本發(fā)明涉及高腫瘤選擇和生物相容性陽離子直鏈聚磷腈載體聚合物和其抗癌藥物偶聯(lián)物，和其制備方法。

背景技術(shù)：

目前在臨床上用于化療的大多數(shù)的抗癌藥物為小于1000Da的低分子量的單體化合物。眾所周知，由于此類單體低分子量抗癌藥物在靜脈注射時(shí)對腫瘤細(xì)胞和組織的無選擇性，會引起嚴(yán)重的毒性和副作用，此外，它們在血液循環(huán)中的半衰期低于幾小時(shí)，限制了它們可持續(xù)性藥效。因此，在新型抗癌藥物開發(fā)中待攻克的最重要關(guān)鍵技術(shù)是將抗癌藥物選擇性遞送到腫瘤部位的腫瘤靶向技術(shù)和抗癌藥物的活性組分在腫瘤部位的及時(shí)釋放技術(shù)。在過去的幾十年中，全世界為克服此限制已經(jīng)作出了大量的工作，并由此已經(jīng)發(fā)現(xiàn)聚合物藥物遞送系統(tǒng)是帶來突破的最有效和實(shí)際的方法之一，由其出現(xiàn)了被稱為“聚合物療法”的新領(lǐng)域(R.Haag，F(xiàn).Kratz，Angew.Chem.Int.Ed.45(2006)1198-1215)。

在藥物遞送系統(tǒng)中采用的大多數(shù)聚合物都是合成或天然的有機(jī)聚合物。許多天然和合成的聚合物都被嘗試用作聚合物療法中的藥物遞送系統(tǒng)，但是發(fā)現(xiàn)只有有限的藥物遞送系統(tǒng)才是有效的，因?yàn)槌饲拔乃龅哪[瘤靶向性和釋放動力學(xué)之外，癌癥的聚合物療法中還需要滿足諸如水溶性、生物可降解性、自毒性、與所負(fù)載藥物的相容性等要求。

發(fā)明人在幾十年前發(fā)現(xiàn)了相對于上述有機(jī)聚合物，通過將各種有機(jī)基團(tuán)接枝到由交替的氮原子和磷原子組成的被稱作磷腈的無機(jī)聚合物主鏈上而設(shè)計(jì)出了一類新型有機(jī)/無機(jī)雜化聚合物(Y.S.Sohn等人，Macromolecules，1995，28，7566)，已將其作為癌癥治療的藥物遞送系統(tǒng)進(jìn)行了深入開發(fā)。在早期，將各種親水性聚(乙二醇)(PEG)和疏水性寡肽引入到磷腈主鏈上，而得到了用于熱敏性藥物遞送系統(tǒng)的兩親性聚磷腈類。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，該兩親性聚磷腈類是自組裝成各種納米結(jié)構(gòu)，如有助于在水溶液中遞送藥物的熱敏性膠束和水凝膠，但是也觀察到，由于將一些疏水性寡肽接枝到聚磷腈主鏈上，使得水溶性下降并產(chǎn)生了一定的毒性。通常已知的是，當(dāng)緩慢加熱此類兩親性聚合物時(shí)，其展現(xiàn)出低臨界溶解溫度(LCST)，在該溫度下聚合物開始從其水溶液中沉淀出來。因此，兩親性聚合物藥物遞送系統(tǒng)應(yīng)具有高于體溫的LCST以用于靜脈注射，從而避免其在血液循環(huán)過程中的沉淀。

關(guān)于疏水性抗癌藥物，包括紫杉醇和多西紫杉醇的紫杉烷族是最廣泛用于包括乳腺癌、卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌的廣譜癌癥的有效化療的一種。由于紫衫烷抗癌劑僅微溶于水(<1μg/ml)，因此它們不能被直接注射，而是應(yīng)該采用表面活性劑(諸如聚山梨酯80或克列莫佛EL和乙醇)配制后進(jìn)行IV注射。然而，這樣配制的紫杉烷抗癌劑展示出包括由抗癌劑本身引起的神經(jīng)毒性和中性粒細(xì)胞減少癥和由于溶劑系統(tǒng)引起的超敏反應(yīng)的若干不良反應(yīng)，這限制了它們在臨床上的廣泛使用。

因此，在過去的十年里，各個(gè)領(lǐng)域中都作出大量的研究來攻克此類不良反應(yīng)，在這些研究中，采用各種形貌結(jié)構(gòu)的納米技術(shù)取得了最積極的進(jìn)展。特別地，由親水性外殼和疏水性核構(gòu)成的聚合物膠束可以通過將疏水性抗癌分子裝入疏水性膠束核而使疏水性抗癌藥物(如紫杉烷)溶解。此外，通過將紫杉烷藥物分子化學(xué)性連接至親水性聚(乙二醇)可以將其偶聯(lián)以溶解，這正處于臨床試驗(yàn)階段。

此類由偶聯(lián)至聚合物藥物遞送系統(tǒng)的小分子抗癌藥物組成的聚合物前藥有望延長其血液循環(huán)時(shí)間并通過提高的通透性和滯留(EPR)效應(yīng)(H.Maeda等人，J.Control.Release 65(2000)271-284)連同控制藥物釋放而提供腫瘤靶向性，以產(chǎn)生最大的藥效和最低的毒性。根據(jù)最近的報(bào)道，為了通過EPR效應(yīng)實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向性，聚合物顆粒的尺寸應(yīng)該在50-200nm的范圍內(nèi)(V.P.Torchilin,J.Control.Release 73(2001)137-172)。另外，基因遞送的研究中報(bào)道，陽離子聚合物可以容易地滲入陰離子腫瘤細(xì)胞(N.P.Gabrielson,D.W.Park,J.Control.Release 136(2009)54-61)。然而，由將偶聯(lián)至聚(谷氨酸)的紫杉醇構(gòu)成的聚谷氨酸(Poliglumex)目前在臨床III期是強(qiáng)陽離子型的，但已知的是，它在其它器官上的聚積比在腫瘤組織上更多，這延緩了它的商業(yè)化(S.Wallace；C.Li,Adv.Drug Deliv.Rev.60(2008)886-898)。

[現(xiàn)有技術(shù)文件]

[非專利文件1]

R.Haag,F.Kratz,Angew.Chem.Int.Ed.45(2006)1198-1215)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問題

因此，本發(fā)明的目的是提供一類新型的用于藥物遞送的陽離子聚磷腈類化合物，和其具有優(yōu)異的腫瘤選擇性和在腫瘤部位的容易的藥物釋放性的抗癌藥物偶聯(lián)化合物，和它們的制備方法。

本發(fā)明的發(fā)明人一直在尋找在上述技術(shù)背景下具有優(yōu)異腫瘤選擇性和容易的藥物釋放性的更有效的臨床藥物遞送系統(tǒng)，并且最終發(fā)現(xiàn)，接枝了作為增溶基團(tuán)的親水性PEG并接枝了選自多官能團(tuán)氨基酸、包含氨基酸或直鏈氨基醇的寡肽之一作為間隔基團(tuán)以與疏水性的抗癌藥物偶聯(lián)的聚磷腈類，由于其陽離子性和較長的血液循環(huán)，展現(xiàn)出優(yōu)異的腫瘤選擇性。本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)利用于酸可裂解的連接基團(tuán)將疏水性抗癌藥物偶聯(lián)至上述聚磷腈載體聚合物時(shí)，通過酸降解得到了在腫瘤部位的具有優(yōu)異腫瘤選擇性和可控釋放性的智能聚合物抗癌藥。

技術(shù)方案

為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明提供了由以下化學(xué)式1表示的直鏈聚磷腈類。

[化學(xué)式1]

其中n是1至300的整數(shù)；OMPEG表示具有350至1000分子量的甲氧基聚(乙二醇)；S是選自由賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸、含有賴氨酸的寡肽、含有精氨酸的寡肽、含有谷氨酰胺的寡肽、含有天冬酰胺的寡肽、含有酪氨酸的寡肽、氨基乙醇、氨基丙醇、氨基丁醇、氨基戊醇和氨基己醇組成的組的間隔基團(tuán)；l等于0-0.9；m等于0.1-1，且l+m等于1。

本發(fā)明還提供了由以下化學(xué)式2表示的聚磷腈-抗癌藥物偶聯(lián)物。

[化學(xué)式2]

其中n是從1至300的整數(shù)；OMPEG表示具有350至1000分子量的甲氧基聚(乙二醇)；S是選自由賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸、含有賴氨酸的寡肽、含有精氨酸的寡肽、含有谷氨酰胺的寡肽、含有天冬酰胺的寡肽、含有酪氨酸的寡肽、氨基乙醇、氨基丙醇、氨基丁醇、氨基戊醇和氨基己醇組成的組的間隔基團(tuán)；L是連接聚合物的間隔基團(tuán)和具有羥基或胺基團(tuán)的藥物分子D的連接基團(tuán)；x和y獨(dú)立地在0-0.5的范圍內(nèi)；z在0-1的范圍內(nèi)；且x+y+z＝1。

此外，本發(fā)明提供制備由化學(xué)式2表示的聚磷腈-藥物偶聯(lián)化合物的方法，其包括步驟(a)至步驟(d)：

(a)通過使起始物料六氯環(huán)三磷腈進(jìn)行熱聚合得到直鏈聚(二氯磷腈)并繼而使該直鏈聚(二氯磷腈)與甲氧基聚(乙二醇)的鈉鹽反應(yīng)，而制備出PEG化的聚磷腈中間體，

(b)使PEG化的聚磷腈中間體與選自由賴氨酸酯、含有賴氨酸的寡肽酯、氨基乙醇、氨基丙醇、氨基丁醇、氨基戊醇和氨基己醇組成的組的間隔基團(tuán)反應(yīng)，而制備出親水性陽離子聚磷腈載體聚合物，

(c)通過使具有OH或NH₂官能團(tuán)的藥物分子與合適的連接基團(tuán)反應(yīng)，而制備出藥物-連接基團(tuán)前體；

(d)將由步驟(c)得到的藥物-連接基團(tuán)前體連接到由步驟(b)得到的親水性陽離子聚磷腈載體聚合物的間隔基團(tuán)上。

可選地，本發(fā)明提供了制備由化學(xué)式2表示的聚磷腈-藥物偶聯(lián)化合物的方法，其包括步驟(a)至步驟(d)：

(a)通過使起始物料六氯環(huán)三磷腈進(jìn)行熱聚合得到直鏈聚(二氯磷腈)并繼而使該直鏈聚(二氯磷腈)與甲氧基聚(乙二醇)的鈉鹽反應(yīng)，而制備出PEG化的聚磷腈中間體，

(b)通過使PEG化的聚磷腈中間體與選自由賴氨酸酯、含有賴氨酸的寡肽酯、氨基乙醇、氨基丙醇、氨基丁醇、氨基戊醇和氨基己醇組成的組的間隔基團(tuán)反應(yīng)，而制備出親水性陽離子聚磷腈載體聚合物，

(c)將連接基團(tuán)連接到由步驟(b)得到的親水性陽離子聚磷腈載體聚合物的間隔基團(tuán)上，

(d)將具有OH或NH₂官能團(tuán)的藥物分子連接到由步驟(c)得到的連接至親水性陽離子聚磷腈載體聚合物的連接基團(tuán)上。

有益效果

本發(fā)明的陽離子直鏈聚磷腈化合物顯示出高腫瘤選擇性，并且發(fā)現(xiàn)，相較于傳統(tǒng)有機(jī)聚合物-藥物偶聯(lián)物，本發(fā)明的直鏈聚磷腈-藥物偶聯(lián)化合物在腫瘤組織中比在其它主要器官(如肝臟和腎臟)中有更高選擇性地聚積。此外，本發(fā)明的直鏈聚磷腈-藥物偶聯(lián)化合物在中性血液和器官中較為穩(wěn)定而不會釋放偶聯(lián)的藥物，而在酸性腫瘤微環(huán)境中其更容易釋放，從而得到最高的藥效和最小的毒性。因而，本發(fā)明的陽離子直鏈聚磷腈化合物和其抗癌藥物偶聯(lián)化合物是具有高度商業(yè)化前景的新材料。

附圖說明

圖1示出了示例1的陽離子聚磷腈化合物的粒徑分布(平均直徑＝3.0nm)。

圖2示出了示例1的陽離子聚磷腈化合物的所測得的ζ電位。

圖3示出了示例12的聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物的粒徑分布(平均直徑＝60nm)。

圖4示出了由熒光芘法測定的示例17的聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物的臨界膠束濃度(CMC)。

圖5示出了示例17的聚磷腈-紫杉醇偶聯(lián)物在酸性pH 5.4和中性pH 7.4的時(shí)間依賴性降解。

圖6(a)示出了，示例1中接種了非小細(xì)胞肺腫瘤細(xì)胞A549的小鼠的主要器官中(1：肝；2：肺；3：腎；4：脾；5：腫瘤；6：肌肉)Cy標(biāo)記的聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物隨時(shí)間依賴性(注射12h、24h、48h、72h后)生物分布的體外NIR熒光圖像，(b)示出了血液(WB)和血漿(PL)的時(shí)間依賴性NIR熒光圖像。

圖7示出了，示例12中接種了SCC7腫瘤細(xì)胞的小鼠在IV注射后主要器官(1：肝；2：肺；3：脾；4：腎；5：腫瘤；6：心臟)中Cy標(biāo)記的聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物時(shí)間依賴性(注射24h和48h后)的生物分布。

圖8示出了與未采用藥物處理的小鼠的各個(gè)器官相比，在圖7中處理過的小鼠的各個(gè)器官的時(shí)間依賴性熒光強(qiáng)度。

圖9示出了采用Sprague-Dawley大鼠，在IV注射后，示例12(■)中聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物和作為參照的泰索帝(◆)的藥物代謝動力學(xué)研究結(jié)果中多西紫杉醇的平均血漿濃度-時(shí)間曲線。

圖10示出了，示例12中采用BALB/C裸鼠和MKN-28胃癌細(xì)胞系的聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物的異種移植試驗(yàn)的結(jié)果。

圖11示出了圖10中異種移植試驗(yàn)期間(40天)小鼠體重的變化。

圖12示出了，示例14中采用BALB/C裸鼠和非小細(xì)胞癌A549細(xì)胞系的聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物的異種移植試驗(yàn)的結(jié)果。

具體實(shí)施方案

最佳方式

提供本發(fā)明的組成和更詳細(xì)的手段。本發(fā)明體現(xiàn)在以下描述中實(shí)施方案，但并不限于此。本發(fā)明的詳細(xì)組成和手段在下文中舉例說明。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，提供了由以下化學(xué)式1表示的聚磷腈化合物。

