本發(fā)明涉及一種化合物及其制備方法和用途，特別涉及一類半胱氨酸改造的抗體-毒素偶聯(lián)物(TDC)及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：
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表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)是一種糖蛋白，屬于ErbB受體家族的一種，該家族包括EGFR(ErbB-1),HER2/c-neu(ErbB-2),Her 3(ErbB-3)和Her 4(ErbB-4)。EGFR是上皮生長(zhǎng)因子(EGF)細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的受體，貫通細(xì)胞膜，分子量170KDa，靠與配體結(jié)合來激活。激活后，EGFR由單體轉(zhuǎn)化為二聚體。EGFR還可能和ErbB受體家族的其他成員聚合來激活，例如ErbB2/Her2/neu。

EGFR通常低量表達(dá)于多種正常組織細(xì)胞，包括皮膚、肝臟等，與正常生理作用相關(guān)。

EGFR過表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展相關(guān)，包括頭頸癌、膀胱癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、腦膠質(zhì)瘤、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌(Atalay et al.,2003；Herbst and Shin,2002)。

多種腫瘤在過量表達(dá)野生型EGFR(EGFRwt)的同時(shí)也表達(dá)突變型的EGFR，EGRFvIII(de2-7 EGFR)。EGRFvIII是EGFRwt第6-273氨基酸缺失的EGFR突變型(Sugawa et al.,1990)，介導(dǎo)配體非依賴型的細(xì)胞持續(xù)活化。EGRFvIII被報(bào)道于多種腫瘤中，包括腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌和前列腺癌(Wikstrand et al.,1997；OlapadeOlaopa et al.,2000)。EGRFvIII的出現(xiàn)往往預(yù)示腫瘤預(yù)后不良。

EGRFvIII特異性表達(dá)于腫瘤細(xì)胞組織中，正常組織細(xì)胞不表達(dá)EGRFvIII，這為靶向治療提供了良好的靶點(diǎn)。

抗體-毒素偶聯(lián)物(Antibody drug conjugate,ADC)是靶向治療的熱點(diǎn)領(lǐng)域，已在美國(guó)獲批上市的兩個(gè)藥物Adcetris和Kadcyla表現(xiàn)出良好的臨床療效，并且有超過50個(gè)ADC藥物在進(jìn)行臨床階段研究。

以EGFRvIII為靶點(diǎn)的通過鏈間二硫鍵巰基非定點(diǎn)偶聯(lián)的ADC藥物ABT-414已在美國(guó)進(jìn)行臨床II期試驗(yàn)，體現(xiàn)出一定的臨床效果，但由于其采用非定點(diǎn)偶聯(lián)方式，其藥物均一性差，對(duì)病人造成較嚴(yán)重的毒副作用，限制了其臨床用藥量，直接影響了其臨床治療效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的化合物半胱氨酸改造的抗體-毒素偶聯(lián)物(TDC)具有通式：2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-payload。其中2C1是親本抗體2A1輕鏈205位纈氨酸(V)改造為半胱氨酸(C)后的抗體。2C1的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO:1，2C1的輕鏈氨基酸序列為SEQ ID NO:12。2C1的親本抗體2A1重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO:1，2A1的輕鏈氨基酸序列為SEQ ID NO:14。2C1保持了其親本抗體2A1與抗原結(jié)合的能力(親和力)，抗原為人的野生型表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFRwt)及人的突變型表皮生長(zhǎng)因子受體(de2-7 EGFR/EGRFvIII)。2C1通過其輕鏈205位改造的半胱氨酸巰基與mc-vc-PAB-payload進(jìn)行抗體-毒素偶聯(lián)物(TDC)定點(diǎn)偶聯(lián)，毒素比抗體比例DAR為1.6-2.0。本發(fā)明的化合物半胱氨酸改造的抗體-毒素偶聯(lián)物(TDC)藥物主要用于治療表達(dá)EGFRvIII及過表達(dá)EGFRwt的腫瘤，包括腦膠質(zhì)癌、非小細(xì)胞肺癌、頭頸癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等。

本發(fā)明記載的全新半胱氨酸改造的抗體-毒素偶聯(lián)物(TDC)相較非定點(diǎn)偶聯(lián)的ADC具有藥物均一性好，副作用小等優(yōu)點(diǎn)，臨床前研究結(jié)果顯示其顯著優(yōu)于非定點(diǎn)偶聯(lián)ADC。

附圖說明

圖1為HIC-HPLC檢測(cè)2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC DAR；

圖2A為SEC-HPLC檢測(cè)2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC聚集情況；

圖2B為SEC-HPLC檢測(cè)通過抗體天然鏈間二硫鍵進(jìn)行半胱氨酸非定點(diǎn)偶聯(lián)的2A1-mc-vc-PAB-MMAE ADC樣品；

