本發(fā)明涉及藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說就是一種基于氧自由基原理的靶向功能材料及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤仍是世界上最嚴(yán)重的疾病之一，每年有一千萬的新發(fā)病例。據(jù)統(tǒng)計在我國惡性腫瘤發(fā)病率為235.23/10萬(男性268.65/10萬，女性200.21/10萬)，中國人口標(biāo)化率(中標(biāo)率)184.58/10萬。全國惡性腫瘤死亡率為148.81/10萬(男性186.37/10萬，女性109.42/10萬)。雖然現(xiàn)今已經(jīng)有很多抗腫瘤藥物，但大多數(shù)藥物在體內(nèi)的分布不具選擇性，或是水溶性差，如何有針對性的對腫瘤進(jìn)行診斷并治療是很重要的。近年來隨著納米技術(shù)的突飛猛進(jìn)，帶來了診斷與分子靶向腫瘤治療技術(shù)的大發(fā)展。許多科學(xué)家以納米材料作為抗腫瘤藥物載體，用于疾病治療，而在這些治療過程中過，依靶向給藥、可控釋藥為主要的藥物開發(fā)和治療研究的重點。

腫瘤靶向分為被動靶向和主動靶向，前者通過實體腫瘤的EPR(enhanced permeability and retention)效應(yīng)實現(xiàn)，后者利用抗體與抗原或腫瘤相關(guān)受體的配體與受體間的特異性結(jié)合來實現(xiàn)，能夠更好的將治療劑量控制在盡可能低的范圍內(nèi)，以降低對非靶點的毒性，又能夠?qū)⒆銐騽┝康乃幬镙斔偷讲≡钊〉弥委熜Ч?/p>

目前為止，已發(fā)現(xiàn)的具有腫瘤靶向功能的配體主要有：抗體、表皮生長因子、促黃體激素釋放激素(LHRH)、α2-糖蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、葉酸等，他們都能起到很好的靶向效果，但是他們大多價格昂貴，不易保存，容易變性而且他們中只能對特定的腫瘤進(jìn)行靶向，例如：利妥昔單抗的靶點為CD20不但價格十分高昂而且只能用于非霍奇金淋巴瘤靶向治療；葉酸不僅對腫瘤部位有靶向作用，還對炎癥也有靶向作用。因此研究新的具有腫瘤靶向功能的配體有著重要的意義。

自由基是人體進(jìn)行生命活動時所產(chǎn)生的一種活性分子(氧化的產(chǎn)物)。正常情況下，自由基具有調(diào)節(jié)細(xì)胞間的信號傳遞和細(xì)胞生長、抑制病毒和細(xì)菌的作用。但如果體內(nèi)自由基過多，則可引起蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)食品)、核酸(DNA)變性，導(dǎo)致細(xì)胞和組織器官損傷，誘發(fā)各種疾病，并加速機(jī)體衰老。自由基ROS是一種缺乏電子的物質(zhì)(不飽和電子物質(zhì))， 進(jìn)入人體后到處爭奪電子，如果奪去細(xì)胞蛋白分子的電子，使蛋白質(zhì)接上支鏈發(fā)生烷基化，形成畸變的分子而致癌。該畸變分子由于自己缺少電子，又要去奪取鄰近分子的電子，又使鄰近分子也發(fā)生畸變而致癌。這樣，惡性循環(huán)就會形成大量畸變的蛋白分子?；蛲蛔?，形成大量癌細(xì)胞，最后出現(xiàn)癌癥。而當(dāng)自由基或畸變分子搶奪了基因的電子時，人就會直接得癌癥。

四甲基哌啶TEMPO及其衍生物具有良好的順磁性，已經(jīng)成功的在生物化學(xué)領(lǐng)域用作電子自旋標(biāo)記物，并取得了良好的標(biāo)記效果；而且它還具有很強(qiáng)的捕獲自由基的能力，是一種重要的自由基捕獲劑。目前已有很多研究表明自由基和腫瘤的形成有著極為密切的關(guān)系，癌細(xì)胞在形成腫瘤的過程中，快速無節(jié)制的生長需要大量血液輸送營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，引發(fā)血管生長過度豐富而雜亂，腫瘤的生長過程中，始終都伴隨各類氧自由基的產(chǎn)生。而TEMPO及其衍生物具有很強(qiáng)的捕獲自由基的能力，因此TEMPO及其衍生物可能成為一個潛在的靶向配體。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于氧自由基原理且具有靶向功能的材料及其應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