[化學(xué)式1]

其中n是1至300的整數(shù)；OMPEG表示具有350至1000分子量的甲氧基聚(乙二醇)；S是選自由賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸、含有賴氨酸的寡肽、含有精氨酸的寡肽、含有谷氨酰胺的寡肽、含有天冬酰胺的寡肽、含有酪氨酸的寡肽、氨基乙醇、氨基丙醇、氨基丁醇、氨基戊醇和氨基己醇組成的組的間隔基團(tuán)；l等于0-0.9；m等于0.1-1，且l+m等于1。

上述本發(fā)明的聚磷腈化合物包括親水性和多官能化的賴氨酸或含有賴氨酸的親水性寡肽作為側(cè)基基團(tuán)，連同包括親水性MPEG作為另一側(cè)基基團(tuán)，顯示出高于100℃的較低臨界溶解溫度(LCST)，此LCST遠(yuǎn)高于體溫，而常規(guī)兩親性聚磷腈的LCST低得多并接近體溫。此外，本發(fā)明的聚磷腈化合物顯著地延長了血液半周期并展示出較低的全身性毒性，且更令人驚奇的是該聚磷腈化合物本身明顯地顯示出較高的腫瘤靶向性，這可能是因?yàn)楸M管其較小的顆粒尺寸(平均直徑<6nm)，其陽離子性質(zhì)和長血液循環(huán)的原因。親水性寡肽的代表性例子是甘氨酰賴氨酸。

本發(fā)明還提供了由以下化學(xué)式2表示的聚磷腈-抗癌藥物偶聯(lián)物。

[化學(xué)式2]

其中n是從1至300的整數(shù)；OMPEG表示分子量為350至1000的甲氧基聚(乙二醇)；S是選自由賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸、含有賴氨酸的寡肽、含有精氨酸的寡肽、含有谷氨酰胺的寡肽、含有天冬酰胺的寡肽、含有酪氨酸的寡肽、氨基乙醇、氨基丙醇、氨基丁醇、氨基戊醇和氨基己醇組成的組的間隔基團(tuán)；L是連接聚合物間隔基團(tuán)和具有羥基或胺基團(tuán)的藥物分子D的偶聯(lián)基團(tuán)；x和y獨(dú)立地在0-0.5的范圍內(nèi)；z在0-1的范圍內(nèi)；且x+y+z＝1。

對于本發(fā)明的實(shí)施方案，S表示賴氨酸或含有賴氨酸的二肽或三肽，但并不僅限于此。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，S表示氨基乙醇和氨基丙醇，但不限于此。期望的藥物分子D為疏水性抗癌劑，諸如多西紫杉醇、紫杉醇、喜樹堿和(反式-(±)-1,2-二氨基環(huán)己烷)鉑(II)，但不限于此。根據(jù)上述化學(xué)式2，本發(fā)明的實(shí)施方案可以由下列化學(xué)式19至21之一來表示。

[化學(xué)式19]

[化學(xué)式20]

在化學(xué)式19和20中，n是獨(dú)立地從3至300的整數(shù)；OMPEG表示具有350至1000分子量的甲氧基聚(乙二醇)；D表示多西紫杉醇、紫杉醇、喜樹堿和(反式-(±)-1,2-二氨基環(huán)己烷)鉑(II)；R為C_1-6直鏈、支化或環(huán)狀的烷基基團(tuán)或OCH₂Bz；x和y獨(dú)立地在0-0.5的范圍內(nèi)；z大于0且小于1.0；x+y+z＝1。

[化學(xué)式21]

其中n是從3至300的整數(shù)；OMPEG表示具有350至1000分子量的甲氧基聚(乙二醇)；D表示多西紫杉醇、紫杉醇或喜樹堿；R’表示t-Boc或CBZ；x和y獨(dú)立地在0-0.5的范圍內(nèi)；z大于0且小于1.0；x+y+z＝1。

本發(fā)明的構(gòu)成組分在下文中說明。

[聚磷腈載體化合物]

本發(fā)明的藥物載體聚磷腈化合物是獨(dú)特的無機(jī)/有機(jī)雜化聚合物，其由交替的氮原子和磷原子組成的無機(jī)聚合物主鏈構(gòu)成，并接枝了兩個(gè)有機(jī)基團(tuán)，一個(gè)是為實(shí)現(xiàn)長血液循環(huán)的親水性聚(乙二醇)和另一個(gè)是為了與疏水性抗癌藥物偶聯(lián)的親水性多官能化的賴氨酸、含有賴氨酸的寡肽或直鏈氨基醇作為間隔基團(tuán)。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，接枝到聚磷腈主鏈上的賴氨酸基團(tuán)或含有賴氨酸的肽能根據(jù)氨基酸的pKa值提供聚磷腈化合物的陽離子性質(zhì)，其中氨基酸的pKa值可以通過作為間隔基團(tuán)的氨基酸來控制。在本發(fā)明中使用的聚(乙二醇)是分子量在300～2000范圍內(nèi)的甲氧基聚(乙二醇)，且其含量是由它與間隔基團(tuán)的摩爾比決定的，而該摩爾比是由x和y確定，并且x取決于最終偶聯(lián)藥物的所需性質(zhì)(諸如溶解性、形貌和生物可降解性)。聚磷腈化合物的分子量可以通過重復(fù)單元n，也可以通過PEG的分子量來控制。與支化的直鏈有機(jī)聚合物相比，本發(fā)明的具有兩個(gè)有機(jī)側(cè)基基團(tuán)的直鏈聚磷腈化合物具有較高的分子量，但較低的水合量，從而產(chǎn)生了更高的原子密度和更好的腫瘤選擇性。

[抗癌藥物]

與本發(fā)明的支化的聚磷腈化合物偶聯(lián)的抗癌活性藥物成分應(yīng)該至少具有一個(gè)羥基(OH^-)基團(tuán)或胺基(NH₂)基團(tuán)的官能團(tuán)，且更希望的是其為諸如紫杉烷、喜樹堿和鉑(II)的藥物的疏水性抗癌藥物，但并不限于此。除了這些小分子抗癌藥物，任何帶有至少一個(gè)羥基或氨基官能團(tuán)的抗癌藥物分子都可以利用本發(fā)明中采用的合適的間隔基團(tuán)和偶基團(tuán)系統(tǒng)與本發(fā)明聚磷腈載體聚合物偶聯(lián)。本發(fā)明的示例將通過展示兩種顯示出較低空間位阻的抗癌藥物來說明。

通過將疏水性紫杉烷藥物分子化學(xué)性偶聯(lián)至親水性聚磷腈載體聚合物而制備的聚磷腈-紫杉烷偶聯(lián)化合物是一類用于靜脈注射的新型聚合物前藥，它們的分子量控制為3000至300,000Da，但我們發(fā)現(xiàn)，30,000至100,000Da的級分對于偶聯(lián)藥物的生物相容性和功效是最優(yōu)的。本發(fā)明的親水性聚磷腈載體聚合物不能在水介質(zhì)中形成聚合物膠束，但是卻發(fā)現(xiàn)其與疏水性紫衫烷分子化學(xué)連接的偶聯(lián)物能自組裝形成平均直徑在20-100nm范圍內(nèi)的強(qiáng)聚合物膠束，如上所述它們通過EPR效應(yīng)表現(xiàn)出優(yōu)異的腫瘤靶向性連同由于膠束的PEG外殼而導(dǎo)致了長血液循環(huán)。最后，為了實(shí)現(xiàn)聚磷腈-紫杉烷偶聯(lián)物的最大藥效和最低全身性毒性，采用酸(pH＝4-7)可裂解的連接基團(tuán)烏頭酸酐將抗癌藥物成分紫杉烷分子連接至載體聚磷腈，以使得強(qiáng)細(xì)胞毒性的紫杉烷藥物分子在中性血液系統(tǒng)(pH＝7.2)的循環(huán)中不會從聚磷腈-紫杉烷偶聯(lián)物中顯著地釋放出來，但在酸性腫瘤微環(huán)境的腫瘤部位卻容易地釋放出來。

如化學(xué)式3所示，多西紫杉醇藥物分子在其2、7、10和2’位置處具有四個(gè)羥基基團(tuán)，但2’位的羥基基團(tuán)是已知最活躍的，因此，通過酯化反應(yīng)將該藥物分子連接至連接基團(tuán)烏頭酸酐的羧酸基團(tuán)而形成了前體，之后使該前體反應(yīng)形成了與聚磷腈載體聚合物的間隔基團(tuán)氨基酸或氨基乙醇的具有胺基團(tuán)的酰胺鍵。在紫杉醇的情況下，可以采用相同的反應(yīng)方案。此處應(yīng)當(dāng)指出采用多功能化的烏頭酸酐作為用于將紫杉烷藥物分子偶聯(lián)至本發(fā)明的聚磷腈化合物的連接基團(tuán)的兩個(gè)重要原因。眾所周知，當(dāng)將空間位阻的藥物分子引入以通過酯化反應(yīng)偶聯(lián)至聚合物藥物載體，其產(chǎn)率不僅非常低，而且可能產(chǎn)生立體異構(gòu)體。從初步的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將多西紫杉醇直接引入到連接了聚磷腈載體聚合物的烏頭酸酐上時(shí)，不僅需要超過24小時(shí)長的反應(yīng)時(shí)間，而且導(dǎo)致產(chǎn)生了一些立體異構(gòu)體。然而，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)多西紫杉醇先與連接基團(tuán)烏頭酸酐反應(yīng)制備前體時(shí)，將其與本發(fā)明的聚磷腈載體聚合物反應(yīng)，可以得到高產(chǎn)率和高純度的最終的聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物。

[化學(xué)式3]

本發(fā)明涉及喜樹堿系列的下文示例性化合物中，但并不限于此，其包括所有藥學(xué)活性的衍生物，特別是伊立替康、托泊替坎和貝洛替康。

[間隔基(S)]

在本發(fā)明中，將多功能化間隔基團(tuán)引入到聚磷腈載體聚合物以將它們化學(xué)地連接到連接基團(tuán)烏頭酸酐上，實(shí)現(xiàn)與抗癌藥物的偶聯(lián)。間隔基團(tuán)應(yīng)包含伯胺基團(tuán)來連接上述連接基團(tuán)和另一個(gè)伯胺或醇基基團(tuán)來將其接枝到聚磷腈主鏈，并且，該間隔基團(tuán)是選自賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸的多官能化的氨基酸基團(tuán)和包含這些氨基酸的寡肽或直鏈氨基醇類的一種。上述氨基酸被歸類為基礎(chǔ)氨基酸類，且當(dāng)將此類基礎(chǔ)氨基酸引入到聚磷腈主鏈，根據(jù)氨基酸的pKa值，在特定的pH范圍內(nèi)，可賦予聚磷腈化合物陽離子特性。間隔基團(tuán)不僅可以是單個(gè)氨基酸，也可以是多于兩個(gè)氨基酸的組合。例如，可以采用甘氨酰賴氨酸(Gly-Lys)、丙氨酰賴氨酸(Ala-Lys)或三肽。此外，對于某些多官能化的氨基酸或肽，可以使羧酸酯基團(tuán)水解以便與藥物分子的直接偶聯(lián)而無需連接基團(tuán)。此代表性示例是賴氨酸，這將在實(shí)施例中進(jìn)行說明。

[連接基團(tuán)]

眾所周知，聚合物藥物偶聯(lián)物的藥效嚴(yán)重依賴于聚合物載體中活性藥物分子的釋放動力學(xué)。在本發(fā)明中，根據(jù)藥物和載體系統(tǒng)的分子結(jié)構(gòu)，通過適當(dāng)選擇間隔基團(tuán)和連接基團(tuán)烏頭酸酐，利用酰胺鍵(-CONH-)或酯鍵(-COO-)將活性藥物分子偶聯(lián)至聚磷腈載體聚合物，這與僅對帶有伯胺基團(tuán)的藥物分子有用的常規(guī)方法不同。因此，本發(fā)明提供了用于為藥物偶聯(lián)引入酸可裂解連接基團(tuán)的新型、升級的間隔基-連接基團(tuán)系統(tǒng)。

前述偶聯(lián)反應(yīng)可以在包括二氯甲烷、氯仿、乙腈、1,4-二惡烷、二甲基甲酰胺和四氫呋喃的對偶聯(lián)反應(yīng)為惰性的任何有機(jī)溶劑中，在通常的偶聯(lián)反應(yīng)條件下進(jìn)行。但是，由于在引入連接基團(tuán)的過程中形成的反應(yīng)中間體的不穩(wěn)定性，整個(gè)反應(yīng)在干燥的溶劑中并在干燥的氬氣氣氛和低溫下(-10-0℃)進(jìn)行，以提高反應(yīng)效率。特別是，已知順式烏頭酸酐連接基團(tuán)會在堿性溶液中進(jìn)行酸酐開環(huán)反應(yīng)，從而產(chǎn)生異構(gòu)體，并因此，在中性條件下采用DPTS(二甲基氨基吡啶/對-甲苯磺酸)作為催化劑進(jìn)行反應(yīng)，來代替堿性催化劑DMAP(二甲基氨基吡啶)。適于制備聚磷腈偶聯(lián)化合物的代表性藥物是寡肽、多肽、單體藥物、抗體、核苷酸，脂質(zhì)類和其它帶有-OH或NH₂官能團(tuán)的材料。

在本發(fā)明中可用的連接基團(tuán)列于以下化學(xué)式4至8中，而化學(xué)式4是最優(yōu)選的。

[化學(xué)式4]

[化學(xué)式5]

[化學(xué)式6]

[化學(xué)式7]

[化學(xué)式8]

在采用上述化學(xué)式7的酸可裂解(pH＝5.5)的烏頭酸酐作為連接基團(tuán)的情況下，聚合物偶聯(lián)藥物可以根據(jù)下述反應(yīng)方案3來制備。

[反應(yīng)方案3]

