本發(fā)明屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種MALDI-TOF-MS檢測(cè)小分子化合物的方法及富勒烯標(biāo)記物作為質(zhì)荷比位移試劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)自上個(gè)世紀(jì)八十年代末期被發(fā)展以來，已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)，糖類，核酸，多肽等生物大分子以及高分子聚合物的結(jié)構(gòu)分析與分子量測(cè)定。MALDI-TOF MS具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快、通量高、抗干擾能力強(qiáng)、有機(jī)溶劑消耗少和樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)。但是，由于傳統(tǒng)的MALDI-TOF MS基質(zhì)主要為低分子量的有機(jī)酸例如：α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，α-CHCA)，2,5-二羥基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB)，芥子酸(sinapinic acid，SA)，煙酸等，它們?nèi)菀自诘头肿恿繀^(qū)域(<500Da)產(chǎn)生大量基質(zhì)信號(hào)峰，干擾小分子分析物的檢測(cè)。為克服這一缺點(diǎn)，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的解決策略主要分為兩類：1)開發(fā)基質(zhì)干擾小的基質(zhì)，比如多孔硅、納米微球、金屬氧化物、碳材料等，但新的基質(zhì)對(duì)分析小分子具有一定的局限性，只針對(duì)部分特定的小分子有作用，目前依然沒有一種方便、廣泛適用的基質(zhì)被開發(fā)出來；2)利用化學(xué)衍生的辦法，設(shè)計(jì)大分子衍生化試劑衍生小分子待測(cè)物，使其質(zhì)荷比遠(yuǎn)離背景干擾區(qū)，但現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的衍生化試劑通常需要很繁瑣的制備過程，并且有一定局限性。因此，在使用MALDI-TOF-MS分析小分子化合物時(shí)迫切需要發(fā)展一種簡(jiǎn)便的、高靈敏度、普適的衍生方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足而提供一種MALDI-TOF-MS檢測(cè)小分子化合物的方法及富勒烯標(biāo)記物作為位移試劑的應(yīng)用，將小分子化合物通過富勒烯標(biāo)記物衍生后，能克服MALDI-TOF-MS分析中低分子量區(qū)域的干擾，顯著改善小分子化合物在質(zhì)譜譜圖中的辨識(shí)度，極大地提高了其在質(zhì)譜中的檢測(cè)靈敏度。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所提出的技術(shù)方案為：

富勒烯標(biāo)記物作為質(zhì)荷比位移試劑(m/z位移試劑)在MALDI-TOF-MS中檢測(cè)小分子化合物的應(yīng)用。

一種MALDI-TOF-MS檢測(cè)小分子化合物的方法，以富勒烯標(biāo)記物作為質(zhì)荷比位移試劑。

按上述方案，所述富勒烯標(biāo)記物為富勒烯衍生物，含有能與小分子化合物反應(yīng)的活性基團(tuán)即可，所述活性基團(tuán)如-COCl基團(tuán)、-N＝C＝S基團(tuán)、-CO-NHS基團(tuán)等等。

按上述方案，本發(fā)明中所述的小分子化合物的質(zhì)荷比<500Da。

按上述方案，本發(fā)明中所述的小分子化合物可以為氨基小分子化合物、羥基小分子化合物等。

按上述方案，所述氨基小分子化合物可以為氨基酸、脂肪胺、芳香胺等，所述羥基小分子化合物為脂肪醇與酚類化合物等，如甲醇、乙醇、苯酚。

一種MALDI-TOF-MS檢測(cè)小分子化合物的方法，包括如下步驟：

1)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制一系列不同濃度的小分子化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并用富勒烯標(biāo)記物進(jìn)行衍生化反應(yīng)，所得標(biāo)準(zhǔn)品衍生產(chǎn)物中加入內(nèi)標(biāo)物后進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，然后以小分子化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品衍生產(chǎn)物與內(nèi)標(biāo)物峰強(qiáng)度比值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；

