本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)高新技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種鑒定周期短、可靠性高的玉米抗粗縮病鑒定方法。
背景技術(shù)：
玉米屬于禾本科玉蜀黍族玉蜀黍?qū)伲鸟Z化起源可以追溯到距今7000-10000年以前，是目前世界第一大作物。我國是世界上僅次于美國的第二大玉米生產(chǎn)國，近年來玉米也成為我國第一大作物，是重要的口糧、飼料糧、工業(yè)原料和能源原料，在生產(chǎn)中有著舉足輕重的地位。近年來，隨著產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和人口不斷增加，對于玉米的產(chǎn)量、品質(zhì)的需求也越來越高，玉米種植面積也逐年增加。
玉米粗縮病是一種在世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害玉米生產(chǎn)的病毒病。該病于1949年首次在意大利發(fā)現(xiàn)，隨后在其它歐洲國家和南美洲國家也相繼發(fā)現(xiàn)。我國于1954年在新疆南部和甘肅西部首先發(fā)現(xiàn)，隨后蔓延全國。自上世紀(jì)70年代以來玉米粗縮病在我國華北、西北和東北的部分地區(qū)引發(fā)大面積毀種或絕產(chǎn)，成為威脅玉米生產(chǎn)的重要病害。據(jù)不完全統(tǒng)計，1996年我國玉米粗縮病發(fā)病田高達(dá)233萬公頃，其中絕產(chǎn)超過4萬公頃。2004年后，玉米粗縮病又在江蘇、安徽、江蘇、浙江、上海等地區(qū)暴發(fā)。2007年僅在山東全省發(fā)生面積就達(dá)340萬畝，2008年在山東進(jìn)一步擴展到1110多萬畝，其中造成絕產(chǎn)25萬畝，安徽、河南、河北等省的玉米粗縮病也比較嚴(yán)重。從2008年到2014年，玉米粗縮病在我國每年的發(fā)病面積都超過300萬公頃，一般病株率在2%至10%之間，嚴(yán)重的田塊可達(dá)80%以上，有的甚至絕收，該病的爆發(fā)和流行嚴(yán)重影響和制約了我國的玉米生產(chǎn)，并造成了巨大的經(jīng)濟損失。近幾年，隨著氣候的變化和種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，玉米粗縮病的發(fā)生在我國又開始呈上升趨勢，尤其在河北、山西、山東、江蘇、浙江、上海等地區(qū)發(fā)生更為嚴(yán)重，控制玉米粗縮病的危害對保證玉米的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有十分重要的意義。
玉米粗縮病的初期癥狀是在幼葉中脈兩側(cè)的細(xì)脈間有透明虛線小點，以后透明小點逐漸增多，葉背面的葉脈上產(chǎn)生粗細(xì)不一的蠟白色突起，手摸有明顯的粗糙感。病株植株矮縮，節(jié)間縮短；葉色濃綠；葉片短寬肥厚，僵直挺立，常有皺褶；雌雄穗發(fā)育不良，嚴(yán)重者不能結(jié)實。
MRDV、MRCV和RBSDV是迄今報道的能引起玉米粗縮病的三種病原，其中MRDV和MRCV分別是歐洲和南美洲玉米粗縮病的病原，我國玉米粗縮病的病原為RBSDV。這三種病毒都屬于呼腸孤病毒科斐濟病毒屬的第二組，三者在病毒粒子形態(tài)、寄主范圍、傳播介體、血清學(xué)和基因組電泳和序列等方面都非常相似。
中國玉米粗縮病病毒RBSDV主要存在于病葉隆起的細(xì)胞及保毒昆蟲的脂肪體、唾液腺、消化道、肌肉、氣管等細(xì)胞內(nèi)。在玉米植株，病毒粒子大多集中在細(xì)胞壁處形成病毒質(zhì)體，玉米粗縮病毒僅限于韌皮部及其附近細(xì)胞。只能由昆蟲傳播，傳毒昆蟲主要為灰飛風(fēng)，灰飛虱一旦獲毒，終身帶毒，蛻皮后仍在體內(nèi)繁殖，屬持久性傳毒。