然而，在該反應(yīng)方案中形成了不能釋放藥物部分的非活性異構(gòu)體，且根據(jù)偶聯(lián)位點(diǎn)的不同，藥物釋放速率和藥效都難以控制。特別是，當(dāng)間隔基團(tuán)/連接基團(tuán)以及連接基團(tuán)/藥物的化學(xué)鍵都是酰胺鍵時(shí)，可能會形成通過水解難以釋放藥物分子的異構(gòu)體(反應(yīng)方案1非活性)，這導(dǎo)致了低的藥效。在反應(yīng)方案4間隔基團(tuán)/連接基團(tuán)以及連接基團(tuán)/藥物的化學(xué)鍵都是酯鍵的情況下，盡管通過酶水解可能可行，但是依然會導(dǎo)致非活性體的形成。此外，當(dāng)采用藥物分子的OH基團(tuán)進(jìn)行酸酐開環(huán)反應(yīng)時(shí)，特別對于空間位阻的藥物應(yīng)該采用大量過量的親核劑。在本發(fā)明的紫杉烷藥物的情況下，大約需要20倍過量的量才能完成反應(yīng)。在此情況下，發(fā)現(xiàn)最終聚磷腈-藥物偶聯(lián)物的產(chǎn)率低于5％，這在商業(yè)上是不可行的。

[反應(yīng)方案4]

在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，以下反應(yīng)方案5現(xiàn)實(shí)，代替烏頭酸酐的開環(huán)反應(yīng)，使其羧基基團(tuán)與藥物分子(HOR’)的羥基基團(tuán)反應(yīng)以形成酯鍵，從而得到藥物前體。隨后通過采用載體聚合物的間隔胺基團(tuán)進(jìn)行酸酐開環(huán)反應(yīng)而將該前體偶聯(lián)至藥物載體聚合物(RNH₂)。烏頭酸酐的開環(huán)反應(yīng)也可以采用上述反應(yīng)方案中所示的過量的NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)來進(jìn)行。此合成路線與上述方法相比提供了重要的優(yōu)勢。首先，可以避免上述反應(yīng)方案1和2中所示的非活性異構(gòu)體，從而得到更高產(chǎn)率的最終偶聯(lián)藥物，且該偶聯(lián)藥物的純度以及藥效都可以得到合理的控制。

[反應(yīng)方案5]

本發(fā)明還提供了直鏈聚磷腈化合物和聚磷腈-藥物偶聯(lián)化合物的詳細(xì)合成方法。在這方面，會對藥物、間隔基團(tuán)和連接基團(tuán)的具體示例進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不限于這些示例。

本發(fā)明的直鏈聚磷腈化合物是通過將親水性的聚(乙二醇)(PEG)和帶有兩個(gè)伯胺和一個(gè)羧基基團(tuán)的多官能化的賴氨酸、含有賴氨酸的寡肽或氨基乙醇接枝到二氯磷腈主鏈(-N＝PCl₂-)上而合成的。由此制備聚磷腈化合物的多官能化的賴氨酸、含有賴氨酸的寡肽或直鏈氨基醇可以作為間隔基團(tuán)，以采用如烏頭酸酐的連接基團(tuán)與如紫杉烷、鉑(II)絡(luò)合物或喜樹堿偶聯(lián)，從而制備出新型的酸可裂解的直鏈聚磷腈-藥物偶聯(lián)物。

本發(fā)明的直鏈聚磷腈-藥物偶聯(lián)化合物在腫瘤組織中通過選擇性聚積顯示出了優(yōu)異的腫瘤選擇性，并且發(fā)現(xiàn)，通過控制上述化學(xué)式1中的x、y和z值，可以制備高水溶性、長血液循環(huán)和優(yōu)異的腫瘤靶向抗癌藥物。

在本發(fā)明中，期望的選自上述賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或含有酪氨酸的寡肽的間隔基團(tuán)是賴氨酸和含有甘氨酸的寡肽，例如，二肽和三肽，且更期望的是甘氨酰賴氨酸，但并不限于此。在上述寡肽中，期望賴氨酸位于末端位置，以與紫杉烷抗癌藥物偶聯(lián)。期望的選自直鏈氨基醇類的間隔基團(tuán)是氨基乙醇、氨基丙醇、氨基丁醇、氨基戊醇和氨基己醇，且更能期望的是氨基乙醇和氨基丙醇。

在本發(fā)明中，將紫杉烷抗癌藥物(D)的分子通過賴氨酸的氨基或羧基基團(tuán)偶聯(lián)至聚磷腈載體聚合物，并且為了防止將羧基用于偶聯(lián)，應(yīng)利用如t-Boc、FMOC或CBZ的保護(hù)基團(tuán)對胺基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)。在上述化學(xué)式1中，L是連接抗癌藥物(D)和載體聚合物間隔基團(tuán)(S)的連接基團(tuán)并且是順式烏頭酸酐、琥珀酸酐或馬來酸酐，并且期望地是順式烏頭酸酐。在本發(fā)明中舉例說明的抗癌藥物組分(D)是紫杉烷族、喜樹堿族和包括多西紫杉醇、紫杉醇、喜樹堿、托泊替坎、伊立替康、貝洛替康和奧沙利鉑的鉑絡(luò)合物，但并不限于這些藥物。

本發(fā)明的聚磷腈-藥物偶聯(lián)物具有在3,000-300,000范圍內(nèi)的窄分子量分布，并且期望地是在30,000-100,000的范圍內(nèi)，且根據(jù)藥物分子(D)的疏水性，本發(fā)明的聚磷腈-藥物偶聯(lián)物在水中通過自組裝成平均直徑在20-200nm范圍內(nèi)的聚合物膠束而高度可溶。如上所述，本發(fā)明中由聚磷腈-藥物偶聯(lián)物組裝而得的此類聚合物膠束由于其EPR效應(yīng)而顯示出優(yōu)異的腫瘤選擇性。

聚磷腈和聚磷腈-紫杉烷偶聯(lián)化合物可以通過以下四個(gè)步驟的合成反應(yīng)來制備。

(a)通過熱聚合，將起始物料六氯環(huán)三磷腈轉(zhuǎn)變?yōu)橹辨溇?二氯磷腈)((N＝PCl₂)_n)，繼而使其與聚(乙二醇)的鈉鹽反應(yīng)，而得到中間體聚磷腈，[N＝PCl(MPEG)]n；

(b)使上述聚磷腈中間體與選自由賴氨酸酯、含有賴氨酸的寡肽、氨基乙醇、氨基丙醇、氨基丁醇、氨基戊醇和氨基己醇組成的組中的其中之一反應(yīng)，而制備出親水性陽離子聚磷腈載體聚合物；

(c)使帶有羥基(OH)或伯胺(NH₂)基團(tuán)的抗癌藥物與連接基團(tuán)(例如烏頭酸酐)反應(yīng)，而制備出前體；以及

(d)最后，使步驟(c)的前體與步驟(b)的聚磷腈載體聚合物反應(yīng)，而得到化學(xué)式2的最終聚磷腈偶聯(lián)化合物。

[化學(xué)式2]

其中n是從1至300的整數(shù)；OMPEG表示分子量為350至1000的甲氧基聚(乙二醇)；S是選自由賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸、含有賴氨酸的寡肽、含有精氨酸的寡肽、含有谷氨酰胺的寡肽、含有天冬酰胺的寡肽、含有酪氨酸的寡肽、氨基乙醇、氨基丙醇、氨基丁醇、氨基戊醇和氨基己醇組成的組的間隔基團(tuán)；L是連接聚合物的間隔基團(tuán)與具有羥基或胺基團(tuán)的藥物分子D的連接基團(tuán)；x和y獨(dú)立地在0-0.5的范圍內(nèi)；z在0-1的范圍內(nèi)；且x+y+z＝1。

在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，帶有羥基(OH)或伯胺(NH₂)基團(tuán)的抗癌藥物可以是選自多西紫杉醇、紫杉醇、喜樹堿和(反式-(±)-1,2-二氨基環(huán)己烷)鉑(II)的組的一種，但不限于這些藥物。

另外，可以使制備聚磷腈-藥物偶聯(lián)物的上述四步反應(yīng)進(jìn)行取決于待偶聯(lián)的藥物分子的結(jié)構(gòu)的輕微改性。例如，在鉑(II)絡(luò)合物的情況下，在步驟(c)中使連接基團(tuán)與聚合物載體反應(yīng)并繼而在步驟(D)中將藥物連接到與載體聚合物相連的連接基團(tuán)上，而不是在步驟(c)中通過將藥物與連接基團(tuán)反應(yīng)而制備前體并繼而在步驟(d)中使前體與聚合物載體反應(yīng)。

所有下述的合成反應(yīng)過程都應(yīng)該在小心控制的惰性氣氛下，采用干燥的氬氣或氮?dú)庖约巴耆稍锏娜軇﹣磉M(jìn)行。詳細(xì)的合成方法在下文中進(jìn)行描述。

步驟(a)

六氯環(huán)三磷腈((N＝PCl₂)₃)如化學(xué)式9所示，將其根據(jù)文獻(xiàn)方法(Youn Soo Sohn等人，Macromolecules,1995,28,7566)進(jìn)行熱聚合，以得到平均分子量為10⁴-10⁵的聚(二氯磷腈)(N＝PCl₂)_n，如化學(xué)式10所示。

[化學(xué)式9]

[化學(xué)式10]

其中n表示范圍為3至300的聚合度。

將化學(xué)式11中的單甲氧基聚(乙二醇)用甲苯和水的共沸混合物干燥，然后與金屬鈉反應(yīng)，以轉(zhuǎn)化為化學(xué)式12中的鈉鹽，隨后使其在三乙胺存在下與化學(xué)式10中的聚(二氯磷腈)反應(yīng)，以完成化學(xué)式15中的聚磷腈的PEG化。

[化學(xué)式11]

[化學(xué)式12]

在上述化學(xué)式11和12中，a是PEG的聚合度且為7至22。

在下文中對PEG化的聚磷腈的制備進(jìn)行更詳細(xì)地說明。

將化學(xué)式9的六氯環(huán)三磷腈(N＝PCl₂)₃與3至10％的無水氯化鋁在手套箱中混合均勻，隨之在真空下被密封在Pyrex安瓿瓶中。在加熱室中在轉(zhuǎn)動條件下在3-5h內(nèi)使該安瓿瓶加熱至230–250℃，以得到聚(二氯磷腈)的透明粘性液體。同時(shí)，使化學(xué)式11的單甲氧基聚(乙二醇)與1.2-1.5當(dāng)量的金屬鈉在非反應(yīng)性無水有機(jī)溶劑如四氫呋喃(THF)、苯、甲苯中反應(yīng)，以得到化學(xué)式12的鈉鹽。向一摩爾的化學(xué)式10的聚(二氯磷腈)溶解在相同溶劑的溶液加入上述制備的0.5-1.8當(dāng)量的化學(xué)式12的鈉鹽。反應(yīng)溶劑可以是任何非反應(yīng)性溶劑，但期望的是四氫呋喃、苯、甲苯和氯仿。應(yīng)將化學(xué)式12的鈉鹽溶液緩慢地在2-8小時(shí)內(nèi)加入冷卻至低于0℃的聚(二氯磷腈)溶液中，然后使反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度下進(jìn)一步反應(yīng)6–24h，以得到化學(xué)式13的PEG化的聚磷腈中間體。

[化學(xué)式13]

其中n是聚磷腈的聚合度，在3至300的范圍內(nèi)，a是甲氧基聚(乙二醇)的聚合度，在7至22的范圍內(nèi)，b是甲氧基聚(乙二醇)的取代摩爾分?jǐn)?shù)，在0.5至1.8的范圍內(nèi)。

步驟(b)

為了用間隔基團(tuán)取代化學(xué)式13的PEG化的聚磷腈的其余的(2-b)氯原子以用于藥物偶聯(lián)，將1.5-1.8當(dāng)量的賴氨酸酯或含賴氨酸的寡肽酯與6當(dāng)量的三乙胺一起溶解于任何不參與反應(yīng)的有機(jī)溶劑中，理想的是將四氫呋喃、氯仿或二氯甲烷緩慢地加入到上述化學(xué)式13的PEG化的聚磷腈中間體溶液中，然后在40-60℃下回流12h至3天。可以將化學(xué)式14的賴氨酸衍生物用作賴氨酸酯，并將化學(xué)式15的衍生物用作包含賴氨酸的寡肽酯。在該化學(xué)式中，可以用亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸來取代甘氨酸。

[化學(xué)式14]

其中R是直鏈、支化或環(huán)狀的C_1-6烷基基團(tuán)或OCH₂Bz，且R’是胺保護(hù)基團(tuán)，t-Boc(叔丁氧羰基)、Fmoc(芴甲氧羰基)或CBZ(芐氧羰基)。

[化學(xué)式15]

其中R是直鏈、支化或環(huán)狀的C_1-6烷基基團(tuán)或OCH₂Bz，且R’是胺保護(hù)基團(tuán)，t-Boc(叔丁氧羰基)、Fmoc(芴甲氧羰基)或CBZ(芐氧羰基)。

在本發(fā)明中，R可以是甲基、乙基、正丙基、正丁基或叔丁基，但不限于此。

將上述反應(yīng)溶液離心或過濾以去除副產(chǎn)物沉淀(Et₃NHCl或NaCl)，并對濾液進(jìn)行濃縮。將乙醇加入到該濃縮物中，隨后進(jìn)行真空濃縮以完全去除有機(jī)溶劑。將油狀產(chǎn)物溶解于少量的乙醇(100ml)中，然后加入大量的水(900ml)，以在低溫下進(jìn)行重結(jié)晶，然后用不同孔徑的膜進(jìn)行膜超濾，以將聚合物分級為50,000至100,000的分子量。對分級的聚磷腈溶液進(jìn)行冷凍干燥，以得到約40-50％產(chǎn)率的化學(xué)式16和化學(xué)式17的聚磷腈化合物。

[化學(xué)式16]

[化學(xué)式17]

在化學(xué)式16和17中，n是聚磷腈的聚合度，其范圍為3至300；MPEG表示分子量為350至1000的甲氧基聚(乙二醇)；b的值為0.5-1.8；R是直鏈、支化或環(huán)狀的C_1-6烷基基團(tuán)或OCH₂Bz；R’是胺保護(hù)基團(tuán)，t-Boc(叔丁氧羰基)、Fmoc(芴甲氧羰基)或CBZ(芐氧羰基)。

步驟(c)

不難將具有官能團(tuán)的藥物分子偶聯(lián)至在步驟(b)中制備的具有多官能間隔基團(tuán)的聚磷腈化合物，但將具有多官能團(tuán)的藥物分子(如紫杉烷)以臨床應(yīng)用中需要的鍵合方式偶聯(lián)至多官能的聚磷腈載體聚合物并不容易。換言之，除了令人滿意的物理化學(xué)性質(zhì)外，抗癌藥物-聚磷腈偶聯(lián)物還需要表現(xiàn)出強(qiáng)的腫瘤靶向性和藥物釋放動力學(xué)。特別地，已知的是聚合物偶聯(lián)物的藥物釋放動力學(xué)對于藥效至關(guān)重要，因此，本發(fā)明中連接基團(tuán)的作用是非常重要的。更具體地，連接基團(tuán)應(yīng)該不僅能夠容易地將藥物分子的官能團(tuán)(OH，NH₂)連接至聚磷腈載體聚合物的官能團(tuán)(COOH，NH₂)，而且能夠使偶聯(lián)藥物在被靶向的腫瘤部位能容易地釋放出藥物分子。