2)將富勒烯標(biāo)記物與小分子化合物待測(cè)品進(jìn)行衍生化反應(yīng)，所得待測(cè)品衍生產(chǎn)物中加入內(nèi)標(biāo)物后進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，得到待測(cè)品衍生產(chǎn)物的質(zhì)譜圖，將待測(cè)品衍生產(chǎn)物與內(nèi)標(biāo)物峰強(qiáng)度比值代入步驟1)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線中，進(jìn)而計(jì)算得到小分子化合物待測(cè)品的濃度。

按上述方案，所述內(nèi)標(biāo)物為含有羧酸基團(tuán)、結(jié)構(gòu)與衍生產(chǎn)物類似且不相同即可。

優(yōu)選地，所述小分子化合物為氨基小分子化合物時(shí)，所述富勒烯標(biāo)記物其結(jié)構(gòu)如式1所示，所述內(nèi)標(biāo)物結(jié)構(gòu)如式2所示；所述小分子化合物為羥基小分子化合物時(shí)，所述富勒烯標(biāo)記物其結(jié)構(gòu)如式3所示，所述內(nèi)標(biāo)物結(jié)構(gòu)如式4所示；

按上述方案，所述步驟1)中小分子化合物為一種或幾種。

按上述方案，所述步驟1)中小分子化合物的濃度范圍是0.7-100μM。

按上述方案，所述步驟1)中小分子化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液與富勒烯標(biāo)記物濃度比為1：(2-4)。

按上述方案，所述步驟2)中富勒烯標(biāo)記物的加入量與步驟1)相同。

按上述方案，所述步驟1)和步驟2)中衍生化反應(yīng)的條件：溶劑為可將待測(cè)物與富勒烯標(biāo)記物溶解的即可，反應(yīng)條件為弱堿性，溫度在20-70℃，時(shí)間為0.5-2h。其中，溶劑可以采用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲苯等有機(jī)溶劑，弱堿性條件可以由三乙胺、氨水、4-二甲氨基吡啶等提供。該衍生化反應(yīng)完成后，需要加入酸調(diào)節(jié)衍生產(chǎn)物的pH為中性，該酸可以采用甲酸等弱酸。

按上述方案，所述步驟1)和步驟2)中內(nèi)標(biāo)物的加入量以保證內(nèi)標(biāo)物的濃度在0.7-70μM之間；優(yōu)選地，所述步驟1)和步驟2)中內(nèi)標(biāo)物的加入量以保證內(nèi)標(biāo)物的濃度在20-40μM之間，即標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍的中間值區(qū)域。

按上述方案，所述步驟1)和步驟2)中MALDI-TOF-MS分析的條件是：所用的基質(zhì)選用常用的有機(jī)基質(zhì)即可，本發(fā)明優(yōu)選為反-2-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基-2-亞丙烯基]丙二腈(DCTB)。

本發(fā)明中富勒烯標(biāo)記物作為質(zhì)荷比位移試劑在MALDI-TOF-MS中檢測(cè)小分子化合物的應(yīng)用，該富勒烯標(biāo)記物與小分子化合物進(jìn)行衍生化反應(yīng)，從而其從低分子區(qū)域拉至高分子區(qū)域，避免了MALDI-TOF-MS中低分子區(qū)段(<500Da)基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)的干擾，從而克服MALDI-TOF-MS在小分子化合物檢測(cè)方面的劣勢(shì)，開發(fā)了以功能化的C60標(biāo)記物作為m/z位移試劑來衍生小分子代謝物的新型MALDI-TOF-MS檢測(cè)手段，開拓MALDI-TOF-MS在代謝組學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用。其中，所涉及氨基小分子化合物、羥基小分子化合物的衍生化反應(yīng)過程如下所示：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

