本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種利用己酸二乙氨基乙醇酯促進(jìn)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法。

背景技術(shù)：

天然蝦青素(3，3′-二羥基-4，4′-二酮基-β，β′-胡蘿卜素)是目前自然界發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的抗氧化劑。天然蝦青素來(lái)源自發(fā)夫酵母、鮭魚(yú)、蝦殼及雨生紅球藻中，而雨生紅球藻中含有豐富的蝦青素，可達(dá)其干重的4％，被譽(yù)為天然蝦青素的濃縮品。蝦青素的抗氧化活性主要體現(xiàn)在一方面它是類胡蘿卜素的最高級(jí)衍生物；另一方面其共軛雙鍵末端具有不飽和的酮基和羥基，由此基團(tuán)構(gòu)成α-羥基酮，因此它要強(qiáng)于一般的類胡蘿卜素的抗氧化性，高于其它類胡蘿卜素10倍、維生素E 550倍，被譽(yù)為“超級(jí)氧化劑”。天然蝦青素對(duì)人體無(wú)任何毒副作用，蝦青素的抗氧化活性使得其在醫(yī)藥、化妝品和保健品等有很大的應(yīng)用潛力，另外蝦青素也可以作為水產(chǎn)動(dòng)物的飼料添加劑以及食品添加劑。

雨生紅球藻屬于一種單細(xì)胞綠藻，它只有在脅迫條件下，比如高溫、強(qiáng)光照、氮饑餓等，能夠大量的積累蝦青素。而關(guān)于刺激雨生紅球藻產(chǎn)蝦青素的誘導(dǎo)大多集中在物理和化學(xué)因子上，較少有關(guān)于植物激素的研究。己酸二乙氨基乙醇酯(DA-6)作為一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)，具有很強(qiáng)的抗逆作用，而雨生紅球藻正是在這種脅迫下才大量積累蝦青素。外源添加DA-6能激發(fā)植物防御基因的表達(dá)，誘導(dǎo)植物的化學(xué)防御，生與機(jī)械損傷和昆蟲(chóng)取食相似的效果。因此DA-6可能會(huì)誘導(dǎo)雨生紅球藻大量積累蝦青素。

