本發(fā)明涉及免疫磁珠的制備領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種HER2抗體免疫磁珠及其制備方法。
背景技術(shù)：
人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor2，HER2)是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜糖蛋白，屬于EGFR家族成員之一。HER2可以促進(jìn)細(xì)胞分裂和蛋白水解酶的分泌，使DNA合成增加，癌細(xì)胞生長(zhǎng)加快，并增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，從而促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，在細(xì)胞分裂增殖和分化中起重要作用。30％以上的人類腫瘤中存在HER2的過(guò)度表達(dá)(如乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、輸卵管癌、胃癌和前列腺癌等)，其中20％～30％的原發(fā)性浸潤(rùn)性乳腺癌有HER2的過(guò)度表達(dá)，并且與腫瘤的侵襲性和患者的預(yù)后相關(guān)。作為一種腫瘤相關(guān)抗原，以HER2作為生物標(biāo)志物的抗腫瘤研究成為醫(yī)學(xué)科學(xué)研究工作人員的研究熱點(diǎn)。
免疫磁珠分選法(Immunomagnetic separation，IMS)是近年來(lái)興起的一種用于細(xì)胞分選的方法，它是在磁珠表面包被具免疫反應(yīng)性的抗體進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)，在細(xì)胞表面形成“抗原-抗體-磁珠”免疫復(fù)合物。這些結(jié)合了磁珠的細(xì)胞一旦置于強(qiáng)大的磁場(chǎng)下，就會(huì)定向移動(dòng)，使免疫復(fù)合物與其他未被結(jié)合的細(xì)胞分群。當(dāng)具超順磁性的磁珠脫離磁場(chǎng)后，磁性立即消失，從而達(dá)到陽(yáng)性或陰性選擇特定細(xì)胞的目的。
將免疫磁珠分選法應(yīng)用于細(xì)胞的分選是本領(lǐng)域近年來(lái)興起的技術(shù)。但是利用免疫磁珠分選法從血液復(fù)雜的環(huán)境中分選出特定的細(xì)胞，需要免疫磁珠具有特異性的生物標(biāo)志物，而且穩(wěn)定性、分散性好，不能團(tuán)聚。同時(shí)，免疫磁珠的粒徑不能過(guò)大，過(guò)大會(huì)壓迫細(xì)胞；免疫磁珠的粒徑也不能過(guò)小，粒徑過(guò)小磁響應(yīng)性也小，容易無(wú)法達(dá)到細(xì)胞分選的效果。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的主要目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足提供一種HER2抗體免疫磁珠及其制備方法，本發(fā)明的HER2抗體免疫磁珠粒徑小，磁響應(yīng)性好，用于腫瘤細(xì)胞捕獲，捕獲效率高，富集時(shí)間短，捕獲得到的腫瘤細(xì)胞可以進(jìn)行進(jìn)一步的分析，同時(shí)制備過(guò)程簡(jiǎn)單，成本低。
在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種HER2抗體免疫磁珠，包括磁性微球部分和抗體部分，所述免疫磁珠的結(jié)構(gòu)式為：A-NH-N＝CH-B，其中A表示磁性微球，B表示HER2抗體，或者A表示HER2抗體，B表示磁性微球。
優(yōu)選的，所述磁性微球?yàn)楹藲そY(jié)構(gòu)的無(wú)機(jī)或有機(jī)高分子包裹的磁性微球。比如二氧化硅包裹的磁性四氧化三鐵、或者葡聚糖包裹的磁性四氧化三鐵等。最優(yōu)選的，所述磁性微球部分為二氧化硅包裹的磁性四氧化三鐵。
優(yōu)選的，所述HER2抗體免疫磁珠的粒徑為200～300nm。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種制備上述HER2抗體免疫磁珠的方法，其步驟包括：
s1.磁性納米簇的制備；
s2.氨基修飾的磁性微球的制備；
s3.肼基修飾的A部分的制備；
s4.醛基修飾的B部分的制備；
s5.免疫磁珠的制備：將步驟s3所述肼基修飾的A部分與步驟s4所述醛基修飾的B部分混合，在4～25℃下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)2～24小時(shí)，得到所述免疫磁珠。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，對(duì)氨基修飾的磁性微球進(jìn)行醛基修飾，并且對(duì)HER2抗體進(jìn)行肼基修飾?；蛘邔?duì)氨基修飾的磁性微球進(jìn)行肼基修飾，并且對(duì)HER2抗體進(jìn)行醛基修飾，均可以實(shí)現(xiàn)上述結(jié)構(gòu)的免疫磁珠。