1、本發(fā)明使用富勒烯標(biāo)記物對(duì)小分子化合物進(jìn)行衍生化反應(yīng)后進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測(cè)，能得到簡(jiǎn)潔單一的準(zhǔn)分子離子峰M^-，不僅顯著改善了這些小分子化合物在質(zhì)譜譜圖中的辨識(shí)度，也極大地提高了它們?cè)谫|(zhì)譜中的檢測(cè)靈敏度，這與通常檢測(cè)小分子化合物所得到的復(fù)雜的基質(zhì)加合峰明顯不同。

2、本發(fā)明以富勒烯標(biāo)記物作為質(zhì)荷比位移試劑(m/z位移試劑)在MALDI-TOF-MS中檢測(cè)小分子化合物的應(yīng)用時(shí)，方法靈敏度高、普適性強(qiáng)、無基質(zhì)干擾，且無需制備復(fù)雜的基質(zhì)和衍生化試劑，就可以定量檢測(cè)樣品中小分子化合物，在代謝組學(xué)的研究中有很大的應(yīng)用前景。

3、本發(fā)明中方法操作簡(jiǎn)便，待測(cè)物用富勒烯標(biāo)記物標(biāo)記后直接用MALDI-TOF-MS分析，具有快速、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于生物樣品的分析。

4、本發(fā)明涉及的衍生方法可以顯著提高小分子待測(cè)物在MALDI-TOF-MS中的檢測(cè)靈敏度，檢出限可達(dá)到nM級(jí)別。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1中m/z位移試劑C60-CONHS衍生氨基小分子化合物所得衍生產(chǎn)物的質(zhì)譜圖。

圖2是實(shí)施例2中m/z位移試劑C60-CONHS衍生部分氨基酸后所得衍生產(chǎn)物的質(zhì)譜圖。

圖3是實(shí)施例2中9種氨基酸混和標(biāo)準(zhǔn)溶液(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、?；撬帷⒘涟彼?、谷氨酰胺、苯丙氨酸、精氨酸、色氨酸，各種氨基酸濃度均100μM)衍生前后(即氨基酸本身與氨基酸衍生后產(chǎn)物)的MALDI-TOF-MS檢測(cè)效果對(duì)比圖；其中(a)為衍生前，氨基酸本身以CHCA作為基質(zhì)檢測(cè)的質(zhì)譜圖；(b)為衍生前，氨基酸本身以C60作為基質(zhì)檢測(cè)的質(zhì)譜圖；(c)為衍生前，氨基酸本身以DCTB作為基質(zhì)檢測(cè)的質(zhì)譜圖；(d)為氨基酸衍生后產(chǎn)物以DCTB作為基質(zhì)檢測(cè)的質(zhì)譜圖。

圖4是實(shí)施例2中m/z位移試劑C60-CONHS對(duì)甘氨酸衍生后所得甘氨酸衍生產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖5是實(shí)施例2中正常人(a)與糖尿病(b)患者血清樣品中所含部分氨基酸的質(zhì)譜圖。

圖6是實(shí)施例2中正常人(a)與糖尿病(b)患者血清樣品中所含部分氨基酸的濃度。

圖7是實(shí)施例3中m/z位移試劑C60-COCl衍生羥基化合物(甲醇，乙醇，苯酚，濃度分別為500μM)所得衍生產(chǎn)物的質(zhì)譜圖；其中(a)甲醇衍生后產(chǎn)物以DCTB作為基質(zhì)檢測(cè)的質(zhì)譜圖；(b)乙醇衍生后產(chǎn)物以DCTB作為基質(zhì)檢測(cè)的質(zhì)譜圖；(c)苯酚衍生后產(chǎn)物以DCTB作為基質(zhì)檢測(cè)的質(zhì)譜圖。

