本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種針對(duì)人腫瘤干細(xì)胞的小鼠單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，以及產(chǎn)生所述抗體的雜交瘤細(xì)胞。本發(fā)明還涉及所述抗體在腫瘤治療和診斷中的用途。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤(癌癥)已成為威脅全世界人民生命與健康的“頭號(hào)殺手”。全世界每年腫瘤的發(fā)病人數(shù)超過1400萬，僅在我國每年新增的腫瘤患者超過300萬。

導(dǎo)致癌癥高死亡率的根本原因是癌細(xì)胞的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移和治療后多數(shù)患者易復(fù)發(fā)和耐藥。臨床上現(xiàn)有的治療手段，手術(shù)、放療、化療對(duì)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥療效甚微，或只有近期療效，并不能改變患者長(zhǎng)期的存活情況。目前，手術(shù)切除對(duì)大約10-20％的早期患者效果好，但對(duì)已發(fā)生擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的患者幾乎無效。放療只能治療局部病灶，常作為術(shù)前、術(shù)后的輔助治療和少數(shù)種類癌癥的根治性治療?；熆捎糜谝寻l(fā)生擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的患者，但因毒副作用大，容易產(chǎn)生近期或遠(yuǎn)期的耐藥，因而只能對(duì)大約20-30％的患者有明顯的近期療效。即使采用手術(shù)、放療和化療聯(lián)合應(yīng)用的綜合治療措施，其生存5年的遠(yuǎn)期療效多年一直徘徊在20-30％，約70-80％的患者在治療后因轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥在5年內(nèi)死亡。即便是就診時(shí)無轉(zhuǎn)移的早期癌癥患者，也還是有一部分在治療后發(fā)生轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)而死亡。近年發(fā)展起來的腫瘤的新型靶向藥物，包括多肽、小分子、蛋白因子、基因治療及抗體藥物，與化療藥聯(lián)合應(yīng)用通常也只能相對(duì)現(xiàn)有治療手段延長(zhǎng)患者生存期3～9個(gè)月，對(duì)遠(yuǎn)期患者的5年生存率沒有顯著的提高。最近兩年新興起的腫瘤免疫治療手段，例如針對(duì)免疫檢查點(diǎn)的pd-1單抗藥物以及car-t細(xì)胞療法，雖然已經(jīng)表現(xiàn)出可取得一些令人鼓舞的遠(yuǎn)期療效的跡象，但總體對(duì)癌癥患者的有效率僅能達(dá)到20-30％左右，仍然有大量的癌癥患者得不到真正有效的藥物的救治。因此提高腫瘤患者遠(yuǎn)期療效、延長(zhǎng)生存期的關(guān)鍵是開發(fā)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥的新型藥物。

發(fā)明概述

在第一方面，本發(fā)明提供了一種單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，所述單克隆抗體由于2016年3月16日以保藏號(hào)cgmccno.12251保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。

在第二方面，本發(fā)明提供了一種雜交瘤細(xì)胞，其以保藏號(hào)cgmccno.12251于2016年3月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。

在第三方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段以及藥學(xué)上可接受的載體。

在一些實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與選自細(xì)胞毒素、放射性同位素或生物活性蛋白質(zhì)的治療性部分綴合。

在第四方面，本發(fā)明提供了一種在患者中治療惡性腫瘤、預(yù)防和/或治療惡性腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的方法，所述方法包括給所述患者施用有效量的本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段或本發(fā)明的藥物組合物。

在一些實(shí)施方案中，所述惡性腫瘤選自乳腺癌、大腸癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌和胃癌。

在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括給所述患者施用其它抗腫瘤治療手段，例如施用化療劑、靶向其它腫瘤特異性抗原的抗體或放療。

在第五方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段或本發(fā)明的藥物組合物在制備用于治療惡性腫瘤、預(yù)防和/或治療惡性腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的藥物中的用途。

在一些實(shí)施方案中，所述惡性腫瘤選自乳腺癌、大腸癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌和胃癌。

在第六方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)生物學(xué)樣品中腫瘤干細(xì)胞存在的方法，包括：

a)使所述生物學(xué)樣品與本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段接觸；

b)檢測(cè)本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述生物學(xué)樣品中的靶抗原的結(jié)合，其中檢出所述結(jié)合代表所述生物學(xué)樣品中存在腫瘤干細(xì)胞。

在第七方面，本發(fā)明還提供一種用于分離腫瘤干細(xì)胞的方法，所述方法包括：

(a)提供疑似包含腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞群；

(b)鑒定所述細(xì)胞的亞群，其結(jié)合本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段；和

(c)分離所述亞群。

在第六和第七方面的一些實(shí)施方案中，所述腫瘤干細(xì)胞選自乳腺癌干細(xì)胞、大腸癌干細(xì)胞、胰腺癌干細(xì)胞、前列腺癌干細(xì)胞、肝癌干細(xì)胞、肺癌干細(xì)胞和胃癌干細(xì)胞。

在第八方面，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)患者中惡性腫瘤的存在的方法，包括：

a)使獲得自所述患者的生物學(xué)樣品與本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段接觸；

b)檢測(cè)本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述生物學(xué)樣品中的靶抗原的結(jié)合，其中檢出代表所述患者中存在惡性腫瘤。

在第九方面，本發(fā)明還提供一種用于預(yù)后患者中惡性腫瘤復(fù)發(fā)或進(jìn)展的方法，所述方法包括：

(a)從所述患者中分離包含循環(huán)細(xì)胞的生物學(xué)樣品；

(b)使所述包含循環(huán)細(xì)胞的生物學(xué)樣品與本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段接觸；和

(c)鑒定結(jié)合本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段的循環(huán)細(xì)胞的存在，

從而預(yù)后所述患者中惡性腫瘤的復(fù)發(fā)或進(jìn)展。

在一些實(shí)施方案中，所述惡性腫瘤的進(jìn)展包含所述惡性腫瘤在患者中的轉(zhuǎn)移。

在第八和第九方面的一些實(shí)施方案中，所述生物學(xué)樣品包括血液樣品、淋巴樣品或其組分。在一些實(shí)施方案中，所述惡性腫瘤選自乳腺癌、大腸癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌和胃癌。

附圖說明

圖1.活細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)單抗hetumomab靶抗原在多種腫瘤細(xì)胞活細(xì)胞表面的表達(dá)(部分典型陽性結(jié)果)。

圖2.免疫組化檢測(cè)單抗hetumomab靶抗原在人肝癌、肺癌、胃癌組織中特異高表達(dá)(部分典型陽性結(jié)果)。

圖3.免疫流式熒光檢測(cè)單抗hetumomab識(shí)別的癌細(xì)胞在人多種腫瘤細(xì)胞系的sphere培養(yǎng)細(xì)胞中均顯著富集(部分典型的流式熒光圖譜)。

圖4.cck8法檢測(cè)單抗hetumomab識(shí)別的多種人腫瘤細(xì)胞(如肝癌、肺癌、胃癌)的hetumomab+細(xì)胞的耐藥能力(ic50)。

圖5.單抗hetumomab顯著抑制多種腫瘤(如肝癌、肺癌、胃癌)的腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力(成球)。

圖6.單抗hetumomab顯著抑制多種腫瘤(如肝癌、肺癌、胃癌)的腫瘤干細(xì)胞的侵襲能力。

圖7.單抗hetumomab顯著抑制多種腫瘤的腫瘤干細(xì)胞的侵襲能力。

圖8.單抗hetumomab及聯(lián)合化療藥物治療人肝癌移植瘤bel7402-v13的體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)曲線。

圖9.單抗hetumomab及聯(lián)合化療藥物治療人肝癌移植瘤bel7402-v13的體內(nèi)腫瘤體積抑制率(停藥時(shí))。

圖10.單抗hetumomab及聯(lián)合化療藥物治療人肝癌移植瘤bel7402-v13的體內(nèi)腫瘤體積抑制率(停藥一個(gè)月后)。

圖11.單抗hetumomab及聯(lián)合化療藥物治療人肝癌移植瘤bel7402-v13的小鼠的生存曲線。

圖12.單抗hetumomab治療人肺癌移植瘤spca-1的體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)曲線。

圖13.單抗hetumomab及聯(lián)合化療藥物治療人胃癌移植瘤snu-5的體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)曲線。

發(fā)明詳述

一、定義

在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的蛋白質(zhì)和核酸化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞和組織培養(yǎng)、微生物學(xué)、免疫學(xué)相關(guān)術(shù)語和實(shí)驗(yàn)室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的術(shù)語和常規(guī)步驟。同時(shí)，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語的定義和解釋。

如本文所用，“抗體”指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，無論天然的或者部分或全部合成(例如重組)產(chǎn)生的，包括其至少包含免疫球蛋白分子的部分可變區(qū)的保留全長(zhǎng)免疫球蛋白的結(jié)合特異性能力的任何片段。因此，抗體包括具有與免疫球蛋白抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(抗體結(jié)合位點(diǎn))同源或基本上同源的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何蛋白?？贵w包括抗體片段，例如抗腫瘤干細(xì)胞抗體片段。如本文所用，因此術(shù)語抗體包括合成抗體、重組產(chǎn)生的抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人抗體、非人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、胞內(nèi)抗體以及抗體片段，例如但不限于fab片段、fab'片段、f(ab’)2片段、fv片段、二硫鍵連接的fv(dsfv)、fd片段、fd’片段、單鏈fv(scfv)、單鏈fab(scfab)、雙抗體、抗獨(dú)特型(抗id)抗體、或者上述任何抗體的抗原結(jié)合片段。本文所提供的抗體包括任何免疫球蛋白類型(例如，igg、igm、igd、ige、iga和igy)、任何類別(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亞類(例如，igg2a和igg2b)的成員。

如本文所用，抗體的“抗體片段”或“抗原結(jié)合片段”指全長(zhǎng)抗體的任何部分，其少于全長(zhǎng)，但是至少包含結(jié)合抗原的所述抗體的部分可變區(qū)(例如一個(gè)或多個(gè)cdr和/或一個(gè)或多個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn))，并且因此保留結(jié)合特異性以及所述全長(zhǎng)抗體的至少部分特異性結(jié)合能力。因此，抗原結(jié)合片段指包含與衍生抗體片段的抗體結(jié)合相同抗原的抗原結(jié)合部分的抗體片段。抗體片段包括通過酶促處理全長(zhǎng)抗體所產(chǎn)生的抗體衍生物，以及合成產(chǎn)生的衍生物，例如重組產(chǎn)生的衍生物?？贵w包括抗體片段?？贵w片段的實(shí)例包括但不限于fab、fab'、f(ab’)2、單鏈fv(scfv)、fv、dsfv、雙抗體、fd和fd’片段以及其他片段，包括修飾的片段(參見，例如，methodsinmolecularbiology,vol207:recombinantantibodiesforcancertherapymethodsandprotocols(2003)；chapter1；p3-25,kipriyanov)。所述片段可以包括連接在一起的多條鏈，例如通過二硫鍵和/或通過肽接頭?？贵w片段一般包含至少或約50個(gè)氨基酸，并且典型至少或約200個(gè)氨基酸。抗原結(jié)合片段包括任何抗體片段，其在被插入抗體框架(例如通過置換相應(yīng)區(qū)域)時(shí)獲得免疫特異性地結(jié)合(即表現(xiàn)出至少或至少約10⁷-10⁸m^-1的ka)抗原的抗體。

如本文所用，“單克隆抗體”指相同抗體的群體，表示單克隆抗體群體中的每個(gè)單獨(dú)的抗體分子與其他抗體分子相同。這種特性與抗體的多克隆群體的特性相反，所述抗體的多克隆群體包含具有多種不同序列的抗體。單克隆抗體可以通過許多公知的方法來制備(smithetal.(2004)j.clin.pathol.57,912-917；和nelsonetal.,jclinpathol(2000),53,111-117)。例如，單克隆抗體可以通過永生化b細(xì)胞來制備，例如通過與骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞系或者通過用諸如ebv的病毒感染b細(xì)胞。重組技術(shù)還可以用來在體外通過用攜帶編碼抗體的核苷酸的人工序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞來從宿主細(xì)胞的克隆群體制備抗體。

如本文中所用，術(shù)語“雜交瘤”或“雜交瘤細(xì)胞”指由融合產(chǎn)抗體的淋巴細(xì)胞和不產(chǎn)抗體的癌細(xì)胞而產(chǎn)生的細(xì)胞或細(xì)胞系(通常為骨髓瘤或淋巴瘤細(xì)胞)。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的，雜交瘤可增殖并持續(xù)供應(yīng)產(chǎn)生特定單克隆抗體。用于產(chǎn)生雜交瘤的方法為本領(lǐng)域已知的(見例如，harlow&lane，1988)。當(dāng)提及術(shù)語“雜交瘤”或“雜交瘤細(xì)胞”時(shí)，其還包括雜交瘤的亞克隆和后代細(xì)胞。