圖3A為2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC與2C1保持了2A1與抗原EGFRvIII的親和力；

圖3B為2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBD TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-DOX TDC保持了2A1與抗原EGFRvIII的親和力；

圖4A為2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC及其對(duì)應(yīng)的2A1-mc-vc-PAB-MMAE ADC對(duì)EGFRwt過表達(dá)的人皮膚鱗癌細(xì)胞A431的IC50檢測(cè)結(jié)果；

圖4B為2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF TDC及其對(duì)應(yīng)的2A1-mc-vc-PAB-MMAF ADC、對(duì)EGFRwt過表達(dá)的人皮膚鱗癌細(xì)胞A431的IC50檢測(cè)結(jié)果；

圖4C為2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBD TDC及其對(duì)應(yīng)的2A1-mc-vc-PAB-PBD ADC對(duì)EGFRwt過表達(dá)的人皮膚鱗癌細(xì)胞A431的IC50檢測(cè)結(jié)果；

圖4D為2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC及其對(duì)應(yīng)的2A1-mc-vc-PAB-MMAE ADC對(duì)表達(dá) EGFRvIII的U87-EGFRvIII的IC50檢測(cè)結(jié)果；

圖4E為2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF TDC及其對(duì)應(yīng)的2A1-mc-vc-PAB-MMAF ADC對(duì)表達(dá)EGFRvIII的U87-EGFRvIII的IC50檢測(cè)結(jié)果；

圖4F為2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBD TDC及其對(duì)應(yīng)的2A1-mc-vc-PAB-PBD ADC對(duì)表達(dá)EGFRvIII的U87-EGFRvIII的IC50檢測(cè)結(jié)果；

圖4G為2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38 TDC及其對(duì)應(yīng)的2A1-mc-vc-PAB-SN38 ADC對(duì)表達(dá)EGFRvIII的U87-EGFRvIII的IC50檢測(cè)結(jié)果；

圖4H為2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-Dox TDC及其對(duì)應(yīng)的2A1-mc-vc-PAB-Dox ADC對(duì)表達(dá)EGFRvIII的U87-EGFRvIII的IC50檢測(cè)結(jié)果；

圖5A為荷瘤小鼠藥效檢測(cè)1mg/kg劑量進(jìn)行單次靜脈給藥結(jié)果；

圖5B為荷瘤小鼠藥效檢測(cè)6mg/kg劑量給藥結(jié)果；

圖6A為大鼠毒性檢測(cè)嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果；

圖6B為大鼠毒性檢測(cè)AST檢測(cè)結(jié)果；

圖6C為大鼠毒性檢測(cè)每天監(jiān)測(cè)體重變化情況。

實(shí)施例1 mc的合成

于30ml冰醋酸中加入6-氨基己酸3.9g(0.03mol)和1.2eq的馬來酸酐3.5g(0.036mol)。反應(yīng)液于120℃攪拌反應(yīng)4～6h。反應(yīng)完畢后，停止加熱，自然冷卻到室溫。60℃減壓濃縮除去大部分醋酸。所得棕黃色粘稠液倒入水中，再加入乙酸乙酯20ml×3萃取，合并有機(jī)層。有機(jī)層依次用水、飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮得到棕黃色油狀物，加入50ml水?dāng)嚢?，有類白色固體析出，過濾，50℃減壓干燥的目標(biāo)產(chǎn)品5.08g，收率80％。mp：89-92℃。m/z：212.2[M+H]+。1HNMR(400Mz,DMSO)：13.21(br,1H,COOH)、6.75(s,2H,COCH＝CHCO)、3.63(t,2H,J＝7.2Hz,NCH2CH2)、2.42(t,2H,J＝7.4Hz,CH2COOH)、1.52-1.68(m,4H,NCH2CH2CH2CH2)、1.30-1.42(m,2H,NCH2CH2CH2CH2)。

實(shí)施例2 Mc-OSu的合成

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于50ml乙腈中加入4.7g(22mmol)MC和25g(22mmol)HOSu。另取4.5g(22mmol)DCC溶于25ml乙腈中，保持內(nèi)溫在0℃左右，將其緩慢滴入反應(yīng)液中。反應(yīng)液于0℃反應(yīng)2小時(shí)后再室溫反應(yīng)過夜。過濾，濾餅用乙腈10ml×3洗滌，濾液減壓濃縮至干。所得油狀物于室溫減壓干燥6h得到淺棕色固體6.4g，收率95％。(不純化直接投下一步反應(yīng))m/z：309.2[M+H]+。1HNMR(400Mz,CDCl3)：1～2(m,6H,CCH2CH2CH2C)、2.68(t,2H,CH2CO)，2.95(s,4H,COCH2CH2CO)、3.68(t,2H,CH2N)、6.81(s,2H,CH＝CH)。

