本發(fā)明屬于馬氏珠母貝DNA去甲基化領(lǐng)域，具體涉及一種對(duì)馬氏珠母貝精、卵結(jié)合過(guò)程進(jìn)行去甲基化處理的方法。

背景技術(shù)：
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馬氏珠母貝是世界上重要的海水珍珠貝，針對(duì)其種質(zhì)退化現(xiàn)象開(kāi)展了雜交、分子標(biāo)記輔助育種等基于DNA序列信息選擇的改良育種。而目前對(duì)其表觀遺傳學(xué)層面的DNA甲基化研究很少。僅見(jiàn)對(duì)馬氏珠母貝閉殼肌、消化腺、斧足、心臟、鰓組織以及精子、卵細(xì)胞、二細(xì)胞期、桑葚胚、擔(dān)輪幼蟲(chóng)、D型幼蟲(chóng)DNA甲基化水平的分析，并發(fā)現(xiàn)馬氏珠母貝免疫相關(guān)基因galectin啟動(dòng)子區(qū)甲基化與其信使RNA的表達(dá)水平顯著相關(guān)。上述研究基礎(chǔ)僅對(duì)馬氏珠母貝DNA甲基化情況及其可能功能進(jìn)行了基礎(chǔ)性的分析，尚未有直接改變DNA甲基化水平的方法與技術(shù)嘗試。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明提供了一種對(duì)馬氏珠母貝精、卵結(jié)合過(guò)程進(jìn)行去甲基化處理的方法。首次從一系列處理馬氏珠母貝精子、卵細(xì)胞結(jié)合過(guò)程的5-氮雜胞苷溶液中找到可使其被處理后受精率保持較高的濃度，為馬氏珠母貝基因組人工去甲基化研究提供了可行濃度。

本發(fā)明的對(duì)馬氏珠母貝精、卵結(jié)合過(guò)程進(jìn)行去甲基化處理的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)、設(shè)立數(shù)組馬氏珠母貝雌、雄親本單對(duì)配對(duì)的人工授精實(shí)驗(yàn)；

(2)、分別將每組單對(duì)配對(duì)親本產(chǎn)生的精子和卵細(xì)胞進(jìn)行混合，并將每組分成兩大部分：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組是采用滅菌海水處理，實(shí)驗(yàn)組分成8份后分別用10^-4mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L、10^-7mol/L、2×10^-4mol/L、2×10^-5mol/L、2×10^-6mol/L和2×10^-7mol/L濃度的5-氮雜胞苷溶液處理；

(3)、分別對(duì)上述所有對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組發(fā)育至二細(xì)胞時(shí)期的胚進(jìn)行觀察、計(jì)數(shù)及受精率統(tǒng)計(jì)；

(4)、根據(jù)選取處理后受精率最高的處理濃度的標(biāo)準(zhǔn)，從實(shí)驗(yàn)組不同5-氮雜胞苷處理濃度中選擇處理后受精率最高的2×10^-5mol/L濃度作為合適的處理濃度。

優(yōu)選，所述的親本均為野生兩年齡個(gè)體。

優(yōu)選，步驟(2)中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的處理時(shí)間點(diǎn)為精子、卵細(xì)胞混合后立即加入處理試劑。

本發(fā)明首次獲得一種馬氏珠母貝精子、卵細(xì)胞結(jié)合過(guò)程中去甲基化試劑5-氮雜胞苷的處理濃度，為2×10^-5mol/L，其處理后二細(xì)胞期受精率為46.9±1.23％，為一系列5-氮雜胞苷濃度溶液處理后受精率最高的處理濃度。該處理濃度可作為后續(xù)去甲基化實(shí)驗(yàn)的可行濃度，并為研究馬氏珠母貝基因組主動(dòng)去甲基化及其效應(yīng)提供技術(shù)資料。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：

(1)、設(shè)立3組馬氏珠母貝雌、雄親本單對(duì)配對(duì)的人工授精實(shí)驗(yàn)，各親本均為野生兩年齡個(gè)體；

(2)、分別將每組單對(duì)配對(duì)親本產(chǎn)生的精子和卵細(xì)胞進(jìn)行混合，并將每組分成兩大部分：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組是采用滅菌海水處理，實(shí)驗(yàn)組分成8份后分別用10^-4mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L、10^-7mol/L、2×10^-4mol/L、2×10^-5mol/L、2×10^-6mol/L和2×10^-7mol/L濃度的5-氮雜胞苷溶液處理(美國(guó)Sigma公司)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的處理時(shí)間點(diǎn)為精子、卵細(xì)胞混合后立即加入處理試劑；

(3)、分別對(duì)所有對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組發(fā)育至二細(xì)胞時(shí)期的胚進(jìn)行觀察、計(jì)數(shù)及受精率統(tǒng)計(jì)。不同濃度(10^-4mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L、10^-7mol/L、2×10^-4mol/L、2×10^-5mol/L、2×10^-6mol/L和2×10^-7mol/L)的5-氮雜胞苷溶液處理后，對(duì)應(yīng)的二細(xì)胞期受精率分別為：40.4±2.34％，43.0±1.12％，41.4±0.64％，41.6±0.40％，42.9±2.55％，46.9±1.23％，42.8±0.25％，42.9±0.90％。對(duì)照組的受精率為52.7±7.17％。受精率的計(jì)算依據(jù)為：顯微鏡視野中，(二細(xì)胞期胚個(gè)體總數(shù)/個(gè)體總數(shù))×100％；每個(gè)對(duì)應(yīng)5-氮雜胞苷濃度處理后二細(xì)胞期中取3次樣，作為重復(fù)實(shí)驗(yàn)，受精率取3次計(jì)算的均值。

(4)、根據(jù)選取處理后受精率最高的處理濃度的標(biāo)準(zhǔn)，從實(shí)驗(yàn)組不同5-氮雜胞苷處理濃度中選擇處理后受精率最高的對(duì)應(yīng)濃度作為合適的處理濃度。

實(shí)驗(yàn)組8個(gè)不同5-氮雜胞苷處理濃度中，選擇的處理后可使受精率最高的5-氮雜胞苷溶液濃度為2×10^-5mol/L，對(duì)應(yīng)受精率為46.9±1.23％。該處理濃度可作為后續(xù)去甲基化試劑處理的合適濃度。