本發(fā)明涉及一種富集并檢測生物樣本中miRNA的方法及配套微流控裝置，屬于樣本中微量或痕量microRNA高靈敏度檢測及腫瘤等重大疾病的早期快速診斷技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

MicroRNA (miRNA) 是體內(nèi)參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控的一類非編碼RNA，在多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用。腫瘤細(xì)胞和正常組織來源的細(xì)胞在miRNA表達(dá)譜上具有明顯差異，大約50%得到注解的miRNA的基因位于與腫瘤形成相關(guān)的脆弱基因位點，這說明miRNA在腫瘤的發(fā)生過程中具有十分重要的作用。因此，研究miRNA的種類及含量對我們研究腫瘤的診斷、分類和治療等都具有十分重要的意義。然而，miRNA的含量很少，僅占總RNA數(shù)量的一小部分（約0.01％），而且樣本在處理及提取過程中必然會損失一部分miRNA，同時miRNA容易降解，從而給準(zhǔn)確定量檢測miRNA帶來了較大的挑戰(zhàn)。鑒于miRNA 易分解且含量較少，因而對miRNA的高效富集對miRNA的精確定量檢測就顯得尤其重要。目前市面上有多種RNA的抽提試劑盒，能夠抽提生物樣本內(nèi)的總RNA，而miRNA的富集提取方法也類似于抽提生物樣本的總RNA，但是試劑盒采用的方法常側(cè)重于保留小RNA。近年來研究的通過富集miRNA-蛋白復(fù)合物來提取miRNA不失為一種新型方法。

Ago2蛋白是Argonaute蛋白家族的一種，是Argonaute蛋白在進(jìn)化過程中演變成的一種亞科蛋白，另外幾種亞科蛋白為Ago1、Ago3和Ago4。4種Argonaute蛋白可以分別識別不同的小RNA分子并組成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC），但目前只有Ago2-miRNA復(fù)合物被證明具有對靶標(biāo)RNA裂解的切割酶活性。根據(jù)文獻(xiàn)報道，miRNA不止存在于細(xì)胞質(zhì)中，完整的miRNA也可以進(jìn)入血液和組織液的循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)。2011年Jason和其組員發(fā)現(xiàn)，血漿中的miRNA多數(shù)是與某種蛋白形成復(fù)合物而穩(wěn)定存在，并非如最初所猜測的以囊泡包裹的形式存在。通過進(jìn)一步研究，他們確定這種與miRNA結(jié)合的蛋白就是Argonaute蛋白家族中的Ago2蛋白。并且他們發(fā)現(xiàn)用Ago2共沉淀下來的miRNA占血漿總miRNA的大多數(shù)，只有很少量的miRNA是被囊泡包裹而存在的。這個結(jié)果說明循環(huán)miRNA可以以兩種形式存在，而Ago2-miRNA復(fù)合物形式是血漿中miRNA穩(wěn)定存在的主要原因。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的提供一種基于磁珠偶聯(lián)抗體富集和檢測樣本中與Ago2結(jié)合的miRNA的方法及配套微流控裝置。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案是：

一種基于磁珠偶聯(lián)抗體富集生物樣本中miRNA的方法，富集方法包括以下步驟：

（1）將抗Ago2抗體與磁珠連接，得到抗Ago2免疫磁珠。

（2）將抗Ago2免疫磁珠與樣品混合，通過抗原抗體免疫反應(yīng)富集Ago2-miRNA復(fù)合物。

進(jìn)一步的，所述磁珠為具有蛋白親和力的磁珠。

進(jìn)一步的，所述抗Ago2抗體為抗Ago2的單克隆抗體或抗Ago2的多克隆抗體。

進(jìn)一步的，所述步驟（1）所述抗Ago2免疫磁珠制備方式如下：

取所需用量的磁珠，除去原保存溶液；加入PBS緩沖液清洗兩次，除去清洗溶液；加入抗Ago2抗體及PBS緩沖液，常溫混合孵育一定時間，除去剩余抗體溶液；加入PBST緩沖液清洗兩次，除去清洗溶液，重懸所得抗Ago2免疫磁珠并換入新管。