圖8是實(shí)施例4中3種羥基化合物混和標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生前后(即羥基化合物本身與其衍生后產(chǎn)物)的MALDI-TOF-MS檢測(cè)效果對(duì)比圖；其中(a)為衍生前，羥基化合物本身以CHCA作為基質(zhì)檢測(cè)的質(zhì)譜圖；(b)為衍生前，羥基化合物本身以DCTB作為基質(zhì)檢測(cè)的質(zhì)譜圖；(c)為羥基化合物本身衍生后產(chǎn)物以DCTB作為基質(zhì)檢測(cè)的質(zhì)譜圖。

圖9是實(shí)施例4中m/z位移試劑C60-COCl對(duì)苯酚衍生后所得苯酚衍生產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明不僅僅局限于下面的實(shí)施例。

下述實(shí)施例1和2中選用人體血清樣品作為檢測(cè)對(duì)象，原因在于人體血清樣品中基質(zhì)成分復(fù)雜，并含有豐富的氨基酸，可以作為檢測(cè)氨基小分子化合物的代表，以此來說明本發(fā)明的技術(shù)方案。故下述實(shí)施例2中以富勒烯標(biāo)記物作為MALDI-TOF-MS的m/z位移試劑用于定量分析人體血清樣品中的氨基酸物質(zhì)。

下述實(shí)施例1和2中所述富勒烯標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)如下所示，縮寫為C60-CONHS，是在C60基礎(chǔ)上接羧酸基團(tuán)，在EDC作用下通過脫水與N-羥基琥珀酰亞胺形成含有活潑酯官能團(tuán)的富勒烯m/z位移試劑。

下述實(shí)施例1和2中采用的內(nèi)標(biāo)物選擇與衍生產(chǎn)物(衍生產(chǎn)物即為富勒烯標(biāo)記物C60-CONHS衍生氨基酸后的衍生物)的類似物，即含有COOH官能團(tuán)的C60衍生物作為內(nèi)標(biāo)物，可以利用C60與對(duì)甲?；郊姿峒柞?、N-乙基甘氨酸反應(yīng)，再酸化，合成得到含有COOH官能團(tuán)的C60衍生物，縮寫為C60-COOH。反應(yīng)過程如下：

下述實(shí)施例3和4中選用甲醇、乙醇、苯酚作為檢測(cè)對(duì)象，分別代表脂肪醇和酚類化合物，可以作為檢測(cè)羥基小分子化合物的代表，以此來說明本發(fā)明的技術(shù)方案。下述實(shí)施例3和4中所述富勒烯標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)如下所示，縮寫為C60-COCl，內(nèi)標(biāo)物如式4所示，縮寫為C60-COOPh。

下述實(shí)施例中采用日本Shimadzu公司的AximaTOF²型基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS)。

實(shí)施例1

考察氨基小分子化合物采用富勒烯標(biāo)記物衍生前后質(zhì)譜譜圖的變化

氨基小分子化合物(500μM,10μL)與C60-CONHS m/z位移試劑(50μM,100μL)混合，加入140mM三乙胺(TEA)11μL，60℃下衍生2h后，得到氨基化合物衍生產(chǎn)物；將所得衍生產(chǎn)物中加入140mM甲酸11μL除去TEA，取所得反應(yīng)液1μL，然后與1μL基質(zhì)(DCTB)混合后點(diǎn)板；待室溫風(fēng)干后進(jìn)入基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)，采用負(fù)離子反射模式分析，結(jié)果去圖1所示。

其中，氨基小分子化合物分別為甘氨酸、鳥氨酸、苯胺、芐胺、丁二胺、庚二胺。

如圖1所示，m/z位移試劑C60-CONHS可以對(duì)氨基小分子化合物進(jìn)行衍生，將其從低m/z區(qū)域轉(zhuǎn)移至高m/z區(qū)域，很好地消除基質(zhì)對(duì)氨基小分子化合物的干擾，說明本發(fā)明所述方法能夠?qū)崿F(xiàn)質(zhì)荷比<500Da的氨基小分子化合物在質(zhì)譜譜圖中的辨識(shí)度，極大地提高它們?cè)谫|(zhì)譜中的檢測(cè)靈敏度。

