本發(fā)明是抗體偶聯(lián)藥物領(lǐng)域。具體來說，本發(fā)明涉及CD19抗體多肽偶聯(lián)抗腫瘤藥物環(huán)磷酰胺的結(jié)合物。

背景技術(shù)：

非霍奇金淋巴瘤(NHL)是具有很強(qiáng)異質(zhì)性的一組獨(dú)立疾病的總稱。在我國也是比較常見的一種腫瘤，在常見惡性腫瘤排位中在前10位以內(nèi)。NHL病變是主要發(fā)生在淋巴結(jié)、脾臟、胸腺等淋巴器官，也可發(fā)生在淋巴結(jié)外的淋巴組織和器官的淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤。依據(jù)細(xì)胞來源將其分為三種基本類型：B細(xì)胞、T細(xì)胞和NK/T細(xì)胞NHL。臨床大多數(shù)NHL為B細(xì)胞型，占總數(shù)70％～85％。NHL在病理學(xué)分型、臨床表現(xiàn)與治療個(gè)體化分層上都比較復(fù)雜，但是一種有可能高度治愈的腫瘤。目前發(fā)病率在不同年齡階段呈明顯上升的趨勢。

近年多個(gè)國際多中心隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)研究資料證明，其標(biāo)準(zhǔn)的一線治療方案應(yīng)當(dāng)是CHOP方案(環(huán)磷酰胺，多柔比星，長春新堿，強(qiáng)的松)為目前治療非霍奇金淋巴瘤較為理想的一線治療方案。50％以上非霍奇金被治愈。盡管如此，這一治療方案會(huì)導(dǎo)致較嚴(yán)重的毒副作用。常見副作用：1.骨髓抑制；2.靜脈炎；3.消化道反應(yīng)；4.脫發(fā)等。其中，環(huán)磷酰胺雙功能烷化劑及細(xì)胞周期非特異性藥物，可干擾DNA及RNA功能，尤以對(duì)前者的影響更大，它與DNA發(fā)生交叉聯(lián)結(jié)，抑制DNA合成，對(duì)S期作用最明顯。臨床用于惡性淋巴瘤有一定療效，但環(huán)磷酰胺也具有較大的毒副作用。產(chǎn)生毒副作用的主要原因在于，環(huán)磷酰胺為廣譜抗腫瘤要求，特異性較差，對(duì)正常細(xì)胞也具有一定的殺傷作用。因此，發(fā)明人希望能夠?qū)h(huán)磷酰胺與特異性的抗體偶聯(lián)，從而產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞的靶向作用，提高療效，減少毒副作用。

CD19是一種B細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)膜糖蛋白，表達(dá)于B系細(xì)胞(不包括成熟漿細(xì)胞)及濾泡樹突狀細(xì)胞上，CD19是一種重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子，調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞的生長激活和活化，在調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞抗原受體或其他表面受體的信號(hào)閾值中起重要作用，是與B淋巴細(xì)胞分化、活化、增殖及抗體產(chǎn)生有關(guān)的重要膜抗原。B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞表面受體CD19起著關(guān)鍵作用。

CD19抗體可以靶向作用于B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞表面，且本身具有抗淋巴瘤的作用。但是CD19抗體的分子量較大，具有抗原性，長期用于人體會(huì)產(chǎn)生中和反應(yīng)，降低藥效。因此，本發(fā)明提供了一種特異性強(qiáng)，純度較高的小分子CD19抗體多肽與環(huán)磷酰胺偶聯(lián)的結(jié)合物，促進(jìn)環(huán)磷酰胺的腫瘤靶向性，提高療效，降低毒副作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的

本發(fā)明提供一種特異性強(qiáng)，純度較高的小分子CD19抗體多肽與環(huán)磷酰胺偶聯(lián)的結(jié)合物，促進(jìn)環(huán)磷酰胺的腫瘤靶向性，提高療效，降低毒副作用。

技術(shù)方案

本發(fā)明的技術(shù)方案在于提供一種小分子CD19抗體多肽與環(huán)磷酰胺的偶聯(lián)結(jié)合物，其特征在于：環(huán)磷酰胺和CD19抗體多肽的偶聯(lián)結(jié)合物；所述CD19抗體多肽為全新序列。所述偶聯(lián)結(jié)合物的制備，步驟包括：(1)用0.1mol/L HCl溶液配制2-8mmol/L濃度的環(huán)磷酰胺；(2)4℃，滴加1％NaNO2，持續(xù)攪拌，反應(yīng)20-30分鐘；(3)用pH8-10的緩沖液溶解所述的CD19抗體多肽；(4)所述CD19抗體多肽溶液中加入重氮化的環(huán)磷酰胺，調(diào)節(jié)pH到9-10；(5)4-8℃，反應(yīng)2小時(shí)；(6)PBS透析2天，即得。所述的CD19抗體多肽采用化學(xué)合成法制備。所述偶聯(lián)結(jié)合物，在制備用于治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選為在制備用于治療惡性淋巴瘤藥物中的應(yīng)用，尤其是用于治療非霍奇金淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。