實(shí)施例3 Fmoc-Val-OSu的合成

于100mlTHF中加入Fmoc-Val 10g和HOSu 3.4g。另取DCC6g溶于50ml乙腈中，保持內(nèi)溫在0℃左右，將其緩慢滴入反應(yīng)液中。反應(yīng)液于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24小時(shí)。過濾，濾餅用THF洗滌，濾液減壓濃縮得到透明油狀物。油狀物未經(jīng)純化直接投下一步反應(yīng)。m/z：437.4[M+H]+

實(shí)施例4.Fmoc-vc的合成

于20mlTHF中加入Cit 4.0g(1.05eq)和碳酸氫鈉的水溶液60ml(NaHCO3 2g,1.05eq)。另取22.35mmolFmoc-Val-OSu溶于60mlDME中，再將其加入反應(yīng)液中。反應(yīng)液于室溫下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)完畢后，向體系中加入15％檸檬酸水溶液110ml，然后再用EA萃取 兩次，合并有機(jī)層，減壓濃縮得到白色固體。并向白色固體中加入甲基叔丁基醚100ml攪洗，過濾，濾餅于40℃減壓干燥4h得產(chǎn)品4.83g，收率65％。m/z：497.6(M+H)+。1HNMR(400Mz,DMSO):0.92(6H,m)、1.35～1.65(4H,m)、2.10(1H,m)、3.01(2H,q)、3.99(1H,t)、4.01-4.45(2H,m)、4.45(2H,t)、5.46(2H,br)、6.03(1H,t)、7.20-8.02(8H,m)、8.25(1H,d)。

實(shí)施例5.Fmoc-vc-PABOH的合成

于反應(yīng)瓶中加入DCM/MeOH＝2/1混合溶劑60ml，再加入Fmoc-vc 2g(4.2mmol)和PABOH 1.04g(2eq)，攪拌溶解部分后再加入EEDQ 2.0g(2eq)。反應(yīng)體系在室溫條件下避光攪拌反應(yīng)2.0d。反應(yīng)完畢后，40℃減壓濃縮得到白色固體。收集白色固體，加入甲基叔丁基醚100ml攪洗，過濾，濾餅用甲基叔丁基醚洗滌，所得白色固體40℃減壓干燥得到2.2g，收率約88％。m/z：602.6(M+H)+。1HNMR(400Mz,DMSO):0.95(6H,m)、1.45～1.69(4H,m)、2.10(1H,m)、3.11(2H,m)、3.99(1H,m)、4.30(2H,d)、4.05～-4.66(2H,m)、4.55(2H,d)、5.21(1H,t)、5.51(2H,br)、6.11(1H,t)、7.09-8.10(12H,m)、8.21(1H,d)、10.51(1H,br)。

實(shí)施例6.vc-PABOH的合成

于10mlNMP中加入Fmoc-vc-PABOH 490mg(0.815mmol)攪拌溶解，再加入二乙胺2ml。于室溫下攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)完畢后，于40℃減壓濃縮，所得油狀物中加入20mlDCM 攪拌析晶，過濾，濾餅用DCM洗滌，所得固體減壓干燥得到277mg,收率90％。m/z：380.2(M+H)+。1HNMR(400Mz,DMSO):0.89(6H,m),1.31～1.61(4H,m),1.82(1H,m),2.86(1H,m),2.89(2H,d),4.38(2H,d),4.44(1H,m),5.01(1H,br),5.35(2H,br),5.84(1H,br),7.14(2H,d),7.42(2H,d),8.08(1H,br),9.88(1H,br)。

實(shí)施例7.mc-vc-PABOH的合成

于10mlNMP中加入vc-PABOH 205mg(0.54mmol)和MC-OSu 184mg(1.1eq)，加畢于室溫下攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)完畢，于40℃減壓濃縮，所得油狀物中加入20ml甲基叔丁基醚攪拌析晶。過濾，濾餅用甲基叔丁基醚洗滌，得到310mg產(chǎn)品，收率100％。m/z:573.3(M+H)+。1HNMR(400Mz,DMSO):0.89(6H,m)、1.15-1.99(10H,m)、2.11(1H,m)、2.31(2H,t)、3.21(2H,m)、3.53(2H,t)、4.32(1H,t)、4.51(1H,m)、4.59(2H,br)、5.24(1H,br)、5.56(2H,br)、6.20(1H,br)、7.12(2H,s)、7.23(2H,d),7.58(2H,d)、7.94(1H,d),8.17(1H,d)、10.21(1H,br)。