如本文所用，術(shù)語“表位”指抗體的互補(bǔ)位結(jié)合的抗原上的任何抗原決定簇。表位決定簇通常包含分子的化學(xué)活性表面分型，例如氨基酸或糖側(cè)鏈，并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。

如本文所用，關(guān)于抗體或其抗原結(jié)合片段的“特異性結(jié)合”或“免疫特異性地結(jié)合”在本文中可交換使用，并且指抗體或抗原結(jié)合片段通過抗體和抗原的抗體結(jié)合位點(diǎn)之間的非共價(jià)相互作用與同種抗原形成一個(gè)或多個(gè)非共價(jià)鍵的能力。所述抗原可以是分離的抗原或存在于腫瘤細(xì)胞。通常，免疫特異性地結(jié)合(或特異性結(jié)合)抗原的抗體是以約或1×10⁷m^-1或1x10⁸m^-1或更大的親和常數(shù)ka(或者1x10^-7m或1×10^-8m或更低的解離常數(shù)(kd))結(jié)合所述抗原。親和常數(shù)可以通過抗體反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)力學(xué)方法來測(cè)定，例如，免疫測(cè)定、表面等離子共振(spr)(richandmyszka(2000)curr.opin.biotechnol11:54；englebienne(1998)analyst.123:1599)、等溫滴定量熱法(itc)或本領(lǐng)域已知的其他動(dòng)力學(xué)相互作用測(cè)定(參見，例如，paul,ed.,fundamentalimmunology,2nded.,ravenpress,newyork,pages332-336(1989)；還參見描述用于計(jì)算抗體的結(jié)合親和力的示例性spr和itc方法的美國專利第7,229,619號(hào))。用于實(shí)時(shí)檢測(cè)和監(jiān)測(cè)結(jié)合速率的儀器和方法是已知的，并且可商購(參見，biacore2000,biacoreab,upsala,swedenandgehealthcarelifesciences；malmqvist(2000)biochem.soc.trans.27:335)。

如本文所用，關(guān)于抗體的術(shù)語“競(jìng)爭(zhēng)”是指第一抗體或其抗原結(jié)合片段以與第二抗體或其抗原結(jié)合片段足夠相似的方式結(jié)合一個(gè)表位，由此第一抗體與其關(guān)聯(lián)表位的結(jié)合結(jié)果在存在第二抗體的條件下與不存在第二抗體的條件下相比可檢測(cè)地降低?；蛘?，在第二抗體與其表位的結(jié)合在存在第一抗體條件下也可檢測(cè)地降低的情況中，可以但不必需是這種情況。也就是說，第一抗體可以抑制第二抗體與其表位的結(jié)合，而不用第二抗體抑制第一抗體與其各自表位的結(jié)合。然而，在每個(gè)抗體均可檢測(cè)地抑制另一抗體與其關(guān)聯(lián)表位或配體的結(jié)合的情況中，無論是相同、更高或更低程度，所述抗體被稱為彼此“交叉競(jìng)爭(zhēng)”結(jié)合其各自的表位。競(jìng)爭(zhēng)及交叉競(jìng)爭(zhēng)抗體均涵蓋在本發(fā)明中。無論這種競(jìng)爭(zhēng)或交叉競(jìng)爭(zhēng)發(fā)生的機(jī)制如何(例如位阻、構(gòu)象改變或者結(jié)合共同表位或其片段)，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本發(fā)明提供的教導(dǎo)將意識(shí)到這種競(jìng)爭(zhēng)和/或交叉競(jìng)爭(zhēng)抗體涵蓋在本發(fā)明中且可用于本發(fā)明揭示的方法中。

如本文所用，“多肽”指共價(jià)連接的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸。術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可交換使用。

"分離的蛋白質(zhì)"、"分離的多肽"或"分離的抗體"指所述蛋白質(zhì)、多肽或抗體(1)不與在其天然狀態(tài)下伴隨其天然相關(guān)成分關(guān)聯(lián)，(2)不含來自相同物種的其它蛋白質(zhì)，(3)由來自不同物種的細(xì)胞表達(dá)，或(4)不在天然中發(fā)生。因此，經(jīng)化學(xué)合成的多肽或在不同于多肽的天然來源細(xì)胞的細(xì)胞系統(tǒng)中合成的多肽將會(huì)與其天然相關(guān)成分"分離"。還可通過分離以使蛋白質(zhì)實(shí)質(zhì)上不含天然相關(guān)成分，即使用本領(lǐng)域眾所周知的蛋白質(zhì)純化技術(shù)。

如本文所用，“治療”患有疾病或疾病狀況的個(gè)體表示所述個(gè)體的癥狀部分或全部緩解，或者在治療后保持不變。因此，治療包括預(yù)防、治療和/或治愈。預(yù)防指防止?jié)撛诩膊『?或防止癥狀惡化或疾病發(fā)展。治療還包括所提供的任何抗體或其抗原結(jié)合片段以及本文所提供的組合物的任何藥學(xué)用途。

如本文所用，“療效”表示由個(gè)體的治療所導(dǎo)致的效果，其改變、通常改良或改善疾病或疾病狀況的癥狀，或者治愈疾病或疾病狀況。

如本文所用，“治療有效量”或“治療有效劑量”指施用于對(duì)象之后至少足以產(chǎn)生療效的物質(zhì)、化合物、材料或包含化合物的組合物的量。因此，其為防止、治愈、改善、阻滯或部分阻滯疾病或病癥的癥狀所必需的量。

如本文所用，“預(yù)防有效量”或“預(yù)防有效劑量”指在施用于對(duì)象時(shí)會(huì)具有預(yù)期的預(yù)防效果的物質(zhì)、化合物、材料或包含化合物的組合物的量，例如，防止或延遲疾病或癥狀的發(fā)生或復(fù)發(fā)，減少疾病或癥狀發(fā)生或復(fù)發(fā)的可能性。完全預(yù)防有效劑量不必通過施用一個(gè)劑量發(fā)生，并且可以僅在施用一系列劑量之后發(fā)生。因此，預(yù)防有效量可以在一次或多次施用中施用。

如本文中所使用的，術(shù)語“患者”是指哺乳動(dòng)物，例如人。

“腫瘤干細(xì)胞”是指存在于腫瘤組織中的一小部分具有干性特征的癌細(xì)胞，其與普通癌細(xì)胞相比具有自我更新能力、強(qiáng)侵襲能力、耐受化療藥物能力和強(qiáng)致瘤能力。

二、針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的單克隆抗體

在本發(fā)明中，采用人腫瘤多能干細(xì)胞系作為免疫原免疫小鼠，通過經(jīng)典的雜交瘤融合技術(shù)獲得了單克隆抗體hetumomab。產(chǎn)生單克隆抗體hetumomab的小鼠雜交瘤細(xì)胞株hetumomab于2016年3月16日以保藏號(hào)cgmccno.12251保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。(實(shí)施例1)

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的單克隆抗體hetumomab的靶抗原表達(dá)于多種人腫瘤細(xì)胞的活細(xì)胞表面，并且在多種腫瘤組織中特異性高表達(dá)(陽性率79％-94％)。本發(fā)明的hetumomab單抗能夠在多種腫瘤細(xì)胞的sphere培養(yǎng)細(xì)胞中富集且能夠識(shí)別esa、cd90等腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的腫瘤細(xì)胞，提示hetumomab單抗是特異性針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的單克隆抗體(實(shí)施例2)。

進(jìn)一步的基于hetumomab靶抗原陽性腫瘤細(xì)胞的研究顯示，相對(duì)于親本腫瘤細(xì)胞和hetumomab靶抗原陰性腫瘤細(xì)胞，hetumomab靶抗原陽性腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新、侵襲、耐藥和體內(nèi)致瘤能力，進(jìn)一步證明hetumomab單抗特異性靶向腫瘤干細(xì)胞(實(shí)施例3)。

本發(fā)明的hetumomab單抗特異性靶向的腫瘤干細(xì)胞包括但不限于乳腺癌干細(xì)胞、大腸癌干細(xì)胞、胰腺癌干細(xì)胞、前列腺癌干細(xì)胞、肝癌干細(xì)胞、肺癌干細(xì)胞和胃癌干細(xì)胞。

因此，本發(fā)明提供了一種單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，所述單克隆抗體由于2016年3月16日以保藏號(hào)cgmccno.12251保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。

本發(fā)明還涵蓋分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其與hetumomab競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合腫瘤干細(xì)胞。

本發(fā)明還涵蓋分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其與hetumomab結(jié)合腫瘤干細(xì)胞上的相同表位。

三、疾病治療

腫瘤干細(xì)胞是存在于腫瘤組織中的一小部分具有干性特征的癌細(xì)胞，具有以下生物學(xué)特征：能夠自我更新、復(fù)制，不定向分化，高致瘤性，高侵襲擴(kuò)散轉(zhuǎn)移能力，對(duì)放化療均不敏感。由于存在腫瘤干細(xì)胞，使得腫瘤不斷快速生長(zhǎng)、擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)。更為嚴(yán)重的是腫瘤干細(xì)胞對(duì)幾乎所有的傳統(tǒng)化療藥物、放療及近年上市的靶向藥物(包括抗體靶向藥物)均耐藥。腫瘤干細(xì)胞均處于細(xì)胞周期的g0期不生長(zhǎng)、不增殖狀態(tài)。放化療只對(duì)處于高度快速生長(zhǎng)增殖的癌細(xì)胞有作用，而不能殺滅處于g0期的腫瘤干細(xì)胞。而且當(dāng)放化療將大量快速生長(zhǎng)的癌細(xì)胞殺滅后，抵抗放化療的腫瘤干細(xì)胞反而被篩選富集，比例大大提高。由于腫瘤干細(xì)胞具有極強(qiáng)的自我復(fù)制能力和擴(kuò)散轉(zhuǎn)移能力，這些腫瘤干細(xì)胞會(huì)快速分化增殖，生長(zhǎng)并擴(kuò)散，轉(zhuǎn)移至全身各器官形成新的轉(zhuǎn)移病灶，而這種轉(zhuǎn)移病灶的癌細(xì)胞均抵抗放化療，在乳腺癌、大腸癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中已經(jīng)證明了腫瘤干細(xì)胞的存在。惡性程度越高的癌癥，腫瘤干細(xì)胞越多，而腫瘤干細(xì)胞比例越高的癌癥患者轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)越多，生存期越短。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的特異性識(shí)別腫瘤干細(xì)胞的hetumomab單抗能夠在體外顯著抑制多種腫瘤干細(xì)胞的自我更新、侵襲和耐藥能力(實(shí)施例4)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，hetumomab單抗能夠在動(dòng)物模型中抑制多種腫瘤移植瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和耐藥(實(shí)施例5)。因此，本發(fā)明的hetumomab單抗能夠通過靶向腫瘤干細(xì)胞而用于治療惡性腫瘤、預(yù)防或/或治療惡性腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。

由此，本發(fā)明提供了一種在患者中治療惡性腫瘤、預(yù)防或/或治療惡性腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的方法，所述方法包括給所述患者施用有效量的本發(fā)明的針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的抗體或其抗原結(jié)合片段?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的方法治療的惡性腫瘤包括但不限于乳腺癌、大腸癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌和胃癌。

四、藥物組合物

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的抗體或其抗原結(jié)合片段以及藥學(xué)上可接受的載體。所述藥物組合物用于在患者中治療惡性腫瘤、預(yù)防或/或治療惡性腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。

本文使用的“藥學(xué)上可接受的載體”包括生理學(xué)相容的任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，該載體適合于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊柱或表皮施用(如通過注射或輸注)。根據(jù)施用途徑，可將活性化合物即抗體分子、免疫綴合物包裹于一種材料中，以保護(hù)該化合物免受可使該化合物失活的酸和其他天然條件的作用。

本發(fā)明的藥物組合物也可含有藥學(xué)上可接受的抗氧化劑。藥學(xué)上可接受的抗氧化劑的例子包括：(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉，亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁羥茴醚(bha)、丁羥甲苯(bht)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

這些組合物還可含有佐劑，如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和分散劑。

可以通過滅菌程序或通過包含諸如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑確保防止存在微生物。在很多情況下，組合物中優(yōu)選包含等滲劑，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化鈉。通過在組合物中加入延遲吸收劑，例如單硬脂酸鹽和明膠，可實(shí)現(xiàn)注射型藥物延長(zhǎng)的吸收。