目前國(guó)內(nèi)已有多家公司可以大規(guī)?；a(chǎn)蝦青素，也已有了一些相關(guān)的技術(shù)和專利，例如專利一種從雨生紅球藻中提取蝦青素的方法(申請(qǐng)?zhí)枺?01410748498.X，申請(qǐng)日：2014-12-10，公開(kāi)號(hào)：CN104529852A，公開(kāi)日：2015-04-22)公開(kāi)了一種高效提取蝦青素的方法，主要利用冰醋酸冰浴、勻漿機(jī)勻漿和液氮低溫處理相結(jié)合的方法，大大提高了細(xì)胞破壁率及蝦青素提取率。專利一種雨生紅球藻高密度培養(yǎng)的氣升式光生物反應(yīng)器(申請(qǐng)?zhí)枺?00510018203.4，申請(qǐng)日：2005-01-26，公開(kāi)號(hào)：CN1680539A，公開(kāi)日：2005-10-12)，公開(kāi)了一種雨生紅球藻高密度培養(yǎng)的氣升式光生物反應(yīng)器，包括養(yǎng)殖罐、水處理裝置、照明裝置、氣體供應(yīng)裝置，通過(guò)調(diào)控反應(yīng)條件實(shí)現(xiàn)全天候高密度養(yǎng)殖，并將藻的養(yǎng)殖和蝦青素積累結(jié)合在同一反應(yīng)器中完成。專利大規(guī)模培養(yǎng)雨生紅球藻和轉(zhuǎn)化蝦青素的裝置及其方法(申請(qǐng)?zhí)枺?00610154678.0，申請(qǐng)日：2006-11-20，公開(kāi)號(hào)：CN1966660，公開(kāi)日：2007-05-23)，公開(kāi)了一種雨生紅球藻大規(guī)模培養(yǎng)及蝦青素轉(zhuǎn)化的裝置，包括光生物反應(yīng)器、充氣裝置、培養(yǎng)液灌輸裝置和靜細(xì)胞收集裝置，通過(guò)浮沉控制裝置實(shí)現(xiàn)全天候高密度養(yǎng)殖，并將藻的養(yǎng)殖和蝦青素積累結(jié)合在同一反應(yīng)器中完成。專利用酵母發(fā)酵殘液培養(yǎng)藻類生產(chǎn)蝦青素的方法(申請(qǐng)?zhí)枺?3130442.7，申請(qǐng)日：2003-07-23，公開(kāi)號(hào)：CN1480524A，公開(kāi)日：2004-03-10)，公開(kāi)了一種利用酵母發(fā)酵殘液生產(chǎn)蝦青素的方法，是向酵母發(fā)酵殘液中加入無(wú)機(jī)鹽配成培養(yǎng)基，在特定的容器內(nèi)培養(yǎng)雨生紅球藻或綠球藻，經(jīng)過(guò)分離提取蝦青素。上述相關(guān)專利技術(shù)雖然先進(jìn)，但是工藝較為復(fù)雜，設(shè)備要求高，操作較為繁瑣，這就增加了生產(chǎn)的成本和技術(shù)推廣的難度。專利一種利用黃腐酸促進(jìn)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法(申請(qǐng)?zhí)枺?01510376770.0申請(qǐng)日：2015-07-01)，公開(kāi)了一種利用利用黃腐酸提高蝦青素積累的方法，雖然提高了蝦青素的積累，但蝦青素積累量以及提取率鑒于生產(chǎn)需求還需進(jìn)一步提高，培養(yǎng)完的廢液也未充分利用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明針對(duì)以上的問(wèn)題，提供了一種利用己酸二乙氨基乙醇酯促進(jìn)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，該方法的不僅操作簡(jiǎn)單、成本低，而且可很大程度上縮短積累蝦青素的周期及提高蝦青素的產(chǎn)率及提取率，培養(yǎng)完藻的廢液可以直接用于灌溉農(nóng)田，提高利用率。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種利用己酸二乙氨基乙醇酯促進(jìn)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，包括以下步驟：

步驟1、藻液的制備：培養(yǎng)雨生紅球藻到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期，用含10％(質(zhì)量百分含量)氮的BBM培養(yǎng)基稀釋藻液并獲得誘導(dǎo)的藻液；

步驟2、誘導(dǎo)雨生紅球藻積累蝦青素：用DMSO配成80mM的DA-6母液，將DA-6母液添加到已經(jīng)稀釋好的誘導(dǎo)的藻液中使DA-6濃度達(dá)到5-20mM；然后將上述藻液進(jìn)行培養(yǎng)，待藻體細(xì)胞完全變紅后，收集藻細(xì)胞；

步驟3、利用有機(jī)溶劑提取藻細(xì)胞的蝦青素。

進(jìn)一步地，雨生紅球藻為雨生紅球藻菌株Haematococcus pluvialis LUGU。

進(jìn)一步地，步驟1中藻液的制備具體為：在25℃、光強(qiáng)2500-2800lx，持續(xù)光照條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)雨生紅球藻到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期，此時(shí)細(xì)胞濃度達(dá)到10⁶cells mL^-1，利用含10％(質(zhì)量百分含量)氮的BBM培養(yǎng)基稀釋到2×10⁵cells mL^-1作為誘導(dǎo)藻液。

進(jìn)一步地，步驟2中誘導(dǎo)雨生紅球藻積累蝦青素中的培養(yǎng)條件為：28℃、光強(qiáng)11000-12000lx、冷光燈連續(xù)光照及氮饑餓的復(fù)合脅迫。