灰飛虱是傳播玉米粗縮病病毒最主要的傳播介體，無毒蟲在感染了RBSDV的植株上吸汁獲毒，獲毒時間一般為24-48h，最短lh，無毒蟲一經(jīng)帶毒后能終身傳毒，不經(jīng)卵傳染，毒蟲多數(shù)為短期間歇傳毒。在“小麥-玉米”種植區(qū)，小麥上發(fā)生的第1代灰飛虱帶毒蟲是造成玉米粗縮病流行的主要侵染源。春天第一代灰飛虱成蟲在越冬寄主上取食得毒后向玉米上遷移，在小麥?zhǔn)斋@期形成遷飛高峰，遷移高峰后約21天出現(xiàn)玉米粗縮病發(fā)病高峰。第2、3、4代灰飛虱遷飛到麥田和田邊雜草傳毒并越夏。秋季冬小麥出苗后，灰飛虱遷飛到麥田和雜草上傳毒越冬，繼而形成全年病害循環(huán)。
化學(xué)農(nóng)藥防治和調(diào)整播種期等防治措施，可以在一定程度上控制玉米粗縮病的發(fā)生和傳播，但是費時費力，帶來農(nóng)藥污染環(huán)境問題，效果并不一定明顯，種植抗病的玉米品種是防治粗縮病最有效的方法。培育和鑒定優(yōu)良的抗病玉米是選育抗病品種的首要問題。對當(dāng)?shù)刂髟云贩N以及我國主要玉米品種進(jìn)行粗縮病抗性鑒定與評價，篩選高抗品種和種質(zhì)，是開展抗玉米粗縮病種質(zhì)改良和育種研究的最直接的依據(jù)和指導(dǎo)。
目前對于玉米粗縮病的研究主要還是依靠田間自然發(fā)病的方法，鑒定耗費周期長，鑒定結(jié)果波動大、重復(fù)性差，這為鑒定玉米植株的粗縮病抗性和遺傳分析帶來了困難。因此，建立一個穩(wěn)定有效的粗縮病抗病性鑒定方法對于鑒定抗病種質(zhì)資源、研究植株的抗病機制、鑒定并克隆抗病基因以及抗病育種都有很重要的意義。因此，完善玉米粗縮病鑒定技術(shù)是一項十分必要的工作，準(zhǔn)確可靠的粗縮病抗性鑒定技術(shù)可保證玉米粗縮病的病原及抗病性鑒定工作的連續(xù)性和重復(fù)性。
我們研究發(fā)現(xiàn)對玉米植株接種RBSDV，不管是抗病還是感病玉米植株體內(nèi)，均檢測到RBSDV病毒，但是玉米植株苗期感染了RBSDV病毒之后，癥狀不凸顯，不能確定其抗病性，需要進(jìn)一步大田栽培至顯癥后才能調(diào)查其抗病性。令人振奮的是，我們研究發(fā)現(xiàn)玉米接種RBSDV病毒后早期幼苗體內(nèi)的RBSDV增殖速度與玉米品種抗性直接相關(guān)，通過調(diào)查接種后病毒粒子的增殖速度能夠直觀反映玉米種質(zhì)對粗縮病的抗性水平。我們的研究發(fā)現(xiàn)給玉米粗縮病抗病性的鑒定提供了新思路，本發(fā)明正是據(jù)此利用熒光定量RT-PCR技術(shù)對接種病毒后早期玉米幼苗體內(nèi)RBSDV進(jìn)行檢測，通過制作RBSDV增殖趨勢圖實現(xiàn)了接毒后早期玉米幼苗內(nèi)RBSDV病毒增殖速度的準(zhǔn)確測量，從而快速且準(zhǔn)確地鑒定玉米對粗縮病的抗性水平和抗性等級。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對目前玉米抗粗縮病鑒定方法具有鑒定周期長、鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確等缺點，提供了一種鑒定周期短、可靠性高的玉米抗粗縮病鑒定方法。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案解決的：
一種玉米抗粗縮病鑒定方法，其特征在于：該鑒定方法包括以下步驟：
1）選擇鑒定標(biāo)尺：根據(jù)人工接毒鑒定中不同品種對玉米粗縮病表現(xiàn)設(shè)置高抗、中抗、感病三個鑒定標(biāo)尺，選擇三個相應(yīng)玉米品種作為鑒定標(biāo)尺；