藥學(xué)上可接受的載體包括無菌水溶液或分散液和用于臨時(shí)制備無菌注射液或分散液的粉末劑。這些用于藥學(xué)活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的使用是本領(lǐng)域公知的。常規(guī)介質(zhì)或試劑，除了任何與活性化合物不相容的范圍外，都可能在本發(fā)明的藥物組合物中。還可以向組合物中摻入補(bǔ)充的活性化合物。

治療性組合物一般必須是無菌的并且在制備和貯存條件下穩(wěn)定的?？梢詫⒔M合物配制成溶液、微乳狀液、脂質(zhì)體或其他適合高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物的溶劑或分散劑。例如，通過使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情況下通過保持所需的顆粒大小，以及通過使用表面活性劑，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。

通過將活性化合物以需要的量混入合適的溶劑中，并且根據(jù)需要加入以上列舉的成分中的一種或其組合，接著無菌微過濾，可制備無菌注射液。通常，通過將活性化合物摻入到含有基本分散介質(zhì)和上面所列其他所需成分的無菌載體中制備分散劑。對(duì)于用于制備無菌注射液的無菌粉末劑，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，由其預(yù)先無菌過濾的溶液得到活性成分加任何額外所需成分的粉末。

可以與載體材料組合制備單一劑量形式的活性成分的量根據(jù)所治療的對(duì)象和特定給藥方式而不同?？梢耘c載體材料組合制備單一劑量形式的活性成分的量一般是產(chǎn)生治療效果的組合物的量。通常，以100％計(jì)，這個(gè)量的范圍是大約0.01％至大約99％的活性成分，優(yōu)選大約0.1％至大約70％，最優(yōu)選大約1％至大約30％的活性成分，與藥學(xué)上可接受的載體相組合。

可以調(diào)節(jié)劑量方案以提供最佳的期望的反應(yīng)(例如，治療反應(yīng))。例如，可以施用單一推注，可以隨時(shí)間施用幾次分開的劑量，或者根據(jù)治療狀況的緊急情況所需，可以按比例減小或增加劑量。特別有利的是將腸胃外組合物配制成容易給藥并且劑量均勻的劑量單位形式。此處使用的劑量單位形式是指適合作為單位劑量用于所治療的對(duì)象的物理不連續(xù)單位；每個(gè)單位含有預(yù)定量的活性化合物，經(jīng)計(jì)算該預(yù)定量的活性化合物與需要的藥物載體組合產(chǎn)生所需的治療效果。對(duì)本發(fā)明劑量單位形式的具體說明限定于且直接依賴于(a)活性化合物的獨(dú)特特性和要達(dá)到的特定治療效果，和(b)本領(lǐng)域中固有的對(duì)于配制這種用于治療個(gè)體敏感性的活性化合物的限制。

對(duì)于抗體分子的給藥而言，劑量范圍為約0.0001至100mg/kg，更通常為0.01至20mg/kg受者體重。例如，劑量可以是0.3mg/kg體重、1mg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重，10mg/kg體重或20mg/kg體重，或在1-20mg/kg范圍內(nèi)。示例性的治療方案需要每周給藥一次、每?jī)芍芤淮?、每三周一次、每四周一次、每月一次、?個(gè)月一次、每3-6個(gè)月一次、或起始給藥間隔略短(如每周一次至每三周一次)后期給藥間隔加長(zhǎng)(如每月一次至每3-6個(gè)月一次)。

或者，針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的抗體分子也可以作為持續(xù)釋放制劑來給藥，在此情況中需要頻率較低的給藥。劑量和頻率根據(jù)抗體分子在患者中的半衰期而不同。通常，人抗體表現(xiàn)出最長(zhǎng)的半衰期，之后是人源化抗體、嵌合抗體和非人類抗體。給藥劑量和頻率根據(jù)處理是預(yù)防性的還是治療性的而不同。在預(yù)防性應(yīng)用中，在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)以較不頻繁的間隔給予相對(duì)較低的劑量。有些患者在余生中持續(xù)接受處理。在治療性應(yīng)用中，有時(shí)需要以較短的間隔給予較高的劑量，直到疾病的進(jìn)展減輕或停止，優(yōu)選直到患者表現(xiàn)為疾病癥狀部分或完全改善。之后，可以以預(yù)防性方案給患者給藥。

本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可能改變，以獲得可有效實(shí)現(xiàn)對(duì)特定患者、組合物和給藥方式的所需治療反應(yīng)，而對(duì)患者無毒性的活性成分的量。選擇的劑量水平取決于多種藥物代謝動(dòng)力學(xué)因素，包括應(yīng)用的本發(fā)明特定組合物的活性，給藥途徑，給藥時(shí)間，應(yīng)用的特定化合物的排泄速率，治療的持續(xù)時(shí)間，與應(yīng)用的特定組合物聯(lián)合應(yīng)用的其他藥物、化合物和/或材料，接受治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、總體健康情況和病史，以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的類似因素。

“有效量”的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段優(yōu)選地導(dǎo)致疾病癥狀的嚴(yán)重性降低，疾病無癥狀期的頻率和持續(xù)時(shí)間增加，或者防止因疾病痛苦而引起的損傷或失能。例如，對(duì)于腫瘤的治療，相對(duì)于未接受治療的對(duì)象，“有效量”的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段優(yōu)選地將細(xì)胞生長(zhǎng)或腫瘤生長(zhǎng)抑制至少約10％，優(yōu)選至少約20％，更優(yōu)選至少約30％，更優(yōu)選至少約40％，更優(yōu)選至少約50％，更優(yōu)選至少約60％，更優(yōu)選至少約70％，更優(yōu)選至少約80％。抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力可以在預(yù)測(cè)對(duì)人類腫瘤的療效的動(dòng)物模型系統(tǒng)中評(píng)價(jià)。或者，也可以通過檢查抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的能力來評(píng)價(jià)，這種抑制可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的試驗(yàn)在體外測(cè)定。有效量的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段能夠減小腫瘤大小，或者以其他方式緩解對(duì)象的癥狀如預(yù)防和/或治療轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)如下因素確定這種量，如對(duì)象的大小、對(duì)象癥狀的嚴(yán)重性和選擇的特定組合物或給藥途徑。

本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段或本發(fā)明的藥物組合物可以利用本領(lǐng)域公知的一種或多種方法通過一種或多種給藥途徑給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，給藥途徑和/或方式根據(jù)期望的結(jié)果而不同。本發(fā)明的抗體優(yōu)選給藥途徑包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、脊柱或其他腸胃外給藥途徑，例如注射或輸注。本文使用的短語“腸胃外給藥”是指除腸和局部給藥以外的給藥模式，通常是注射，包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。

或者，本發(fā)明的針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的抗體或其抗原結(jié)合片段或本發(fā)明的藥物組合物也可以通過非腸胃外途徑給藥，如局部、表皮或粘膜途徑給藥，例如，鼻內(nèi)、經(jīng)口、陰道、直腸、舌下或局部。

活性化合物可以與保護(hù)化合物不被快速釋放的載體一起制備，例如控釋制劑，包括植入物、透皮貼劑和微膠囊遞送系統(tǒng)。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這樣的制劑的很多方法受專利保護(hù)或者通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。參見，例如，sustainedandcontrolledreleasedrugdeliverysystems，j.r.robinson，ed.，marceldekker，inc.，newyork，1978。

治療性組合物可應(yīng)用本領(lǐng)域公知的醫(yī)療裝置給藥。例如，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療組合物可用無針皮下注射裝置給藥，如在美國專利no.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公開的裝置?？捎糜诒景l(fā)明的公知的植入物和模塊的例子包括：美國專利no.4,487,603，該專利公開了用于以受控速率分散藥物的可植入微量輸注泵；美國專利no.4,486,194，該專利公開了用于通過皮膚給藥的治療裝置；美國專利no.4,447,233，該專利公開了用于以精確的輸注速率遞送藥物的醫(yī)用輸注泵；美國專利no.4,447,224，該專利公開了用于連續(xù)遞送藥物的變流可植入輸注裝置；美國專利no.4,439,196，該專利公開了具有多腔區(qū)室的滲透藥物遞送系統(tǒng)：和美國專利no.4,475,196，該專利公開了一種滲透藥物遞送系統(tǒng)。這些專利引入本文作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知許多其他這樣的植入物、遞送系統(tǒng)和模塊。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的抗體可配制為確保在體內(nèi)的正確分布。例如，血-腦屏障(bbb)阻止了許多高度親水性的化合物。為了確保本發(fā)明的治療性化合物能夠跨過bbb(如果需要時(shí))，可將它們配制在如脂質(zhì)體中。至于制備脂質(zhì)體的方法，參見，例如，美國專利4,522,811；5,374,548和5,399,331。脂質(zhì)體包含可被選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)入特定細(xì)胞或器官內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)靶向部分，從而增強(qiáng)靶向藥物遞送(參見，例如，v.v.ranade(1989)j.clin.pharmacol.29：685)。靶向部分的例子包括葉酸或生物素(參見，例如，low等的美國專利5,416,016)；甘露糖苷(umezawa等(1988)biochem.biophys.res.commun.153：1038)；抗體(p.g.bloeman等(1995)febslett.357:140；m.owais等(1995)antimicrob.agentschemother.39:180)；表面活性劑蛋白a受體(briscoe等(1995)am.j.physiol.1233:134)；p120(schreier等(1994)j.biol.chem.269:9090)；也參見k.keinanen；m.l.laukkanen(1994)febslett.346:123；j.j.killion；i.j.fidler(1994)immunomethods4：273。

所述藥物組合物中本發(fā)明的針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的抗體或其抗原結(jié)合片段還可以與諸如細(xì)胞毒素、放射性同位素或生物活性蛋白質(zhì)等治療性部分綴合。

細(xì)胞毒素包括對(duì)細(xì)胞有害(例如殺傷細(xì)胞)的任何試劑。實(shí)例包括：紫杉醇、細(xì)胞松弛素b、短桿菌肽d、溴化乙啶、吐根堿、絲裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、秋水仙素、阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素d、1-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素和它們的類似物或同系物。

可用于綴合的治療劑還包括，例如：抗代謝物(例如，氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)，烷化劑(例如，氮芥、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(bsnu)和洛莫司汀(ccnu)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、鏈唑霉素、絲裂霉素c和順-二氯二胺合鉑(ii)(ddp)順鉑)，氨茴霉素類(例如，柔紅菌素(以前稱為道諾霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放線菌素d(以前稱為放線菌素)、博來霉素、光輝霉素和安曲霉素(amc))，和抗有絲分裂劑(例如，長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿)。

能與本發(fā)明的針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的抗體綴合的治療性細(xì)胞毒素的其他優(yōu)選例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、阿里他汀、和它們的衍生物。

可以利用本領(lǐng)域使用的接頭技術(shù)將細(xì)胞毒素與本發(fā)明的針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的抗體綴合。已經(jīng)用于將細(xì)胞毒素與針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的抗體綴合的接頭類型的實(shí)例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接頭?？梢赃x擇，例如，在溶酶體區(qū)室內(nèi)易被低ph切割或易被蛋白酶切割的接頭，該蛋白酶例如是在腫瘤組織中優(yōu)先表達(dá)的蛋白酶，如組織蛋白酶(例如組織蛋白酶b、c、d)。

關(guān)于細(xì)胞毒素的類型、用于綴合治療劑與抗體的接頭和方法的進(jìn)一步討論，參見saito，g.等(2003)adv.drugdeliv.rev.55：199-215；trail，p.a.等(2003)cancer.immunol.immunother.52：328-337；payne，g.(2003)cancercell3：207-212；allen，t.m.(2002)nat.rev.cancer2：750-763；pastan，i.和kreitman，r.j.(2002)curr.opin.investig.drugs3：1089-1091；senter，p.d.和springer，c.j.(2001)adv.drugdeliv.rev.53：247-264。

本發(fā)明的針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的抗體也可以與放射性同位素綴合，產(chǎn)生細(xì)胞毒性放射性藥物，也被稱作放射性抗體綴合物。能夠與診斷或治療性使用的抗體綴合的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、銦111、釔90和镥177。制備放射性抗體綴合物的方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)建立。