進(jìn)一步地，步驟3中利用有機(jī)溶劑提取藻細(xì)胞的蝦青素具體為：取5ml上述藻液，3500r/min離心5min，棄上清得藻細(xì)胞沉淀；分別向藻細(xì)胞沉淀中加入2mL 30％甲醇和5％KOH混合液，66℃水浴15min，4000r/min離心10min，除上清，沉淀加入純水洗滌2次，除堿液殘留；然后加入5mL DMSO，250w超聲破壁15min，其中，超聲1min，10s間歇，于45℃水浴20min，抽提至藻體發(fā)白，離心收集上清測(cè)OD490；并按照公式計(jì)算得出蝦青素的濃度，其中C為蝦青素濃度，A為490nm下OD值，Va為DMSO體積，Vb為藻液體積。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：

1)本發(fā)明操作簡(jiǎn)單易行、成本低、蝦青素提取率高，原材料為自己篩選的雨生紅球藻菌株可按常規(guī)方法培養(yǎng)。提高培養(yǎng)完藻的廢液利用率。

2)本發(fā)明大幅提高了蝦青素的產(chǎn)率，實(shí)驗(yàn)證明，添加5-20mM的DA-6的誘導(dǎo)組比對(duì)照組積累蝦青素的周期縮短了13-27％，蝦青素的產(chǎn)量比對(duì)照組提高了87-91.6％，達(dá)到22.708-23.26mg L^-1。

當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。

具體實(shí)施方式

以下將配合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來(lái)解決技術(shù)問(wèn)題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過(guò)程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。

本發(fā)明提供一種利用己酸二乙氨基乙醇酯促進(jìn)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，包括以下步驟：

步驟1、藻液的制備：雨生紅球藻采用雨生紅球藻菌株

Haematococcus pluvialis LUGU(NCBI:KM115647)，利用BBM培養(yǎng)基，在25℃、光強(qiáng)2800lx，持續(xù)光照條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)雨生紅球藻到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期，此時(shí)藻細(xì)胞濃度達(dá)到10⁶cells mL^-1，無(wú)菌條件下離心，利用含10％氮的BBM培養(yǎng)基稀釋到2×10⁵cells mL^-1作為誘導(dǎo)藻液；

步驟2、誘導(dǎo)雨生紅球藻積累蝦青素：用去離子水配成80mM的DA-6母液，將DA-6母液添加到已經(jīng)稀釋好的誘導(dǎo)的藻液中使DA-6濃度達(dá)到5-20mM；然后將上述藻液在28℃、光強(qiáng)11000-12000lx、冷光燈連續(xù)光照及氮饑餓的復(fù)合脅迫下進(jìn)行培養(yǎng)，待藻體細(xì)胞完全變紅后，收集藻細(xì)胞，

步驟3、利用有機(jī)溶劑提取藻細(xì)胞的蝦青素，蝦青素的提取方法：

每隔一天取5ml上述藻液，3500r/min離心5min，棄上清得藻細(xì)胞沉淀；分別向藻細(xì)胞沉淀中加入2mL 30％甲醇和5％KOH混合液，66℃水浴15min，4000r/min離心10min，除上清，沉淀加入純水洗滌2次，除堿液殘留；然后加入5mL DMSO，250w超聲破壁15min(超聲1min，10s間歇)，于45℃水浴20min，抽提至藻體發(fā)白，離心收集上清測(cè)OD490；并按照公式計(jì)算得出蝦青素的濃度，其中C為蝦青素濃度，A為490nm下OD值，Va為DMSO體積，Vb為藻液體積。

實(shí)施例1

(1)雨生紅球藻采用雨生紅球藻菌株Haematococcus pluvialis LUGU，利用BBM培養(yǎng)基，在25℃、光強(qiáng)2800lx，持續(xù)光照條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)雨生紅球藻到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)藻細(xì)胞濃度達(dá)到10⁶cells mL^-1，利用含10％氮的BBM培養(yǎng)基稀釋到2×10⁵cells mL^-1作為誘導(dǎo)藻液。