實(shí)施例8.mc-vc-PAB-PNP的合成

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下取mc-vc-PABOH 168.6mg(0.294mmol)溶于5ml無水吡啶中，反應(yīng)體系冷卻到0℃左右。另取PNP179mg(3eq)溶于5mlDCM中，再將其緩慢加入到反應(yīng)體系中。并于0℃左右保持10min后除去冰浴，再于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3h。反應(yīng)完畢，加入70mlEA和 100ml 15％檸檬酸水溶液，分取有機(jī)層。有機(jī)層依次用檸檬酸，水，飽和食鹽水洗滌，再無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干得到淺黃色油狀物，加入甲基叔丁基醚析晶得到類白色固體86mg,收率40％。m/z:738(M+H)+。1HNMR(400Mz,CDCl3/CD3OD):0.84(6H,m)、1.11-1.84(10H,m)、2.05(1H,m)、2.15(2H,t)、3.09(2H,m)、3.32(2H,t)、4.12(1H,m)、4.38(1H,m)、5.15(2H,s)、6.61(2H,s)、6.84(1H,d),7.61(1H,d)、7.21(2H,d),7.50(2H,d)、7.61(2H,d),8.18(2H,d)、9.59(1H,br)。

實(shí)施例9.mc-vc-PAB-MMAE的合成

于2mlDMF中加入20mg mc-vc-PAB-PNP(1.5eq)和3mgHOBT。室溫?cái)嚢杵毯?，加?3mgMMAE，0.5ml吡啶，25ulDIEA。反應(yīng)液于室溫下攪拌反應(yīng)2d。反應(yīng)完畢后，反應(yīng)液直接用制備柱純化，收集所需成分濃縮后凍干，得到約10mg產(chǎn)品，收率約42％。m/z:1317.1(M+H)+。

實(shí)施例10.mc-vc-PAB-MMAF的合成

按照實(shí)施例9的操作，得到mc-vc-PAB-MMAF約12.5mg，收率45.2％，m/z:1331.7(M+H)+。

實(shí)施例11 mc-vc-PAB-PBD的合成

按照實(shí)施例9的操作，得到mc-vc-PAB-PBD約9.5mg，收率32.5％，m/z:1325.4(M+H)+。

實(shí)施例12 mc-vc-PAB-DOX的合成

按照實(shí)施例9的操作，得到mc-vc-PAB-DOX約11.2mg，收率38.9％，m/z:1143.2(M+H)+。

實(shí)施例14 mc-vc-PAB-SN-38的合成

將100mg 10-O-Boc-SN-38用10ml干燥的二氯甲烷溶解后，加入25.6mg(1eq)DMAP，于0℃下滴加三光氣的二氯甲烷溶液(62mg三光氣用2ml二氯甲烷溶解)，滴畢，繼續(xù)于0℃下反應(yīng)12h，減壓除去二氯甲烷，用10ml干燥的DMF溶解后，加入144mg mc-vc-PABOH，轉(zhuǎn)至室溫?cái)嚢?4h，經(jīng)過制備液相分離得到mc-vc-PAB-SN-38 41mg，兩步收率總的為19.7％，m/z:992.1(M+H)+。

實(shí)施例15、2C1抗體的表達(dá)與純化

使用Freestyle^TM 293-F(Invitrogen)懸浮細(xì)胞表達(dá)2C1抗體。轉(zhuǎn)染前一天，以6×105個(gè)/mL密度將細(xì)胞接種于含300mL F17完全培養(yǎng)基(FreestyleTM F17表達(dá)培養(yǎng)基，Gibco公司)的1L搖瓶中，37℃，5％CO2，120rpm細(xì)胞培養(yǎng)搖床過夜培養(yǎng)。次日，用PEI進(jìn)行抗體表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，其中質(zhì)粒:PEI比例為2:1。轉(zhuǎn)染后一天，按2.5％(v/v)加入TN1補(bǔ)料培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4天后離心收集上清。

收集得到的細(xì)胞表達(dá)上清，經(jīng)Protein A親和層析柱(Mabselect Sure LX，GE公司)，以0.1M檸檬酸(pH3.0)洗脫，捕獲的抗體用1M Tris-HCl(pH9.0)按1/10(v/v)調(diào)節(jié)至pH7.0，再通過凝膠過濾層析柱SEC(Superdex 200，GE公司)去除多聚體和內(nèi)毒素等雜質(zhì)，同時(shí)將抗體緩沖液置換成PBS(pH7.4)，收集UV280nm目標(biāo)峰樣品經(jīng)超濾離心管(30KD，Pall公司)濃縮至5mg/ml。