本發(fā)明的針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的抗體也可以與具有需要的生物活性的蛋白質(zhì)綴合，可用于修飾特定的生物學(xué)反應(yīng)。這樣的生物活性蛋白質(zhì)包括，例如：具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白a、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，如腫瘤壞死因子或干擾素-γ；或生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)物，如淋巴因子、白介素-1(“il-1”)、白介素-2(“il-2”)、白介素-6(“il-6”)、白介素-10(“il-10”)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“gm-csf”)、粒細(xì)胞集落刺激因子(“g-csf”)或其他免疫因子如ifn等。

將這種治療性部分與抗體分子綴合的技術(shù)是眾所周知的，參見，例如，arnon等，“monoclonalantibodiesforimmunotargetingofdrugsincancertherapy”，monoclonalantibodiesandcancertherapy，reisfeld等(ed.)，pp.243-56(alanr.liss，inc.1985)；hellstrom等，“antibodiesfordrugdelivery”，controlleddrugdelivery(2nded.)，robinson等(ed.)，pp.623-53(marceldekker，inc.1987)；thorpe，“antibodycarriersofcytotoxicagentsincancertherapy：areview”，monoclonalantibodies’84：biologicalandclinicalapplications，pinchera等(ed.)，pp.475-506(1985)；“analysis，results，andfutureprospectiveofthetherapeuticuseofradiolabeledantibodyincancertherapy”，monoclonalantibodiesforcancerdetectionandtherapy，baldwin等(ed.)，pp.303-16(academicpress1985)，和thorpe等，“thepreparationandcytotoxicpropertiesofantibody-toxinconjugates，”immunol.rev.，62：119-58(1982)。

五、聯(lián)合治療

本發(fā)明的針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的抗體或藥物組合物可以與化療劑或靶向其他腫瘤抗原的抗體聯(lián)合施用。本申請(qǐng)實(shí)施例5證明了本發(fā)明的hetumomab單克隆抗體與化療劑聯(lián)合施用在腫瘤治療中具有協(xié)同作用。不受任何理論的限制，認(rèn)為本發(fā)明的針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的抗體能夠抑制腫瘤耐藥功能，從而能夠在與化療劑或靶向其他腫瘤抗原的抗體組合施用時(shí)取得協(xié)同效果。

可以與本發(fā)明的抗體或本發(fā)明的藥物組合物組合使用的化療劑或靶向其他腫瘤抗原的抗體沒有特別限制。所述化療劑和靶向其他腫瘤抗原的抗體的實(shí)例包括但不限于：異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、美法侖、依諾他賓、卡培他濱、卡莫氟、克拉屈濱、吉西他濱、阿糖胞苷、替加氟、替加氟-尿嘧啶、ts-1、去氧氟尿苷、奈拉濱、羥基脲、氟尿嘧啶、氟達(dá)拉濱、培美曲塞、噴司他丁、巰嘌呤、甲氨蝶呤、伊立替康、依托泊苷、艾立布林、索布佐生、多西他賽、紫杉醇、長(zhǎng)春瑞濱、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春地辛、長(zhǎng)春堿、放線菌素d、阿柔比星、氨柔比星、伊達(dá)比星、表柔比星、凈司他丁酯、柔紅霉素、多柔比星、吡柔比星、博來霉素、培洛霉素、絲裂霉素c、米托蒽醌、奧沙利鉑、卡鉑、順鉑、奈達(dá)鉑、阿那曲唑、依西美坦、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、比卡魯胺、托瑞米芬、氟他胺、潑尼松龍、磷雌酚、米托坦、甲睪酮、亮丙瑞林、來曲唑、甲基安宮黃體酮、替伊莫單抗、伊馬替尼、依維莫司、厄洛替尼、吉非替尼、舒尼替尼、西妥昔單抗、索拉非尼、達(dá)沙替尼、他米巴羅汀、曲妥珠單抗、維甲酸、帕木單抗、貝伐單抗、硼替佐米、和拉帕替尼。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述化療劑是含鉑的化療劑，例如順鉑。

本發(fā)明的抗體和所述化療劑或靶向其他腫瘤抗原的抗體可以全部在一次施用或分開施用。當(dāng)分開施用時(shí)(采用互相不同的施用方案的情況下)，它們可以連續(xù)施用而不中斷或以預(yù)定的間隔施用。

本發(fā)明的抗體和所述化療劑或靶向其他腫瘤抗原的抗體在本發(fā)明的藥物組合物中的組合劑量沒有特別限制。如上所述，本發(fā)明的抗體的劑量可以通過參考當(dāng)所述抗體單獨(dú)使用時(shí)的劑量來確定。所述化療劑和靶向其他腫瘤抗原的抗體可以根據(jù)各自藥物標(biāo)明的劑量使用或可以減少(考慮到和本發(fā)明的抗體的組合效果)。

本發(fā)明的抗體或本發(fā)明的藥物組合物還可以與放療聯(lián)合，例如包括向患者施用電離輻射，其早于、在其過程中和/或晚于本發(fā)明的抗體或藥物組合物的施用過程。

六、腫瘤干細(xì)胞檢測(cè)和純化

如本文所述，本發(fā)明的hetumomab單克隆抗體特異性識(shí)別腫瘤干細(xì)胞。因此，本發(fā)明還提供一種檢測(cè)生物學(xué)樣品中腫瘤干細(xì)胞存在的方法，包括：

a)使所述生物學(xué)樣品與本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段接觸；

b)檢測(cè)本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述生物學(xué)樣品中的靶抗原的結(jié)合，其中檢出代表所述生物學(xué)樣品中存在腫瘤干細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤干細(xì)胞選自乳腺癌干細(xì)胞、大腸癌干細(xì)胞、胰腺癌干細(xì)胞、前列腺癌干細(xì)胞、肝癌干細(xì)胞、肺癌干細(xì)胞和胃癌干細(xì)胞。

在本發(fā)明上述檢測(cè)方法的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段還綴合有可用于檢測(cè)或可被其他試劑檢測(cè)到的熒光染料、化學(xué)物質(zhì)、多肽、酶、同位素、標(biāo)簽等。

用于檢測(cè)抗體-抗原結(jié)合的方法是本領(lǐng)域已知的，例如elisa等。

本發(fā)明還提供一種用于分離腫瘤干細(xì)胞的方法，所述方法包括：

(a)提供疑似包含腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞群；

(b)鑒定所述細(xì)胞的亞群，其結(jié)合本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段；和

(c)分離所述亞群。

例如，可以通過流式細(xì)胞術(shù)分離肝癌干細(xì)胞。

七、診斷和預(yù)后

如本文所述，本發(fā)明的單克隆抗體hetumomab的靶抗原表達(dá)于多種人腫瘤細(xì)胞的活細(xì)胞表面，并且在多種腫瘤組織中特異性高表達(dá)(陽性率79％-94％)。

因此，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)患者中惡性腫瘤的存在的方法，包括：

a)使獲得自所述患者的生物學(xué)樣品與本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段接觸；

b)檢測(cè)本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述生物學(xué)樣品中的靶抗原的結(jié)合，其中檢出代表所述患者中存在惡性腫瘤。

本發(fā)明還提供一種用于預(yù)后患者中惡性腫瘤復(fù)發(fā)或進(jìn)展的方法，所述方法包括：

(a)從所述患者中分離包含循環(huán)細(xì)胞的生物學(xué)樣品；

(b)使所述包含循環(huán)細(xì)胞的生物學(xué)樣品與本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段接觸；和

(c)鑒定結(jié)合本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段的循環(huán)細(xì)胞的存在，

從而預(yù)后所述患者中惡性腫瘤的復(fù)發(fā)或進(jìn)展。

在一些實(shí)施方案中，所述惡性腫瘤的進(jìn)展包含所述惡性腫瘤在患者中的轉(zhuǎn)移。

鑒定到結(jié)合本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段的循環(huán)細(xì)胞的存在提示所述患者中惡性腫瘤復(fù)發(fā)或進(jìn)展的高風(fēng)險(xiǎn)。

在一些實(shí)施方案中，所述生物學(xué)樣品包括血液樣品、淋巴樣品或其組分。

在一些實(shí)施方案中，所述惡性腫瘤選自乳腺癌、大腸癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌和胃癌。

在本發(fā)明上述方法的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段還綴合有可用于檢測(cè)或可被其他試劑檢測(cè)到的熒光染料、化學(xué)物質(zhì)、多肽、酶、同位素、標(biāo)簽等。

用于檢測(cè)抗體-抗原結(jié)合的方法是本領(lǐng)域已知的，例如elisa等。

八、試劑盒

本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括用于本發(fā)明的方法的試劑盒，該試劑盒包括本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，以及使用說明。該試劑盒可以進(jìn)一步包括至少一種另外的檢測(cè)試劑，其用于檢測(cè)本發(fā)明的單克隆抗體的存在。試劑盒一般包括表明試劑盒內(nèi)容物的預(yù)期用途和/或使用方法的標(biāo)簽。術(shù)語標(biāo)簽包括在試劑盒上或與試劑盒一起提供的或以其他方式隨試劑盒提供的任何書面的或記錄的材料。

實(shí)施例

通過參考在此給出的一些具體實(shí)施例可獲得對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步的理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，其無意于對(duì)本發(fā)明的范圍做出任何限制。顯然，可以對(duì)本發(fā)明作出多種改動(dòng)和變化而不脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，因此，這些改動(dòng)和變化同樣在本申請(qǐng)要求保護(hù)的范圍內(nèi)。

實(shí)施例1小鼠單克隆抗體hetumomab的制備

一、抗人腫瘤多能干細(xì)胞小鼠單克隆抗體庫的制備

本實(shí)施例采用一種人腫瘤多能干細(xì)胞系t3a-a3作為免疫原(liuh,etal.celldeathanddisease.2013,4:e857)。該人腫瘤干細(xì)胞系從原發(fā)肝癌患者手術(shù)切除的肝癌組織中分離獲得，能夠在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)。。該細(xì)胞系已傳代超過100次，細(xì)胞仍然生長(zhǎng)迅速，并保持干細(xì)胞性質(zhì)。該細(xì)胞系既表達(dá)多種干細(xì)胞的標(biāo)志物、具有干細(xì)胞的自我更新能力、具有向不同腫瘤細(xì)胞定向分化的潛能；同時(shí)也具有腫瘤性質(zhì)，具有成瘤能力和轉(zhuǎn)移能力。該細(xì)胞系在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)而保持性質(zhì)不變，并且在免疫缺陷鼠體內(nèi)成瘤能力和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)。

將擴(kuò)大培養(yǎng)獲得的肝癌干細(xì)胞(人腫瘤多能干細(xì)胞)系t3a-a3采用多聚甲醛固定，免疫普通balb/c鼠，2-4周一次，每次約1×10⁷細(xì)胞。長(zhǎng)期免疫，直至采用常規(guī)細(xì)胞免疫化學(xué)方法測(cè)定免疫小鼠血清抗人肝癌干細(xì)胞(人腫瘤多能干細(xì)胞)系t3a-a3的滴度超過1:50000。取小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0采用常規(guī)的peg介導(dǎo)融合的方法，融合形成分泌小鼠單克隆抗體的雜交瘤。采用常規(guī)的甲基纖維素平板法制備雜交瘤單克隆，待各個(gè)單克隆生長(zhǎng)后將其分別挑取至96孔板繼續(xù)培養(yǎng)，由此獲得含有大量抗人肝癌干細(xì)胞(人腫瘤多能干細(xì)胞)系t3a-a3的單克隆抗體的雜交瘤克隆的文庫。收集96孔板中每個(gè)雜交瘤克隆的培養(yǎng)上清，用于下一步的測(cè)定和篩選過程。

二、抗人腫瘤多能干細(xì)胞小鼠單克隆抗體hetumomab的篩選

無血清懸浮培養(yǎng)基采用含20ng/mlegf、20ng/mlbfgf、按1:50比例添加b27、10ng/mllif、2mmol/ml谷氨酰胺、1μ/mlheparin的dmem/f12(1:1)培養(yǎng)液。使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)前洗滌1次細(xì)胞。將經(jīng)無血清懸浮培養(yǎng)的人肝癌干細(xì)胞(人腫瘤多能干細(xì)胞)系t3a-a3球形細(xì)胞，輕柔吹散成單細(xì)胞，以2000細(xì)胞/孔接種96孔板。用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，用含1％bsa的pbs洗滌細(xì)胞，每孔中分別加入一個(gè)雜交瘤克隆的培養(yǎng)上清100μl，室溫孵育2小時(shí)；用含1％bsa的pbs洗滌5次后，加入生物素標(biāo)記抗鼠二抗室溫，反應(yīng)30分鐘；再用含1％bsa的pbs洗滌5次后，加入cy3標(biāo)記的avidin，室溫反應(yīng)30分鐘；含1％bsa的pbs洗滌5次后，在熒光顯微鏡下進(jìn)行熒光鏡檢，判斷單抗庫中的各個(gè)單抗雜交瘤上清與人肝癌干細(xì)胞(人腫瘤多能干細(xì)胞)系t3a-a3的反應(yīng)。能觀察到部分細(xì)胞具有熒光染色即判斷為陽性，初步篩選獲得能與人肝癌干細(xì)胞(人腫瘤多能干細(xì)胞)系t3a-a3膜表面抗原結(jié)合的鼠單克隆抗體。