2）低氧誘導(dǎo)待測玉米和鑒定標(biāo)尺的胚芽鞘：每個品種取10-16粒種子，用0.6%次氯酸鈉溶液浸泡15min進(jìn)行滅菌，超純水沖洗干凈，然后放置于25℃條件下適宜濃度的IAA溶液中低氧誘導(dǎo)培養(yǎng)3天，誘導(dǎo)出胚芽鞘；
3）胚芽鞘接種帶毒灰飛虱后暗培養(yǎng)：將胚芽鞘用超純水洗凈，放入鋪有吸水棉的試管中，每個試管一個種子，定量接種帶毒灰飛虱，用透氣紗布封閉試管后平置，傳毒24h，將傳毒后胚芽鞘用超純水沖洗，然后放置于25℃條件下浸潤了適宜濃度的ABA溶液的吸水棉上暗培養(yǎng)；
4）熒光定量PCR獲得各玉米品種周期時間點的RBSDV病毒S7與內(nèi)參基因的相對表達(dá)量（RQ值）：按照周期時間點采集待測玉米和鑒定標(biāo)尺特定位置的胚芽鞘40-60g，每個品種每個取材時間點取材2-3重復(fù)，-70℃保存，提取RNA并純化，取1μL上述病毒RNA提取液，加入熒光定量PCR反應(yīng)體系，利用引物RBSDV-F：5’-AGA GCT CTT CTA GTT ATT GCG-3’和RBSDV-R：5’-TCA GCA AAA GGT AAA GGA ACG-3’按照熒光定量PCR擴增程序擴增RBSDV病毒S7片段，擴增完畢，進(jìn)入結(jié)果分析界面，以GAPDH為內(nèi)參，與對照組相比，獲得每個品種每個取樣時間點重復(fù)的RBSDV病毒S7與內(nèi)參基因的相對表達(dá)量（RQ值）；
5）繪制RBSDV增殖指數(shù)趨勢線：利用多重復(fù)的RQ值統(tǒng)計每個待測品種和鑒定標(biāo)尺飼毒后每個取樣時間點的RQ值均值，以RQ值均值為縱坐標(biāo)、飼毒后周期取樣時間點為橫坐標(biāo)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，獲得RBSDV增殖指數(shù)趨勢線y=Aekx；
6）根據(jù)RBSDV增殖指數(shù)趨勢線公式評價待測玉米品種對玉米粗縮病的抗性水平和抗性等級：根據(jù)每個品種RBSDV增殖指數(shù)趨勢線公式y(tǒng)=Aekx評價待測玉米品種的抗性水平，即公式中k值大的品種比k值小的品種對RBSDV抗性低，待測品種k值小于等于高抗標(biāo)尺的為高抗品種，待測品種k值大于高抗標(biāo)尺且小于等于中抗標(biāo)尺的為中抗品種，待測品種k值大于中抗標(biāo)尺且小于等于感病標(biāo)尺的為感病品種，待測品種k值大于感病標(biāo)尺的為超感品種。
所述步驟1）和6）中的高抗鑒定標(biāo)尺為室內(nèi)接毒鑒定中抗病表現(xiàn)在當(dāng)?shù)赜衩灼贩N資源中排名為9%-11%；中抗鑒定標(biāo)尺排名為23%-27%；感病鑒定標(biāo)尺排名為46%-54%。
所述步驟2）中的適宜濃度的IAA溶液濃度為2.0-3.0μmol/L；所述的低氧誘導(dǎo)方法為種子置于液面下5-10cm處培養(yǎng)。
所述步驟3）中的帶毒灰飛虱的獲取步驟為：
3.1）RBSDV毒源獲?。簭挠衩状挚s病重病區(qū)田間采集表現(xiàn)為玉米粗縮病癥狀的玉米幼嫩病株，-70℃保存；
3.2）傳毒介體繼代繁殖：大田采集并純化灰飛虱高齡若蟲，用玉米幼苗飼養(yǎng)并傳代；
3.3）介體飼毒：飼毒時從-70℃冰箱中取出玉米粗縮病病株，常溫放置2-3h使病株自然展開，然后用吸水棉布包裹病株根部后用塑料袋緊密包扎，確保水不會流出，然后將其移入保鮮盒內(nèi)，將室內(nèi)人工飼養(yǎng)的灰飛虱轉(zhuǎn)入保鮮盒內(nèi)的RBSDV毒源玉米上，25℃飼毒48h后移除毒源，將灰飛虱轉(zhuǎn)移到玉米幼苗上飼養(yǎng)度過循回期即為帶毒灰飛虱。
所述步驟3）中的適宜濃度的ABA溶液濃度控制為35-45μmol/L；所述步驟3）中的定量接種帶毒灰飛虱控制為10-15蟲/個胚芽鞘。