通過此方法獲得的2C1抗體，濃度為5mg/ml，目標(biāo)抗體單體(POI％)大于98％，用于后續(xù)試驗(yàn)。

實(shí)施例16、通過偶聯(lián)2C1抗體和mc-vc-PAB-MMAE制備2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC樣品細(xì)胞表達(dá)的2C1抗體，經(jīng)過Mabselect Sure純化，低pH洗脫后馬上加入Tris溶液中和，并換液為pH7.5的Tris-HCl緩沖液?；衔飉c-vc-PAB-MMAE，白色粉末，將其溶解于DMA中備用。為了去除突變半胱氨酸殘基上的屏蔽物，需要先將抗體還原。按照20倍分子比將1M的DTT水溶液加入2C1抗體溶液中，混勻后20℃反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)時(shí)間到后將樣品的pH調(diào)整至5.0，并通過SP Sepharose F.F.陽離子交換層析去除樣品中的DTT和屏蔽物。隨后按照10倍分子比將DHAA溶液加入樣品中，25℃避光反應(yīng)3小時(shí)，使抗體鏈間二硫鍵重新連接。然后加入mc-vc-PAB-MMAE溶液，使得mc-vc-PAB-MMAE與抗體突變半胱氨酸進(jìn)行偶聯(lián)，充分混勻后25℃反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后使用SP Sepharose F.F.陽離子交換層析去除未偶聯(lián)上抗體分子的mc-vc-PAB-MMAE,得到2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC樣品。

實(shí)施例17、通過偶聯(lián)2C1抗體和mc-vc-PAB-MMAF制備2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF TDC樣品，按照實(shí)施例16的操作步驟，通過偶聯(lián)2C1抗體和mc-vc-PAB-MMAF制備2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF TDC。

實(shí)施例18、通過偶聯(lián)2C1抗體和mc-vc-PAB-PBD制備2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBD TDC樣品，按照實(shí)施例16的操作步驟，通過偶聯(lián)2C1抗體和mc-vc-PAB-PBD制備 2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBDTDC。

實(shí)施例19、通過偶聯(lián)2C1抗體和mc-vc-PAB-SN38制備2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38 TDC樣品，按照實(shí)施例16的操作步驟，通過偶聯(lián)2C1抗體和mc-vc-PAB-SN38制備2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38 TDC。

實(shí)施例20、通過偶聯(lián)2C1抗體和mc-vc-PAB-Dox制備2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-Dox TDC樣品，按照實(shí)施例16的操作步驟，通過偶聯(lián)2C1抗體和mc-vc-PAB-Dox制備2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-Dox TDC。

實(shí)施例21、通過偶聯(lián)2A1抗體和mc-vc-PAB-Dox制備2A1-mc-vc-PAB–MMAE ADC樣品

細(xì)胞表達(dá)的2A1抗體，經(jīng)過Mabselect Sure純化，低pH洗脫后馬上加入Tris溶液中和，并換液為pH7.5的Tris-HCl緩沖液。Mc-vc-PAB-MMAE，白色粉末，將其溶解于DMA中備用。為了將抗體的鏈間二硫鍵打開，需要先將抗體還原。按照20倍分子比將1M的DTT水溶液加入2A1抗體溶液中，混勻后20℃反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)時(shí)間到后將樣品的pH調(diào)整至5.0，并通過SP Sepharose F.F.陽離子交換層析去除樣品中的DTT。然后加入mc-vc-PAB-MMAE溶液，使得mc-vc-PAB-MMAE與抗體與打開的鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基進(jìn)行偶聯(lián)，充分混勻后25℃反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后使用SP Sepharose F.F.陽離子交換層析去除未偶聯(lián)上抗體分子的mc-vc-PAB-MMAE。得到2A1-mc-vc-PAB-MMAE ADC樣品。