進(jìn)一步，選擇無血清懸浮培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞系(yanli,zhao-youtang,sheng-longye,yin-kunliu,jiechen,qiongxue,junchen,dong-meigao,wei-huabao.establishmentofcellcloneswithdifferentmetastaticpotentialfromthemetastatichepatocellularcarcinomacelllinemhcc97.世界胃腸病學(xué)雜志(英文版).2001,7(05):630-636.)的球形細(xì)胞，同樣進(jìn)行以上程序，熒光顯微鏡鏡檢判斷單抗庫中的雜交瘤單抗上清與人肝癌干細(xì)胞(mhcc97l球形細(xì)胞富含肝癌干細(xì)胞)的反應(yīng)，獲得能與肝癌干細(xì)胞膜表面抗原結(jié)合的鼠單克隆抗體。

從抗人腫瘤多能干細(xì)胞小鼠單克隆抗體庫篩選出1株小鼠單克隆抗體hetumomab，其不僅與人腫瘤多能干細(xì)胞系t3a-a3膜表面抗原結(jié)合，也同時(shí)與人肝癌mhcc97l細(xì)胞系的干細(xì)胞(mhcc97l球形細(xì)胞)膜表面抗原結(jié)合，證明小鼠單克隆抗體hetumomab能夠識(shí)別不同來源的人肝癌干細(xì)胞。選擇小鼠單克隆抗體hetumomab進(jìn)行進(jìn)一步鑒定和藥效研究。

分泌hetumomab單抗的小鼠雜交瘤細(xì)胞以保藏號(hào)cgmccno.12251于2016年3月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所)。

將hetumomab雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，收集含抗體上清。采用southernbiotech公司的單抗亞類檢測(cè)試劑盒鑒定單抗的類和亞類以及sigma公司的elisa二抗檢測(cè)上清的抗體產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示單抗hetumomab為igg1型重鏈、κ型輕鏈。

分泌單抗hetumomab的雜交瘤細(xì)胞在體外擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80％，更換無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4-5天后，收集分泌有抗體的無血清上清液。采用抗proteing純化柱純化單抗hetumomab。再用10％sds-page經(jīng)考馬斯亮蘭染色鑒定分離純化的hetumomab單抗的純度。結(jié)果顯示，hetumomab的重鏈分子量約在47kda，輕鏈分子量約在26kda，這與理論上一般igg抗體重鏈和輕鏈的分子量相符合。掃描分析電泳目的條帶的純度在95％以上，純化的hetumomab單抗純度滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

實(shí)施例2hetumomab靶抗原在多種腫瘤細(xì)胞及組織中特異表達(dá)

一、hetumomab靶抗原在人多種肝癌、肺癌、胃癌細(xì)胞系中表達(dá)且可表達(dá)于活細(xì)胞表面。

采用常規(guī)活細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)了單抗hetumomab靶抗原在人多種腫瘤細(xì)胞系如肝癌、肺癌、胃癌細(xì)胞系中在活細(xì)胞表面的表達(dá)情況。具體技術(shù)方法大致如下：細(xì)胞爬片或接種96孔培養(yǎng)板(4×10³個(gè)/孔)，待細(xì)胞長(zhǎng)到60％～70％滿時(shí)，無血清培養(yǎng)液洗2次，pbs洗1次。加入一抗(雜交瘤上清或純化抗體)，鼠抗α-tublin抗體(稀釋度1:1000)作為細(xì)胞是否通透的對(duì)照，正常鼠igg、sp2/0上清、pbs作為陰性對(duì)照，室溫孵育1h；活細(xì)胞洗液(含1％bsa的pbs)洗滌5次，每次5min；4％多聚甲醛室溫下固定15min；固定細(xì)胞洗液(含0.1％bsa、0.05％tween-20的pbs)洗滌5次，每次5min；加入100μl的二抗，避光室溫孵育30min；固定細(xì)胞洗液洗滌5次，每次5min；50μl含10μg/mldapi、50％甘油的pbs封閉；熒光顯微鏡下觀察。以觀察到部分細(xì)胞出現(xiàn)膜熒光染色為陽性結(jié)果。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單抗hetumomab靶抗原可表達(dá)于以下這些人肝癌、肺癌、胃癌細(xì)胞系(購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)活細(xì)胞的表面：

人肝癌細(xì)胞系：mhcc97l、bel7402-v13；

人肺癌細(xì)胞系：a549、spca-1；

人胃癌細(xì)胞系：snu-5、bgc-823。

部分典型的陽性結(jié)果照片如圖1所示。

以上結(jié)果說明單抗hetumomab靶抗原在人多種腫瘤，例如肝癌、肺癌、胃癌細(xì)胞系中均有表達(dá)且可表達(dá)于活的癌細(xì)胞的膜表面。

二、hetumomab靶抗原在人肝癌、肺癌、胃癌組織中特異高表達(dá)。

采用傳統(tǒng)的常規(guī)免疫組織化學(xué)技術(shù)，以hetumomab為一抗，采用抗鼠抗體二抗，檢測(cè)了單抗hetumomab靶抗原在多例人肝癌、肺癌、胃癌患者及相關(guān)其他組織中的表達(dá)情況。

具體技術(shù)方法大致如下：將組織片子常規(guī)脫蠟；檸檬酸緩沖液(ph6.0)倒入抗原修復(fù)盒，放入片子，將修復(fù)盒置于沸水中，水浴加熱30min，室溫自然冷卻2h；pbs洗滌3min×3次，將片子上的水甩干，立即用組化筆沿組織劃圈；每塊組織上加一滴內(nèi)源性過氧化物酶阻斷溶液，室溫孵育20min，pbs洗滌3min×3次，甩掉洗液，加一滴正常動(dòng)物血清——羊血清封閉，室溫孵育20min；甩掉封閉血清，各組織點(diǎn)上加一抗，放入保濕盒中，4℃過夜孵育；甩掉一抗，pbs洗滌3min×3次，甩掉洗液，加二抗biotin-抗鼠抗體二抗，室溫孵育20min；pbs洗滌3min×5次，甩掉洗液，加一滴avidin-hrp，室溫孵育10min；pbs洗滌3min×3次，甩掉洗液，加一滴新鮮配制的dab，顯微鏡下觀察，同時(shí)嚴(yán)格計(jì)時(shí)，待組織呈陽性后，自來水沖洗終止；蘇木素復(fù)染5min，1％鹽酸-75％酒精分色2秒，自來水沖洗；片子脫水后用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

以單抗hetumomab為一抗，檢測(cè)了120例人肝癌組織、20例癌旁組織、10例正常肝組織、10例肝炎組織、40例肝硬化組織中單抗hetumomab靶抗原的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1)顯示：?jiǎn)慰筯etumomab的靶抗原在79.17％(95/120)的人肝癌組織中特異性表達(dá)，而在癌旁組織、正常肝組織、肝炎組織及肝硬化組織中均未見其表達(dá)，說明了單抗hetumomab靶抗原在人肝癌組織中特異高表達(dá)。

表1.免疫組化技術(shù)檢測(cè)單抗hetumomab靶抗原在人肝癌組織中表達(dá)的結(jié)果

以單抗hetumomab為一抗，檢測(cè)了160例人肺癌組織、32例癌旁組織、3例正常肺組織中單抗hetumomab靶抗原的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示：?jiǎn)慰筯etumomab的靶抗原在82.5％(132/160)的人肺癌組織中特異性表達(dá)，而僅僅在6.25％的癌旁組織中表達(dá)，在正常肺組織中未見其表達(dá)，說明了單抗hetumomab靶抗原在人肺癌組織中特異高表達(dá)。

表2.免疫組化技術(shù)檢測(cè)hetumomab靶抗原在人肺癌組織中的表達(dá)

以單抗hetumomab為一抗，檢測(cè)了110例人胃癌組織、20例癌旁組織、3例正常胃組織中單抗hetumomab靶抗原的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表3)顯示：?jiǎn)慰筯etumomab的靶抗原在93.64％(103/110)的人胃癌組織中特異性表達(dá)，而在癌旁組織和正常胃組織中均未見其表達(dá)，說明了單抗hetumomab靶抗原在人胃癌組織中特異高表達(dá)。

表3.免疫組化技術(shù)檢測(cè)單抗hetumomab靶抗原在人胃癌組織中表達(dá)的結(jié)果

以上免疫組化檢測(cè)結(jié)果的部分典型的陽性結(jié)果照片如圖2所示。

以上這些結(jié)果說明單抗hetumomab靶抗原在人多種腫瘤，例如肝癌、肺癌、胃癌的多數(shù)患者的癌組織中均有特異的高表達(dá)。

實(shí)施例3單抗hetumomab識(shí)別腫瘤干細(xì)胞

一、單抗hetumomab識(shí)別的癌細(xì)胞在癌細(xì)胞的sphere培養(yǎng)細(xì)胞中富集。

根據(jù)現(xiàn)有大量文獻(xiàn)報(bào)道，無血清懸浮培養(yǎng)即sphere(成球)培養(yǎng)可以富集腫瘤干細(xì)胞(reynolds,b.a.ands.weiss,"clonalandpopulationanalysesdemonstratethatanegf-responsivemammalianembryoniccnsprecursorisastemcell."devbiol,1996.175(1):p.1-13.；fang,n.,etal.,"phresponsiveadhesionofphospholipidvesicleonpoly(acrylicacid)cushiongraftedtopoly(ethyleneterephthalate)surface."colloidssurfbbiointerfaces,2005.42(3-4):p.245-52.；和tirino,v.,etal.,"theroleofcd133intheidentificationandcharacterisationoftumour-initiatingcellsinnon-small-celllungcancer."eurjcardiothoracsurg,2009.36(3):p.446-53.)。所以根據(jù)單抗hetumomab識(shí)別的癌細(xì)胞能否在sphere培養(yǎng)中得到富集來初步判斷單抗hetumomab識(shí)別的細(xì)胞是否與腫瘤干細(xì)胞相關(guān)。

對(duì)人肝癌細(xì)胞系bel7402-v13和mhcc97l細(xì)胞進(jìn)行了無血清培養(yǎng)5天后，采用活細(xì)胞流式熒光術(shù)對(duì)親本細(xì)胞和sphere培養(yǎng)細(xì)胞中hetumomab⁺細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表4)顯示hetumomab⁺細(xì)胞在bel7402-v13sphere細(xì)胞的比例為8.92％，比其在親本細(xì)胞中的比例2.25％富集了3.96倍；hetumomab⁺細(xì)胞在mhcc97lsphere細(xì)胞中的比例為7.51％，比其在親本細(xì)胞中的比例3.45％富集了2.18倍。即經(jīng)過無血清培養(yǎng)后，肝癌細(xì)胞系的hetumomab⁺細(xì)胞得到了富集。

表4.免疫流式熒光技術(shù)檢測(cè)單抗hetumomab識(shí)別的肝癌細(xì)胞在肝癌細(xì)胞的sphere培養(yǎng)細(xì)胞中富集的結(jié)果

對(duì)人肺癌細(xì)胞系spca-1和a549細(xì)胞進(jìn)行了無血清培養(yǎng)5天后，采用活細(xì)胞流式熒光術(shù)對(duì)親本細(xì)胞和sphere培養(yǎng)細(xì)胞中hetumomab⁺細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表5)顯示hetumomab⁺細(xì)胞在spca-1sphere細(xì)胞的比例為7.34％，比其在親本細(xì)胞中的比例1.74％富集了4.22倍；hetumomab⁺細(xì)胞在a549sphere細(xì)胞中的比例為13.30％，比其在親本細(xì)胞中的比例7.23％富集了1.84倍。即經(jīng)過無血清培養(yǎng)后，肺癌細(xì)胞系的hetumomab⁺細(xì)胞得到了富集。

表5.免疫流式熒光技術(shù)檢測(cè)單抗hetumomab識(shí)別的肺癌細(xì)胞在肺癌細(xì)胞的sphere培養(yǎng)細(xì)胞中富集的結(jié)果