一種基于氧自由基的靶向功能材料，具體為基于氧自由基原理且具有腫瘤靶向功能的配體，配體的結(jié)構(gòu)特征為：含有氮氧自由基的哌啶類化合物，例如：2，2，6，6-四甲基哌啶-氮-氧化物(A)；(4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基；4-氨基-TEMPO(B)；

一種基于氧自由基原理且具有靶向功能配體的制備方法，用一定方法先制備得到具有表面改性的載體，并將表面改性載體的特殊基團(tuán)和TEMPO或其衍生物通過化學(xué)反應(yīng)，用化學(xué)鍵連接起來，構(gòu)成外面含有裸露TEMPO基團(tuán)的抗腫瘤藥物的載體；其合成示意步驟如化學(xué)式I；

所述的一定方法是指分子自組裝法，高溫沉淀法，熱分解法，超聲法中的一種。

所述的抗腫瘤藥物的載體(A)為：納米膠束(其粒徑為1-1000nm)、納米顆粒(其粒徑為1-1000nm)、納米囊泡(其粒徑為1-1000nm)、納米管(其粒徑為1-1000nm)或一些修飾后保持藥物本身性質(zhì)的藥物分子中的一種或幾種。

所述的X為羧基(-COOH)，氨基(-NH2)，N-甲基丙烯酰氧琥珀酰亞胺(-NAS)中的一種；最好是-NAS基團(tuán)，由于它能夠很容易與不同的功能配體發(fā)生連接，如葉酸、熒光素、氮氧自由基。

所述的Y為氨基(-NH2)，羧基(-COOH)中的一種，其中氨基優(yōu)先。

所述的表面改性的載體是指含有熒光標(biāo)記物質(zhì)(例如：量子點(QDS)，異硫氰酸熒光素(FITC)，羥基熒光素(FAM)，四氯熒光素(TET)，菁染料(cy5.5)等)的載體中的一種或幾種。

所述的表面改性載體的特殊基團(tuán)為氨基，羧基，N-甲基丙烯酰氧琥珀酰亞胺(-NAS)基團(tuán)中的一種或幾種。

所述的TEMPO或其衍生物為氨基化、羧基化或其他化學(xué)方法修飾后的TEMPO或其衍生物，將TEMPO基團(tuán)裸露載體在外面是為了使其能更好的與腫瘤及其環(huán)境接觸達(dá)到更好的靶向效果。

所述的化學(xué)反應(yīng)是指能使表面改性的納米載體與TEMPO或其衍生物通過化學(xué)鍵連接起來，且不改變原有材料以及配體性能的化學(xué)反應(yīng)，如酸胺縮合反應(yīng)、酰胺縮合等的一種或幾種。

一種基于氧自由基原理且具有靶向功能的配體靶向性能的驗證

使用多功能活體成像系統(tǒng)(Coliper IVIS Lumina II)對荷瘤動物靜脈單劑量注射生理鹽水、無靶向配體納米載體水溶液和具有靶向配體納米載體水溶液后的動物體內(nèi)分布進(jìn)行實時的活體成像檢測，在經(jīng)過活體成像后對裸鼠進(jìn)行解剖，取出其組織進(jìn)行離體熒光成像。

所述的動物活體成像系統(tǒng)(In-vivo Imaging System)，主要用于大鼠、小鼠等小動物的生物發(fā)光成像(bioluminescence imaging，BLI)和生物熒光成像(biofluorescence imaging，BFI)，系統(tǒng)還兼有X-ray成像和放射性同位素成像等功能，可以在活體小動物內(nèi)對標(biāo)記對象進(jìn)行直接而持續(xù)的觀察。

所述的荷瘤是指接種癌細(xì)胞(人乳腺癌(MCF-7)細(xì)胞、人頸癌(Hela)細(xì)胞、人肺癌(A549)細(xì)胞等)后形成的實體瘤，實體瘤的體積要達(dá)到50mm3以上才可以。