本發(fā)明中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，化學(xué)式18的順式烏頭酸酐是在合成和藥物釋放動力學(xué)方面將紫杉烷偶聯(lián)至聚磷腈載體聚合物的最佳連接基團(tuán)，特別是在首先將連接基團(tuán)與紫杉烷反應(yīng)制備前體，然后將其連接到聚磷腈類的間隔基團(tuán)上的情況下。紫杉烷藥物前體的制備如下。

在氬氣氣氛下將多西紫杉醇(1.0mmol，803mg)和順式烏頭酸酐(2.0mmol，312mg)混合并溶解在THF或二氯甲烷中。將混合溶液冷卻至凝固點(diǎn)，然后加入DIC(N,N'-二異丙基碳二亞胺)(2.0mmol，0.252g)和DPTS(4-(N,N'-二甲基氨基)吡啶鎓-4-甲苯磺酸鹽)(2.0mmol，0.58g)，使連接基團(tuán)烏頭酸的羧酸基團(tuán)與多西紫杉醇的2'-羥基基團(tuán)之間進(jìn)行12小時(shí)的酯化反應(yīng)。通過TLC確認(rèn)反應(yīng)完成后，加入過量的NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)和DIPEA(二異丙基乙胺)以使未反應(yīng)的烏頭酸的酸酐環(huán)開環(huán)。已知烏頭酸酐環(huán)容易在堿性溶液中通過羥基和胺基開環(huán)。攪拌12小時(shí)后，將反應(yīng)混合物冷卻至0℃保溫3小時(shí)，然后真空過濾去除沉淀物。將濾液進(jìn)行真空蒸餾，除去所有的有機(jī)溶劑，以得到油狀混合物，將其溶解于乙醇(50ml)中。向該乙醇溶液中加入大量過量的水(500ml)，在冰箱中重結(jié)晶3小時(shí)。去除上清液以得到油狀產(chǎn)物，將得到的油狀產(chǎn)物完全溶解在300ml二氯甲烷中。將該二氯甲烷溶液用飽和鹽溶液洗滌三次，隨后將所收集的有機(jī)層用無水NaHCO₃干燥，然后進(jìn)行真空蒸發(fā)，以得到95％產(chǎn)率的前體。

[化學(xué)式18]

步驟(d)

將疏水抗癌藥物如紫杉烷偶聯(lián)至上述在步驟(b)中制備的聚磷腈載體聚合物，以得到由化學(xué)式2表示的新型聚磷腈-紫杉烷偶聯(lián)物。將紫杉烷分子偶聯(lián)至聚磷腈載體聚合物的方法有兩種：一種方法是將紫杉烷分子通過烏頭酸以酰胺鍵合的方式偶聯(lián)至聚磷腈載體的賴氨酸胺上，另一種方法是聚磷腈載體的賴氨酸羧基基團(tuán)與紫杉烷分子的2'-羥基基團(tuán)的酯化反應(yīng)。因此，步驟(d)以兩種不同的方法進(jìn)行。

在酰胺鍵合方法中，應(yīng)該通過將上述的化學(xué)式16或化學(xué)式17的聚磷腈載體聚合物的保護(hù)基團(tuán)(t-Boc)與三氟乙酸和二氯甲烷(2:1)的混合物反應(yīng)6h，然后進(jìn)行中和、水洗并隨之凍干，而將該保護(hù)基團(tuán)除去。將脫保護(hù)的聚磷腈載體聚合物與藥物前體(通過使連接基團(tuán)烏頭酸酐與藥物如紫杉烷反應(yīng)，隨后加入過量的NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)和DIPEA(二異丙基乙胺)而制備的烏頭酸紫衫烷-NHS(N-羥基琥珀酰亞胺基))反應(yīng)12h。將所得的反應(yīng)混合物真空蒸發(fā)濃縮12h，然后溶解于乙醇中。對最終的溶液進(jìn)行真空蒸發(fā)(37℃，5mm巴)，去除所有痕量溶劑和DIPEA。將殘留的聚合物偶聯(lián)產(chǎn)物溶解于50ml乙醇中，然后在該乙醇溶液中加入950ml蒸餾水，以在冰箱中重結(jié)晶。3h后，對該溶液混合物進(jìn)行真空過濾，以收集最終的聚合物偶聯(lián)產(chǎn)物，用30％的乙醇溶液洗滌數(shù)次、然后使用超濾膜用蒸餾水超濾，直至通過UV光譜法檢測到未反應(yīng)的紫杉烷小于0.1％為止。將純化的聚磷腈-紫杉烷偶聯(lián)物溶液進(jìn)行凍干，以得到化學(xué)式19或20的最終產(chǎn)物。

[化學(xué)式19]

[化學(xué)式20]

在化學(xué)式19和20中，n是獨(dú)立地從3至300的整數(shù)；OMPEG表示具有350至1000分子量的甲氧基聚(乙二醇)；D表示多西紫杉醇、紫杉醇、喜樹堿和(反式-(±)-1,2-二氨基環(huán)己烷)鉑(II)；R為C_1-6直鏈、支化或環(huán)狀的烷基基團(tuán)或OCH₂Bz；x和y獨(dú)立地在0-0.5的范圍內(nèi)；z大于0且小于1.0；x+y+z＝1。

在酯鍵合的方法中，可以用堿將聚磷腈載體聚合物的間隔基團(tuán)的末端賴氨酸酯水解成羧酸形式，然后與紫杉烷的2'-羥基基團(tuán)進(jìn)行酯化反應(yīng)。例如，將化學(xué)式19的聚磷腈載體聚合物溶解在甲醇中，然后向其中加入過量的KOH或NaOH(150～200％)，以得到載體聚合物的賴氨酸的鉀鹽或鈉鹽。通過真空蒸發(fā)去除甲醇溶劑，將所得金屬鹽溶解于蒸餾水(100ml)中。將二氯甲烷或氯仿(300ml)加入到該溶液中，通過緩慢加入有機(jī)酸將其酸化。當(dāng)水層的pH降低到4-3時(shí)，通過振蕩該兩層溶劑層，將酸形式的聚磷腈載體聚合物萃取到有機(jī)層中。將該萃取程序重復(fù)三次，用無水碳酸氫鈉干燥所收集的有機(jī)層溶液。對干燥的溶液進(jìn)行過濾和真空蒸發(fā)，以得到具有末端被水解的賴氨酸基團(tuán)的聚磷腈載體聚合物。將所得的具有被水解的賴氨酸的聚磷腈載體聚合物和等量的多西紫杉醇溶解于四氫呋喃中，然后加入N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺和三乙胺進(jìn)行酯化反應(yīng)。通過TLC利用溶劑混合物(CHCl₃:MeOH₃＝10:1)確認(rèn)反應(yīng)完成，然后將反應(yīng)混合物進(jìn)行真空蒸餾以濃縮反應(yīng)混合物，隨后通過超濾膜分級出分子量為30至100kDa的化學(xué)式21的最終聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物。

[化學(xué)式21]

其中n是從3至300的整數(shù)；OMPEG表示具有350至1000分子量的甲氧基聚(乙二醇)；D表示多西紫杉醇、紫杉醇或喜樹堿；R’表示t-Boc或CBZ；x和y獨(dú)立地在0至0.5的范圍內(nèi)；z大于0且小于1.0；x+y+z＝1。

在下文中，將參考以下示例和示范更詳細(xì)地描述本發(fā)明的構(gòu)成和作用，但是本發(fā)明不限于此。在以下的示例中，采用Perkin-Elmer C、H和N分析儀對本發(fā)明化合物進(jìn)行碳、氫和氮元素分析。采用Varian Gemini-500NMR譜儀測量氫和氮的核磁共振譜。采用Malvern Zeta-sizer(Nano-ZS)測量聚磷腈載體聚合物及其藥物偶聯(lián)物的粒徑分布。

發(fā)明的方式

聚磷腈化合物(藥物遞送系統(tǒng))的合成

示例1、[NP(MPEG550)_1.5(賴氨酸乙基)_0.5]_n的合成

將六氯環(huán)三磷腈([NPCl₂]₃，11.54g，100mmol)和無水氯化鋁(AlCl₃，7.5重量％)在手套箱中均勻混合，然后根據(jù)文獻(xiàn)方法(Sohn YS等人，Macromolecules 1995，28，7566)在250℃下進(jìn)行熱聚合5h，得到聚(二氯膦腈)([NPCl₂]_n)。同時(shí)，在氬氣氣氛下，在干燥的甲苯溶劑中將平均分子量為550的甲氧基聚(乙二醇)(MPEG550)(82.5g，150mmol)與金屬鈉(4.9g，200.4mmol)在120℃下反應(yīng)6h得到MPEG550的鈉鹽。在玻璃容器中，在冰浴(0℃)上向上述溶解于四氫呋喃的聚(二氯膦腈)(100ml)中在60min內(nèi)緩慢加入所制備的MPEG550的鈉鹽溶液。1h后，移除冰浴，然后將反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度下進(jìn)一步反應(yīng)12h，以得到PEG化的聚磷腈中間體溶液。用在干燥的氯仿(200ml)中干燥的三甲胺去中和Boc-賴氨酸乙酯，在單獨(dú)的容器中，將經(jīng)過中和的Boc-賴氨酸乙酯(N-Boc-賴氨酸乙基，20.5g，75.0mmol)緩慢地加入到上述PEG化的聚磷腈中間體溶液中，將該反應(yīng)混合物在室溫下進(jìn)一步地反應(yīng)24h。過濾該反應(yīng)混合物，去除所得的副產(chǎn)物沉淀(NEt₃·HCl或NaCl)，并將濾液進(jìn)行真空蒸發(fā)以濃縮該溶液(將該溶液溶解于乙醇中，隨后進(jìn)行真空蒸發(fā))。最后，將殘余物溶解在蒸餾水中，并過濾去除任何不溶物，并使用超濾膜(CE，MWCO＝3000)對濾液進(jìn)行透析，去除低于3000Da的較低分子量的級分。將分級的聚磷腈聚合物用蒸餾水洗滌多于5次，然后進(jìn)行凍干。將得到的聚磷腈聚合物溶解在含有30％(體積/體積)三氟乙酸的二氯甲烷溶液(200ml)中，攪拌6h，以從聚合物中去除保護(hù)基團(tuán)(t-Boc)，得到產(chǎn)率65％(3.37g)的脫保護(hù)的聚磷腈聚合物[NP(MPEG550)_1.5(賴氨酸乙基)_0.5]_n。

通過質(zhì)子NMR確定出脫保護(hù)的賴氨酸胺后，采用三乙胺中和該聚合物溶液，然后通過真空蒸餾去除有機(jī)溶劑。向所得的聚合物中加入碳酸氫鈉水溶液以完全溶解聚合物，將其脫鹽，然后使用分子量截留值為3k Da、30k Da、100k Da的超濾膜進(jìn)行分級?？偦厥章蕿?0％。

組成：C₈₃H₁₇₀N₄O₄₁P₂

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(51.66)；H(8.59)；N(2.83)。理論值：C(51.33)；H(8.82)；N(2.88)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：1.25(s，1.5H，賴氨酸-OCH₂CH₃)，2.49(br，1.00H，琥珀?；?CH₂)，2.90(br，1.00H，賴氨酸-ε-CH₂)，3.38(s，4.50H，MPEG550-OCH₃)，3.65(br，66.0H，MPEG550-OCH₂CH₂)，4.4(s，1H，賴氨酸-CH)。

³¹P-NMR譜：(CDCl₃，ppm)：δ-0.014(s)，δ-5.551(s)。

示例2、[NP(MPEG750)_1.5(賴氨酸乙基)_0.5]_n的合成

根據(jù)與示例1中所述的相同的方法，使用六氯環(huán)三磷腈([NPCl₂]₃，11.54g，100mmol)、平均分子量為750的甲氧基聚(乙二醇)(MPEG750，112.5g，150mmol)、三甲胺(80.0ml，600mmol)和Boc-賴氨酸乙基(20.5g，75mmol)制備出產(chǎn)率為74％的標(biāo)題聚磷腈化合物的期望產(chǎn)物。

組成：C₁₀₇H₂₁₈N₄O₅₃P₂

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(51.30)；H(8.99)；N(2.36)。理論值：C(52.01)；H(8.89)；N(2.27)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：1.25(s，1.50H，賴氨酸-OCH₂CH₃)，1.39-1.98(br，3.00H，賴氨酸-CH₂)，2.90(br，1H，賴氨酸-ε-CH₂)，3.38(s，4.50H，MPEG750-OCH₃)，3.65(br，98.0H，MPEG750-OCH₂CH₂)，4.01(bs，6H，MPEG750-CH₂)，4.45(m，0.5H，賴氨酸-CH)。

³¹P-NMR譜：(CDCl₃，ppm)：δ-0.014(s)，δ-5.551(s)。

示例3、[NP(MPEG1000)_1.5(賴氨酸乙基)_0.5]_n的合成

根據(jù)與示例1中所述的相同的方法，使用六氯環(huán)三磷腈([NPCl₂]₃，11.54g，100mmol)、平均分子量為1000的甲氧基聚(乙二醇)(MPEG1000，150g，150mmol)、三甲胺(80.0ml，600mmol)和Boc-賴氨酸乙基(20.5g，75mmol)制備出產(chǎn)率為74％的標(biāo)題聚磷腈化合物的期望產(chǎn)物。

組成：C₁₄₃H₂₉₀N₄O₇₁P₂

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(53.01)；H(8.70)；N(2.36)。理論值：C(52.62)；H(8.96)；N(1.72)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：1.25(s，1.50H，賴氨酸-OCH₂CH₃)，1.39-1.98(br，3.00H，賴氨酸-CH₂)，2.90(br，1H，賴氨酸-ε-CH₂)，3.38(s，4.50H，MPEG1000-OCH₃)，3.65(br，130.0H，MPEG1000-OCH₂CH₂)，4.45(m，0.5H，賴氨酸-CH)。