有益效果

本發(fā)明的小分子CD19抗體多肽與環(huán)磷酰胺的偶聯(lián)結(jié)合物，可用于促進(jìn)環(huán)磷酰胺的腫瘤靶向性，提高療效，降低毒副作用。有益效果在于(1)提高環(huán)磷酰胺在體內(nèi)腫瘤組織的濃度；同時(shí)降低環(huán)磷酰胺在全血，以及心、肝、脾、肺、腎、腦等組織的分布；(2)顯著性抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；(3)降低環(huán)磷酰胺的毒性；(4)小分子CD19抗體多肽與環(huán)磷酰胺的偶聯(lián)結(jié)合物能與腫瘤細(xì)胞的特異性結(jié)合；(5)提高荷瘤小鼠生存率。

具體實(shí)施方式

多肽由上海生工吉爾合成。

實(shí)施例1

制備CD19抗體多肽與環(huán)磷酰胺的偶聯(lián)結(jié)合物：用0.1mol/L HCl溶液配制2mmol/L濃度的環(huán)磷酰胺；4℃，滴加1％NaNO2，持續(xù)攪拌，反應(yīng)20分鐘；用pH8的緩沖液溶解所述的CD19抗體多肽；CD19抗體多肽溶液中加入重氮化的環(huán)磷酰胺，調(diào)節(jié)pH到9；在4-8℃，反應(yīng)2小時(shí)；再用PBS透析2天，凍干，即得。

實(shí)施例2

制備CD19抗體多肽與環(huán)磷酰胺的偶聯(lián)結(jié)合物：用0.1mol/L HCl溶液配制

8mmol/L濃度的環(huán)磷酰胺；4℃，滴加1％NaNO2，持續(xù)攪拌，反應(yīng)30分鐘；用pH10的緩沖液溶解所述的CD19抗體多肽；CD19抗體多肽溶液中加入重氮化的環(huán)磷酰胺，調(diào)節(jié)pH到10；在4-8℃，反應(yīng)2小時(shí)；再用PBS透析2天，凍干，即得。

實(shí)施例3

用人B細(xì)胞淋巴瘤移植瘤模型檢測CD19抗體多肽與環(huán)磷酰胺的偶聯(lián)結(jié)合物的體內(nèi)活力。

6-8w齡SCID小鼠，小鼠隨機(jī)分成5組，雌雄各半，每組10只。(1)空白組；(2)結(jié)合物低劑量組；(3)結(jié)合物中劑量組；(4)結(jié)合物高劑量組；(5)環(huán)磷酰胺陽性組。建立人B細(xì)胞淋巴瘤移植瘤模型，在接種淋巴瘤細(xì)胞后的第7天，分別尾靜脈給藥給藥。給藥方案為：空白組加入相同體積的溶劑，實(shí)驗(yàn)組為結(jié)合物設(shè)3個(gè)劑量：0.05、0.1、0.2mmol/Kg，陽性組為0.2mmol/Kg的環(huán)磷酰胺，每天給藥，連續(xù)14天。21天后，觀察小鼠存活數(shù)量，計(jì)算存活率。結(jié)果顯示，結(jié)合物可有效地保護(hù)荷瘤小鼠，在劑量0.05、0.1、0.2mmol/Kg時(shí)可以提高荷瘤小鼠的生存率，生存率分別為67.43，78.67，79.03％。

實(shí)施例4

B細(xì)胞淋巴瘤的體外增殖率實(shí)驗(yàn)：采用MTT比色法。將對(duì)數(shù)生長的人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞，以1.0×10⁵加入96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h；實(shí)驗(yàn)分為5組，分別為空白組、陽性組和低中高劑量的實(shí)施例1得到的CD19抗體多肽與環(huán)磷酰胺的偶聯(lián)結(jié)合物；分別加入相同體積的DMEM培養(yǎng)基(HyClone，含胎牛血清20％)，環(huán)磷酰胺(1mmol/ml)和CD19抗體多肽與環(huán)磷酰胺的偶聯(lián)結(jié)合物(10、20、40μmol/ml)。每孔設(shè)五個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h，每孔加入MTT，作用4h后，加入DMSO，孵育30min，在酶標(biāo)儀620nm處測定吸光度A值，按公式成B細(xì)胞淋巴瘤抑制率＝(1—實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值)×100％。環(huán)磷酰胺陽性組和實(shí)施例1的偶聯(lián)結(jié)合物實(shí)驗(yàn)組的B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的抑制率分別為78.9、47.02、69.1和87.2％(p＜0.05)。結(jié)果顯示，實(shí)施例1的偶聯(lián)結(jié)合物能有效抑制腫瘤細(xì)胞生長，高劑量結(jié)合物的腫瘤抑制率高于環(huán)磷酰胺。