對(duì)人胃癌細(xì)胞系snu-5和bgc-823細(xì)胞進(jìn)行了無血清培養(yǎng)5天后，采用活細(xì)胞流式熒光術(shù)對(duì)親本細(xì)胞和sphere培養(yǎng)細(xì)胞中hetumomab⁺細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表6)顯示hetumomab⁺細(xì)胞在snu-5sphere細(xì)胞的比例為7.19％，比其在親本細(xì)胞中的比例3.38％富集了2.13倍；hetumomab⁺細(xì)胞在bgc-823sphere細(xì)胞中的比例為7.45％，比其在親本細(xì)胞中的比例2.95％富集了2.53倍。即經(jīng)過無血清培養(yǎng)后，胃癌細(xì)胞系的hetumomab⁺細(xì)胞得到了富集。

表6.免疫流式熒光技術(shù)檢測(cè)單抗hetumomab識(shí)別的胃癌細(xì)胞在胃癌細(xì)胞的sphere培養(yǎng)細(xì)胞中富集的結(jié)果

以上免疫流式熒光檢測(cè)結(jié)果的部分典型的圖譜如圖3所示。

以上這些結(jié)果說明單抗hetumomab識(shí)別的癌細(xì)胞在人多種腫瘤，例如肝癌、肺癌、胃癌細(xì)胞系的sphere培養(yǎng)細(xì)胞中均顯著富集。

二、單抗hetumomab識(shí)別esa、cd90陽性的腫瘤干細(xì)胞。

現(xiàn)已有多篇文獻(xiàn)(yamashitat,etal.epcampositivehepatocellularcarcinomacellsaretumor-initiatingcellswithstem/progenitorcellfeatures.gastroenterology.2009,136(3):1012-1024.；和yangzf.identificationoflocalandcirculatingcancerstemcellsinhumanlivercancer.hepatology.2008,47(3):919-928.)證明了esa和cd90為一些肝癌細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物。為了檢測(cè)在人肝癌細(xì)胞bel7402-v13細(xì)胞中單抗hetumomab識(shí)肝癌細(xì)胞同時(shí)也是esa、cd90標(biāo)志物陽性的肝癌干細(xì)胞，我們采用雙色流式熒光術(shù)，對(duì)在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天的人肝癌bel7402-v13細(xì)胞進(jìn)行了染色。

結(jié)果(如表7)顯示，單抗hetumomab識(shí)別的細(xì)胞比例為8.52％，esa⁺干細(xì)胞表達(dá)比例為9.02％，兩者共染比例為3.63％，即單抗hetumomab識(shí)別了40.2％的esa⁺干細(xì)胞。對(duì)在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天的人肝癌mhcc97l細(xì)胞進(jìn)行了染色，結(jié)果(如表7)顯示，單抗hetumomab識(shí)別的細(xì)胞比例為2.38％，cd90⁺干細(xì)胞表達(dá)比例為4.54％，兩者共染比例為2.01％，即單抗hetumomab識(shí)別了44.3％的cd90⁺干細(xì)胞。

表7.雙色流式熒光術(shù)檢測(cè)單抗hetumomab與esa、cd90肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物在肝癌細(xì)胞中共染色的結(jié)果

以上這些結(jié)果說明單抗hetumomab識(shí)別esa、cd90等標(biāo)志物陽性的人腫瘤干細(xì)胞。

三、單抗hetumomab識(shí)別的癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新能力

自我更新能力、強(qiáng)侵襲能力、耐受化療藥物能力和強(qiáng)致瘤能力是腫瘤干細(xì)胞區(qū)別于普通子代腫瘤細(xì)胞的重要基本特征。因此，為了進(jìn)一步驗(yàn)證單抗hetumomab識(shí)別的細(xì)胞是否具有腫瘤干細(xì)胞特性，分選了多種人腫瘤細(xì)胞中的hetumomab⁺細(xì)胞，檢測(cè)其自我更新、侵襲、耐藥和體內(nèi)致瘤能力。

腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力主要的表現(xiàn)形式為在無血清培養(yǎng)基中的成球能力，其方式稱為不對(duì)稱分裂，即一個(gè)細(xì)胞分裂成兩個(gè)子代細(xì)胞時(shí)，其中一個(gè)子代細(xì)胞保持著與親代細(xì)胞完全相同的特征，而另一個(gè)子代細(xì)胞可以繼續(xù)分裂，形成正常的子代細(xì)胞。因此，可以通過檢測(cè)hetumomab⁺細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中的成球能力來確定其自我更新能力。

采用流式分選技術(shù)從培養(yǎng)5天的人肝癌bel7402-v13sphere細(xì)胞中分離出hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞。將分選得到的細(xì)胞以500個(gè)/孔接種于含0.8％甲基纖維素的半固態(tài)sphere培養(yǎng)基(半固態(tài)sphere培養(yǎng)基為含0.8％甲基纖維素、20ng/mlegf、20ng/mlbfgf、按1:50比例添加b27、10ng/mllif、2mmol/ml谷氨酰胺、1u/mlheparin的dmem/f12(1:1)培養(yǎng)液)中，在超低粘附24孔板中培養(yǎng)，觀察各細(xì)胞成球數(shù)量。結(jié)果顯示(表8)，hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基條件下的成球數(shù)分別為262±8.5、168±5.6、98±5.6，即hetumomab⁺細(xì)胞的成球率明顯高于其他兩種細(xì)胞(p<0.05)。因此，hetumomab⁺細(xì)胞比親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新能力。

表8肝癌細(xì)胞中hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞自我更新能力的比較

采用流式分選技術(shù)從人肺癌spca-1sphere細(xì)胞中分離出hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞。將分選得到的細(xì)胞以500個(gè)/孔接種于含0.8％甲基纖維素的半固態(tài)sphere培養(yǎng)基中，在超低粘附24孔板板中培養(yǎng)，觀察各細(xì)胞成球數(shù)量。結(jié)果顯示(表8)，hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基條件下的成球數(shù)分別為165.7±6.0、127±5.6、83.7±4.7，即hetumomab⁺細(xì)胞的成球率明顯高于其他兩種細(xì)胞(p<0.05)。因此，hetumomab⁺細(xì)胞比親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新能力。

表9肺癌細(xì)胞中hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞自我更新能力的比較

采用流式分選技術(shù)從人胃癌snu-5sphere細(xì)胞中分離出hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞。將分選得到的細(xì)胞以500個(gè)/孔接種于含0.8％甲基纖維素的半固態(tài)sphere培養(yǎng)基中，在超低粘附24孔板板中培養(yǎng)，觀察各細(xì)胞成球數(shù)量。結(jié)果顯示(表10)，hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基條件下的成球數(shù)分別為24±1.4、15.5±0.7、11.5±0.7，即hetumomab⁺細(xì)胞的成球率明顯高于其他兩種細(xì)胞(p<0.05)。因此，hetumomab⁺細(xì)胞比親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新能力。

表10胃癌細(xì)胞中hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞自我更新能力的比較

以上這些結(jié)果說明單抗hetumomab識(shí)別的多種癌細(xì)胞(肝癌、肺癌、胃癌)均具有更強(qiáng)的自我更新能力，即具有腫瘤干細(xì)胞主要特征之一：高自我更新能力。

四、單抗hetumomab識(shí)別的癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力

自我更新能力、強(qiáng)侵襲能力、耐受化療藥物能力和強(qiáng)致瘤能力是腫瘤干細(xì)胞區(qū)別于普通子代腫瘤細(xì)胞的重要基本特征。因此，為了進(jìn)一步驗(yàn)證單抗hetumomab識(shí)別的細(xì)胞是否具有腫瘤干細(xì)胞特性，故分選了多種人腫瘤細(xì)胞中的hetumomab⁺細(xì)胞，檢測(cè)其自我更新、侵襲、耐藥和體內(nèi)致瘤能力。

采用流式分選技術(shù)從培養(yǎng)5天的人肝癌bel7402-v13sphere細(xì)胞中分離出hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞。將分選得到的細(xì)胞以相同數(shù)量接種于預(yù)先包被matrigel膠的transwell小室中，24h后固定，顯微鏡下觀察穿膜的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示(表11)，hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞穿膜的細(xì)胞數(shù)為分別為每視野308±9.5、210±10.7和132±14.7，即hetumomab⁺細(xì)胞的侵襲穿過膜的數(shù)量明顯高于其他兩種細(xì)胞(p<0.05)。因此，hetumomab⁺細(xì)胞比親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力。

表11肝癌細(xì)胞中hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞侵襲能力的比較

采用流式分選技術(shù)從培養(yǎng)的人肺癌spca-1sphere細(xì)胞中分離出hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞。將分選得到的細(xì)胞以相同數(shù)量接種于預(yù)先包被matrigel膠的transwell小室中，24h后固定，顯微鏡下觀察穿膜的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示(表12)，hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞穿膜的細(xì)胞數(shù)為分別為每視野222±11.5、193.7±5.7、154.3±12.1，即hetumomab⁺細(xì)胞的侵襲穿過膜的數(shù)量明顯高于其他兩種細(xì)胞(p<0.05)。因此，hetumomab⁺細(xì)胞比親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力。

表12肺癌細(xì)胞中hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞侵襲能力的比較

采用流式分選技術(shù)從培養(yǎng)的人胃癌snu-5sphere細(xì)胞中分離出hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞。將分選得到的細(xì)胞以相同數(shù)量接種于預(yù)先包被matrigel膠的transwell小室中，24h后固定，顯微鏡下觀察穿膜的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示(表13)，hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞穿膜的細(xì)胞數(shù)為分別為每視野247.5±19.1、142.5±9.2和145.0±11.3，即hetumomab⁺細(xì)胞的侵襲穿過膜的數(shù)量明顯高于其他兩種細(xì)胞(p<0.05)。因此，hetumomab⁺細(xì)胞比親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力。

表13胃癌細(xì)胞中hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞侵襲能力的比較

以上這些結(jié)果說明單抗hetumomab識(shí)別的多種癌細(xì)胞(肝癌、肺癌、胃癌)均具有更強(qiáng)的侵襲能力，即具有腫瘤干細(xì)胞主要特征之一：高侵襲性。

五、單抗hetumomab識(shí)別的癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的耐受化療藥物的能力

自我更新能力、強(qiáng)侵襲能力、耐受化療藥物能力和強(qiáng)致瘤能力是腫瘤干細(xì)胞區(qū)別于普通子代腫瘤細(xì)胞的重要基本特征。因此，為了進(jìn)一步驗(yàn)證單抗hetumomab識(shí)別的細(xì)胞是否具有腫瘤干細(xì)胞特性，故分選了多種人腫瘤細(xì)胞中的hetumomab⁺細(xì)胞，檢測(cè)其自我更新、侵襲、耐藥和體內(nèi)致瘤能力。

為了檢測(cè)hetumomab⁺肝癌細(xì)胞的耐藥能力，將人肝癌細(xì)胞bel7402-v13sphere細(xì)胞流式分選獲得的hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞以5000個(gè)/孔的數(shù)量接種于96孔板中，每組細(xì)胞均用含0μg/ml、0.0625μg/ml、0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml和4μg/ml8種不同濃度的順鉑的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，3天后更換1次培養(yǎng)基，7天后用cck8法檢測(cè)od值測(cè)定反映其耐藥能力的ic50。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(表14，圖4)，hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞的ic50分別為0.739μg/ml、0.502μg/ml和0.313μg/ml，即hetumomab⁺細(xì)胞的耐藥性明顯高于親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。因此，hetumomab⁺肝癌細(xì)胞比親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞具有更強(qiáng)的耐受化療藥物的能力。

表14肝癌細(xì)胞中hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞耐受化療藥物能力的比較

為了檢測(cè)hetumomab⁺肺癌細(xì)胞的耐藥能力，將人肺癌細(xì)胞spca-1sphere細(xì)胞中流式分選獲得的hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞以5000個(gè)/孔的數(shù)量接種于96孔板中，每組細(xì)胞均用含0μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.6μg/ml、0.8μg/ml、1μg/ml和2μg/ml7種不同濃度的順鉑的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，之后用cck8法檢測(cè)od值測(cè)定反映其耐藥能力的ic50。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(表15，圖4)，hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞的ic50分別為0.707μg/ml、0.513μg/ml和0.180μg/ml，即hetumomab⁺細(xì)胞的耐藥性明顯高于親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。因此，hetumomab⁺肺癌細(xì)胞比親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞具有更強(qiáng)的耐受化療藥物的能力。