所述的荷瘤動物是指用于實驗且形成實體瘤的動物，如小鼠、兔子等，實驗室中最常用的是裸鼠。

1.一種具有TEMPO基團(tuán)或其衍生物的納米載體的合成方法，其具體步驟如下：

取表面改性的納米載體與TEMPO或其衍生物以摩爾比100∶0.01到100∶1的比例于圓底燒瓶中，加入20mL的溶劑，在20HZ-100HZ功率下，超聲使其完全溶解，在0～360℃下發(fā)生化學(xué)反應(yīng)且反應(yīng)0.5～48h，待反應(yīng)完全后將反應(yīng)液用預(yù)處理過的透析袋(截留分子量：8000～14000g/mol)透析2-48h來除去有機(jī)溶劑、未反應(yīng)的TEMPO或其衍生物以及其他的一些副產(chǎn)物，除雜后用不改變所得材料性能的方法來得到干燥的具有TEMPO基團(tuán)的納米載體；

2.一種具有TEMPO基團(tuán)或其衍生物的納米載體的靶向性能的驗證，其具體步驟如下：

(1)將荷瘤小鼠的活體成像實驗分為三組，每組3頭小鼠。實驗組每頭小鼠以熒光試劑為1mg/Kg體重單劑量尾靜脈注射給藥。第一組3頭小鼠的編號以及處理方式分別為：I-A：陰性對照組，生理鹽水。

I-B：陽性對照組，無TEMPO組。

I-C：實驗組，含TEMPO組。

第二組、第三組為第一組的平行組，6頭小鼠的編號為II-A、II-B、II-C、III-A、III-B、III-C，處理方式同第一組。每組注射完成后，將小鼠由左至右依次擺放在樣品臺上，取不同時間點使用多功能活體成像系統(tǒng)(Coliper IVIS Lumina II)對小鼠進(jìn)行活體成像，設(shè)置儀器激發(fā)波長為640nm，700nm處收集發(fā)射光，觀察體內(nèi)熒光分布情況來驗證其靶向性。

(2)為了對活體成像結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行表征，在經(jīng)過尾靜脈注射并活體成像后對裸鼠進(jìn)行解剖，取出其組織進(jìn)行離體熒光成像，來驗證其靶向性。將對照組裸鼠同時處死，取其組織作為對照。組織的擺放按照從以上到下的順序：心、肝、脾、肺、腎、腫瘤。

一種基于氧自由基的靶向功能材料具有靶向功能。

一種基于氧自由基的靶向功能材料在治療腫瘤部位的靶向性材料中的應(yīng)用。

一種基于氧自由基的靶向功能材料在治療炎癥部位的靶向性材料，治療動脈硬化的靶向性材料或者治療胃炎的靶向性材料中的應(yīng)用。

一種基于氧自由基的靶向功能材料在治療消化性潰瘍的靶向性材料，治療腦的再灌流性損害材料或者治療胃炎材料中的應(yīng)用。

一種基于氧自由基的靶向功能材料在治療消化性潰瘍材料，治療原發(fā)性腎小球疾病材料或者治療糖尿病材料中的應(yīng)用。

一種基于氧自由基的靶向功能材料在治療支氣管哮喘材料，治療肺氣腫材料或者治療震顫麻痹癥材料中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極效果是：

本發(fā)明的優(yōu)點在于提供了一種新的具有腫瘤靶向功能配體，而且對氧自由基敏感，并可方便通過EPR進(jìn)行跟蹤監(jiān)測。它不但便宜廉價、易保存，也可以與多種納米載體進(jìn)行連接，還可以實現(xiàn)同時靶向給藥和腫瘤檢測。

【附圖說明】

圖1以基礎(chǔ)共聚物開發(fā)出功能模塊組成倉儲式功能模塊庫，根據(jù)需要選取相應(yīng)的功能模塊自組裝成功能膠束。

圖2基礎(chǔ)共聚物PLA-PNNUA-PNAS的合成及其兩種功能模塊PLA-PNNUA-cy5.5和PLA-PNNUA-TEMPO的合成。

圖3基礎(chǔ)共聚物PLA-PNNUA-PNAS的結(jié)構(gòu)(A)與1H NMR譜(B)