實(shí)施例5

用人B細(xì)胞淋巴瘤移植瘤模型檢測CD19抗體多肽與環(huán)磷酰胺的偶聯(lián)結(jié)合物的體內(nèi)分布。

6-8w齡SCID小鼠，小鼠隨機(jī)分成3組，雌雄各半，每組6只。(1)空白組；(2)結(jié)合物組；(3)環(huán)磷酰胺陽性組。建立人B細(xì)胞淋巴瘤移植瘤模型，在接種淋巴瘤細(xì)胞后的第7天，分別尾靜脈給藥給藥。給藥方案為：空白組加入相同體積的溶劑，實(shí)驗(yàn)組為0.2mmol/Kg劑量的結(jié)合物，陽性組為0.2mmol/Kg的環(huán)磷酰胺，每天給藥，連續(xù)7天。14天后，將小鼠處死后，分別取全血，以及心、肝、脾、肺、腎、腦、腫瘤等組織。全血肝素抗凝，將肝素抗凝血離心沉淀血細(xì)胞,取上清血漿0.5ml，加入2.67％HCLO4，離心沉淀血漿蛋白，上清水浴加熱100℃20分鐘，待測；各組織經(jīng)過勻漿、除蛋白、離心后，取上清。將血漿及組織的上清分別加NBP在堿性條件下進(jìn)行顯色反應(yīng)，然后在575nm波長下進(jìn)行比色測定。計(jì)算小鼠血漿及各組織中環(huán)磷酰胺的濃度。

表1 結(jié)合物在腫瘤模型動(dòng)物中血漿及組織分布濃度

*P<0.05，**P<0.01與陽性組相比。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，與環(huán)磷酰胺陽性組比較，CD19抗體多肽與環(huán)磷酰胺的偶聯(lián)結(jié)合物組體內(nèi)腫瘤組織中的濃度明顯升高，(p＜0.05)，而心、肝、脾、肺、腎、腦等組織，以及血漿中的環(huán)磷酰胺濃度明顯降低，尤其是血漿中的藥物濃度為23.98±32.62μg/ml(p＜0.05)，有顯著性差異。

實(shí)施例6

CD19抗體多肽與環(huán)磷酰胺的偶聯(lián)結(jié)合物的的毒性作用。采用實(shí)施例1結(jié)合物，測定半數(shù)致死量：取60只小鼠隨機(jī)分為6組，每組l0只。各組小鼠先禁食12h，分別腹腔注射不同劑量的實(shí)施例2結(jié)合物，劑量分別為125、250、500、1000、2000、5000mg/Kg，給受試藥物后再禁食3-4小時(shí)。此后連續(xù)觀察2周，有無死亡現(xiàn)象，計(jì)算半數(shù)致死量LD50。并觀察皮膚、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循環(huán)、自主及中樞神經(jīng)系統(tǒng)行為表現(xiàn)。

結(jié)果：實(shí)施例1結(jié)合物對(duì)小鼠的半數(shù)致死量LD50為1743.98mg/Kg。

實(shí)施例7

結(jié)合物與B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的結(jié)合率：采用ELISA方法，將對(duì)數(shù)生長的人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞，以1.0×10⁵加入96孔酶標(biāo)板上，4℃，包被過夜；PBS三次洗板后，將實(shí)施例1的結(jié)合物，按空白組，濃度梯度0、10、20、40μmol/ml分別加入96孔板中，同時(shí)每孔加入定量的抗CD19抗體競爭結(jié)合，37℃，孵育2小時(shí)時(shí)間后；PBS三次洗板后，再加入偶聯(lián)辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)的抗人IgG抗體，37℃，孵育1小時(shí)；再PBS三次洗板后，加入ABC溶液，孵育10-20分鐘，最后用流水終止反應(yīng)；顯微鏡觀察，所述實(shí)施例1結(jié)合物與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的細(xì)胞呈棕黑色，為陽性細(xì)胞，采用計(jì)算機(jī)軟件計(jì)算呈陽性細(xì)胞的數(shù)量。

結(jié)果：實(shí)施例1結(jié)合物與B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞結(jié)合的數(shù)量與空白組相比有顯著性差異，劑量為40μmol/ml時(shí)，陽性細(xì)胞數(shù)量達(dá)到475.9±34.6(p＜0.05)。由此可見，實(shí)施例1結(jié)合物與B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞結(jié)合率隨劑量遞增。

SEQUENCE LISTING

<110> 蘇州普羅達(dá)生物科技有限公司

<120> 一種CD19抗體多肽與環(huán)磷酰胺偶聯(lián)的結(jié)合物

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 14

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser

1 5 10 15

Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro

20 25 30

Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg

35 40