表15肺癌癌細(xì)胞中hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞耐受化療藥物能力的比較

為了檢測(cè)hetumomab⁺胃癌細(xì)胞的耐藥能力，我們將人胃癌細(xì)胞snu-5sphere細(xì)胞中流式分選獲得的hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞以5000個(gè)/孔的數(shù)量接種于96孔板中，每組細(xì)胞均用含0μg/ml、0.0125μg/ml、0.025μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml和0.8μg/ml8種不同濃度的順鉑的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，之后用cck8法檢測(cè)od值測(cè)定反映其耐藥能力的ic50。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(表16，圖4)，hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞的ic50分別為0.285μmol/l、0.155μmol/l和0.094μmol/l，即hetumomab⁺細(xì)胞的耐藥性明顯高于親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。因此，hetumomab⁺胃癌細(xì)胞比親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞具有更強(qiáng)的耐受化療藥物的能力。

表16胃癌細(xì)胞中hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞耐受化療藥物能力的比較

以上這些結(jié)果說明單抗hetumomab識(shí)別的多種癌細(xì)胞(肝癌、肺癌、胃癌)均具有更強(qiáng)的耐受化療藥物能力，即具有腫瘤干細(xì)胞主要特征之一：強(qiáng)耐藥性。

六、單抗hetumomab識(shí)別的癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的體內(nèi)致瘤能力

自我更新能力、強(qiáng)侵襲能力、耐受化療藥物能力和強(qiáng)致瘤能力是腫瘤干細(xì)胞區(qū)別于普通子代腫瘤細(xì)胞的重要基本特征。因此，為了進(jìn)一步驗(yàn)證單抗hetumomab識(shí)別的細(xì)胞是否具有腫瘤干細(xì)胞特性，故分選了多種人腫瘤細(xì)胞中的hetumomab⁺細(xì)胞，檢測(cè)其自我更新、侵襲、耐藥和體內(nèi)致瘤能力。

檢驗(yàn)一種細(xì)胞是否為腫瘤干細(xì)胞的“金標(biāo)準(zhǔn)”是體內(nèi)的強(qiáng)致瘤性。因此，將人肝癌細(xì)胞bel7402-v13sphere細(xì)胞流式分選獲得的hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞分別接種至4周齡大小的裸鼠皮下，長(zhǎng)時(shí)間觀察其體內(nèi)成瘤的情況。結(jié)果如表17所示，1×10⁴個(gè)hetumomab⁺細(xì)胞在接種3周時(shí)就可在小鼠體內(nèi)致瘤，而親本細(xì)胞則需1×10⁵個(gè)細(xì)胞在接種3周后才出瘤，hetumomab^-細(xì)胞在觀察期間始終沒有出瘤。這項(xiàng)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明hetumomab⁺細(xì)胞的體內(nèi)致瘤性較親本和hetumomab^-細(xì)胞顯著強(qiáng)。提示hetumomab⁺細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的高致瘤性特征，符合腫瘤干細(xì)胞的判定“金標(biāo)準(zhǔn)”。因此，單抗hetumomab識(shí)別的細(xì)胞是肝癌腫瘤干細(xì)胞。

表17肝癌細(xì)胞bel7402-v13中hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞體內(nèi)致瘤能力的比較(成瘤的動(dòng)物只數(shù))

將人胃癌細(xì)胞snu-5sphere細(xì)胞流式分選獲得的hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞分別接種至4周齡大小的裸鼠皮下，長(zhǎng)時(shí)間觀察其體內(nèi)成瘤的情況。結(jié)果如表18所示，2×10³個(gè)hetumomab⁺細(xì)胞在接種3月時(shí)就可在小鼠體內(nèi)半數(shù)小鼠致瘤，而親本細(xì)胞2×10³個(gè)細(xì)胞在接種4個(gè)月后仍未出瘤，hetumomab^-細(xì)胞在觀察期間始終沒有出瘤。這項(xiàng)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明hetumomab⁺細(xì)胞的體內(nèi)致瘤性較親本和hetumomab^-細(xì)胞顯著強(qiáng)。提示hetumomab⁺細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的高致瘤性特征，符合腫瘤干細(xì)胞的判定“金標(biāo)準(zhǔn)”。因此，單抗hetumomab識(shí)別的細(xì)胞是胃癌腫瘤干細(xì)胞。

表18胃癌細(xì)胞snu-5中hetumomab⁺細(xì)胞、親本細(xì)胞和hetumomab^-細(xì)胞體內(nèi)致瘤能力的比較(成瘤的動(dòng)物只數(shù))

以上這些結(jié)果說明單抗hetumomab識(shí)別的多種癌細(xì)胞(肝癌、胃癌)均具有更強(qiáng)的體內(nèi)致瘤能力，即具有腫瘤干細(xì)胞主要特征之一高致瘤性。

實(shí)施例4單抗hetumomab可以抑制腫瘤干細(xì)胞的自我更新、侵襲和耐藥功能

一、單抗hetumomab顯著抑制多種腫瘤(肝癌、胃癌、肺癌)的腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力(腫瘤干細(xì)胞主要特征之一)。

腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力主要的表現(xiàn)形式為在無血清培養(yǎng)基中的成球能力，其方式稱為不對(duì)稱分裂，即一個(gè)細(xì)胞分裂成兩個(gè)子代細(xì)胞時(shí)，其中一個(gè)子代細(xì)胞保持著與親代細(xì)胞完全相同的特征，而另一個(gè)子代細(xì)胞可以繼續(xù)分裂，形成正常的子代細(xì)胞。為了證明單抗hetumomab是否是能夠直接抑制肝癌干細(xì)胞的功能性單抗，我們將在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天的人肝癌細(xì)胞系bel7402-v13sphere細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液后，以純化的單抗hetumomab(250μg/ml)為實(shí)驗(yàn)組，以pbs為陰性對(duì)照組，與細(xì)胞在37℃孵育2h，期間每隔半小時(shí)將細(xì)胞與抗體或陰性對(duì)照混勻一次。各組取500個(gè)細(xì)胞接種于含0.8％甲基纖維素的半固態(tài)sphere培養(yǎng)基(含egf、lif、bfgf等)中，于超低粘附24孔板板中培養(yǎng)，隔天補(bǔ)液1-1.5ml，14天后觀察兩組細(xì)胞成球數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5)顯示，實(shí)驗(yàn)組的成球數(shù)量為212±2.8，而陰性對(duì)照組的成球數(shù)量為278.5±0.7個(gè)，明顯高于實(shí)驗(yàn)組。單抗hetumomab對(duì)bel7402-v13細(xì)胞的成球抑制率達(dá)23.9％，p<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明，單抗hetumomab可直接作用于肝癌干細(xì)胞并抑制其自我更新能力。

為了證明單抗hetumomab是否是能夠直接抑制肺癌干細(xì)胞的功能性單抗，采用同樣的方法檢測(cè)了單抗hetumomab對(duì)人肺癌細(xì)胞系spca-1成球的抑制作用。結(jié)果(如表19、圖5)顯示，實(shí)驗(yàn)組最高抗體濃度的成球數(shù)量為88.3±7.2，而陰性對(duì)照組的成球數(shù)量為151.3±9.1個(gè)，明顯高于實(shí)驗(yàn)組，單抗hetumomab對(duì)spca-1細(xì)胞的成球抑制率達(dá)41.6％，p<0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明，單抗hetumomab可直接作用于肺癌干細(xì)胞并抑制其自我更新能力。

表19檢測(cè)單抗hetumomab抑制人肺癌細(xì)胞系spca-1成球的結(jié)果

為了證明單抗hetumomab是否是能夠直接抑制胃癌干細(xì)胞的功能性單抗，采用同樣的方法檢測(cè)了單抗hetumomab對(duì)人胃癌細(xì)胞系snu-5的cd44陽性細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞亞群成球的抑制作用。結(jié)果(如表20、圖5)顯示，實(shí)驗(yàn)組最高抗體濃度的成球數(shù)量為18±2.0，而陰性對(duì)照組的成球數(shù)量為128±4.0個(gè)，明顯高于實(shí)驗(yàn)組，單抗hetumomab對(duì)snu-5cd44⁺細(xì)胞的成球抑制率達(dá)85.9％，p<0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明，單抗hetumomab可直接作用于胃癌干細(xì)胞并抑制其自我更新能力。

表20檢測(cè)單抗hetumomab抑制人胃癌細(xì)胞系snu-5cd44⁺細(xì)胞成球的結(jié)果

以上這些結(jié)果說明單抗hetumomab可以直接顯著抑制多種癌細(xì)胞(肝癌、肺癌、胃癌)的自我更新能力，證明單抗hetumomab不僅能識(shí)別靶向腫瘤干細(xì)胞，而且是可以直接抑制腫瘤干細(xì)胞的功能性(治療性)抗腫瘤干細(xì)胞單抗。

二、單抗hetumomab顯著抑制多種腫瘤(肝癌、胃癌、肺癌)的腫瘤干細(xì)胞的侵襲能力(腫瘤干細(xì)胞主要特征之二)。

高侵襲性是腫瘤干細(xì)胞的另一個(gè)重要生物學(xué)特征。為了證明單抗hetumomab是否是能夠直接抑制肝癌干細(xì)胞的功能性單抗，采用transwell侵襲實(shí)驗(yàn)對(duì)單抗hetumomab抑制肝癌細(xì)胞的侵襲能力進(jìn)行了分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖6)，pbs陰性對(duì)照組的侵襲細(xì)胞數(shù)為(301.0±16.3)/視野，單抗hetumomab(0.5mg/ml)組的侵襲細(xì)胞數(shù)為(148±16.4)/視野。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單抗hetumomab直接作用后的細(xì)胞侵襲能力明顯減弱，其對(duì)bel7402-v13sphere細(xì)胞侵襲的抑制率為50.8％，p<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單抗hetumomab可直接作用于肝癌干細(xì)胞并抑制其侵襲能力。

為了證明單抗hetumomab是否是能夠直接抑制肺癌干細(xì)胞的功能性單抗，采用同樣的方法檢測(cè)了單抗hetumomab對(duì)人肺癌細(xì)胞系spca-1侵襲的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(表21、圖6)，pbs陰性對(duì)照組的侵襲細(xì)胞數(shù)為(232.3±3.1)/視野，單抗hetumomab組的侵襲細(xì)胞數(shù)最低為(153.0±6.1)/視野。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單抗hetumomab直接作用后的細(xì)胞侵襲能力明顯減弱，其對(duì)spca-1sphere細(xì)胞侵襲的抑制率為34.1％，p<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單抗hetumomab可直接作用于肺癌干細(xì)胞并抑制其侵襲能力。

表21檢測(cè)單抗hetumomab抑制人肺癌細(xì)胞系spca-1侵襲的結(jié)果

為了證明單抗hetumomab是否是能夠直接抑制胃癌干細(xì)胞的功能性單抗，采用同樣的方法檢測(cè)了單抗hetumomab對(duì)人胃癌細(xì)胞系snu-5的cd44陽性細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞亞群侵襲的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(表22、圖6)，pbs陰性對(duì)照組的侵襲細(xì)胞數(shù)為(231±7.0)/視野，單抗hetumomab組的侵襲細(xì)胞數(shù)最低為(56±4.0)/視野。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單抗hetumomab直接作用后的細(xì)胞侵襲能力明顯減弱，其對(duì)snu-5cd44⁺細(xì)胞侵襲的抑制率為75.8％，p<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單抗hetumomab可直接作用于胃癌干細(xì)胞并抑制其侵襲能力。

表21檢測(cè)單抗hetumomab抑制人胃癌細(xì)胞系snu-5cd44⁺細(xì)胞侵襲的結(jié)果

以上這些結(jié)果說明單抗hetumomab可以直接顯著抑制多種癌細(xì)胞(肝癌、肺癌、胃癌)的侵襲能力，證明單抗hetumomab不僅能識(shí)別靶向腫瘤干細(xì)胞，而且是可以直接抑制腫瘤干細(xì)胞的功能性(治療性)抗腫瘤干細(xì)胞單抗。

三、單抗hetumomab顯著抑制多種腫瘤(肝癌、肺癌)的腫瘤干細(xì)胞的耐受化療藥物的能力(腫瘤干細(xì)胞主要特征之三)。

耐藥是腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特征之一。為了證明單抗hetumomab是否是能夠直接抑制肝癌干細(xì)胞的功能性單抗，將培養(yǎng)5天的bel7402-v13sphere細(xì)胞以5000個(gè)/孔的數(shù)量接種于96孔板中，并加入純化的單抗hetumomab(0.5mg/ml)和pbs于各孔中，在37℃，5％co2孵箱中培養(yǎng)24h后，移去含抗體的培養(yǎng)基，每組細(xì)胞均用含0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4和8μg/ml共9不同濃度順鉑的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，48h更換1次含順鉑的完全培養(yǎng)基，5天后按照cck-8試劑盒說明書加入cck-8試劑，檢測(cè)od450吸光度值，并計(jì)算各組ic50值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖7)，單抗hetumomab直接作用后的細(xì)胞的耐藥能力明顯下降，其ic50值為0.334μg/ml，而對(duì)照組的ic50值為0.9μg/ml，單抗hetumomab直接作用的細(xì)胞耐藥能力明顯低于對(duì)照組。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單抗hetumomab可直接作用于肝癌干細(xì)胞并抑制其耐藥的能力。