所述步驟4）中的周期取樣時間點為RBSDV傳毒后4-18天內(nèi)每隔2.5-3.5天均勻分布的3-4個時間點；特定位置的胚芽鞘為胚芽鞘全長的正中間部位。
所述步驟4）中的提取RNA的方法為：取適量葉片加液氮于研缽中迅速磨碎，按比例加入TRI-Reagent到1.5ml離心管中，樣品體積不應(yīng)超過TRI-Reagent體積10%，4℃12000×g低溫離心1.5min，然后小心轉(zhuǎn)移上清到新的離心管中。
所述步驟4）中的純化RNA的方法為：a）直接添加一體積（95%-100%）酒精到已經(jīng)溶解于TRI-Reagent的上清液中，漩渦混勻；b）轉(zhuǎn)移到吸附柱中過濾（吸附柱置于收集管中），然后12000×g離心1min，之后把吸附柱轉(zhuǎn)移到新的收集管中；c）加400μl RNA Wash Buffer到離心柱中，12000×g離心1min；d）將80μl配好的DNAase I cocktail buffer直接加到離心柱中，25-37℃水浴加熱離心柱15min，12000×g離心30s；e）添加400μl RNA Prewash到吸附柱中，12000×g離心1min，收集過濾的液體，重復(fù)此步驟；f）添加700μl RNA Wash Buffer到吸附柱中，12000×g離心1min，然后從收集管中小心轉(zhuǎn)移吸附柱到一個新的RNase-free 1.5ml離心管中；g）至少添加25μl DNase/RNase-Free Water 到離心管基質(zhì)中，最大速度離心1min，被洗脫的RNA可以直接利用或保存于-70℃超低溫冰箱中。
所述步驟4）中的熒光定量反應(yīng)體系每20μL中含：10μL的2×qPCR master mix (Promega)、1.0μL的cDNA模板、8.2μL的ddH2O以及0.8μL的10μM引物RBSDV-R和RP；實時熒光定量PCR擴增程序為：95℃預(yù)變性2min；95℃變性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，共進(jìn)行40次循環(huán)；95℃變性15s，60℃退火1min，95℃變性15s。
所述步驟3.3）中的RBSDV毒源玉米來源于步驟3.1）中的表現(xiàn)為玉米粗縮病癥狀的玉米幼嫩病株。
附圖說明
附圖為對實施例所選擇的鑒定標(biāo)尺胚芽鞘傳毒后周期取材點取材檢測RBSDV濃度變化所獲得RBSDV增殖指數(shù)趨勢圖。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
一種玉米粗縮病的分子鑒定方法，其特征在于：該鑒定方法包括以下步驟：
1）選擇鑒定標(biāo)尺：根據(jù)人工接毒鑒定中不同品種對玉米粗縮病表現(xiàn)設(shè)置高抗、中抗、感病三個鑒定標(biāo)尺，選擇三個相應(yīng)玉米品種做為鑒定標(biāo)尺，其中，高抗鑒定標(biāo)尺為室內(nèi)接毒鑒定中抗病表現(xiàn)在當(dāng)?shù)赜衩灼贩N資源中排名為9%-11%，中抗鑒定標(biāo)尺排名為23%-27%，感病鑒定標(biāo)尺排名為46%-54%；
2）低氧誘導(dǎo)待測玉米和鑒定標(biāo)尺品種的胚芽鞘：每個品種取10-16粒種子，用0.6%次氯酸鈉溶液浸泡15min進(jìn)行滅菌，超純水沖洗干凈，然后放置于25℃條件下2.0-3.0μmol/L的IAA溶液液面下5-10cm處低氧誘導(dǎo)培養(yǎng)3天，誘導(dǎo)出胚芽鞘；
3）胚芽鞘接種帶毒灰飛虱后暗培養(yǎng)：
3.1）RBSDV毒源獲取：從玉米粗縮病重病區(qū)田間采集表現(xiàn)為玉米粗縮病癥狀的玉米幼嫩病株，-70℃保存；
3.2）傳毒介體繼代繁殖：大田采集并純化灰飛虱高齡若蟲，用玉米幼苗飼養(yǎng)并傳代；