³¹P-NMR譜：(CDCl₃，ppm)：δ-0.014(s)，δ-5.551(s)。

示例4、[NP(MPEG550)_1.25(賴氨酸乙基)_0.75]_n的合成

根據(jù)與示例1中所述的相同的方法，使用六氯環(huán)三磷腈([NPCl₂]₃，11.54g，100mmol)、平均分子量為550的甲氧基聚(乙二醇)(MPEG550，69.0g，126mmol)、三甲胺(80.0ml，600mmol)和Boc-賴氨酸乙基(27.4g，100mmol)制備出產(chǎn)率為74％的標(biāo)題聚磷腈化合物的期望產(chǎn)物。

組成：C_74.5H₁₅₃N₅O_35.5P₂

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(50.87)；H(9.02)；N(4.31)。理論值：C(51.14)；H(8.82)；N(4.14)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：1.25(s，2.25H，賴氨酸-OCH₂CH₃)，1.39-1.98(br，4.50H，賴氨酸-CH₂)，2.90(br，1.5H，賴氨酸-ε-CH₂)，3.38(s，3.75H，MPEG550-OCH₃)，3.65(br，82.5H，MPEG550-OCH₂CH₂)，4.45(m，0.7H，賴氨酸-CH)。

³¹P-NMR譜：(CDCl₃，ppm)：δ-0.014(s)，δ-5.551(s)。

示例5、[NP(MPEG550)_1.0(賴氨酸乙基)_1.0]_n的合成

根據(jù)與示例1中所述的相同的方法，使用六氯環(huán)三磷腈([NPCl₂]₃，11.54g，100mmol)、平均分子量為550的甲氧基聚(乙二醇)(MPEG550，55.0g，100mmol)、三甲胺(80.0ml，600mmol)和Boc-賴氨酸乙基(35.6g，130mmol)制備出產(chǎn)率為74％的標(biāo)題聚磷腈化合物的期望產(chǎn)物。

組成：C₆₆H₁₃₆N₆O₃₀P₂

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(50.29)；H(8.95)；N(5.51)。理論值：C(50.95)；H(8.81)；N(5.40)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：1.25(s，3.00H，賴氨酸-OCH₂CH₃)，1.39-1.98(br，6.00H，賴氨酸-CH₂)，2.90(br，2.0H，賴氨酸-ε-CH₂)，3.38(s，3.0H，MPEG550-OCH₃)，3.65(br，66.0H，MPEG550-OCH₂CH₂)，4.45(m，1.0H，賴氨酸-CH)。

³¹P-NMR譜：(CDCl₃，ppm)：δ-0.014(s)，δ-5.551(s)。

示例6、[NP(MPEG550)_1.5(賴氨酸乙基)_0.5]_n的合成

根據(jù)與示例1中所述的相同的方法，使用六氯環(huán)三磷腈([NPCl₂]₃，11.54g，100mmol)、平均分子量為550的甲氧基聚(乙二醇)(MPEG550，82.5g，150mmol)、三甲胺(80.0ml，600mmol)和Gly(N^ε-Boc賴氨酸乙基(24.8g，90mmol)制備出產(chǎn)率為74％的標(biāo)題聚磷腈化合物的期望產(chǎn)物。

組成：C₈₅H₁₇₃N₅O₄₂P₂

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(50.75)；H(8.82)；N(3.61)。理論值：C(51.06)；H(8.72)；N(3.50)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：1.25(s，3.00H，賴氨酸-OCH₂CH₃)，1.39-1.98(br，6.00H，賴氨酸-CH₂)，2.90(br，2.0H，賴氨酸-ε-CH₂)，3.38(s，3.0H，MPEG750-OCH₃)，3.65(br，66.0H，MPEG500-OCH₂CH₂)，3.92(bs，2H，甘氨酸-CH₂)，4.45(m，1.0H，賴氨酸-CH)。

³¹P-NMR譜：(CDCl₃，ppm)：δ-0.014(s)，δ-5.551(s)。

示例7、[NP(MPEG550)_1.5(N^α-Boc賴氨酸)_0.5]_n的合成

根據(jù)與示例1中所述的相同的方法，使用六氯環(huán)三磷腈([NPCl₂]₃，11.54g，100mmol)、平均分子量為550的甲氧基聚(乙二醇)(MPEG550，82.5g，150mmol)、三甲胺(80.0ml，600mmol)和N^ε-Boc賴氨酸乙基(20.5g，75mmol)制備出標(biāo)題聚磷腈化合物產(chǎn)物的酯形式[NP(MPEG550)_1.5(N^α-Boc賴氨酸乙基)_0.5]_n(產(chǎn)率75％)。將該合成的衍生物(10g，10mmol)和NaOH(0.4g，10mmol)溶解在甲醇中，然后在環(huán)境溫度下水解4小時(shí)。通過使用質(zhì)子NMR確認(rèn)水解完全，然后將溶液進(jìn)行真空蒸發(fā)，得到固態(tài)聚合物，將該固態(tài)聚合物溶解在蒸餾水中，并通過有機(jī)酸酸化至pH＝3。將該酸化的聚合物溶液用氯仿或二氯甲烷萃取三次。有機(jī)層用無水碳酸氫鈉干燥，然后進(jìn)行真空蒸發(fā)，得到該標(biāo)題化合物(產(chǎn)率95％)。

組成：C₈₆H₁₇₄N₄O₄₃P₂

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(51.02)；H(8.94)；N(2.91)。理論值：C(51.28)；H(8.71)；N(2.78)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：1.32(s，4.5H，Boc-CH₃)，1.39-1.98(br，6.00H，賴氨酸-CH₂)，2.90(br，2.0H，賴氨酸-ε-CH₂)，3.38(s，3.0H，MPEG550-OCH₃)，3.65(br，66.0H，MPEG550-OCH₂CH₂)，4.45(m，1.0H，賴氨酸-CH)。

示例8、[NP(MPEG550)(AE)]_n的合成

根據(jù)與示例1中所述的相同的方法，使用六氯環(huán)三磷腈([NPCl₂]₃，2.0g，5.72mmol)、催化氯化鋁(AlCl₃，7.0重量％)、平均分子量為550的甲氧基聚(乙二醇)(MPEG550，9.48g，17.2mmol)和金屬鈉(0.59g，25.7mmol)制備出PEG化的聚磷腈中間體。同時(shí)，在干燥的四氫呋喃(50ml)中，將2-氨基乙醇(AE，1.30g，21.3mmol)和氫化鈉(0.61g,25.4mmol)在環(huán)境溫度下反應(yīng)5h，得到黃色的2-氨基乙醇的鈉鹽沉淀物，用乙醚充分洗滌后，將其溶解在二甲基亞砜(50ml)中。將所得溶液加入到上述PEG化的聚磷腈中間體中，并將反應(yīng)混合物在50℃下進(jìn)一步反應(yīng)24小時(shí)。將反應(yīng)混合物過濾以去除副產(chǎn)物氯化鈉，并使用纖維素膜(MWCO：3.5kDa)對濾液進(jìn)行透析，在凍干后，得到70％產(chǎn)率的新型聚磷腈載體聚合物。

組成：C₂₇H₅₇N₂O₁₄P·H₂O

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(47.38)；H(8.61)；N(3.95)。理論值：C(47.45)；H(8.64)；N(4.10)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：3.26(s，3H，MPEG的OCH₃)，3.50-3.52(m，4H，氨基乙醇的(CH₂)₂)，3.54-3.81(brm，46H，MPEG的CH₂)，3.83-4.10(brm，2H，MPEG的-P-O-CH₂-)。

³¹P-NMR譜：(CDCl₃，ppm)：δ-2.66(O-P-O)。

示例9、[NP(MPEG750)(AE)]_n的合成

根據(jù)與示例8中所述的相同的方法，使用六氯環(huán)三磷腈([NPCl₂]₃，2.0g，5.72mmol)、催化氯化鋁(AlCl₃，7.0重量％)、平均分子量為750的甲氧基聚(乙二醇)(MPEG750，12.9g,17.2mmol)、金屬鈉(0.59g，25.7mmol)、2-氨基乙醇(1.30g，21.3mmol)和氫化鈉(0.61g，25.4mmol)制備出產(chǎn)率為78％的標(biāo)題聚磷腈化合物的期望產(chǎn)物。

組成：C₃₅H₇₃N₂O₁₈P·H₂O

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(48.02)；H(8.96)；N(3.55)。理論值：C(48.89)；H(8.73)；N(3.26)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：3.41(s，3H，MPEG的OCH₃)，3.49-3.53(m，4H，氨基乙醇的(CH₂)₂)，3.57-3.83(brm，62H，MPEG的CH₂)，3.83-4.05(brm，2H，MPEG的-P-O-CH₂-)。

³¹P-NMR譜：(CDCl₃，ppm)：δ-3.95(O-P-O)。

抗癌藥物-連接基團(tuán)前體的合成

示例10、2'-烏頭酸多西紫杉醇NHS酯的合成

將烏頭酸酐(3.12g，20mmol)、多西紫杉醇(8.03g，10mmol)和催化劑DPTS(二甲基氨基吡啶/對甲苯磺酸)(6.0g，20mmol)真空干燥4h，并冷卻至-10℃，隨后將其完全溶解在干燥的四氫呋喃(100ml)中。向該溶液中緩慢地加入也溶解在干燥的四氫呋喃中的DIC(N,N'-二異丙基碳二亞胺)(2.5g，20mmol)。將混合反應(yīng)溶液在-10℃下反應(yīng)6h，然后在0℃下反應(yīng)6至12h。反應(yīng)的進(jìn)程通過使用二氯甲烷:甲醇(95:5)的溶劑混合物的TLC監(jiān)測，直到檢測不到游離多西紫杉醇為止。在確認(rèn)反應(yīng)完成后，向上述反應(yīng)溶液中加入過量的NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)(11.5g，100mmol)和大量過量的堿性DIPEA(二異丙基乙胺)，并使反應(yīng)混合物進(jìn)一步反應(yīng)12h。最后將反應(yīng)混合物進(jìn)行真空蒸發(fā)，得到固體聚合物產(chǎn)物，將其溶解于少量乙醇(50ml)中，然后加入大量的水(950ml)，在0℃下重結(jié)晶3h。除去上清液水層，得到棕色油狀產(chǎn)物，將其溶解在氯仿或二氯甲烷中，依次用鹽溶液(pH＝7)、檸檬酸溶液(pH＝2)、碳酸氫鈉溶液(pH＝9)、最后用鹽溶液洗滌。最終的有機(jī)溶液用無水硫酸鎂干燥，然后經(jīng)過真空干燥，最終獲得由2'-烏頭酸-多西紫杉醇-NHS酯構(gòu)成的前體。

組成：C₅₃H₆₀N₂O₂₁

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(60.07)；H(5.86)；N(2.71)。理論值：C(59.99)；H(5.70)；N(2.64)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：1.13ppm(s，3H，C17-CH₃)，1.24ppm(s，3H，C16-CH₃)，1.34ppm(s，9H，C60-叔丁基)，1.75ppm(s，3H，C19-CH₃)，1.96ppm(s，3H，C18-CH₃)，2.18ppm(d，2H，C14-CH₂)，2.43ppm(s，3H，C22-CH₃)，2.64(t，4H，NHS-CH₂CH₂)，2.92(s，2H，烏頭酸-CH₂)，4.21ppm(d，1H，C20-CH_a)，4.24ppm(m，1H，C7-CH)，4.32ppm(d，1H，C20-CH_b)，4.95ppm(dd，1H，C5CH)，5.23ppm(d，1H，C10-CH)，5.40ppm(d，1H，C30-CH)，5.69ppm(d，1H，C2-CH)，6.40-6.68(m，1H，烏頭酸-CH)，7.51ppm(m，2H，C33，C27-CH)，7.53(m，6H，C32，C34-CH；C31，C35-CH；C26，C28-CH)，8.12(d，2H，C25，C29-CH)。

示例11、2'-烏頭酸紫杉醇NHS酯的合成

根據(jù)與示例10中所述相同的方法，使用烏頭酸酐(3.12g，20mmol)、紫杉醇(8.53g，10mmol)、DPTS(5.88g，20mmol)、NHS(11.5g，100mmol)，DIC(2.52g，20mmol)和DIPEA(10ml)制備出由2'-烏頭酸紫杉醇NHS酯構(gòu)成的前體的期望產(chǎn)物。

組成：C₅₅H₅₈N₂O₁₉

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(61.90)；H(5.75)；N(2.80)。理論值：C(62.85)；H(5.56)；N(2.67)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：1.13ppm(s，3H，C17-CH₃)，1.24ppm(s，3H，C16-CH₃)，1.34ppm(s，9H，C60-叔丁基)，1.75ppm(s，3H，C19-CH₃)，1.96ppm(s，3H，C18-CH₃)，2.18ppm(d，2H，C14-CH₂)，2.43ppm(s，3H，C22-CH₃)，2.64(t，4H，NHS-CH₂CH₂)，2.92(s，2H，烏頭酸-CH₂)，4.21ppm(d，1H，C20-CH_a)，4.24ppm(m，1H，C7-CH)，4.32ppm(d，1H，C20-CH_b)，4.95ppm(dd，1H，C5CH)，5.23ppm(d，1H，C10-CH)，5.40ppm(d，1H，C30-CH)，5.69ppm(d，1H，C2-CH)，6.40-6.68(m，1H，烏頭酸-CH)，7.51ppm(m，2H，C33，C27-CH)，7.53(m，6H，C32，C34-CH；C31，C35-CH；C26，C28-CH)，8.12(d，2H，C25，C29-CH)。

示例12、2'-烏頭酸喜樹堿NHS酯的合成

根據(jù)與示例10中所述相同的程序，使用烏頭酸酐(3.12g，20mmol)、喜樹堿(3.48g，10mmol)、DPTS(5.88g，20mmol)、NHS(11.5g，100mmol)，DIC(2.52g，20mmol)和DIPEA(10ml)制備出由2'-烏頭酸喜樹堿NHS酯構(gòu)成的前體的期望產(chǎn)物。

組成：C₃₀H₂₃N₃O₁₁

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(60.29)；H(3.98)；N(6.57)。理論值：C(59.90)；H(3.85)；N(6.99)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：0.9(t，3H，C18-CH3)，2.0(m，2H，C19-CH₂)，2.64(t，4H，NHS-CH₂CH₂)，2.92(s，2H，烏頭酸-CH₂)，4.20(d，2H，C5-CH₂)，4.76(m，2H，C22-CH₂)，6.40-6.68(m，1H，烏頭酸-CH)，6.70(s，1H，C14-CH)，7.59(s，1H，C11-CH)，7.80(m，2H，C12-CH；C7-CH)，8.0(m，2H，C9-CH；C12-CH)。