進(jìn)一步的，所述步驟s3中的肼基修飾的A部分是通過(guò)：將氨基修飾的磁性微球或HER2抗體用摩爾當(dāng)量為10～50倍的SANH進(jìn)行肼基修飾后得到的。最優(yōu)選的，SANH的摩爾當(dāng)量為氨基修飾的磁性微球或HER2抗體的25倍。所述SANH為對(duì)-丙腙基吡啶甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(CAS：362522-50-7)，在室溫條件下可以溫和的將氨基轉(zhuǎn)換為肼基。所述SANH一般溶解在DMF溶液中進(jìn)行反應(yīng)，濃度可以根據(jù)磁性微球或HER2抗體的濃度進(jìn)行調(diào)整，不影響反應(yīng)結(jié)果。該反應(yīng)過(guò)程可以在15～25℃室溫條件下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的檢測(cè)技術(shù)判斷，本發(fā)明一般采用對(duì)磁性微球的修飾反應(yīng)時(shí)間16～24h，對(duì)HER2抗體的修飾反應(yīng)時(shí)間2～4h。
進(jìn)一步的，所述步驟s4中的醛基修飾的B部分是通過(guò)：將氨基修飾的磁性微球或HER2抗體用摩爾當(dāng)量為5～20倍的SFB進(jìn)行醛基修飾后得到的。最優(yōu)選的，SFB的摩爾當(dāng)量為氨基修飾的磁性微球或HER2抗體的10倍。所述SFB為4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亞胺酯(CAS：60444-78-2)，在室溫條件下可以溫和的將氨基轉(zhuǎn)換為醛基。所述SFB一般溶解在DMF溶液中進(jìn)行反應(yīng)，濃度可以根據(jù)磁性微球或HER2抗體的濃度進(jìn)行調(diào)整，不影響反應(yīng)結(jié)果。該反應(yīng)過(guò)程可以在15～25℃室溫條件下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的檢測(cè)技術(shù)判斷，本發(fā)明一般采用對(duì)磁性微球的修飾反應(yīng)時(shí)間16～24h，對(duì)HER2抗體的修飾反應(yīng)時(shí)間2～4h。
所述步驟s1中的磁性納米簇是通過(guò)水熱法、溶劑熱法或共沉淀法制備得到，也可以采用市售商品。制備磁性納米簇的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，得到的產(chǎn)品只需要滿足具有良好的磁性，并且可以與無(wú)機(jī)或有機(jī)高分子形成核殼結(jié)構(gòu)即可。
作為優(yōu)選的，所述步驟s1中的磁性納米簇是通過(guò)如下方法制備得到：
1)在空氣中，向二價(jià)鐵鹽的水溶液中加入氨水，然后攪拌使溶液變成黑色，得到黑色Fe3O4顆粒；
2)向步驟1)中加入油酸，混合均勻后轉(zhuǎn)移至密閉的反應(yīng)釜中，在60～130℃下加熱反應(yīng)3～5小時(shí)，即可得到所述磁性納米簇。
進(jìn)一步的，所述步驟s2中的氨基修飾的磁性微球?yàn)楹藲そY(jié)構(gòu)的二氧化硅包裹的磁性微球，效果更加優(yōu)于直接在磁性納米簇粒子表面進(jìn)行氨基修飾得到的磁性微球，可以采用市售商品或者按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的常規(guī)方法制備，均不影響本發(fā)明的結(jié)果。可以使納米簇聚集在二氧化硅內(nèi)部，形成核殼結(jié)構(gòu)，增大粒徑，并且增加磁性和穩(wěn)定性即可。優(yōu)選的，本發(fā)明采用如下方法制備氨基修飾的二氧化硅包裹的磁性微球：向含有磁性納米簇的溶液中加入氨水、硅烷化試劑和氨基硅烷偶聯(lián)劑，反應(yīng)1～3天后得到氨基修飾的磁性微球部分；所述磁性納米簇、氨水、硅烷化試劑、氨基硅烷偶聯(lián)劑加入的質(zhì)量比為：1:(12.5～40):(2～8):(0.5～3)。其中氨水的質(zhì)量百分濃度為25～28％。其中，硅烷化試劑可以為正硅酸四乙酯(CAS：562-90-3)，氨基硅烷偶聯(lián)劑可以為(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(CAS：919-30-2)。本領(lǐng)域技術(shù)人員在選擇其他的硅烷化試劑與氨基硅烷偶聯(lián)劑時(shí)，可以對(duì)反應(yīng)原料的比例進(jìn)行調(diào)整，均不超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。