圖4多功能膠束的電子順磁共振圖譜。

圖5具有cy5.5熒光染料的多功能膠束的熒光圖譜。

圖6多功能膠束的透射電鏡照片QDs@PLA-PNNUA(A)，QDs@PLA-PNNUA-TEMPO(B)，PLA-PNNUA-Cy5.5(C)和PLA-PNNUA-Cy5.5(TEMPO)(D)

圖7用cy5.5作為熒光探針對荷MCF-7荷瘤小鼠的活體成像(圖7A)與組織照片(圖7B)。

圖8包埋油溶性QDs的多功能納米膠束的熒光圖譜

圖9用QDs作為熒光探針對荷MCF-7荷瘤小鼠的活體成像(圖9C)與組織照片(圖9D)。

【具體實施方式】

以下提供本發(fā)明一種基于氧自由基原理且具有靶向功能的配體及其應(yīng)用的具體實施方式。

實施例1

TEMPO對腫瘤部位的靶向性驗證(1)：

一.基礎(chǔ)共聚物PLA-PNNUA-PNAS的合成

第一步，向燒瓶中加入一定比例的N-異丙基甲基丙烯酰胺、N-異丙基馬來酰胺酸、10-十一烯酸，DMF(二甲基甲酰胺)溶解。加入AIBN(偶氮二異丁腈)和聚乳酸大分子RAFT引發(fā)劑。通氮氣除氧。80℃反應(yīng)6小時。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入無水乙醚中，將得到的沉淀離心收集，清洗后室溫真空烘干，得白色粉末PLA-PNNUA。

第二步，以PLA-PNNUA作為RAFT引發(fā)劑，與單體NAS(N-甲基丙烯酰氧琥珀酰亞胺)制備基礎(chǔ)共聚物PLA-PNNUA-PNAS。燒瓶中加入PLA-PNNUA和NAS單體，加入5mLDMF溶解，加入AIBN。通氮氣除氧。80℃反應(yīng)6小時。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入無水乙醚中，將得到的沉淀離心收集，清洗后室溫真空烘干，得白色粉末PLA-PNNUA-PNAS。核磁共振氫譜(¹H NMR，附圖3)對PLA-PNNUA-PNAS的結(jié)構(gòu)經(jīng)行了表征，結(jié)果表明成功制備了環(huán)境響應(yīng)基礎(chǔ)共聚物PLA-PNNUA-PNAS。

二.腫瘤靶向PLA-PNNUA-TEMPO和熒光PLA-PNNUA-cy5.5的制備

1.TEMPO(4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基)自旋標(biāo)記PLA-PNNUA-TEMPO聚合物的制備

將PLA-PNNUA-PNAS與TEMPO溶于DMSO，避光反應(yīng)48小時。反應(yīng)液對1000mL超純水透析24小時。凍干透析袋內(nèi)的液體，得到橘紅色粉末，為TEMPO自旋標(biāo)記功能模塊PLA-PNNUA-TEMPO。(電子順磁共振圖譜，附圖4)

2.熒光PLA-PNNUA-cy5.5的制備

(1)PLA-PNNUA-NH2合成

首先將PLA-PNNUA-PNAS(0.4g)溶于5mL DMF加入圓底燒瓶。取6ml的乙二胺，慢慢滴加入燒瓶，磁力攪拌混合均勻后加入0.05mL的三乙胺，繼續(xù)攪拌30分鐘后將燒瓶放入4℃冰箱內(nèi)避光反應(yīng)48小時。反應(yīng)完成后將反應(yīng)液裝入透析袋中，用1000mL超純水透析24小時以除去有機(jī)溶劑、未反應(yīng)的乙二胺以及其他的一些副產(chǎn)物。透析結(jié)束后將透析袋內(nèi)的液體凍干，得到白色粉末(PLA-PNNUA-NH2)置于干燥器內(nèi)待 用。

(2)PLA-PNNUA-cy5.5合成

首先將PLA-PNNUA-NH2(0.8g)溶于5mL DMSO加入圓底燒瓶。取1ml的DMSO將cy5.5完全溶解后，慢慢滴加入燒瓶，磁力攪拌混合均勻后加入0.05mL的三乙胺，在冰水浴中繼續(xù)攪拌4h后將燒瓶放入4℃冰箱內(nèi)避光反應(yīng)48小時。反應(yīng)完成后將反應(yīng)液裝入透析袋中，用1000mL超純水透析24小時以除去有機(jī)溶劑、未反應(yīng)的cy5.5以及其他的一些副產(chǎn)物。透析結(jié)束后將透析袋內(nèi)的液體凍干，得到藍(lán)色粉末(PLA-PNNUA-cy5.5)置于4℃冰箱內(nèi)待用。