實(shí)施例22、通過偶聯(lián)2A1抗體和mc-vc-PAB-MMAF制備2A1-mc-vc-PAB–MMAF ADC樣品

按照實(shí)施例21的操作步驟，通過偶聯(lián)2A1抗體和mc-vc-PAB-MMAF制備2A1-mc-vc-PAB–MMAF ADC。

實(shí)施例23、通過偶聯(lián)2A1抗體和mc-vc-PAB-PBD制備2A1-mc-vc-PAB–PBD ADC樣品

按照實(shí)施例21的操作步驟，通過偶聯(lián)2A1抗體和mc-vc-PAB-PBD制備2A1-mc-vc-PAB-PBD ADC。

實(shí)施例24、通過偶聯(lián)2A1抗體和mc-vc-PAB-SN38制備2A1-mc-vc-PAB-SN38 ADC樣品

按照實(shí)施例21的操作步驟，通過偶聯(lián)2A1抗體和mc-vc-PAB-SN38制備2A1-mc-vc-PAB-SN38 ADC。

實(shí)施例25、通過偶聯(lián)2A1抗體和mc-vc-PAB-Dox制備2A1-mc-vc-PAB–Dox ADC 樣品

按照實(shí)施例21的操作步驟，通過偶聯(lián)2A1抗體和mc-vc-PAB-Dox制備2A1-mc-vc-PAB-Dox ADC。

實(shí)施例26、HIC-HPLC檢測(cè)毒素比抗體比例DAR

用高效液相色譜疏水層析方法分析TDC及ADC樣品，根據(jù)對(duì)應(yīng)峰面積計(jì)算DAR。具體方法如下：

色譜柱：HICBu‐NP5(5μm,4.6x 35mm)；

流動(dòng)相：A:2M硫酸銨，0.025M、pH7的磷酸鹽緩沖液；B：0.025M、pH7的磷酸鹽緩沖液；C：100％異丙醇；

緩沖液A平衡，緩沖液B與緩沖液C梯度洗脫，25℃，214nm檢測(cè)。DAR計(jì)算公式為：DAR＝(0D面積×0+1D面積×1+2D面積×2)/(0D面積+1D面積+2D面積)。

附圖1、HIC-HPLC檢測(cè)2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC DAR。根據(jù)附圖1計(jì)算得到定點(diǎn)偶聯(lián)DAR＝1.9，其化合物均一性很好。

附表1、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-payload TDC、2A1-mc-vc-PAB-payload ADC偶聯(lián)效率DAR表

附表1顯示，通過半胱氨酸改造進(jìn)行定點(diǎn)偶聯(lián)的TDC化合物偶聯(lián)效率均較高(理論最高值為2.0)，DAR≥1.7，產(chǎn)品均一性顯著好于通過抗體天然鏈間二硫鍵進(jìn)行半胱氨酸非定點(diǎn)偶聯(lián)的ADC化合物(DAR理論最高值為8.0)。

實(shí)施例27、SEC-HPLC檢測(cè)TDC聚集情況

將TDC樣品保存于37℃，第0、7、21天分別用SEC-HPLC分析其聚集情況，具體方法如下：

色譜柱：TSKgel SuperSW mAb HR(7.8mm×30cm)

流動(dòng)相：0.1M硫酸鈉、0.1M，pH6.7的磷酸鹽緩沖液。

25℃，280nm檢測(cè)。

附圖2A、SEC-HPLC檢測(cè)2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC聚集情況，樣品于37℃存放3周，聚集體含量基本沒有變化；

附圖2B、SEC-HPLC檢測(cè)通過抗體天然鏈間二硫鍵進(jìn)行半胱氨酸非定點(diǎn)偶聯(lián)的2A1-mc-vc-PAB-MMAE ADC樣品，樣品偶聯(lián)結(jié)束后立即檢測(cè)，約有30％的聚集體，其中包括大量高分子量聚集體。

附表2、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-payload TDC、2A1-mc-vc-PAB-payload ADC目標(biāo)單體含量列表

附表2顯示，通過抗體天然鏈間二硫鍵進(jìn)行半胱氨酸非定點(diǎn)偶聯(lián)的ADC化合物目標(biāo)單體含量顯著低于通過半胱氨酸改造進(jìn)行定點(diǎn)偶聯(lián)的TDC化合物。

實(shí)施例28、TDC保持了骨架抗體2C1與原始抗體2A1對(duì)于EGFRvIII的親和力用間接ELISA法對(duì)比TDC、2C1及2A1對(duì)于EGFRvIII的相對(duì)親和力。具體步驟如下：重組EGFRvIII-His*6抗原包板；魚皮明膠封閉；分別稀釋2A1、2C1、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB- PBD TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-DOX TDC，最高濃度50ug/ml，4倍梯度稀釋，共11個(gè)濃度；HRP標(biāo)記的二抗孵育；TMB顯色，檢測(cè)450nm處吸收。檢測(cè)結(jié)果以A450對(duì)濃度作圖，如圖3所示，2C1、偶聯(lián)后的TDC保持了與2A1相似的親和力，EC50值很接近；說明2A1上輕鏈V205C的定點(diǎn)突變以及2C1與mc-vc-PAB-payload的定點(diǎn)偶聯(lián)不影響其與EGFRvIII抗原的親和力。