3.3）介體飼毒：飼毒時從-70℃冰箱中取出玉米粗縮病病株，常溫放置2-3h使病株自然展開，然后用吸水棉布包裹病株根部后用塑料袋緊密包扎，確保水不會流出，然后將其移入保鮮盒內(nèi)，將室內(nèi)人工飼養(yǎng)的1.5-2.5齡灰飛虱若蟲轉(zhuǎn)入保鮮盒內(nèi)的RBSDV毒源玉米上，該RBSDV毒源玉米即3.1）中的表現(xiàn)為玉米粗縮病癥狀的分蘗盛期玉米病株，25℃飼毒48h后移除毒源，將灰飛虱轉(zhuǎn)移到玉米幼苗上飼養(yǎng)度過循回期即為帶毒灰飛虱；
3.4）胚芽鞘接種帶毒灰飛虱：將胚芽鞘用超純水洗凈，放入鋪有吸水棉的試管中，每個試管一個種子，按照10-15蟲/個胚芽鞘的比例定量接種帶毒灰飛虱，用透氣紗布封閉試管后平置，傳毒24h；
3.5）胚芽鞘接毒后暗培養(yǎng)：將胚芽鞘用超純水沖洗，然后放置于25℃條件下浸潤了35-45μmol/L的ABA溶液的吸水棉上暗培養(yǎng)；
4）熒光定量PCR獲得各玉米品種周期時間點的RBSDV病毒S7與內(nèi)參基因的相對表達(dá)量（RQ值）：灰飛虱傳毒結(jié)束后4-18天內(nèi)在每隔2.5-3.0天均勻分布的3-4個時間點采集待測玉米和鑒定標(biāo)尺胚芽鞘長度的正中間部位40-60g，每個品種每個取材時間點取材2-3重復(fù)，-70℃保存，提取RNA并純化，（RNA提取方法為：取適量葉片加液氮于研缽中迅速磨碎，按比例加入TRI-Reagent到1.5ml離心管中，樣品體積不應(yīng)超過TRI-Reagent體積10%，4℃12000×g低溫離心1.5min，然后小心轉(zhuǎn)移上清到新的離心管中；RNA純化方法為：a）直接添加一體積（95%-100%）酒精到已經(jīng)溶解于TRI-Reagent的上清液中，漩渦混勻；b）轉(zhuǎn)移到吸附柱中過濾（吸附柱置于收集管中），然后12000×g離心1min，之后把吸附柱轉(zhuǎn)移到新的收集管中；c）加400μl RNA Wash Buffer到離心柱中，12000×g離心1min；d）將80μl配好的DNAase I cocktail buffer直接加到離心柱中，25-37℃水浴加熱離心柱15min，12000×g離心30s；e）添加400μl RNA Prewash到吸附柱中，12000×g離心1min，收集過濾的液體，重復(fù)此步驟；f）添加700μl RNA Wash Buffer到吸附柱中，12000×g離心1min，然后從收集管中小心轉(zhuǎn)移吸附柱到一個新的RNase-free 1.5ml離心管中；g）至少添加25μl DNase/RNase-Free Water 到離心管基質(zhì)中，最大速度離心1min，被洗脫的RNA可以直接利用或保存于-70℃超低溫冰箱中。）取1μL上述病毒RNA提取液，加入熒光定量PCR反應(yīng)體系，利用引物RBSDV-F：5’-AGA GCT CTT CTA GTT ATT GCG-3’和RBSDV-R：5’-TCA GCA AAA GGT AAA GGA ACG-3’按照熒光定量PCR擴增程序擴增RBSDV病毒S7片段，擴增完畢，進(jìn)入結(jié)果分析界面，以GAPDH為內(nèi)參，與對照組相比，獲得每個品種每個取樣時間點重復(fù)的RBSDV病毒S7與內(nèi)參基因的相對表達(dá)量（RQ值）；
5）繪制RBSDV增殖指數(shù)趨勢線：利用多重復(fù)的RQ值統(tǒng)計每個待測品種和鑒定標(biāo)尺飼毒后每個取樣時間點的RQ值均值，以RQ值均值為縱坐標(biāo)、飼毒后周期取樣時間點為橫坐標(biāo)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，獲得RBSDV增殖指數(shù)趨勢線y=Aekx；
6）根據(jù)RBSDV增殖指數(shù)趨勢線公式評價待測玉米品種對玉米粗縮病的抗性水平和抗性等級：