三.PLA-PNNUA-cy5.5膠束制備

在25mL圓底燒瓶中將共聚物PLA-PNNUA-cy5.5(10mg)和PLA-PNNUA-NAS(10mg)溶于10mL氯仿，超聲分散15min后40℃減壓旋蒸出去溶劑，使共聚物在圓底燒瓶的內(nèi)表面形成一層薄膜。然后將圓底燒瓶置于超聲波清洗器(超聲功率：120W，頻率：58kHz)中，用注射器緩慢加入10mL超純水，每加2-3滴停下輕輕搖晃，使得薄膜充分被水浸潤到。超純水加完后，繼續(xù)超聲15min，即得納米膠束溶液。將制備完成的納米膠束溶液凍干保存-20℃冰箱內(nèi)待用。(具有cy5.5熒光染料的多功能膠束的熒光圖譜，附圖5)

四.TEMPO和cy5.5一體化膠束制備

在25mL圓底燒瓶中將共聚物PLA-PNNUA-TEMPO(10mg)和PLA-PNNUA-cy5.5(10mg)溶于10mL氯仿.超聲分散15min后40℃減壓旋蒸出去溶劑，使共聚物在圓底燒瓶的內(nèi)表面形成一層薄膜。然后將圓底燒瓶置于超聲波清洗器(超聲功率：120W，頻率：58kHz)中，用注射器緩慢加入10mL超純水，每加2-3滴停下輕輕搖晃，使得薄膜充分被水浸潤到。超純水加完后，繼續(xù)超聲15min，即得PLA-PNNUA-Cy5.5(TEMPO)納米膠束溶液。凍干保存-20℃冰箱內(nèi)待用。(具有cy5.5熒光染料的多功能膠束的電子順磁共振圖譜和熒光圖譜，附圖4和附圖5)

五.小鼠MCF-7腋皮下接種腫瘤模型的建立

1體外細(xì)胞培養(yǎng)

(1)PBS緩沖液配制

在裝有800mL超純水的錐形瓶中加入8.0g NaCl，0.20g KCl，3.15g Na2HPO4.12H₂O，0.24g KH₂PO₄，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH至7.4，加水定容至1L，高溫滅菌后，4℃低溫保存待用。

(2)DMEM培養(yǎng)基的配制

配制1000mL的DMEM培養(yǎng)基：取DMEM培養(yǎng)基干粉一袋，倒入1000mL容量的容量瓶中，加入700mL超純水，磁力攪拌溶解。然后加入1.5g NaHCO₃，攪拌溶解后，加入100mL胎牛血清，青霉素-鏈霉素雙抗液10mL，混勻后定容至1000mL，最后用0.22μm微孔濾膜無菌過濾后于4℃保存。

(3)RPMI 1640培養(yǎng)基的配制

配制1000mL的RPMI 1640培養(yǎng)基：取RPMI 1640培養(yǎng)基干粉一袋，倒入1000mL容量的容量瓶中，加入700mL超純水，磁力攪拌溶解。然后加入1.5g NaHCO₃，攪拌溶解后，加入100mL胎牛血清，青霉素-鏈霉素雙抗液10mL，混勻后定容至1000mL，最后用0.22μm微孔濾膜無菌過濾后于4℃保存。

(4)細(xì)胞的體外培養(yǎng)

MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞單層接近長滿培養(yǎng)瓶時，用1-2mL 0.25％胰蛋白酶消化液消化，隨后按1∶2的比例傳代，每24h換新鮮培養(yǎng)基一次，過程中采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況和貼壁形態(tài)。傳代2-3次使細(xì)胞達(dá)到良好的生長狀態(tài)，進(jìn)行實驗。

2裸鼠的飼養(yǎng)

雌性裸鼠5周齡，體重在16g左右，裸鼠在屏蔽的操靜臺飼養(yǎng)，溫度控制在28℃左右，濕度在40％左右，飼養(yǎng)條件完全按照裸鼠飼養(yǎng)條件進(jìn)行飼養(yǎng)。

