kāi)皮膚，鈍性分離肌肉見(jiàn)肋骨，在第三肋間隙用眼科剪輕輕向下分離肋間肌，向上伸入血管鉗反復(fù)夾閉兩根肋骨以減少出血。用拉鉤拉開(kāi)胸壁，在兩側(cè)胸壁肌肉分別穿一雙線留小圈在內(nèi)側(cè)。小心剪開(kāi)心包膜，用棉簽輕壓住心臟。在左心耳下緣3-4mm進(jìn)針，進(jìn)針深約1.5mm，斜向右上方肺動(dòng)脈圓錐方向出針，針距約3-4mm，分別將線兩端穿入小圈內(nèi)。收緊結(jié)扎線，連同小段聚已烯管結(jié)扎。30分鐘后輕拉松結(jié)線，打開(kāi)血管再灌注。 尾靜脈推注5nmolVEGF或IMT-VEGF，獲得大鼠心臟的缺血再灌注模型。以尾靜脈推注生理鹽水為對(duì)照組(control)。

在注射后10分鐘、1小時(shí)、6小時(shí)，分別檢測(cè)正常心肌、缺血心肌以及外周血血清中VEGF的含量。

如圖2A所示，N為正常心肌組織、I為缺血心肌組織；注射后10分鐘，IMT-VEGF組缺血心肌中VEGF的含量為19.27±0.96μg/g，顯著高于對(duì)照組(3.76±0.43μg/g)和VEGF組(3.35±2.12μg/g)。隨著時(shí)間的增加，在注射后1小時(shí)和6小時(shí)后，IMT-VEGF組缺血心肌中的VEGF含量緩慢降低到15.87±0.55μg/g和10.94±0.44μg/g，仍然顯著高于對(duì)照組和VEGF組。而在注射后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，IMT-VEGF組血清中VEGF的含量卻顯著低于VEGF組，如圖2B所示，這說(shuō)明IMT-VEGF通過(guò)靜脈注射能夠富集到缺血心肌組織，與VEGF相比具有靶向性。

同時(shí)也用His抗體(anti-polyhistidine，1:2,000，sigma)通過(guò)western blot檢測(cè)了靜脈注射1小時(shí)后缺血心肌的外源VEGF含量，如圖2C,D(N為正常心肌組織、I為缺血心肌組織)所示，在缺血心肌中外源IMT-VEGF的含量顯著高于VEGF。同時(shí)，正常心肌中IMT-VEGF的含量顯著低于缺血心肌中IMT-VEGF的含量。這表明IMT-VEGF與VEGF相比具有富集到缺血心肌的能力。

2)體內(nèi)示蹤

為了更直觀地確定IMT-VEGF通過(guò)靜脈注射靶向到缺血心肌的能力，用Gd-DO3A標(biāo)記了VEGF和IMT-VEGF使其能夠通過(guò)核磁影像進(jìn)行體內(nèi)示蹤。Gd-DO3A是一種可用于核磁檢測(cè)的對(duì)比劑，可以增強(qiáng)核磁的信號(hào)。將Gd-DO3A與VEGF或IMT-VEGF的賴氨酸殘基交聯(lián)，具體如下：

蛋白質(zhì)VEGF或IMT-VEGF溶于HEPES緩沖溶液(sigma)中，濃度為2mg/ml，加入交聯(lián)劑乙二醇二縮水甘油醚，交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)的配比為25∶1，室溫反應(yīng)12小時(shí)，低溫透析脫交聯(lián)劑，得到交聯(lián)后VEGF或IMT-VEGF(圖3A)。

將5nmol交聯(lián)后VEGF或IMT-VEGF按照上述1)中的方法尾靜脈推注，獲得大鼠心臟的缺血再灌注模型。

核磁影像檢測(cè)(采用1.0T Siemens磁共振成像儀，梯度場(chǎng)強(qiáng)45mT/m，切換率每毫秒200mT/m。心電門(mén)控采用磁共振兼容的無(wú)線矢量心電門(mén)控板)結(jié)果如圖3B所示，當(dāng)把它通過(guò)尾靜脈注射到缺血心肌損傷的大鼠體內(nèi)，1小時(shí)后可在缺血的左心室部位觀察到強(qiáng)對(duì)比信號(hào)，而VEGF組的左心室信號(hào)強(qiáng)度明顯小于IMT-VEGF。3小時(shí)后，IMT-VEGF在左心室腔內(nèi)壁可見(jiàn)增強(qiáng)的對(duì)比信號(hào)，而VEGF的信號(hào)卻很弱。這些結(jié)果直接地表明IMT-VEGF可以通過(guò)靜脈注射靶向的損傷的左心室。

3)熒光標(biāo)記來(lái)確定IMT-VEGF的具體位置

盡管從核磁影像中觀測(cè)到了靶向到左心室的IMT-VEGF的信號(hào)，但是不容易確定IMT-VEGF僅僅是停留在腔內(nèi)的血液中還是在心肌組織當(dāng)中。于是進(jìn)一步通過(guò)熒光標(biāo)記來(lái)確定IMT-VEGF的具體位置。