示例13、2'-烏頭酸甘氨酸喜樹堿的合成

將t-Boc-甘氨酸(0.5g，2.85mmol)和喜樹堿(CPT)(0.5g，1.43mmol)溶解于無水二氯甲烷(20ml)中，并向其中加入DIPC(0.36ml，2.85mmol)和DMAP(0.31g，2.53mmol)。在室溫下將混合物溶液攪拌反應(yīng)16h。通過振蕩，用稀鹽酸水溶液(pH＝2)萃取所得混合物。分離水層，并用無水硫酸鎂干燥，然后進(jìn)行真空干燥，得到t-Boc-甘氨酸喜樹堿。在二氯甲烷和三氟乙酸的混合物(10ml/10ml)中將該中間體反應(yīng)1h，除去t-Boc基團(tuán)，在0℃下將得到的喜樹堿-甘氨酸-NH₂和順式烏頭酸酐(0.57g，3.63mmol)在二甲基甲酰胺溶劑(2ml)中反應(yīng)16h。向反應(yīng)混合物中加入過量的乙醚以沉淀喜樹堿前體，將其進(jìn)行過濾并真空干燥，得到80％產(chǎn)率的2'-烏頭酸-甘氨酸喜樹堿。

組成：C₂₈H₂₃N₃O₁₀

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(59.72)；H(4.01)；N(7.39)。理論值：C(59.84)；H(4.09)；N(7.48)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：0.88-0.93(brm，3H，CPT-C18的-CH₃)，2.12-2.16(m，2H，CPT-C-19的-CH₂)，2.86(s，2H，順式烏頭酸鹽的-CH₂)，3.92-4.42(brm，2H，甘氨酸的-CH₂)，5.27(brs，2H,CPT-C5的-CH₂)，5.49(brs，2H，CPT-C22的-CH₂)，5.97(s，1H，順式烏頭酸鹽的＝CH)，7.18-7.21(m，1H，CPT-C14的＝CH)，7.69-7.72(m，1H，CPT-C11的＝CH)，7.84-7.89(m，1H，CPT-C10的＝CH)，8.10-8.21(m，2H，CPT-C12和C9的＝CH)，8.68(brs，1H，CPT-C7的＝CH)，12.3-12.8(brs，順式烏頭酸的-COOH)。

聚磷腈-抗癌藥物偶聯(lián)物的合成

示例14、[NP(MPEG550)_1.5(賴氨酸乙基-2'-烏頭酸-多西紫杉醇)_0.5]_n的合成

在反應(yīng)燒瓶中，將示例1中得到的聚磷腈化合物(4.85g，5.0mmol)溶解在二氯甲烷中，用冰浴冷卻。將示例8中得到的2'-烏頭酸-多西紫杉醇-NHS酯也溶解在二氯甲烷中，并加入到該反應(yīng)燒瓶中，反應(yīng)混合物在低溫(0-5℃)下反應(yīng)12h。反應(yīng)12h后，將反應(yīng)混合物進(jìn)行真空蒸發(fā)，將殘余物溶解在少量乙醇中，然后加入大量過量的水進(jìn)行重結(jié)晶，重復(fù)兩次。使用膜過濾器去除剩余的不溶性雜質(zhì)，將濾液用30％乙醇水溶液洗滌5次，然后用純水洗滌5次，隨后使用超濾膜分級并凍干，得到產(chǎn)率為90％的最終聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物，[NP(MPEG550)_1.5(賴氨酸乙基-2'-烏頭酸-多西紫杉醇)_0.5]_n。

組成：C₁₃₂H₂₂₅N₅O₅₉P₂

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(53.62)；H(7.92)；N(2.67)。理論值：C(54.89)；H(7.85)；N(2.42)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：1.13ppm(s，1.5H，C17-CH₃)，1.24ppm(s，1.5H，C16-CH₃)，1.34ppm(bs，4.1H，C60-叔丁基)，1.75ppm(s，1.5H，C19-CH₃)，1.96ppm(s，1.5H，C18-CH₃)，2.18ppm(d，1.0H，C14-CH₂)，2.43ppm(s，1.5H，C22-CH₃)，4.21ppm(d，0.5H，C20-CH_a)，4.24ppm(m，0.5H，C7-CH)，4.32ppm(d，0.5H，C20-CH_b)，4.95ppm(dd，0.5H，C5-CH)，5.23ppm(d，0.5H，C10-CH)，5.40ppm(d，0.5H，C30-CH)，5.69ppm(d，0.5H，C2-CH)，7.51ppm(m，1.0H，C33，C27-CH)，7.53(m，3.0H，C32，C34-CH；C31，C35-CH；C26，C28-CH)，8.12(d，0.6H，C25，C29-CH)，1.24(s，1.5H，賴氨酸-OCH₂CH₃)，1.29(bs，1H，賴氨酸-CH₂)，1.55ppm(bs，1H，賴氨酸-CH2)，1.80(bs，1H，賴氨酸-CH₂)，2.90(br，1H，賴氨酸-e-CH₂)，3.38ppm(s，4.50H，CH₃O-，PEG)，和3.63ppm(m，66.0H，-CH₂CH₂-O-)，4.4(s，0.51H，賴氨酸-CH)。

³¹P-NMR譜：(CDCl₃，ppm)：δ-0.014(s)，δ-5.551(s)。

示例15、[NP(MPEG550)_1.5(賴氨酸乙基)_0.2(賴氨酸乙基-2'-烏頭酸-多西紫杉醇)_0.3]_n的合成

根據(jù)與示例14中所述相同的方法，使用示例1的聚磷腈化合物(9.7g，10mmol)、前體(示例11的2'-烏頭酸多西紫杉醇NHS酯(3.18g，3.0mmol))和DIPEA(5ml)得到產(chǎn)率為90％的期望的標(biāo)題產(chǎn)物。

組成：C_112.4H₂₀₃N_4.6O_51.8P₂

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(53.48)；H(8.31)；N(2.64)。理論值：C(53.79)；H(8.15)；N(2.57)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：1.13ppm(s，0.9H，C17-CH₃)，1.24ppm(s，0.9H，C16-CH₃)，1.34ppm(bs，3.31H，C60-叔丁基)，1.75ppm(s，0.9H，C19-CH₃)，1.96ppm(s，0.9H，C18-CH₃)，2.18ppm(d，0.6H，C14-CH₂)，2.43ppm(s，0.9H，C22-CH₃)，4.21ppm(d，0.3H，C20-CH_a)，4.24ppm(m，0.3H，C7-CH)，4.32ppm(d，0.3H，C20-CH_b)，4.95ppm(dd，0.31H，C5-CH)，5.23ppm(d，0.3H，C10-CH)，5.40ppm(d，0.3H，C30-CH)，5.69ppm(d，0.3H，C2-CH)，7.51ppm(m，0.6H，C33，C27-CH)，7.53(m，1.8H，C32，C34-CH；C31，C35-CH；C26，C28-CH)，8.12(d，0.6H，C25，C29-CH)，1.24(s，1.5H，賴氨酸-OCH₂CH₃)，1.29(bs，1H，賴氨酸-CH₂)，1.55ppm(bs，1H，賴氨酸-CH2)，1.80(bs，1H，賴氨酸-CH₂)，2.90(br，1H，賴氨酸-e-CH₂)，3.38ppm(s，4.50H，CH₃O-，PEG)，和3.63ppm(m，66.0H，-CH₂CH₂-O-)，4.4(s，0.51H，賴氨酸-CH)。

³¹P-NMR譜：(CDCl₃，ppm)：δ-0.014(s)，δ-5.551(s)。

示例16、[NP(MPEG750)_1.5(賴氨酸乙基)_0.2(賴氨酸乙基-2'-烏頭酸-多西紫杉醇)_0.3]_n

根據(jù)與示例14中所述相同的方法，使用示例2的聚磷腈化合物(12.3g，10mmol)、前體(示例8的2'-烏頭酸多西紫杉醇NHS酯(5.3g，5.0mmol))和DIPEA(10ml)得到產(chǎn)率為89％的期望的標(biāo)題產(chǎn)物。

組成：C_136.4H₂₅₁N_4.6O_63.8P₂

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(53.27)；H(8.45)；N(2.31)。理論值：C(53.92)；H(8.33)；N(2.12)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：1.13ppm(s，0.9H，C17-CH₃)，1.24ppm(s，0.9H，C16-CH₃)，1.34ppm(bs，3.31H，C60-叔丁基)，1.75ppm(s，0.9H，C19-CH₃)，1.96ppm(s，0.9H，C18-CH₃)，2.18ppm(d，0.6H，C14-CH₂)，2.43ppm(s，0.9H，C22-CH₃)，4.21ppm(d，0.3H，C20-CH_a)，4.24ppm(m，0.3H，C7-CH)，4.32ppm(d，0.3H，C20-CH_b)，4.95ppm(dd，0.31H，C5-CH)，5.23ppm(d，0.3H，C10-CH)，5.40ppm(d，0.3H，C30-CH)，5.69ppm(d，0.3H，C2-CH)，7.51ppm(m，0.6H，C33，C27-CH)，7.53(m，1.8H，C32，C34-CH；C31，C35-CH；C26，C28-CH)，8.12(d，0.6H，C25，C29-CH)，1.24(s，1.5H，賴氨酸-OCH₂CH₃)，1.29(bs，1H，賴氨酸-CH₂)，1.55ppm(bs，1H，賴氨酸-CH2)，1.80(bs，1H，賴氨酸-CH₂)，2.90(br，1H，賴氨酸-ε-CH₂)，3.38ppm(s，4.50H，CH₃O-，PEG)，和3.63ppm(m，98.0H，-CH₂CH₂O-)，4.0(bs，4H，MPEG750-CH₂)，4.51(s，0.51H，賴氨酸-CH)。

³¹P-NMR譜：(CDCl₃，ppm)：δ-0.014(s)，δ-5.551(s)。

示例17、[NP(MPEG1000)_1.5(賴氨酸乙基)_0.2(賴氨酸乙基-2'-烏頭酸-多西紫杉醇)_0.3]_n

根據(jù)與示例14中所述相同的方法，使用示例3的聚磷腈化合物(15.6g，10mmol)、前體(示例11的2'-烏頭酸多西紫杉醇NHS酯(5.3g，5.0mmol))和DIPEA(10ml)得到產(chǎn)率為89％的期望的標(biāo)題產(chǎn)物。

組成：C_172.4H₃₂₃N_4.6O_48.2P₂

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(53.71)；H(8.74)；N(2.01)。理論值：C(54.04)；H(8.50)；N(1.68)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：1.13ppm(s，0.9H，C17-CH₃)，1.24ppm(s，0.9H，C16-CH₃)，1.34ppm(bs，3.31H，C60-叔丁基)，1.75ppm(s，0.9H，C19-CH₃)，1.96ppm(s，0.9H，C18-CH₃)，2.18ppm(d，0.6H，C14-CH₂)，2.43ppm(s，0.9H，C22-CH₃)，4.21ppm(d，0.3H，C20-CH_a)，4.24ppm(m，0.3H，C7-CH)，4.32ppm(d，0.3H，C20-CH_b)，4.95ppm(dd，0.31H，C5-CH)，5.23ppm(d，0.3H，C10-CH)，5.40ppm(d，0.3H，C30-CH)，5.69ppm(d，0.3H，C2-CH)，7.51ppm(m，0.6H，C33，C27-CH)，7.53(m，1.8H，C32，C34-CH；C31，C35-CH；C26，C28-CH)，8.12(d，0.6H，C25，C29-CH)，1.24(s，1.5H，賴氨酸-OCH₂CH₃)，1.29(bs，1H，賴氨酸-CH₂)，1.55ppm(bs，1H，賴氨酸-CH₂)，1.80(bs，1H，賴氨酸-CH₂)，2.90(br，1H，賴氨酸-ε-CH₂)，3.38ppm(s，4.50H，MPEG-CH₃O-)，和3.63ppm(m，128H，MPEG-CH₂CH₂O)，4.0(bs，4H，MPEG1000-CH₂)，4.51(s，0.51H，賴氨酸-CH)。

³¹P-NMR譜：(CDCl₃，ppm)：δ-0.014(s)，δ-5.551(s)。

示例18、[NP(MPEG550)_1.5(賴氨酸乙基)_0.2(賴氨酸乙基-2'-烏頭酸-多西紫杉醇)_0.5]_n的合成

根據(jù)與示例14中所述相同的方法，使用示例5的聚磷腈化合物(7.7g，10mmol)、前體(示例8的2'-烏頭酸多西紫杉醇NHS酯(6.36g，6.0mmol))和DIPEA(10ml)得到產(chǎn)率為89％的期望的標(biāo)題產(chǎn)物。

組成：C₁₁₅H₁₉₁N₇O₄₈P₂

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(54.92)；H(8.01)；N(3.99)。理論值：C(55.21)；H(7.70)；N(3.92)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：1.13ppm(s，0.9H，C17-CH₃)，1.24ppm(s，0.9H，C16-CH₃)，1.34ppm(bs，3.31H，C60-叔丁基)，1.75ppm(s，0.9H，C19-CH₃)，1.96ppm(s,0.9H，C18-CH₃)，2.18ppm(d，0.6H，C14-CH₂)，2.43ppm(s，0.9H，C22-CH₃)，4.21ppm(d，0.3H，C20-CH_a)，4.24ppm(m，0.3H，C7-CH)，4.32ppm(d，0.3H，C20-CH_b)，4.95ppm(dd，0.31H，C5-CH)，5.23ppm(d，0.3H，C10-CH)，5.40ppm(d，0.3H，C30-CH)，5.69ppm(d，0.3H，C2-CH)，7.51ppm(m，0.6H，C33，C27-CH)，7.53(m，1.8H，C32，C34-CH；C31，C35-CH；C26，C28-CH)，8.12(d，0.6H，C25，C29-CH)，1.24(s，3.0H，賴氨酸-OCH₂CH₃)，1.29(bs，2H，賴氨酸-CH₂)，1.55ppm(bs，2H，賴氨酸--CH2)，1.80(bs，2H，賴氨酸-CH₂)，2.90(br，2H，賴氨酸-e-CH₂)，3.38ppm(s，3.00H，CH₃O-，PEG)，和3.63ppm(m，44.0H，-CH₂CH₂-O-)，4.4(s，0.51H，賴氨酸-CH)。