3小鼠MCF-7腋皮下接種腫瘤模型的建立

取雌性裸小鼠(5周齡)9頭，用無葉酸嚙齒動物飼料飼養(yǎng)于無病原體環(huán)境中。取無菌培養(yǎng)、傳代、處于對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞，在已滅菌的離心管中用無菌3ml培養(yǎng)基稀釋成細(xì)胞懸液，接種于小鼠右腋皮下，每只小鼠接種0.25ml，建立小鼠MCF-7腋皮下接種腫瘤模型。待移植實體瘤的體積達(dá)到50mm3以上，進(jìn)行活體成像實驗。

六.荷瘤小鼠的活體成像實驗對新配體的靶向性能驗證

1.荷瘤小鼠的活體成像實驗分為三組，每組3頭小鼠。實驗組每頭小鼠以Cy5.5以5mg/Kg體重單劑量尾靜脈注射給藥。3頭小鼠的編號以及處理方式分別為：

I-A：陰性對照組，生理鹽水。

I-B：陽性對照組，PLA-PNNUA-Cy5.5膠束組。

I-C：PLA-PNNUA-Cy5.5(TEMPO)膠束。

注射后1h拍照并處死拍組織。

2設(shè)置儀器激發(fā)

從左至右一次為生理鹽水對照組，PLA-PNNUA-Cy5.5對照組，PLA-PNNUA-Cy5.5(TEMPO)實驗組。注射樣品后小鼠成像以及各組織在640nm激發(fā)，700nm收集的成像圖譜，如附圖7所示

實驗結(jié)果

附圖7(A)中箭頭處為荷瘤位置，I為尾部靜脈注射100μL生理鹽水對照組小鼠的成像圖，II為尾部靜脈注射無TEMPO的PLA-PNNUA-Cy5.5膠束(5mg/mL，200μL)的實驗小鼠成像圖，III為尾部靜脈注射PLA-PNNUA-Cy5.5(TEMPO)納米膠束(5mg/mL，200μL)的實驗小鼠成像圖。從圖中可以看出，給藥1h后，與I組和II組荷瘤小鼠相比，注射PLA-PNNUA-Cy5.5(TEMPO)膠束組的小鼠III活體成像在荷瘤部位的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，表明小鼠荷瘤部位的Cy5.5濃度較高，進(jìn)而說明PLA-PNNUA-Cy5.5(TEMPO)膠束組在腫瘤部位的聚集濃度比PLA-PNNUA-Cy5.5膠束組聚集的濃度要大，也就是在膠束表面修飾TEMPO基團(tuán)后，由于TEMPO基團(tuán)和腫瘤部位的自由基等物質(zhì)發(fā)生結(jié)合，使得納米膠束有選擇性地濃集定位于腫瘤部位。實驗結(jié)果表明，與無TEMPO的納米膠束組相比，PLA-PNNUA-Cy5.5(TEMPO)納米膠束組在荷瘤小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出良好的主動靶向腫瘤組織的能力。

為了進(jìn)一步證明由活體熒光成像所得到的納米膠束組的成像結(jié)果以及納米膠束在小鼠體內(nèi)分布情況，將注射1h后的小鼠進(jìn)行解剖，并得到解剖器官的熒光成像圖。結(jié)果如圖7(B)所示，各離體器官的熒光強(qiáng)度與活體成像所得到的結(jié)果相似，在離體成像圖中，從上至下依次為心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和腫瘤組織。從圖中可看出，肝臟和腎臟的熒光強(qiáng)度很高，一方面由于這兩個器官的自發(fā)熒光很高，另一方面這兩個器官具有“排毒”的作用，因此納米膠束也容易在此富集。與生理鹽水組和無TEMPO的納米膠束組相比，PLA-PNNUA-Cy5.5(TEMPO)納米膠束組腫瘤組織處有較強(qiáng)的熒光，此結(jié)果與小鼠活體熒光成像結(jié)果具有一致性。