為了證明單抗hetumomab是否是能夠直接抑制肺癌干細(xì)胞的功能性單抗，采用同樣的方法檢測(cè)了單抗hetumomab對(duì)人肺癌細(xì)胞系spca-1耐藥的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖7)，單抗hetumomab直接作用后的細(xì)胞的耐藥能力明顯下降，其ic50值最低為0.136μg/ml，而對(duì)照組的ic50值為0.351μg/ml，單抗hetumomab直接作用的細(xì)胞耐藥能力明顯低于對(duì)照組。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單抗hetumomab可直接作用于肺癌干細(xì)胞并抑制其耐藥的能力。

以上這些結(jié)果說明單抗hetumomab可以直接顯著抑制多種癌細(xì)胞(肝癌、肺癌)的耐受化療藥物的能力，證明單抗hetumomab不僅能識(shí)別靶向腫瘤干細(xì)胞，而且是可以直接抑制腫瘤干細(xì)胞的功能性(治療性)抗腫瘤干細(xì)胞單抗。

實(shí)施例5單抗hetumomab在動(dòng)物體內(nèi)具有抑制腫瘤移植瘤生長(zhǎng)、協(xié)同化療的藥效學(xué)作用

前面的一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，單抗hetumomab是靶向多種腫瘤干細(xì)胞的單抗；并且體外藥效學(xué)研究結(jié)果表明，單抗hetumomab可以明顯的抑制多種腫瘤干細(xì)胞的自我更新、侵襲和耐藥能力。為了進(jìn)一步明確單抗hetumomab在體內(nèi)對(duì)多種腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和耐藥的影響，采用多種人腫瘤動(dòng)物模型，評(píng)價(jià)了單抗hetumomab在體內(nèi)對(duì)多種腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和耐藥的藥效學(xué)作用。

一、單抗hetumomab顯著抑制人肝癌移植瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)，并能明顯協(xié)同增強(qiáng)化療的療效、顯著延長(zhǎng)生存期，具有顯著的抗腫瘤藥效學(xué)作用。

進(jìn)行了單抗hetumomab在裸鼠體內(nèi)治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究，觀察并比較單用單抗、單用化療藥及單抗聯(lián)合化療藥治療肝癌的療效，分析比較單抗hetumomab在體內(nèi)能否治療肝癌的生長(zhǎng)和耐藥，并探討靶向肝癌干細(xì)胞治療肝癌的最優(yōu)方案。

將bel7402-v13的sphere細(xì)胞以3萬/只接種至裸鼠皮下，將裸鼠隨機(jī)分為6組(6只/組)，分別為：?jiǎn)为?dú)化療藥組(順鉑0.3mg/kg，6只)；抗體高劑量組(10mg/kg，6只)；抗體高劑量+化療組(6只)；抗體低劑量組(2.5mg/kg，6只)；抗體低劑量+化療組(6只)；pbs組(6只)。接種細(xì)胞后第二天開始治療，每周治療2次，5周后結(jié)束治療。每周2次測(cè)量皮下移植瘤的長(zhǎng)徑和短徑，用公式v＝(π/6)×(長(zhǎng)徑×短徑×短徑)計(jì)算瘤體積，觀察各組的腫瘤體積、生長(zhǎng)速率的變化。停藥后，繼續(xù)觀察移植瘤的生長(zhǎng)情況，并記錄腫瘤大小。腫瘤生長(zhǎng)速率＝(vt-v0)/天數(shù)，vt是每次測(cè)量時(shí)的腫瘤體積，v0是給藥前的腫瘤體積(v0指停止給藥時(shí)的腫瘤體積)。

小鼠體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)曲線如圖8所示，單抗hetumomab能顯著抑制裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)。并且隨著抗體的劑量升高移植瘤抑制率也逐漸升高，存在著劑量依賴關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9顯示，在治療5個(gè)星期停藥時(shí)，高、低劑量的單抗hetumomab對(duì)移植瘤的抑制率分別為71.5％、54.4％，化療藥組的抑制率為83.5％，單抗高、低劑量聯(lián)合化療藥組的抑制率相似，都達(dá)到了97％左右。結(jié)果提示，與單用單抗和單用化療藥組相比，單抗聯(lián)合化療藥組在移植瘤的治療中顯示出了較好的治療效果。

停藥一個(gè)月時(shí)，小鼠出現(xiàn)死亡的情況。這時(shí)各組的抑制率如圖10所示，單抗高、低對(duì)移植瘤的抑制率分別為49.1％、34.4％，單抗高、低聯(lián)合化療藥組的抑制率相似，約為84.5％左右，但單用化療藥組的抑制率為48.6％。該結(jié)果提示，單抗聯(lián)合化療藥組對(duì)小鼠移植瘤的抑制率高于其他幾種治療方案組，p<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。停藥后一個(gè)月時(shí)的移植瘤體積與停藥時(shí)的相比，單抗聯(lián)合化療組的腫瘤生長(zhǎng)速率為0.051cm³/天，比pbs對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)速率(0.239cm³/天)低4.7倍，且比單抗高、低劑量組和化療藥組的腫瘤生長(zhǎng)速率(0.148cm³/天、0.185cm³/天和0.154cm³/天)分別低2.9、3.6和3.1倍，該結(jié)果表明單抗聯(lián)合化療藥的方法可有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)和復(fù)發(fā)。

整個(gè)治療和觀察過程持續(xù)六個(gè)月。小鼠在六個(gè)月中生存曲線(圖11)顯示，這6組小鼠的生存曲線分布差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.05。說明單抗聯(lián)合化療藥組的小鼠生存狀況明顯好于pbs對(duì)照組、單抗組和化療藥組。提示，單抗聯(lián)合化療藥治療可以延長(zhǎng)小鼠的生存期。

以上結(jié)果說明，單抗hetumomab單獨(dú)使用能夠顯著抑制人肝癌移植瘤的生長(zhǎng)，具有顯著的抑制肝癌的藥效學(xué)作用。單抗hetumomab聯(lián)合化療藥組都顯示出了對(duì)移植瘤高的抑制率，能顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，且治療效果優(yōu)于單用抗體組和單用化療藥組，表明單抗聯(lián)合化療藥可有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)，降低化療耐藥。聯(lián)合用藥組的小鼠生存期明顯大于單用抗體組和單用化療藥組，表明單抗hetumomab聯(lián)合化療藥治療腫瘤的方案不僅能治療腫瘤的生長(zhǎng)，還能延長(zhǎng)小鼠的生存期，可能是顯著抑制了腫瘤在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移引起的小鼠死亡。

二、單抗hetumomab顯著抑制人肺癌移植瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)，具有顯著的抗腫瘤藥效學(xué)作用。

進(jìn)行了單抗hetumomab在裸鼠體內(nèi)治療肺癌的實(shí)驗(yàn)研究，并觀察單用單抗、單用化療藥治療肺癌的療效。

具體地，收獲人肺癌細(xì)胞系spca-1的球體細(xì)胞，以2.5×10⁵個(gè)細(xì)胞/只接種裸小鼠。共分5組，每組5只：pbs對(duì)照組、單獨(dú)化療組(順鉑0.3mg/kg)、hetumomab抗體高劑量組(40mg/kg)、hetumomab抗體中劑量組(10mg/kg)、hetumomab低劑量組(2.5mg/kg)。接種肺癌細(xì)胞后第2天開始抗體治療，實(shí)驗(yàn)組以及對(duì)照組通過腹腔注射進(jìn)行治療，共治療至接種28天后，停藥?；熕幗M治療每周2次。每周2次測(cè)量皮下移植瘤的長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算瘤體積，公式v＝(π/6)×(長(zhǎng)徑×短徑×短徑)。觀察各組的腫瘤體積變化。

接種28天后停止治療時(shí)，觀察并測(cè)量小鼠瘤體積生長(zhǎng)情況，計(jì)算抑制率。小鼠體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)曲線如圖12所示，瘤體積抑制率如表22所示，單抗hetumomab能顯著抑制裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)，并隨著抗體的劑量升高移植瘤抑制率也相應(yīng)升高，在停藥時(shí)，高、中、低劑量的單抗hetumomab對(duì)移植瘤的抑制率分別為55.97％、43.56％、35.58％，化療藥組的抑制率僅為24.91％。

以上結(jié)果說明，單抗hetumomab單獨(dú)使用能夠顯著抑制人肺癌移植瘤的生長(zhǎng)，具有顯著的抑制肺癌的藥效學(xué)作用。

表22單抗hetumomab抑制動(dòng)物體內(nèi)人肺癌spca-1移植瘤生長(zhǎng)的結(jié)果

三、單抗hetumomab顯著抑制人胃癌移植瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)，并能明顯協(xié)同增強(qiáng)化療的療效，具有顯著的抗腫瘤藥效學(xué)作用。

進(jìn)行了單抗hetumomab在裸鼠體內(nèi)治療胃癌的實(shí)驗(yàn)研究，并觀察比較單用單抗、單用化療藥及單抗聯(lián)合化療藥治療胃癌的療效，分析比較單抗hetumomab在體內(nèi)能否治療胃癌的生長(zhǎng)和協(xié)同增強(qiáng)化療療效。

具體地，收獲人胃癌細(xì)胞系snu-5-v13的球體細(xì)胞，以2.5×10⁵個(gè)細(xì)胞/只接種裸小鼠。共分7組，每組8只：pbs對(duì)照組、鼠igg對(duì)照組、單獨(dú)化療組(順鉑0.3mg/kg)、hetumomab抗體高劑量組(20mg/kg)、hetumomab低劑量組(1.25mg/kg)、hetumomab高劑量+化療藥、hetumomab低劑量+化藥。接種胃癌細(xì)胞后第2天開始抗體治療，實(shí)驗(yàn)組以及對(duì)照組通過腹腔注射進(jìn)行治療，共治療一個(gè)月后，停藥?；熕幗M治療4周，每周2次后停藥。每周2次測(cè)量皮下移植瘤的長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算瘤體積，公式v＝(π/6)×(長(zhǎng)徑×短徑×短徑)。觀察各組的腫瘤體積變化。

接種一個(gè)月后停止治療時(shí)，觀察并測(cè)量小鼠瘤體積生長(zhǎng)情況，計(jì)算抑制率。小鼠體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)曲線如圖13所示，瘤體積抑制率如表23所示，單抗hetumomab能顯著抑制裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)，并隨著抗體的劑量升高移植瘤抑制率也相應(yīng)升高，在停藥時(shí)，高、低劑量的單抗hetumomab對(duì)移植瘤的抑制率分別為57.62％、30.68％，化療藥組的抑制率僅為33.16％，單抗高、低劑量聯(lián)合化療藥組的抑制率分別達(dá)到了70.68％和47.93％，結(jié)果提示，單抗聯(lián)合化療藥組對(duì)小鼠移植瘤的抑制率高于單獨(dú)化療和單獨(dú)抗體治療的治療方案組，p<0.05，單抗聯(lián)合化療藥組在移植瘤的治療中顯示出了更好的治療效果。

以上結(jié)果說明，單抗hetumomab單獨(dú)使用能夠顯著抑制人胃癌移植瘤的生長(zhǎng)，具有顯著的抑制胃癌的藥效學(xué)作用。單抗hetumomab聯(lián)合化療藥組都顯示出了對(duì)移植瘤高的抑制率，能顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，且治療效果優(yōu)于單用抗體組和單用化療藥組，表明單抗聯(lián)合化療藥可有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)，降低化療耐藥。

表23單抗hetumomab抑制動(dòng)物體內(nèi)人胃癌snu-5移植瘤生長(zhǎng)的結(jié)果

以上這一系列動(dòng)物體內(nèi)抑制腫瘤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，單抗hetumomab在體內(nèi)對(duì)多種人腫瘤(如肝癌、肺癌、胃癌)的生長(zhǎng)和耐藥具有顯著的抑制作用(藥效學(xué)作用)，對(duì)于治療多種腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和耐藥具有重要的應(yīng)用價(jià)值。