實(shí)施例2

正常人和糖尿病患者血清樣品中氨基酸的分析檢測(cè)

正常人和糖尿病患者血清樣品通過標(biāo)準(zhǔn)的臨床渠道從湖北省中南醫(yī)院獲得，保存在-80℃冰箱中。在進(jìn)行檢測(cè)氨基化合物分析之前，血清樣品先加入等量的乙腈除蛋白(具體條件為：渦旋，12000r/min離心10min)，然后取上清液作為氨基酸化合物待測(cè)品。

MALDI-TOF-MS檢測(cè)正常人和糖尿病患者血清樣品中氨基化合物的方法，包括如下步驟：

1)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制一系列不同濃度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其中氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液中同時(shí)含有多種氨基酸，每一種氨基酸的濃度范圍均在0.7-70μM之間(具體氨基酸種類與濃度區(qū)間如表1所示)，并用富勒烯標(biāo)記物進(jìn)行衍生化反應(yīng)，所得標(biāo)準(zhǔn)品衍生產(chǎn)物中加入內(nèi)標(biāo)物后進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，然后以氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度X為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品衍生產(chǎn)物與內(nèi)標(biāo)物峰強(qiáng)度比值Y為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體如表1所示；其中，衍生化反應(yīng)條件和內(nèi)標(biāo)物的加入量均與步驟2)相同；

2)①將100μL 0.3mM富勒烯標(biāo)記物C60-CONHS(即m/z位移試劑)與20μL血清樣品(即氨基酸待測(cè)品)混合，并加入140mM TEA 11μL，于60℃下進(jìn)行衍生化反應(yīng)2h，然后加入140mM甲酸11μL除去TEA，即得到血清樣品衍生物；

②將所得血清樣品衍生產(chǎn)物中加入適量?jī)?nèi)標(biāo)物溶液C60-COOH(0.3mM、10μL)混合后，取1μL與1μL基質(zhì)(DCTB)混合點(diǎn)板，室溫風(fēng)干后進(jìn)入基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜，采用負(fù)離子反射模式分析，得到血清樣品衍生產(chǎn)物的質(zhì)譜圖；

③將血清樣品衍生產(chǎn)物與內(nèi)標(biāo)物峰強(qiáng)度比值代入表1所得標(biāo)準(zhǔn)曲線中，進(jìn)而計(jì)算得到血清樣品中各氨基酸的濃度，結(jié)果如圖6所示。

如圖2所示，m/z位移試劑C60-CONHS可以較好的衍生氨基酸，將其從低分子量區(qū)域拉至高分子量區(qū)域，且圖3很好的表明，本發(fā)明所述方法能很好地消除基質(zhì)對(duì)氨基小分子化合物的干擾，實(shí)現(xiàn)對(duì)氨基小分子化合物的靈敏的檢測(cè)。

如圖5所示，本發(fā)明所述方法對(duì)血清樣品中氨基酸進(jìn)行成功的檢測(cè)。應(yīng)用本發(fā)明所提供的氨基酸定量分析檢測(cè)的方法學(xué)考察數(shù)據(jù)如表1所示，包括標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限等，其中Y為縱坐標(biāo)，X為橫坐標(biāo)。

對(duì)血清樣品分別進(jìn)行低(5μM)、中(15μM)、高(50μM)三個(gè)濃度加標(biāo)，考察加標(biāo)回收率及日內(nèi)、日間精密度，實(shí)驗(yàn)各重復(fù)5次。如表2所示，目標(biāo)物檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD﹤14.9％，相對(duì)回收率在80％-117％之間，說明本發(fā)明所述方法準(zhǔn)確性和精密度可以滿足實(shí)際樣品檢測(cè)需求，定量檢測(cè)氨基小分子化合物的方法準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好。。