附圖3A、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC與2C1保持了2A1與抗原EGFRvIII的親和力。

附圖3B、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBD TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38 TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-DOX TDC保持了2A1與抗原EGFRvIII的親和力，2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-payload可與多種小分子細(xì)胞毒素進(jìn)行定點(diǎn)偶聯(lián)并保持抗原-抗體親和力。

實(shí)施例29、細(xì)胞毒性藥效檢測(cè)

通過下列實(shí)驗(yàn)過程測(cè)定TDC及ADC的細(xì)胞毒性活性：將TDC及ADC分別加入到EGFR過量表達(dá)或EGFRVIII表達(dá)的人的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中，細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后測(cè)定細(xì)胞存活率?；诩?xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)用于測(cè)定細(xì)胞存活率、細(xì)胞毒性和本發(fā)明TDC誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡。

通過細(xì)胞增殖試驗(yàn)測(cè)定抗體-毒素偶聯(lián)物的體外藥效。CellTiterAqueousOne Solution Cell Proliferation Assay為商購(gòu)的(Promega Corp.，Madison,WI)。CellTiterAQueous One Solution Cell Proliferation Assay(a)是一種用比色法來檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中的活細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)試劑。此試劑含有一個(gè)新型的四唑化合物[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,inner salt；MTS]和一種電子偶聯(lián)劑(phenazine ethosulfate；PES)。PES具有增強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性，這使它可與MTS混合形成穩(wěn)定的溶液。這種方便的“單溶液”模式，是在第一代CellTiterAQueous Assay的基礎(chǔ)上的改進(jìn)，CellTiterAQueous Assay中使用的電子偶聯(lián)劑PMS與MTS溶液是分開提供的。MTS(Owen’s reagent)被細(xì)胞生物還原成為一種有色的甲臜產(chǎn)物，可直接溶解于培養(yǎng)基中(下式)。這種轉(zhuǎn)化很可能是在代謝活躍的細(xì)胞中的脫氫酶產(chǎn)生的NADPH或NADH的作用下完成的。檢測(cè)時(shí)，只需將少量的CellTiterAQueous One Solution Reagent直接加入培養(yǎng)板孔的培養(yǎng)基中，孵育1–4小時(shí)，然后以酶標(biāo)儀讀取490nm的吸光度值。

在490nm處檢測(cè)到的甲臜產(chǎn)物的量與培養(yǎng)中的活細(xì)胞數(shù)成正比。由于MTS的甲臜產(chǎn)物在組織培養(yǎng)基中可溶，CellTiterAQueous One Solution Assay與MTT或INT法相比操作步驟更少。

本發(fā)明中采用A431(EGFR過表達(dá)細(xì)胞)和U87-EGFRVIII(EGFR突變體穩(wěn)定細(xì)胞系)作為體外藥效檢測(cè)的研究體系。在96孔板中，進(jìn)行細(xì)胞鋪板6000/孔，24小時(shí)后，進(jìn)行抗體加藥。對(duì)A431的用藥濃度為2uM-3.8nM，兩倍稀釋，對(duì)U87-EGFRVIII的用藥濃度為2nM-0.4pM。處理72小時(shí)后MTS檢測(cè)細(xì)胞活性。

附圖4A-4C、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBD TDC及其對(duì)應(yīng)的2A1-mc-vc-PAB-MMAE ADC、2A1-mc-vc-PAB-MMAF ADC、2A1-mc-vc-PAB-PBD ADC對(duì)EGFRwt過表達(dá)的人皮膚鱗癌細(xì)胞A431的IC50檢測(cè)結(jié)果。TDC細(xì)胞毒性活性優(yōu)于ADC。

附圖4D-4H、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBD TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38 TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-Dox TDC及其對(duì)應(yīng)的2A1-mc-vc-PAB-MMAE ADC、2A1-mc-vc-PAB-MMAF ADC、2A1-mc-vc-PAB-PBD ADC、2A1-mc-vc-PAB-SN38ADC、2A1-mc-vc-PAB-Dox ADC對(duì)表達(dá)EGFRvIII的U87-EGFRvIII的IC50檢測(cè)結(jié)果。TDC細(xì)胞毒性活性優(yōu)于ADC。

附表3、TDC、ADC對(duì)EGFRwt過表達(dá)細(xì)胞系A(chǔ)431及EGFRvIII表達(dá)穩(wěn)定性株U87-EGFRVIII細(xì)胞毒性IC₅₀檢測(cè)結(jié)果。