優(yōu)選的，所述步驟s5中，磁性微球和HER2抗體的質(zhì)量比可以為1：(0.01～1)。HER2抗體與磁性微球的質(zhì)量比越高越有利于磁性微球表面偶聯(lián)HER2抗體，但是考慮到HER2抗體的成本因素，一般采用磁性微球和HER2抗體的質(zhì)量比為1：(0.01～0.2)，有利于節(jié)省成本。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種用于捕獲腫瘤細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒中含有上述的HER2抗體免疫磁珠。所述腫瘤細(xì)胞可以為乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、輸卵管癌、胃癌和前列腺癌等與HER2抗體表達(dá)相關(guān)的腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明的有益效果為：
(1)將本發(fā)明的免疫磁珠用于捕獲腫瘤細(xì)胞，不僅特異性、敏感性好，而且磁響應(yīng)迅速、富集時(shí)間短，捕獲效率高。避免了捕獲的腫瘤細(xì)胞損傷，腫瘤細(xì)胞可以用于進(jìn)一步的分析和培養(yǎng)?？梢杂糜谕饷隗w、體液或活檢組織的腫瘤細(xì)胞捕獲與分析。
(2)本發(fā)明的免疫磁珠，其磁性微球部分和HER2抗體部分通過(guò)腙鍵結(jié)構(gòu)相連，得到的免疫磁珠在弱堿性條件下(血液中)性質(zhì)穩(wěn)定，同時(shí)粒徑小，磁響應(yīng)性好，分散性好。
(3)本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，氨基、醛基和肼基修飾的過(guò)程均可以在室溫下進(jìn)行，不容易造成HER2抗體的變質(zhì)、降解等，同時(shí)避免了使用還原劑，使HER2抗體可以在低溫下與細(xì)胞孵育，保持HER2抗體和細(xì)胞的生物活性。
(4)本發(fā)明原料簡(jiǎn)單易得，成本低，工藝步驟簡(jiǎn)單，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明HER2抗體免疫磁珠分選的腫瘤細(xì)胞免疫熒光圖。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明：下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書(shū)選擇。
實(shí)施例1 HER2抗體免疫磁珠的制備
(1)磁性納米簇的制備：
a.在空氣中，將7g FeCl2·4H2O加入到50mL去離子水中，得到濃度為0.14g/mL的FeCl2水溶液。向50mL FeCl2水溶液中加入氨水30mL，攪拌20min后，顏色逐漸變?yōu)闇\綠色，再變深綠色，最后變?yōu)楹谏?/p>
b.向步驟a中加入1.1g油酸，混合均勻后將混合液置于密閉的反應(yīng)釜中，在110℃下加熱反應(yīng)4小時(shí)，然后用去離子水和乙醇交替洗滌各一次，磁分離后分散在正己烷中，即可得到黑色的磁性納米簇Fe3O4 1。
(2)氨基修飾的磁性微球的制備：向10mg磁性納米簇Fe3O4 1的溶液中加入125mg氨水、30mg正硅酸四乙酯和30mg(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，反應(yīng)1天后進(jìn)行磁分離，并且用乙醇和水交替洗滌各兩次，并用0.1M的pH 7～8的磷酸緩沖液分散后得到濃度為5mmol/L的氨基修飾的磁性微球1。
(3)肼基修飾的HER2抗體的制備：將5μL SANH的DMF溶液(濃度為5mmol/L)加入到100μL HER2抗體溶液(濃度為10μmol/L)中，在室溫反應(yīng)2h后，用超濾柱純化得到肼基修飾的HER2抗體(簡(jiǎn)寫(xiě)為HER2-SANH)1。
檢測(cè)HER2-SANH的濃度：通過(guò)BCA法計(jì)算修飾后的HER2-SANH的濃度為2.40mg/mL。
檢測(cè)肼基修飾率：用定量的2-甲酰苯磺酰鈉鹽溶液檢測(cè)肼基修飾率。取純化后的HER2-SANH加入到的2-甲酰苯磺酰鈉鹽溶液中，渦旋混勻后于37℃反應(yīng)1h，Nanodrop檢測(cè)348nm處的吸光值為0.25。通過(guò)348nm處的吸光值和HER2-SANH的濃度計(jì)算出HER2-SANH的肼基修飾率為6.8。
(4)醛基修飾的磁性微球的制備：將5μL的氨基修飾的磁性微球1加入到SFB的DMF溶液(濃度為5mmol/L)50μL中，在室溫反應(yīng)20h后，進(jìn)行磁分離純化，得到醛基修飾的磁性微球1。
(5)免疫磁珠的制備：將1mg步驟(4)中的醛基修飾的磁性微球與0.01mg步驟(3)中的肼基修飾的HER2抗體混合，在25℃下pH值為6.0的PBS緩沖液中混合2小時(shí)后，進(jìn)行磁分離得到HER2抗體偶聯(lián)磁性微球的HER2抗體免疫磁珠。計(jì)算得到每毫克HER2抗體免疫磁珠1上，包被抗體率為85％(消耗的抗體量與加入的抗體總量的比例)。
實(shí)施例2 HER2抗體免疫磁珠的敏感性檢測(cè)
采集健康志愿者血樣，通過(guò)人淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行PBMCs提取，然后將人乳腺腺癌細(xì)胞SK-BR-3(來(lái)源中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買(mǎi))懸液按比例加入到PBMCs中，使PBMCs與SK-BR-3的比例分別為103:1、104:1、105:1、106:1。然后將免疫磁珠依次加入到上述各混合細(xì)胞懸液中，在4℃下孵育30分鐘。在1分鐘內(nèi)進(jìn)行磁分選并用PBS洗滌2-3次，得到用免疫磁珠捕獲并回收的SK-BR-3細(xì)胞。并且磁分選在1分鐘內(nèi)完成，說(shuō)明免疫磁珠的磁響應(yīng)性好。