本實(shí)施例計(jì)算得到血清樣品中各氨基酸的濃度，結(jié)果如圖5-6和表3所示，與正常人相比，除支鏈氨基酸如亮氨酸的含量明顯升高，生糖氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、精氨酸的含量都有所降低。

表1

表2

表3

實(shí)施例3

考察羥基小分子化合物采用富勒烯標(biāo)記物衍生前后質(zhì)譜譜圖的變化

羥基小分子化合物(500μM,10μL)與C60-COCl m/z位移試劑(100μM,100μL)混合，加入100mM 4-二甲氨基吡啶(DMAP)10μL，40℃下衍生0.5h后，得到羥基小分子化合物衍生產(chǎn)物；取所得反應(yīng)液1μL，然后與1μL基質(zhì)(DCTB)混合后點(diǎn)板；待室溫風(fēng)干后進(jìn)入基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)，采用負(fù)離子反射模式分析，結(jié)果去圖1所示。

其中，羥基小分子化合物分別為甲醇、乙醇、苯酚。檢測(cè)結(jié)果如如圖7所示，m/z位移試劑C60-COCl可以對(duì)羥基小分子化合物進(jìn)行衍生，將其從低m/z區(qū)域轉(zhuǎn)移至高m/z區(qū)域，很好地消除基質(zhì)對(duì)羥基小分子化合物的干擾，說明本發(fā)明所述方法能夠?qū)崿F(xiàn)質(zhì)荷比<500Da的羥基小分子化合物在質(zhì)譜譜圖中的辨識(shí)度，極大地提高它們?cè)谫|(zhì)譜中的檢測(cè)靈敏度。

實(shí)施例4

1、配制羥基小分子化合物的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，其中標(biāo)準(zhǔn)品溶液中甲醇、乙醇、苯酚濃度分別為150，200，150μM；

羥基小分子化合物的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液(10μL)與C60-COCl m/z位移試劑(100μM,100μL)混合，加入100mM 4-二甲氨基吡啶(DMAP)10μL，40℃下衍生0.5h后，得到標(biāo)準(zhǔn)品衍生產(chǎn)物(體積120μL)；

取1μL標(biāo)準(zhǔn)品衍生產(chǎn)物與1μL基質(zhì)(DCTB)混合點(diǎn)板，室溫風(fēng)干后進(jìn)入基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜，采用負(fù)離子反射模式分析，結(jié)果如圖8所示；

2、配制一系列苯酚的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其中苯酚的濃度范圍在1-100μM之間，并用C60-COCl進(jìn)行衍生化反應(yīng)，得到標(biāo)準(zhǔn)品衍生產(chǎn)物；

所得標(biāo)準(zhǔn)品衍生產(chǎn)物(體積120μL)中加入內(nèi)標(biāo)物溶液C60-COOPh(0.3mM、10μL)進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，然后以苯酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度X為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品衍生產(chǎn)物與內(nèi)標(biāo)物峰強(qiáng)度比值Y為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖9所示。

由圖8-9可知：本發(fā)明所述方法能很好地消除基質(zhì)對(duì)羥基小分子化合物的干擾，并且羥基小分子化合物的濃度與檢測(cè)信號(hào)存在線性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)羥基小分子化合物的靈敏的檢測(cè)，檢出限nM級(jí)別。

綜上所述，本發(fā)明使用富勒烯標(biāo)記物對(duì)能夠?qū)Πò被》肿踊衔?、羥基小分子化合物等在內(nèi)的小分子化合物進(jìn)行衍生化反應(yīng)后進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測(cè)，能克服MALDI-TOF-MS分析中低分子量區(qū)域的干擾，顯著改善小分子化合物在質(zhì)譜譜圖中的辨識(shí)度，極大地提高了其在質(zhì)譜中的檢測(cè)靈敏度，普適性強(qiáng)，能準(zhǔn)確定量檢測(cè)樣品中小分子化合物。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變換，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。