³¹P-NMR譜：(CDCl₃，ppm)：δ-0.014(s)，δ-5.551(s)。

示例19、[NP(MPEG550)_1.5(甘氨酸賴氨酸乙基)_0.2(甘氨酸賴氨酸乙基-2'-烏頭酸-多西紫杉醇)_0.3]_n的合成

根據(jù)與示例14中所述相同的方法，使用示例6的聚磷腈化合物(10.4g，10mmol)、前體(示例10的2'-烏頭酸多西紫杉醇NHS酯(5.3g，5.0mmol))和DIPEA(10ml)得到產(chǎn)率為89％的期望的標(biāo)題產(chǎn)物。

組成：C_114.4H₂₀₆N_5.6O_52.8P₂

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(52.98)；H(8.23)；N(3.19)。理論值：C(53.53)；H(8.09)；N(3.06)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：1.13ppm(s，0.9H，C17-CH₃)，1.24ppm(s，0.9H，C16-CH₃)，1.34ppm(bs，3.31H，C60-叔丁基)，1.75ppm(s，0.9H，C19-CH₃)，1.96ppm(s，0.9H，C18-CH₃)，2.18ppm(d，0.6H，C14-CH₂)，2.43ppm(s，0.9H，C22-CH₃)，4.21ppm(d，0.3H，C20-CH_a)，4.24ppm(m，0.3H，C7-CH)，4.32ppm(d，0.3H，C20-CH_b)，4.95ppm(dd，0.31H，C5-CH)，5.23ppm(d，0.3H，C10-CH)，5.40ppm(d，0.3H，C30-CH)，5.69ppm(d，0.3H，C2-CH)，7.51ppm(m，0.6H，C33，C27-CH)，7.53(m，1.8H，C32，C34-CH；C31，C35-CH；C26，C28-CH)，8.12(d，0.6H，C25，C29-CH)，1.24(s，1.5H，賴氨酸-OCH₂CH₃)，1.29(bs，1H，賴氨酸-CH₂)，1.55ppm(bs，1H，賴氨酸-CH2)，1.80(bs，1H，賴氨酸-CH₂)，2.90(br，1H，賴氨酸-e-CH₂)，3.38ppm(s，4.50H，CH₃O-，PEG)，和3.63ppm(m，66.0H，-CH₂CH₂-O-)，3.98(bs，2H，甘氨酸-CH₂)，4.4(s，0.51H，賴氨酸-CH)。

³¹P-NMR譜：(CDCl₃，ppm)：δ-0.014(s)，δ-5.551(s)。

示例20、[NP(MPEG550)_1.50(賴氨酸乙基)_0.2(賴氨酸乙基-2'-琥珀酰基紫杉醇)_0.3]_n的合成

通過使用DCL(2.54g，20mmol)和DIPEA(10ml)，將示例1的聚磷腈化合物(9.7g，10mmol)與通過文獻(xiàn)方法(C.-M.Huang等，Chem.Biol.2000，7，453-461)制備的2'-琥珀酰基紫杉醇(5.26g，5.0mmol)進(jìn)行酯化反應(yīng)，得到產(chǎn)率為90％的期望的標(biāo)題產(chǎn)物。

組成：C_113.6H₂₀₂N_4.6O_51.8P₂

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(54.15)；H(8.26)；N(2.61)。理論值：C(54.49)；H(8.12)；N(2.57)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：1.25(s，1.5H，賴氨酸-OCH₂CH₃)，2.49(br，1.00H，琥珀?；?CH₂)，2.90(br，1.00H，賴氨酸-ε-CH₂)，3.38(s，4.50H，MPEG550-OCH₃)，3.65(br，66.0H，MPEG550-OCH₂CH₂)，1.13(s，12H)，1.25(s，12H)，1.35(s，36H)，1.68(m，8H)，1.75(s，12H)，1.86(m，8H)，1.96(s，12H)，2.36(m，20H)，2.60(m，4H)，3.98(s，8H)，4.06(d，8H)，4.30(m，12H)，4.33(m，8H)，4.97(d，4H)，5.22(m，4H)，5.36(s，4H)，5.60(m，4H)，5.69(m，8H)，6.20(t，4H)，7.33(m，8H)，7.41(m，8H)，7.52(m，8H)，7.61(m，4H)，7.33(m，4H)，8.12(d，8H)。

³¹P-NMR譜：(CDCl₃，ppm)：δ-0.014(s)，δ-5.551(s)。

示例21、[NP(MPEG550)_1.50(賴氨酸乙基)_0.2(賴氨酸乙基-2'-琥珀?；仙即?_0.50]_n的合成

根據(jù)與示例20中所述相同的方法，通過使用DCL(2.54g，20mmol)和DIPEA(10ml)，將示例6的聚磷腈化合物(10.4g，10mmol)與通過文獻(xiàn)方法(C.-M.Huang等人，Chem.Biol.2000，7，453-461)制備的2'-琥珀?；仙即?7.36g，7.0mmol)進(jìn)行酯化反應(yīng)，得到產(chǎn)率為80％的期望的標(biāo)題產(chǎn)物。

組成：C₁₃₆H₂₂₆N₆O₅₈P₂

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(55.36)；H(7.99)；N(2.93)。理論值：C(55.67)；H(7.76)；N(2.86)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：1.25(s，1.5H，賴氨酸-OCH₂CH₃)，2.49(br，1.00H，琥珀?；?CH₂)，2.90(br，1.00H，賴氨酸-ε-CH₂)，3.38(s，4.50H，MPEG550-OCH₃)，3.65(br，66.0H，MPEG550-OCH₂CH₂)，1.13(s，12H)，1.25(s，12H)，1.35(s，36H)，1.68(m，8H)，1.75(s，12H)，1.86(m，8H)，1.96(s，12H)，2.36(m，20H)，2.60(m，4H)，3.98(s，8H)，4.06(d，8H)，4.30(m，12H)，4.33(m.8H)，4.97(d，4H)，5.22(m，4H)，5.36(s，4H)，5.60(m，4H)，5.69(m，8H)，6.20(t，4H)，7.33(m，8H)，7.41(m，38H)，7.52(m，8H)，7.61(m，4H)，7.33(m，4H)，8.12(d，8H)。

³¹P-NMR譜：(CDCl₃，ppm)：δ-0.014(s)，δ-5.551(s)。

示例22、[NP(MPEG550)_1.50(N_α-Boc賴氨酸)_0.2(N_α-Boc賴氨酸-多西紫杉醇)₀₃]_n的合成

將示例7的聚磷腈化合物(9.57g，10.0mmol)和多西紫杉醇(10.6g，10.0mmol)真空干燥，然后在反應(yīng)容器中將其溶解于四氫呋喃、二氯甲烷或氯仿的干燥溶劑中，進(jìn)行冰浴冷卻后向其中加入溶解在相同溶劑中的催化劑DCl(2.54g，20mmol)和DIPEA(10ml)。將反應(yīng)混合物在冰溫下反應(yīng)24h后，將反應(yīng)溶液減壓過濾并將濾液真空干燥。將所得產(chǎn)物用示例14中相同的方法純化，得到產(chǎn)率為60％的標(biāo)題化合物。

組成：C_113.8H_204.2N_4.6O_50.8P₂

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(55.06)；H(7.98)；N(2.60)。理論值：C(54.42)；H(8.19)；N(2.57)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：1.25(s，1.5H，賴氨酸-OCH₂CH₃)，2.49(br，1.00H，琥珀?；?CH₂)，2.90(br，1.00H，賴氨酸-ε-CH₂)，3.38(s，4.50H，MPEG550-OCH₃)，3.65(br，66.0H，MPEG550-OCH₂CH₂)，1.13(s，12H)，1.25(s，12H)，1.35(s，36H)，1.68(m，8H)，1.75(s，12H)，1.86(m，8H)，1.96(s，12H)，2.36(m，20H)，2.60(m，4H)，3.98(s，8H)，4.06(d，8H)，4.30(m，12H)，4.33(m.8H)，4.97(d，4H)，5.22(m，4H)，5.36(s，4H)，5.60(m，4H)，5.69(m，8H)，6.20(t，4H)，7.33(m，8H)，7.41(m，8H)，7.52(m，8H)，7.61(m，4H)，7.33(m，4H)，8.12(d，8H)。

³¹P-NMR譜：(CDCl₃，ppm)：δ-0.014(s)，δ-5.551(s)。

示例23、[NP(MPEG550)_1.5(賴氨酸乙基)_0.2(賴氨酸乙基-2'-烏頭酸-喜樹堿)_0.3]_n的合成

根據(jù)與示例14的相同方法，將示例1的聚磷腈化合物(9.7g，10mmol)和示例12的2'-烏頭酸-喜樹堿-NHS酯(2.5g，5.03mmol)反應(yīng)，得到產(chǎn)率為75％的所需的標(biāo)題化合物。

組成：C_98.6H_180.8N_5.2O_45.8P₂

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(52.61)；H(8.42)；N(3.34)。理論值：C(53.01)；H(8.16)；N(3.26)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：0.9(t，3H，C18-CH3)，2.0(m，2H，C19-CH₂，2.64(t，4H，NHS-CH₂CH₂)，2.92(s，2H，烏頭酸-CH₂)，4.20(d，2H，C5-CH₂)，4.76(m，2H，C22-CH₂)，6.40-6.68(m，1H，烏頭酸-CH)，6.70(s，1H，C14-CH)，7.59(s，1H，C11-CH)，7.80(m，2H，C12-CH；C7-CH)，8.0(m，2H，C9-CH；C12-CH)，1.24(s，1.5H，賴氨酸-OCH₂CH₃)，1.29(bs，1H，賴氨酸-CH₂)，1.55ppm(bs，1H，賴氨酸-CH2)，1.80(bs，39 1H，賴氨酸-CH₂)，2.90(br，1H，賴氨酸-e-CH₂)，3.38ppm(s，4.50H，CH₃O-，PEG)，和3.63ppm(m，66.0H，-CH₂CH₂-O-)，4.4(s，0.51H，賴氨酸-CH)。

³¹P-NMR譜：(CDCl₃，ppm)：δ-0.014(s)，δ-5.551(s)。

示例24、[NP(MPEG550)(賴氨酸乙基)_0.2(烏頭酸-甘氨酰喜樹堿)]_n的合成

根據(jù)與示例14中所述相同的方法，將示例5的聚磷腈化合物(0.5g，0.25mmol)和前體(示例13的2'-烏頭酸-甘氨酸喜樹堿(0.17g，0.25mmol))和DIPEA(10ml)制備出產(chǎn)率為85％的期望的標(biāo)題化合物。

組成：C₁₁₁H₁₉₁N₇O₅₀P₂

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：0.89-0.92(brm，3H，CPT-C18的-CH₃)，1.13-1.58(brm，6H，賴氨酸的-CH₂)，2.12-2.17(brm，2H，CPT-C-19的-CH₂)，3.01(s，2H，順式烏頭酸鹽的-CH₂)，3.21(s，9H，MPEG的-OCH₃)，3.34-3.54(brm，144H，MPEG的-CH_2-CH₂)，3.94-4.41(brm，5H，甘氨酸的-CH₂，賴氨酸的P-NH-CH₂和順式烏頭酸鹽的＝CH)，5.29(brs，2H，CPT-C5的-CH₂)，5.47(brs，2H，CPT-C22的-CH₂)，7.15-7.17(m，1H，CPT-C14的＝CH)，7.69-7.72(m，1H，CPT-C11的＝CH)，7.84-7.94(m，1H，CPT-C10的＝CH)，8.10-8.21(m，2H，CPT-C12和CPT-C9的＝CH)，8.68(brs，1H，CPT-C7的＝CH)。

³¹P-NMR(DMSO，ppm)：δ-5.19(O-P-O)，0.85(O-P-N)。

示例25、[NP(MPEG550)(AE)(ACA)Pt(dach)]_n的合成

將示例8的聚磷腈載體聚合物[NP(MPEG550)(AE)]_n(1g，1.5mmol)溶解于碳酸氫鈉水溶液(pH＝9.0)中，并加入連接基團(tuán)順式烏頭酸酐(ACA)(2.35g，15mmol)，在4℃下進(jìn)一步反應(yīng)5h。使用纖維素膜(MWCO：3.5kDa)對反應(yīng)混合物進(jìn)行透析，得到具有連接基團(tuán)的新型聚磷腈中間體[NP(MPEG550)(AE)(ACA)]_n。將氫氧化鋇(1.33mmol)的甲醇溶液(20ml)加入到經(jīng)過透析的溶液中，并將反應(yīng)混合物進(jìn)一步攪拌5h，以將酸性連接基團(tuán)轉(zhuǎn)化為聚合物的鋇鹽。將反應(yīng)溶液真空蒸發(fā)直至干燥。將固體聚合物溶解于蒸餾水(10ml)中，向該聚合物溶液中緩慢加入(dach)Pt(SO₄)(dach：反式±1,2-二氨基環(huán)己烷)(0.49g，1.21mmol)的水溶液(10ml)，并將反應(yīng)混合物進(jìn)一步攪拌3h。過濾掉硫酸鋇沉淀物后，將濾液用纖維素膜(MWCO：3.5kDa)透析、凍干，得到產(chǎn)率為74％的新型聚磷腈-奧沙利鉑偶聯(lián)物藥物。

組成：C₃₉H₇₃N₄O₁₉PPt·H₂O

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(40.54)；H(6.34)；N(4.62)。理論值：C(40.83)；H(6.54)；N(4.88)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：1.04-1.20(brm，4H，dach的C-4和C-5)，1.44(brs，2H，dach的C-3)，1.82-1.93(brm，2H，dach的C-6)，2.02-2.52(brm，2H，C-1，dach的C-2)，3.26(s，3H，MPEG的OCH₃)，3.41-3.45(m，6H，順式烏頭酸鹽和氨基乙醇的CH₂)，3.47-3.81(brm，46H，MPEG的-O-CH₂)，3.95-4.21(brm，2H，MPEG的-P-O-CH₂-)，4.69(s，1H，順式烏頭酸鹽的-C＝CH)。

³¹P-NMR(DMSO，ppm)：-4.53(O-P-O)。

示例26、[NP(MPEG750)(AE)(ACA)Pt(dach)]_n的合成

根據(jù)示例25中所述相同的方法，使用示例9的聚磷腈化合物(1.0g，11.91mmol)、順式烏頭酸酐(1.86g，1.191mmol)、Ba(OH)₂·8H₂O(0.35g，1.11mmol)和(dach)PtSO₄(0.4g，0.99mmol)制備得到產(chǎn)率為72％的所期望的標(biāo)題化合物。