重復(fù)各濃度下的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，所有濃度下都可以檢測(cè)到SK-BR-3細(xì)胞，說(shuō)明免疫磁珠的敏感性好。
實(shí)施例3 模擬血液中腫瘤細(xì)胞的捕獲
采集健康志愿者血樣，將SK-BR-3細(xì)胞與健康人的外周血混合，配成混合細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)SK-BR-3細(xì)胞的濃度為1、10、20、50、500、1000個(gè)/mL，然后將免疫磁珠依次加入到上述各混合細(xì)胞懸液中，在4℃下孵育30分鐘。在1分鐘內(nèi)進(jìn)行磁分選并用PBS洗滌2-3次，得到用免疫磁珠捕獲并回收的SK-BR-3細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)回收的SK-BR-3細(xì)胞，在SK-BR-3細(xì)胞的濃度為1個(gè)/mL時(shí)仍然可以捕獲到SK-BR-3細(xì)胞。
從實(shí)施例2-3的捕獲結(jié)果來(lái)看，免疫磁珠在單純環(huán)境中(實(shí)施例2)的捕獲效率能夠精確到1：106，免疫磁珠在復(fù)雜環(huán)境中(實(shí)施例3)也可以檢測(cè)到1個(gè)/mL的SK-BR-3細(xì)胞，可以滿足目前液體活檢的要求。
對(duì)上述孵育后的磁珠用無(wú)鈣鎂的PBS緩沖液重懸，將洗脫得到的細(xì)胞用PicoPure RNA Isolation Kit試劑盒(Thermo Cat No：KIT0214)提取純化總RNA，采用了PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TAKARA,Cat No：RR047A)，按說(shuō)明書(shū)要求去除基因組DNA以及進(jìn)行cDNA鏈合成。接下來(lái)涉及相應(yīng)Taqman引物，進(jìn)行qPCR檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)標(biāo)比較qPCR檢測(cè)結(jié)果，在相同條件下，與SK-BR-3細(xì)胞的qPCR檢測(cè)結(jié)果一致。說(shuō)明用本發(fā)明的免疫磁珠捕獲腫瘤細(xì)胞不會(huì)損傷細(xì)胞，可以用于后續(xù)細(xì)胞分析。并且說(shuō)明，用本發(fā)明的免疫磁珠捕獲到的細(xì)胞基本沒(méi)有PBMCs細(xì)胞，PBMCs細(xì)胞則基本不與HER2抗體免疫磁珠結(jié)合。
實(shí)施例4 癌癥病人的乳腺癌腫瘤細(xì)胞捕獲
取健康人和不同的轉(zhuǎn)移性乳腺癌癌癥病人的外周血血液，對(duì)血液中的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行捕獲。要求受試者血常規(guī)白細(xì)胞值位于2×106～1.2×107個(gè)/mL之間，全血樣本未出現(xiàn)溶血或血塊凝結(jié)。并且受試者相關(guān)信息完整，樣本采集、保存方法規(guī)范，實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范，具體步驟如下：取不同癌癥病人血液3ml，加入HER2抗體免疫磁珠依次加入到上述各混合細(xì)胞懸液中，在4℃下孵育30分鐘，然后在1分鐘內(nèi)進(jìn)行磁分選并用PBS洗滌2-3次，將孵育回收的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行抗體染色、并在載玻片上固定、然后進(jìn)行細(xì)胞核DAPI染色、封片后，用熒光顯微鏡鑒定，結(jié)果如圖1所示，細(xì)胞膜表面顯示有熒光，在熒光顯微鏡下為綠光熒光，說(shuō)明捕獲到的細(xì)胞表面呈HER2陽(yáng)性，說(shuō)明為腫瘤細(xì)胞。而正常人的血液中沒(méi)有捕獲到腫瘤細(xì)胞。
如果先對(duì)血液進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，并且用CD45抗體免疫磁珠去除血液中的白細(xì)胞后再用HER2抗體免疫磁珠進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的捕獲，捕獲效率更高。
以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明實(shí)施例原理以及權(quán)利要求的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也視為本發(fā)明實(shí)施例的保護(hù)范圍。