6.1）待測品種抗性水平評價：根據(jù)每個品種RBSDV增殖指數(shù)趨勢線公式y(tǒng)=Aekx評價待測玉米品種的抗性水平，即公式中k值大的品種比k值小的品種對RBSDV抗性低；
6.2）待測品種抗性等級劃分：根據(jù)待測品種和鑒定標(biāo)尺k值大小來評價待測品種的抗性等級，即待測品種k值小于等于高抗標(biāo)尺為高抗品種，待測品種k值大于高抗標(biāo)尺且小于等于中抗標(biāo)尺的為中抗品種，待測品種k值大于中抗標(biāo)尺且小于等于感病標(biāo)尺為感病品種，待測品種k值大于感病標(biāo)尺為超感品種。
實施例
2014年，利用該發(fā)明的鑒定方法對征集得到的部分玉米品種資源進(jìn)行了粗縮病抗性鑒定，分別設(shè)置丹340、珠甜1號、濟單7號三個玉米品種做為高抗、中抗、感病鑒定標(biāo)尺，其中，丹340在2012-2013年室內(nèi)接毒鑒定中抗病表現(xiàn)在68個玉米品種資源群體中排名第7，珠甜1號排名17，濟單7號排名34；處理的IAA溶液濃度選擇為2.5μmol/L；ABA溶液濃度選擇為40μmol/L；種子置于液面下8cm處培養(yǎng)誘導(dǎo)胚芽鞘；定量接種帶毒灰飛虱控制為12蟲/個胚芽鞘；胚芽鞘采集時間點設(shè)置為接毒完成后第5、8、11、14天四個時間點。
實時熒光定量PCR獲得每個品種周期取樣時間點的RQ值，如表1所示：
然后繪制RBSDV增殖指數(shù)趨勢線：以RQ值均值為縱坐標(biāo)，飼毒后取樣時間點為橫坐標(biāo)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，獲得RBSDV增殖指數(shù)趨勢線，如附圖所示。
根據(jù)RBSDV增殖指數(shù)趨勢圖各品種k值的差異來評價待測玉米品種的粗縮病抗性水平和抗性等級。在本實驗中，高抗標(biāo)尺丹340 k值計算為0.6368；中抗標(biāo)尺珠甜1號k值計算為1.4271；感病標(biāo)尺濟單7號k值計算為1.9715，如附圖所示。待測品種k值與鑒定標(biāo)尺比較獲得相應(yīng)的抗性等級，我們對以下8個玉米品種采用本發(fā)明的鑒定方法鑒定種質(zhì)粗縮病抗性，結(jié)果如表2。
通過將表2的鑒定結(jié)果與田間多年多點粗縮病發(fā)病結(jié)果的比較，我們發(fā)現(xiàn)該鑒定結(jié)果與大田發(fā)病表現(xiàn)非常吻合，而且本發(fā)明在傳毒介體接毒玉米胚芽鞘后短時間內(nèi)就能對種質(zhì)粗縮病抗性進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測，從而大大縮短了鑒定時間。
通過實施例可以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的鑒定新方法與利用發(fā)病病癥評價抗感性的方法相比，通過接毒玉米胚芽鞘后調(diào)查胚芽鞘內(nèi)病毒增殖速度來評價玉米粗縮病品種抗性，大大縮短了鑒定周期；而且通過檢測胚芽鞘內(nèi)病毒增殖速度從分子水平上確定玉米種質(zhì)對玉米粗縮病的抗性水平和抗性等級，可靠性更高，因而本發(fā)明具有較大的育種應(yīng)用價值。
以上實施例僅為說明本發(fā)明的技術(shù)思想，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡是按照本發(fā)明提出的技術(shù)思想，在技術(shù)方案基礎(chǔ)上所做的任何改動，均落入本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)；本發(fā)明未涉及的技術(shù)均可通過現(xiàn)有技術(shù)加以實現(xiàn)。