將熒光染料DylightNHS Esters 488(Thermo)用N,N-dimethylformamide(DMF，sigma)稀釋為10mg/ml，得到熒光染料溶液；

將VEGF或IMT-VEGF用PBS(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na₂HPO₄,1.76mM KH₂PO₄,pH＝7.3)稀釋為5mg/ml，得到蛋白溶液。

將熒光染料溶液和蛋白溶液按摩爾數(shù)比大于10:1混合，室溫孵育1小時(shí)，得到交聯(lián)熒光染料蛋白VEGFF或IMT-VEGF(圖3C)，透析去除未交聯(lián)的熒光染料，透析膜孔徑＝7KDa。

將25nmol交聯(lián)熒光染料蛋白VEGFF或IMT-VEGF按照上述1)中的方法尾靜脈推注，獲得大鼠心臟的缺血再灌注模型。以單獨(dú)注射熒光染料DylightNHS Esters 488為對(duì)照。

注射后1小時(shí)，取心臟做冰凍切片，用熒光共聚焦顯微鏡檢測(cè)(Leica SP8，激發(fā)波長(zhǎng)475-525nm)，結(jié)果如圖3D，可觀測(cè)到IMT-VEGF組在缺血的左心室心肌中有明顯的熒光信號(hào)分布，而熒光染料組和VEGF組并未見(jiàn)明顯的信號(hào)差別。

統(tǒng)計(jì)各組心肌的熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖3E所示，可以看出，IMT-VEGF組左心室心肌的熒光強(qiáng)度顯著大于VEGF組和熒光染料組。

這一結(jié)果驗(yàn)證了通過(guò)靜脈注射IMT-VEGF不是只停留在左心室腔內(nèi)的血液中，而是靶向到了損傷心肌。

3、IMT-VEGF治療大鼠心肌損傷

生理鹽水(0.9％NaCl,control)、5nmolVEGF(實(shí)施例1純化得到的)和5nmol IMT-VEGF(實(shí)施例1純化得到的)分別按照上述2的1)中的方法通過(guò)尾靜脈注射到心臟缺血再灌注損傷的大鼠體內(nèi)。注射后3個(gè)月通過(guò)組織學(xué)分析(馬素染色)檢測(cè)了修復(fù)效果的差異(圖4)。

結(jié)果如圖4A所示，馬素染色顯示了心臟的梗死部位。IMT-VEGF組有較為完整的左心室結(jié)構(gòu)，而對(duì)照組和VEGF組的心肌梗死較為明顯。

統(tǒng)計(jì)梗死區(qū)域面積和左心室室壁厚度，結(jié)果如圖4B-4C所示，IMT-VEGF組的梗死區(qū)域面積顯著小于對(duì)照組和VEGF組，同時(shí)左心室室壁厚度也顯著大于對(duì)照組和VEGF組，結(jié)果說(shuō)明IMT-VEGF有效降低了梗死大小。

注射后3個(gè)月用免疫熒光檢測(cè)了心臟梗死區(qū)域的血管再生和心肌細(xì)胞存活情況。具體方法如下：冰凍切片放置室溫，PBS漂洗5分鐘；加入羊血清封閉1小時(shí)；加一抗anti-α-SMA(1:500，mouse，中杉金橋)，anti-vWF(1:800，rabbit，Abcam)， anti-cTnT(1:100，mouse，Abcam)，anti-cardiac myosin heavy chain(1:500，rat，santa cruz)，anti-cTnT(1:100，mouse，Abcam)，4℃孵育過(guò)夜后，PBS漂洗3次，每次5分鐘；加入熒光標(biāo)記二抗goat anti-mouse 488(1:500，invitrogen)和goat anti-rat 594(1:500，invitrogen)；含DAPI的封片劑(mounting medium，中杉金橋)封片后，熒光顯微鏡觀察。

結(jié)果如圖5A，D所示，可以看出，α-smooth muscle actin(α-SMA)陽(yáng)性的成熟血管和von Willebrand Factor(vWF)陽(yáng)性的毛細(xì)血管數(shù)目都顯著大于對(duì)照組和VEGF。因?yàn)镮MT-VEGF的靶向結(jié)合，提高了VEGF在病灶區(qū)的濃度，使血管再生的效率也有所提高。在梗死邊緣區(qū)域，IMT-VEGF組的cardiac myosin heavy chain(cMHC)陽(yáng)性的心肌細(xì)胞比例也顯著大于對(duì)照組和VEGF組。這說(shuō)明IMT-VEGF有效保證了心肌細(xì)胞的存活。與此同時(shí)，通過(guò)TUNEL檢測(cè)(TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡試劑盒，Roche)了梗死邊緣區(qū)域細(xì)胞的凋亡情況。TUNEL檢測(cè)結(jié)果如圖5D，F(xiàn)所示，IMT-VEGF組的凋亡細(xì)胞比例顯著小于對(duì)照組和VEGF組，說(shuō)明IMT-VEGF抑制了梗死邊緣區(qū)域的細(xì)胞凋亡，防止了梗死面積的進(jìn)一步擴(kuò)大。