附表3結(jié)果顯示，2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBD TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38 TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-Dox TDC對(duì)EGFRwt過表達(dá)細(xì)胞系A(chǔ)431及EGFRvIII表達(dá)穩(wěn)定性株U87-EGFRVIII細(xì)胞毒性活性優(yōu)于其對(duì)應(yīng)的2A1-mc-vc-PAB-MMAE ADC、2A1-mc-vc-PAB-MMAF ADC、2A1-mc-vc-PAB-PBD ADC、2A1-mc-vc-PAB-SN38ADC、2A1-mc-vc-PAB-Dox ADC。實(shí)施例30、荷瘤小鼠藥效檢測(cè)

本發(fā)明中建立了U87-EGFRvIII荷瘤小鼠模型，以評(píng)價(jià)TDC和ADC偶聯(lián)藥物的體內(nèi)藥效。即以3×106 U87-EGFRvIII細(xì)胞通過皮下注射到4～6周鼠齡的BALB/c裸鼠兩側(cè)，待小鼠腫瘤平均大小生長(zhǎng)至65～88mm3，隨機(jī)分組，每組5只，在第0天，2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBD、2A1-mc-vc-PAB-MMAE、2A1-mc-vc-PAB-MMAF、2A1-mc-vc-PAB-PBD分別以1mg/kg劑量進(jìn)行單次靜脈給藥(附圖5A)，2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-DOX、2A1-mc-vc-PAB-SN38、2A1-mc-vc-PAB-DOX以6mg/kg劑量給藥(附圖5B)。數(shù)據(jù)顯示為測(cè)量時(shí)腫瘤平均體積±SE。

附圖5A、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBD、2A1-mc-vc-PAB-MMAE、2A1-mc-vc-PAB-MMAF、2A1-mc-vc--PAB-PBD在第0天，分別以1mg/kg劑量進(jìn)行單次靜脈給藥。TDC組(2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBD)抑瘤效果顯著優(yōu)于ADC組(2A1-mc-vc-PAB-MMAE、2A1-mc-vc-PAB- MMAF、2A1-mc-vc-PAB-PBD)。

附圖5B、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-DOX、2A1-mc-vc-PAB-SN38、2A1-mc-vc-PAB-DOX在第0天，分別以6mg/kg劑量進(jìn)行單次靜脈給藥。TDC組(2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-DOX)抑瘤效果顯著優(yōu)于ADC組(2A1-mc-vc-PAB-SN38、2A1-mc-vc-PAB-DOX)。

實(shí)施例31、大鼠毒性檢測(cè)

本發(fā)明為評(píng)估半胱氨酸改造的抗體-毒素偶聯(lián)物耐受性，采用正常Sprague-Dawley大鼠以單劑量靜脈注射TDC或ADC(第一天)，其中2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBD、2A1-mc-vc-PAB-MMAE、2A1-mc-vc-PAB-MMAF、2A1-mc-vc-PAB-PBD給藥劑量為50mg/kg，2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-DOX、2A1-mc-vc-PAB-SN38、2A1-mc-vc-PAB-DOX給藥劑量為100mg/kg。給藥后第5天和第12天采集血液樣本，進(jìn)行嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(附圖6A)和AST檢測(cè)(附圖6B)，并每天監(jiān)測(cè)體重變化情況(附圖6C)。第12天采樣后，處死大鼠。

附圖6A、TDC及ADC大鼠毒性檢測(cè)，嗜中性粒細(xì)胞變化情況。在第12天，ADC組嗜中性粒細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照及TDC組，顯示ADC組毒性顯著大于TDC組。

附圖6B、TDC及ADC大鼠毒性檢測(cè)，肝臟中AST水平變化情況。在第12天，ADC組肝臟中AST水平顯著高于對(duì)照及TDC組，ADC組顯示出明顯的肝損傷，而TDC組安全性顯著好于ADC組。

附圖6C、TDC及ADC大鼠毒性檢測(cè)，體重變化情況。在前5天，ADC組體重均持續(xù)下降，5天逐漸恢復(fù)；TDC組與對(duì)照組顯著差異，表明TDC組安全性顯著好于ADC組。

本發(fā)明并不限于由實(shí)施例中披露的具體實(shí)施方案的范圍，這些實(shí)施例用來例示本發(fā)明的幾個(gè)方面，在功能上等效的任意實(shí)施方案均屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)際上，除本文所示和所述的以外，本發(fā)明的各種變型對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言也是顯而易見的并且屬于本文所附權(quán)利要求的范圍。