實驗結(jié)果表明，與無TEMPO的納米膠束組相比，PLA-PNNUA-Cy5.5(TEMPO)納米膠束組在荷瘤小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出良好的主動靶向腫瘤組織的能力。這是由于TEMPO配體的連接，使納米膠束不但具有了順磁性能，還具有了捕捉自由基的能力。當(dāng)含有TEMPO的納米膠束隨血液經(jīng)過腫瘤組織時，由于腫瘤組織的自由基較多，裸露在膠束外面的TEMPO就會和自由基發(fā)生結(jié)合，停留在腫瘤組織部位，進(jìn)而增大了納米膠束在腫瘤部位的聚集，因此含TEMPO納米膠束組在荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤組織的熒光光強(qiáng)度較強(qiáng)。

所述的納米膠束可換作表面含有TEMPO基團(tuán)的納米顆粒、納米囊泡、納米管等載體中的一種或幾種。

實施例2

TEMPO對腫瘤部位的靶向性驗證(2)：

制備包埋疏水性量子點的TEMPO膠束，利用實例1方案對TEMPO的靶向驗證一CdTe量子點(QDs)的制備

1水溶性CdTe量子點的制備

將CdCl2·2.5H₂O(0.04mol/L，4mL)加入到100mL三口燒瓶中，稀釋到50mL。磁力攪拌下依次加入100mg檸檬酸鈉，Na₂TeO₃(0.01mol/L，4mL)，50mg MPA，50mg NaBH₄。當(dāng)溶液的顏色變?yōu)榛揖G色時，放入油浴中100℃加熱回流，通過控制反應(yīng)1-12h時間得到CdTe量子點。

2油溶性CdTe QOs的制備

取2mM水溶性CdTe QDs，加5ml十二硫醇和20ml丙酮，接回流裝置，70℃水浴加熱，磁力攪拌反應(yīng)3h，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮，加入15ml甲苯，萃取，分液取有機(jī)層，接回流裝置，75℃水浴加熱，磁力攪拌反應(yīng)1h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲苯，加入三倍體積無水乙醇沉淀QDs，12000rpm/min離心10min，棄上清液，沉淀加適量無水乙醇渦旋振蕩洗滌，12000rpm/min離心10min，棄上清液，加一定體積氯仿渦旋振蕩溶解沉淀，12000rpm/min離心10min，吸取上清液，即得油溶性CdTe QDs。

二PLA-PNNUA-TEMPO合成

與實施例1中基礎(chǔ)共聚物PLA-PNNUA-PNAS的合成相同

三QDs@PLA-PNNUA和QDs@PLA-PNNUA-TEMPO膠束的制備合成及表征

取0.1mg油溶性QDS溶于2ml四氫呋喃(THF)，超聲30min。將10mgPLA-PNNUA或PLA-PNNUA-TEMPO溶于7ml去離子水超聲30min。在攪拌下將PLA-PNNUA-PAS或PLA-PNNUA-TEMPO溶液緩慢加入溶有QDs的四氫呋喃中，加完后繼續(xù)攪拌12h。用1000ml去離子水透析24h，除去有機(jī)溶劑、未反應(yīng)的4-NH₂-TEMPO以及其他的一些副產(chǎn)物。透析過程的前4小時每小時換一次水，隨后繼續(xù)透析20小時。透析結(jié)束后將透析袋內(nèi)的液體凍干得到淺黃色固體。在激發(fā)波長460nm下，600nm處的熒光峰是屬于QDs@PLA-PNNUA和QDs@PLA-PNNUA-TEMPO膠束中QDs所發(fā)出熒光(包埋油溶性QDs的多功能納米膠束的電子順磁共振圖譜和熒光圖譜，附圖4和附圖8)。(在本專利中QDs用于靶向驗證的熒光標(biāo)記，同時也可視為藥物模型。)

四小鼠MCF-7腋皮下接種腫瘤模型的建立以及對新配體的靶向性能驗證，與實施例1除去把在激發(fā)波長改為460nm接受波長改為590nm外，其余相同，結(jié)果如附圖9所示