(2)用去離子水配成80mM的DA-6母液，將DA-6母液添加到已經(jīng)稀釋好的誘導(dǎo)藻液中使DA-6度達(dá)到5mM；然后將上述藻液在28℃、光強(qiáng)11500lx、冷光燈連續(xù)光照及饑餓營(yíng)養(yǎng)鹽的復(fù)合脅迫下進(jìn)行培養(yǎng)，每天定期取樣觀察藻細(xì)胞顏色變化，發(fā)現(xiàn)11天后藻體細(xì)胞完全變紅后，收集藻細(xì)胞利用有機(jī)溶劑提取藻細(xì)胞的蝦青素，此時(shí)其蝦青素的積累量已達(dá)到最高。

實(shí)施例2

(1)雨生紅球藻采用雨生紅球藻菌株Haematococcus pluvialis LUGU，利用BBM培養(yǎng)基，在25℃、光強(qiáng)2800lx，持續(xù)光照條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)至雨生紅球藻到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)藻細(xì)胞濃度達(dá)到10⁶cells mL^-1，利用含10％氮的BBM培養(yǎng)基稀釋到2×10⁵cells mL^-1作為誘導(dǎo)藻液。

(2)用去離子水配成80mM的DA-6母液，將DA-6母液添加到已經(jīng)稀釋好的誘導(dǎo)藻液中使DA-6濃度達(dá)到10mM；然后將上述藻液在28℃、光強(qiáng)11000lx、冷光燈連續(xù)光照及饑餓營(yíng)養(yǎng)鹽的復(fù)合脅迫下進(jìn)行培養(yǎng)，每天定期取樣觀察藻細(xì)胞顏色變化，13天后藻體細(xì)胞完全變紅后，收集藻細(xì)胞利用有機(jī)溶劑提取藻細(xì)胞的蝦青素，此時(shí)其蝦青素的積累量已達(dá)到最高。

實(shí)施例3

(1)雨生紅球藻采用雨生紅球藻菌株Haematococcus pluvialisLUGU，利用BBM培養(yǎng)基，在25℃、光強(qiáng)2800lx，持續(xù)光照條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)至雨生紅球藻到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)藻細(xì)胞濃度達(dá)到10⁶cells mL^-1，利用含10％氮的BBM培養(yǎng)基稀釋到2×10⁵cells mL^-1作為誘導(dǎo)藻液。

(2)用去離子水配成80mM的DA-6母液，將DA-6母液添加到已經(jīng)稀釋好的誘導(dǎo)藻液中使DA-6濃度達(dá)到20mM；然后將上述藻液在28℃、光強(qiáng)12000lx、冷光燈連續(xù)光照及饑餓營(yíng)養(yǎng)鹽的復(fù)合脅迫下進(jìn)行培養(yǎng)，每天定期取樣觀察藻細(xì)胞顏色變化，13天后藻體細(xì)胞完全變紅后，收集藻細(xì)胞利用有機(jī)溶劑提取藻細(xì)胞的蝦青素，此時(shí)其蝦青素的積累量已達(dá)到最高。

己酸二乙氨基乙醇酯(DA-6)作為一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可以有效地促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，利用一定濃度的DA-6作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)雨生紅球藻積累蝦青素，通過(guò)采用上述蝦青素的提取方法對(duì)各組進(jìn)行提取蝦青素，結(jié)果顯示：空白對(duì)照組(不添加DA-6)積累蝦青素完成的時(shí)間為15天，第15天時(shí)蝦青素的含量為12.14mg L^-1，DA-6處理后的比對(duì)照組積累蝦青素的周期縮短了13-27％，且蝦青素的產(chǎn)量比對(duì)照組提高了87-91.6％，達(dá)到22.708-23.26mg L^-1。

上述說(shuō)明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過(guò)上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。