所述步驟（2）所述免疫磁珠富集血清中Ago2-miRNA復(fù)合物方法如下：

將步驟（1）所得抗Ago2免疫磁珠與樣本混合孵育一定時間；加入PBST緩沖液清洗兩次，除去清洗溶液，重懸磁珠并換入新管。

本發(fā)明還提供了一種基于磁珠偶聯(lián)抗體檢測樣本中miRNA的方法，檢測方法包括以下步驟：

（1）將根據(jù)權(quán)利要求1富集到Ago2-miRNA的免疫磁珠與適量裂解液混合，高溫反應(yīng)一定時間，除去磁珠。

（2）反應(yīng)完成后將所得的液體進(jìn)行qPCR檢測。

本發(fā)明還提供了一種富集樣本中miRNA的微流控裝置，所述微流控裝置制備包括以下步驟：

（1）根據(jù)上述磁珠免疫富集方法設(shè)計制備微流控芯片模板；

（2）在微流控芯片模板上澆注PDMS聚合物經(jīng)固化得到PDMS膜；

（3）將PDMS膜與玻璃片進(jìn)行等離子鍵合，封裝得到所需微流控芯片裝置。

上述生物樣本包括血液、尿液、唾液、關(guān)節(jié)滑液或細(xì)胞裂解液等。

本發(fā)明的優(yōu)勢在于，集合抗原抗體免疫識別與結(jié)合的高特異性和高親和性磁珠分離的簡便易操作性以及微流控裝置的高效反應(yīng)和富集等特性，可快速檢測生物樣本如血液、尿液、唾液、關(guān)節(jié)滑液以及細(xì)胞裂解液等中與疾病特別是腫瘤相關(guān)的多種miRNA，對癌癥等重大疾病的及早發(fā)現(xiàn)和診斷治療等具有重要意義。

附圖說明

圖1為富集血清中Ago2-miRNA復(fù)合物的Western Blot驗證結(jié)果。

圖2為磁珠富集并qPCR檢測血清中與Ago2結(jié)合miRNA結(jié)果。

圖3為微流控裝置設(shè)計方案及實物圖。

圖4為微流控富集系統(tǒng)。

圖5為微流控系統(tǒng)富集并qPCR檢測血清中與Ago2結(jié)合的miRNA結(jié)果。

具體實施方式

本發(fā)明一種基于磁珠偶聯(lián)抗體富集并檢測樣本中miRNA的方法，包括以下步驟：

（1）取適量Protein G磁珠，除去原保存溶液，使用PBS緩沖液清洗兩次，除去清洗溶液；

（2）使用PBS緩沖液重懸磁珠，并加入適量抗Ago2單克隆抗體，常溫孵育一定時間；

（3）在離心管進(jìn)行富集反應(yīng)時，使用PBST緩沖液清洗兩次，除去多余抗體，并重懸免疫磁珠移入新的離心管；

（4）將免疫磁珠與待測樣本混合，常溫孵育一定時間；

（5）使用PBST緩沖液清洗兩次，除去洗液，并重懸免疫磁珠移入新的離心管；

（6）收集反應(yīng)后的免疫磁珠，取少量進(jìn)行洗脫，將洗脫液通過Western Blot實驗驗證是否富集到Ago2蛋白；余下磁珠經(jīng)DTT裂解得到miRNA并進(jìn)行qPCR實驗進(jìn)行定量分析；

（7）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算裂解液中miRNA的含量，并根據(jù)富集樣本的體積以及裂解液的體積計算得到樣本中miRNA含量。

（8）在利用微流控裝置進(jìn)行富集反應(yīng)時，結(jié)合分離富集方法，設(shè)計制備微流控芯片模板；

（9）在微流控芯片模板上澆注PDMS聚合物經(jīng)固化得到PDMS膜；

（10）將PDMS膜與玻璃片進(jìn)行等離子鍵合，封裝得到所需微流控芯片裝置。

（11）使用PBST緩沖液清洗通道，再使用PBS緩沖液清洗通道，通入封閉液封閉微流控通道表面的活性區(qū)域；

（12）將與Ago2蛋白結(jié)合的免疫磁珠導(dǎo)入已經(jīng)使用BSA溶液封閉后的微流控孔道，使用磁鐵將磁珠固定于孔道內(nèi)部；

（13）導(dǎo)入待測樣本，使免疫磁珠與樣本混合孵育一定時間；

（14）使用PBST緩沖液清洗孔道，再使用PBS緩沖液清洗通道；

（15）除去磁鐵，收集免疫磁珠，并使用裂解液進(jìn)行裂解得到miRNA溶液，后進(jìn)行qPCR實驗；

（16）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算裂解液中miRNA的含量，并根據(jù)富集樣本體積以及裂解液體積計算得到樣本中miRNA含量。

以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不為本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明步驟或條件有所修改，均屬于本發(fā)明的范圍。

實施例中所用試劑和儀器：抗Ago2小鼠單克隆抗體（ab57113，Abcam，美國）；抗Ago2兔單克隆抗體（ab186733，Abcam，美國）；Protein G磁珠（Invitrogen公司，美國）；Ago2蛋白（北京義翹神州，中國）；有機(jī)灌封膠（道康寧，美國），其余試劑均為常規(guī)試劑；HulaMixer? Sample Mixer孵育器（Invitrogen公司，美國）。