實驗結(jié)果

附圖9(C)從左至右依次為：I為尾部靜脈注射100μL生理鹽水對照組小鼠的成像圖，II為尾部靜脈注射QDs@PLA-PNNUA納米膠束(5mg/mL，200μL)的實驗小鼠成像圖，III為尾部靜脈注射QDs@PLA-PNNUA-TEMPO納米膠束(5mg/mL，200μL)的實驗小鼠成像圖，圖中箭頭處為荷瘤位置。圖9為注射樣品后小鼠成像以及各組織成像在460nm激發(fā)，590nm收集的成像圖譜。從圖中可以看出，給藥1h后，與I組和II組荷瘤小鼠相比，注射QDs@PLA-PNNUA-TEMPO膠束組的小鼠III活體成像在荷瘤部位的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，表明小鼠荷瘤部位的QDs濃度較高，進(jìn)而說明QDs@PLA-PNNUA-TEMPO膠束組在腫瘤部位的聚集濃度比QDs@PLA-PNNUA-PAS膠束組聚集的濃度要大。這個結(jié)果與實施例1的小鼠活體成像結(jié)果具有一致性。

為了進(jìn)一步證明由活體熒光成像所得到的納米膠束組的成像結(jié)果以及納米膠束在小鼠體內(nèi)分布情況，將注射1h后的小鼠進(jìn)行解剖，并得到解剖器官的熒光成像圖。結(jié)果如圖9(D)所示，各離體器官的熒光強(qiáng)度與活體成像所得到的結(jié)果相似，在離體成像圖中，從上至下依次為心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和腫瘤組織。從圖中可看出，肝臟和腎臟的熒光強(qiáng)度很高，這也是由于這兩個器官的自發(fā)熒光很高和“排毒”性能，與生理鹽水組和無TEMPO的納米膠束組相比，QDs@PLA-PNNUA-TEMPO納米膠束組腫瘤組織處有較強(qiáng)的熒光，此結(jié)果與小鼠活體熒光成像結(jié)果具有一致性。

許多研究表明在濃度相同的條件下Cy5.5在組織成像的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于QDs，但從圖7(B)和9(D)所示的結(jié)果來看，在相同標(biāo)尺下(10⁸)，在腫瘤部位的熒光強(qiáng)度幾乎相同。這是由于我們所用的聚合物具有良好的pH性能，當(dāng)膠束進(jìn)入腫瘤組織時，因腫瘤組織的弱酸性，膠束結(jié)構(gòu)遭到破壞，釋放出包埋的油溶性CdTe QDs。由于油溶性CdTe QDs具有疏水性能，不溶于血液，不易被血液帶走，從而可以聚集在腫瘤部位，這樣就會使腫瘤部位的QDs濃度增大，顯示出較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。這也進(jìn)一步驗證了我們制備的響應(yīng)性材料具有良好的環(huán)境響應(yīng)能力。

所述的納米膠束可換作納米顆粒、納米囊泡、納米管等載體中的一種或幾種，進(jìn)行TEMPO靶向性能的驗證。

實施例3

TEMPO對炎癥的靶向性驗證：

采用美洲大蠊提取液，蟑螂提取液誘發(fā)等方法構(gòu)建小鼠肺炎癥模型，利用實施例1中材料和試驗方法來驗證TEMPO對炎癥的靶向，結(jié)果表明含有TEMPO的載藥載體對炎癥部位有一定的靶向性。

實施例4

TEMPO對動脈硬化的部位靶向性驗證：

利用腹腔注射蛋黃乳液等方法構(gòu)建小鼠高血脂模型。構(gòu)建方法：通過在動物飼料中加入過量的膽固醇和脂肪，飼養(yǎng)一定時間后，它的主動脈及冠狀動脈處會逐漸形成粥樣硬化斑塊，并出現(xiàn)高血脂癥。高膽固醇和高脂飲食，加入少量膽酸鹽，可增加膽固醇的吸收，如再加入甲狀腺抑制藥--甲基硫氧嘧啶或丙基硫氧嘧啶可進(jìn)一步加速病變的形成。利用實施例1中材料和試驗方法來驗證TEMPO對動脈硬化的靶向，結(jié)果表明含有TEMPO的載藥載體對動脈硬化部位有一定的靶向性。

實施例5

利用含有TEMPO及其衍生物的納米載藥載體，對各種由自由基過多而引起疾病(如：腦血栓、腦的再灌流性損害、胃炎、消化性潰瘍、原發(fā)性腎小球疾病、糖尿病(糖尿病食品)、支氣管哮喘、肺氣腫、震顫麻痹癥等病癥)的病灶部位進(jìn)行靶向?qū)嶒?，結(jié)果表明含有TEMPO的載藥載體對這些病灶部位有一定的靶向性。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。