組成：C₄₇H₈₉N₄O₂₃PPt·H₂O

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(42.32)；H(7.64)；N(3.88)。理論值：C(42.65)；H(6.88)；N(4.23)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：1.05-1.21(brm，4H，dach的C-4和C-5)，1.47(brs，2H，dach的C-3)，1.80-1.93(brm，2H，dach的C-6)，2.01-2.45(brm，2H，dach的C-1和C-2)，3.27(s，3H，MPEG的-OCH₃)，3.41-3.45(m，6H，順式烏頭酸鹽和氨基乙醇的-CH₂)，3.50-3.72(brm，62H，MPEG的-CH₂)，3.99-4.13(brm，2H，MPEG的-P-O-CH₂)，4.70(s，₁H，順式烏頭酸鹽的-C＝CH)。

³¹P-NMR(DMSO，ppm)：-4.52(O-P-O)。

示例27、[NP(MPEG550)(賴氨酸乙醇)(ACA)Pt(dach)]_n的合成

根據(jù)示例25中所述相同的方法，使用示例5的聚磷腈化合物(1.0g，1.28mmol)、順式烏頭酸酐(2g，1.191mmol)、Ba(OH)₂·8H₂O(0.44g，1.39mol)和(dach)PtSO₄(0.52，1.28mmol)制備得到產(chǎn)率為79％的所期望的標(biāo)題化合物。

組成：C₄₅H₈₄N₅O₂₀PPt·H₂O

元素分析數(shù)據(jù)(％)：C(42.63)；H(6.61)；N(5.42)。理論值：C(42.88)；H(6.83)；N(5.56)。

¹H-NMR譜(CDCl₃)(δ，ppm)：1.07-1.21(brm，7H，賴氨酸的-CH₃和(CH₂)₂)，1.43-1.48(brm，6H，dach的-C-3、-C-4和C-5)，1.80-1.93(brm，8H，賴氨酸的-CH₂和dach的-C-6)，2.02-2.26(brm，2H，dach的C-1和C-2)，2.82(brs，2H，順式烏頭酸鹽的CH₂)，3.26(s，3H，MPEG的-OCH₃)，3.44-3.72(brm，46H，MPEG的-CH₂-CH₂)，3.96-4.03(brm，3H，乙酯的CH₂和賴氨酸的-N-CH)，4.62(s，1H，順式烏頭酸鹽的＝CH)。

物理化學(xué)性質(zhì)和藥效的測量

實(shí)驗(yàn)1、粒徑和膠束形成

將示例1的聚磷腈載體化合物和示例11的聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物分別溶解于蒸餾水(0.2％)中，并通過DLS(動態(tài)光散射)方法測量其粒徑分布和ζ電位，結(jié)果示于圖1、2和3。

圖1示出了聚磷腈載體聚合物的粒徑分布，其平均直徑為約3～4nm，對應(yīng)于未組裝的聚合物的流體動力學(xué)體積的粒徑，這可能是由于聚合物的賴氨酸胺基團(tuán)的陽離子性質(zhì)，如圖2所示。然而，如圖3所示，聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物的粒徑增加到60nm，這清楚地表明，由于通過將引入疏水多西紫杉醇分子引入到載體聚合物而導(dǎo)致偶聯(lián)分子產(chǎn)生兩親性，偶聯(lián)藥物分子自組裝形成了較大的膠束納米顆粒。進(jìn)一步證實(shí)在5～70℃的溫度范圍內(nèi)膠束尺寸沒有顯著變化。

實(shí)驗(yàn)2、聚磷腈-紫杉醇偶聯(lián)物的臨界膠束濃度(CMC)的測量。

如上所述，本發(fā)明的聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物在水溶液中形成聚合膠束。為了將這種聚合物-藥物偶聯(lián)物在臨床上用于IV注射，由聚合物-藥物偶聯(lián)物自組裝的膠束的溶液穩(wěn)定性是關(guān)鍵的。這種膠束穩(wěn)定性用“臨界膠束濃度(CMC)”表示，其通過多種方法測量，但最廣泛使用的方法是“芘熒光法”(K.Kalyanasundoram等人，J.Am.Chem.Soc.1988，99，2039)。根據(jù)該方法，本發(fā)明的聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物的CMC值的測量如下：

制備芘水溶液(6×10^-7M)，并使用該溶液制備一系列濃度范圍為5.0～0.0005％(重量/重量)的示例17的聚磷腈-紫杉醇偶聯(lián)物的樣品溶液。在339nm(I_ex)和390nm(I_em)處測量熒光光譜，然后，如圖4所示，根據(jù)譜帶I和譜帶III的熒光強(qiáng)度的比率，測定CMC的值。

由此獲得的聚磷腈-紫杉醇偶聯(lián)物的CMC值為41mg/L，其非常低，并且當(dāng)靜脈注射時(shí)，在血液系統(tǒng)中聚合物膠束將會是穩(wěn)定的。

實(shí)驗(yàn)3、聚磷腈-藥物偶聯(lián)物的生物可降解性。

儀器：Yonglin GPC系統(tǒng)

柱：Waters水凝膠HR柱(1×保護(hù)，1×線性，2×HR2)

流出物：水/乙腈(8:2)(0.5％NaNO₃)

流速：1ml/min

通過將示例17的聚磷腈-紫杉醇偶聯(lián)物(250mg)溶解在pH＝5.4的緩沖溶液(5ml)和另一種pH＝7.4的緩沖溶液(5ml)中，制備出兩種樣品溶液。在37℃下將兩種樣品溶液在水浴中緩慢振蕩，并且在預(yù)定的時(shí)間(培養(yǎng)后0.5、1、2、4、6、8、16天)取500μl樣品溶液并凍干。將干燥的樣品溶解在含有0.2％叔丁基溴化銨的四氫呋喃中，并經(jīng)過凝膠滲透色譜分析(GPC)。根據(jù)GPC數(shù)據(jù)，在圖5中示出了聚磷腈-紫杉醇偶聯(lián)藥物的降解模式。

從圖中可以看出，聚磷腈偶聯(lián)藥物的平均分子量首先在幾天內(nèi)快速下降，但是特別在中性介質(zhì)下其降解降低。預(yù)計(jì)聚磷腈主鏈在血液系統(tǒng)中的半衰期為約16天，但最令人鼓舞的是，聚磷腈主鏈在酸性介質(zhì)中是連續(xù)可降解的，這類似于與藥物釋放動力學(xué)相關(guān)的腫瘤微環(huán)境。在本發(fā)明中，將所有最終聚合物產(chǎn)物分級成不同的分子量，研究它們的生物降解性、排泄性和藥物釋放動力學(xué)。

實(shí)驗(yàn)4、通過成像研究聚磷腈化合物的腫瘤靶向性

儀器：Kodak成像站4000mm電子成像系統(tǒng)(Kodak，New Haven，CT)

激發(fā)和發(fā)射過濾器：Omega Optical，Battlebor，VT(激發(fā)：560nm，發(fā)射：700nm)

購買十只八周齡的CH3/HeN裸鼠(東京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)研究所)，并在用非小細(xì)胞肺癌A549(1×10₆)接種適應(yīng)一周后。當(dāng)腫瘤尺寸生長至約300mm³時(shí)，將小鼠分為兩組，一組注射用熒光染料Cy5.5標(biāo)記的示例1的聚磷腈載體化合物，另一組不作處理作為參照組。在預(yù)定時(shí)間(IV注射后12h，24h，48h，72h)，處死小鼠，分離全部主要器官(肝、肺、腎、脾、腫瘤、肌肉)，利用CCD相機(jī)進(jìn)行NIR熒光成像(Kodak成像站4000MM)研究，結(jié)果示于圖6中。

從圖中器官的熒光強(qiáng)度，與其它器官相比，示例1的聚磷腈化合物清楚地顯示出其主要聚積在腫瘤組織中，盡管其具有3-4nm的小粒徑而不能產(chǎn)生EPR效應(yīng)。因此，可以推測出，該聚磷腈載體聚合物的腫瘤選擇性是由于聚合物的賴氨酸游離胺導(dǎo)致其所具有的陽離子性質(zhì)和由于其PEG化結(jié)構(gòu)而引起的長血液循環(huán)。

實(shí)驗(yàn)5、聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)藥物的腫瘤靶向性

示例12的聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物用Cy5.5標(biāo)記，并且以與實(shí)驗(yàn)4(圖7)相同的方式比較其器官分布。通過將用Cy5.5標(biāo)記的偶聯(lián)藥物處理的小鼠的每個(gè)器官的熒光強(qiáng)度與未處理的小鼠的每個(gè)器官的熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較，獲得偶聯(lián)藥物的定量生物分布數(shù)據(jù)，結(jié)果示于圖8中。

圖7顯示出偶聯(lián)藥物主要在腫瘤中聚積，并且特別地，該聚積在注射后48h后達(dá)到最大值，這可能是由于偶聯(lián)物的較大粒度(60nm)的EPR效應(yīng)(提高的滲透性和滯留效應(yīng))和長血液循環(huán)。圖8所示的聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)藥物的生物分布的定量數(shù)據(jù)清楚地顯示，與之前的聚磷腈載體聚合物由于其陽離子性造成的腫瘤選擇性相比，該偶聯(lián)藥物的腫瘤選擇性要高得多，這是由于其大粒徑的EPR效應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)6、聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物中多西紫杉醇含量的分析。

聚磷腈-藥物偶聯(lián)物中藥物組分的含量可以通過¹H NMR光譜、UV光譜或HPLC測定。在質(zhì)子NMR光譜法中，偶聯(lián)藥物中的多西紫杉醇含量可以從接枝到聚合物主鏈的PEG基團(tuán)在3.4ppm(3H-CH₃)處的甲氧基質(zhì)子與被偶聯(lián)的多西紫杉醇在7.33ppm(C10，2H)處的C10質(zhì)子的積分面積之比估算而得。然而，甲氧基質(zhì)子和多西紫杉醇C10質(zhì)子的化學(xué)位移都與相鄰的質(zhì)子峰輕微重疊，這影響了積分比的準(zhǔn)確性。在HPLC方法中，通過酸性分解從偶聯(lián)藥物中釋放出的游離多西紫杉醇的總量可以通過HPLC來測量，但是不能得到可重復(fù)的結(jié)果。

另一方面，使用UV光譜法可以獲得可重復(fù)的結(jié)果，因?yàn)槎辔髯仙即挤肿釉?30nm處顯示出強(qiáng)的UV吸收，而聚磷腈載體聚合物在約230nm處幾乎沒有吸收。因此，使用水和乙腈(1:1)的溶劑混合物(多西紫杉醇在其中可完全溶解)測量的校準(zhǔn)曲線。通過使用10.0mg多西紫杉醇/10ml溶劑混合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液及其稀釋溶液(1mg/ml，1/2mg/ml等)在230nm處測量的UV吸收而得到校準(zhǔn)曲線。

實(shí)驗(yàn)7、從聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物的體外藥物釋放

儀器：配備DAD檢測器(230nm)的Agilent 1100系列

柱：Agilent Zobax Eclipse Plus C18柱(直徑＝4.6mm；長度＝150mm，粒徑＝3.5μm)

流速：1.p ml/min

洗脫液組成：A：含0.1％TFA的H₂O；B：乙腈(等度法)

使用HPLC方法進(jìn)行聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物的體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)。使用與實(shí)驗(yàn)6相同的方式得到的校準(zhǔn)曲線測定從偶聯(lián)物釋放的藥物多西紫杉醇的量。

實(shí)驗(yàn)8、聚磷腈-紫杉醇偶聯(lián)物的細(xì)胞毒性的體外試驗(yàn)。

眾所周知，由于抗癌劑紫杉醇是在臨床上對許多不同的癌癥非常有效，選擇乳腺癌(MCF-7)、卵巢癌(SK-OV3)、非小細(xì)胞肺癌(A549)和胃癌(SNU638)癌細(xì)胞系，根據(jù)文獻(xiàn)方法(SRB方法)(Rita Song等人，J.Control.Release 105(2005)142-150)測試其體外細(xì)胞毒性。

結(jié)果示于下表1中。從表中可以看出，示例20和21的聚磷腈-紫杉醇偶聯(lián)物的IC_50值比游離紫杉醇高得多，因?yàn)樵诰哿纂?紫杉醇偶聯(lián)物降解后，疏水性紫杉醇組分非常難以從聚合物膠束核中釋放出來。

表1聚磷腈-紫杉醇偶聯(lián)物的體外細(xì)胞毒性

實(shí)驗(yàn)9、聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物的藥代動力學(xué)研究。

為了檢測示例12的聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物相比于目前臨床使用的非偶聯(lián)而配制的“泰索帝”的藥代動力學(xué)，采用Sprague-Dawley大鼠根據(jù)文獻(xiàn)方法(Jun等人，Int.J.Pharm.422(2012)374-380)對偶聯(lián)物進(jìn)行藥代動力學(xué)研究。時(shí)間依賴性血漿濃度示于圖9，藥代動力學(xué)參數(shù)示于表2中。

表2示例14和作為參照的泰索帝的藥代動力學(xué)參數(shù)

實(shí)驗(yàn)10、聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物的裸鼠異種移植試驗(yàn)。

為了評價(jià)示例12相比于作為參照的泰索帝體外效應(yīng)，根據(jù)文獻(xiàn)方法(Y.J.Jun等人，Int J.Pharm.422(2012)374-380)，使用BALB/C裸鼠進(jìn)行針對胃癌細(xì)胞系MKN-28的裸鼠異種移植試驗(yàn)。由于泰索帝的已知最佳劑量為10mg/kg，基于聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物中多西紫杉醇的含量，將示例14的一次注射劑量確定為10mg/kg和20mg/kg，給藥三次(第1、5、9天)。從第一次注射開始至40天，測量每個(gè)的腫瘤尺寸和體重。圖10示出對MKN-28胃癌腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性，圖11示出了40天內(nèi)的體重變化。從圖10中可以看出，聚磷腈-多西紫杉醇偶聯(lián)物顯示出與泰索帝相當(dāng)?shù)膹?qiáng)抗腫瘤活性，更重要的結(jié)果可以從圖11看出，在藥物注射期間用泰索帝處理的小鼠的平均體重顯著降低(>10％)，而對于偶聯(lián)藥物卻沒有觀察到顯著的體重變化，這意味著本發(fā)明的偶聯(lián)藥物顯示較低的全身毒性。對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549進(jìn)行的異種移植試驗(yàn)的結(jié)果示于圖12，其顯示處本發(fā)明的偶聯(lián)藥物表現(xiàn)出甚至比參照泰索帝更好的抗腫瘤活性。