實施例1——富集血清中Ago2-miRNA復(fù)合物并檢測miRNA

1 免疫磁珠制備：

1.1 取Protein G磁珠1.5 mg置于2 mL離心管中，利用磁性分離器除去原保存溶液，并使用200 μL PBS緩沖液清洗兩次，利用磁性分離器除去清洗溶液；

1.2 使用200 μL PBS緩沖液重懸磁珠，加入8μg抗Ago2兔單克隆抗體，于孵育器上常溫孵育15 min；

1.3 使用200 μLPBST緩沖液清洗磁珠兩次，每次輕輕振蕩1 min，防止磁珠凝結(jié)，同時除去多余抗體并移入新的離心管，得到抗Ago2免疫磁珠。

2免疫磁珠富集血清中Ago2-miRNA復(fù)合物并檢測miRNA（未偶聯(lián)抗體的磁珠作為陰性對照）

2.1 將抗Ago2免疫磁珠加入1 mL血清樣本中，于孵育器上常溫孵育60 min，利用磁性分離器除去殘余血清，再次加入1 mL血清樣本，重復(fù)上述操作，共4 mL血清樣本，通過抗原抗體免疫反應(yīng)富集血清中Ago2-miRNA復(fù)合物；

2.2使用200 μL PBST緩沖液清洗兩次，每次輕輕振蕩1 min，防止磁珠凝結(jié)，同時除去雜質(zhì)并移入新管，使用200 μL PBS緩沖液重懸備用；

2.3取上一步中100 μL混合物，利用磁性分離器除去重懸液，加入30 μL洗脫液（10% SDS溶液）常溫孵育5 min，除去磁珠并取10 μL洗脫液進(jìn)行Western Blot實驗，驗證是否成功富集到血清中的Ago2蛋白；

2.4取剩余100 μL混合物，利用磁性分離器除去重懸液，按照DTT（1 M）與PBS緩沖液比例為1:9加入除菌后的DTT溶液，混勻后在95 ^oC反應(yīng)10 min，利用磁性分離器除去磁珠得到miRNA溶液；

2.5 取miR-122標(biāo)準(zhǔn)樣本，按照同樣比例加入DTT（1M）溶液，并在95^oC反應(yīng)10 min，作為陽性對照；

2.6將得到的miRNA溶液及陽性對照進(jìn)行qPCR定量分析。

3上述實驗中，Western Blot實驗結(jié)果如圖1所示，顯示為成功富集到血清中的Ago2蛋白；qPCR實驗結(jié)果如圖2所示，顯示為成功檢測到富集的與Ago2蛋白結(jié)合的miRNA。

實施例2——微流控裝置富集血清中Ago2-miRNA復(fù)合物并檢測miRNA

1 免疫磁珠制備同實施例1。

2 微流控裝置制備：

2.1 根據(jù)上述磁珠免疫富集方法設(shè)計制備微流控芯片模板；

2.2 在微流控芯片模板上澆注PDMS聚合物經(jīng)固化得到PDMS膜；

2.3 將PDMS膜與玻璃片進(jìn)行等離子鍵合，封裝得到所需微流控芯片裝置（圖3，圖4）。

3免疫磁珠在微流控平臺富集血清中Ago2-miRNA復(fù)合物并檢測miRNA（未偶聯(lián)抗體磁珠進(jìn)行實驗作為陰性對照）

3.1 通入1 mL濃度為1%的 BSA溶液流經(jīng)微流控孔道，流速控制為50 μL/min，封閉微流控通道，防止PDMS膜對蛋白的非特異性吸附；

3.2 使用500 μL PBS緩沖液清洗孔道，流速控制為50 μL/min，除去BSA溶液；

3.3將抗Ago2免疫磁珠導(dǎo)入微流控裝置的孔道并利用磁鐵使磁珠在通道中固定，導(dǎo)入4 mL血清樣本，流速控制為30 μL/min，通過抗原抗體免疫反應(yīng)富集血清中Ago2-miRNA復(fù)合物；

3.4使用500μL PBST緩沖液清洗微流控通道，再使用500 μL PBS緩沖液清洗微流控通道，流速控制為30 μL/min，除去反應(yīng)后的樣本；

3.5按照DTT（1 M）與PBS緩沖液比例為1:9加入除菌后的DTT溶液，除去磁鐵，將微流控裝置在加熱板上95 ^oC反應(yīng)10 min，使用磁鐵固定磁珠于微流控通道內(nèi)，在出口處收集得到的miRNA溶液；

3.6取miR-122標(biāo)準(zhǔn)樣本，按照同樣比例加入DTT（1M）溶液，并在95^oC反應(yīng)10 min，作為陽性對照；

3.7反應(yīng)結(jié)束后將得到的miRNA溶液及陽性對照進(jìn)行qPCR定量分析。

4上述實驗中，qPCR實驗結(jié)果如圖5所示，顯示為成功檢測到富集的與Ago2蛋白結(jié)合的miRNA。