本發(fā)明涉及地特胰島素晶體的洗滌方法，屬于地特胰島素晶體的制備領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

糖尿病已成為繼心腦血管疾病、惡性腫瘤后的第三大威脅人類健康的慢性非傳染性疾病。世衛(wèi)組織2016年年度全球糖尿病報(bào)告中指出，中國(guó)糖尿病患病率呈爆炸式增長(zhǎng)。2010年中國(guó)糖尿病的患病率已達(dá)到9.7％，2015年中國(guó)的糖尿病患者數(shù)量已超過(guò)1.1億。中國(guó)每年投入超過(guò)1700億人民幣用于糖尿病管理；用于糖尿病的直接醫(yī)療支出更是占到中國(guó)醫(yī)療總支出的13％。世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)，若不盡快采取行動(dòng)，到2040年中國(guó)的糖尿病患者將增至1.5億人，給國(guó)人健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)嚴(yán)重影響。

地特胰島素，即賴氨酸b29n(ε-十四酰)去(b30)人胰島素，是第一個(gè)采用化學(xué)修飾的方法，用能與血液中的白蛋白可逆結(jié)合的脂肪酸酰化肽鏈上的氨基酸而產(chǎn)生。地特胰島素作為一種中性的、可溶的、長(zhǎng)效胰島素類似物，是通過(guò)?；饔迷赽29位的賴氨酸上結(jié)合了一個(gè)14碳的脂肪酸而形成。?；闹舅峥煞€(wěn)定胰島素分子的自身聚集，且與白蛋白可逆性結(jié)合，使地特胰島素從皮下注射部位吸收緩慢，作用持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，在控制血糖的同時(shí)能減少低血糖的風(fēng)險(xiǎn)。地特胰島素2004年在歐盟上市，2005年在美國(guó)上市，2013年銷售額20.57億美元，2014年銷售額25.21億美元，2015年銷售額超過(guò)32億美元，近三年年均增長(zhǎng)超過(guò)25％。

以固態(tài)晶體形式存在的胰島素，相比較于非結(jié)晶形式的沉淀粉末及溶液狀態(tài)保存的樣品，在產(chǎn)品穩(wěn)定性、方便性方面均有優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也利于后續(xù)的制劑配方設(shè)計(jì)。由于結(jié)晶體系中含有高鹽、有機(jī)溶劑和其它試劑，這些物質(zhì)含量遠(yuǎn)高于原料藥和制劑藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，需要進(jìn)行有效洗滌后才可成為合格的原料藥品。根據(jù)胰島素類產(chǎn)品不易溶于水的性質(zhì)，同時(shí)參考中國(guó)專利cn102219851a晶體洗滌工藝，發(fā)現(xiàn)低速離心并使用注射用水進(jìn)行洗滌，得到的晶體蛋白易碎裂，晶型均一性差，洗滌過(guò)程晶體沉降慢，部分晶體易溶解，得率低。中國(guó)專利cn102219851b，使用ph7.8濃度0.02mol/l的乙酸銨進(jìn)行晶體洗滌，采用溶液替換的方法進(jìn)行，洗滌過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)晶體難以沉降，替換后30分鐘觀察沉降晶體明顯減少，取晶體鏡檢發(fā)現(xiàn)地特胰島素晶體蛋白大部分溶解且晶體破裂明顯。因此，亟待開發(fā)一種新的地特胰島素晶體的洗滌方法，將結(jié)晶后的地特胰島素晶體蛋白高效洗滌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種地特胰島素晶體的洗滌方法，該方法能夠?qū)⒔?jīng)過(guò)結(jié)晶操作后的地特胰島素晶體蛋白高效洗滌，洗滌后的地特胰島素晶體保持完整，樣品收率高、對(duì)樣品純度無(wú)任何影響，且操作簡(jiǎn)單。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明公開了一種地特胰島素晶體的洗滌方法，包括以下步驟：

(1)結(jié)晶反應(yīng)完成后，將結(jié)晶溶液從結(jié)晶反應(yīng)產(chǎn)物中移除，加入弱酸鹽溶液對(duì)留下的地特胰島素晶體進(jìn)行第一次洗滌；

(2)移除第一次洗滌產(chǎn)生的洗滌液，加入弱酸鹽溶液對(duì)留下的地特胰島素晶體進(jìn)行第二次洗滌；

(3)移除第二次洗滌產(chǎn)生的洗滌液，加入注射用水對(duì)留下的地特胰島素晶體進(jìn)行第三次洗滌；

(4)移除洗滌液，將地特胰島素晶體冷凍凍干。

其中，步驟(1)或步驟(2)中所述的洗滌是將弱酸鹽溶液與地特胰島素晶體混合，攪拌，靜置；步驟(3)所述的洗滌是將注射用水與地特胰島素晶體混合，攪拌，靜置；

更優(yōu)選的，所述的攪拌是輕微的攪拌，所述的靜置時(shí)間優(yōu)選為≥2小時(shí)，更優(yōu)選為2-4小時(shí)，最優(yōu)選為3小時(shí)；

優(yōu)選的，步驟(1)-(3)中的洗滌操作是在4-8℃的溫度條件下進(jìn)行洗滌。

優(yōu)選的，所述的注射用水的溫度為4-8℃；

為了達(dá)到更佳的洗滌效果，步驟(1)中最好將大部分或全部的結(jié)晶溶液移除，所加入的弱酸鹽溶液與所移除的結(jié)晶溶液的體積相等；步驟(2)中最好也是將大部分或全部的洗滌液移除，所加入的弱酸鹽溶液與所移除的洗滌液的體積相等；其中，所述的“大部分”是指占總體積的70％或以上。

步驟(3)中所所加入的注射用水的體積最好不低于第二次洗滌產(chǎn)生的洗滌液總體積的1/3；優(yōu)選的，所加入的注射用水的體積為第二次洗滌產(chǎn)生的洗滌液的體積的1/3倍-1倍。

為了達(dá)到更佳的洗滌效果，可以在進(jìn)行第三次洗滌后接著再進(jìn)行第四次洗滌；其中，所述的第四次洗滌包括：移除第三次洗滌產(chǎn)生的洗滌液，加入注射用水對(duì)留下的地特胰島素晶體進(jìn)行第四次洗滌；在進(jìn)行第四次洗滌后再接著進(jìn)行第五次洗滌，所述的第五次洗滌包括：移除第四次洗滌產(chǎn)生的洗滌液，加入注射用水對(duì)留下的地特胰島素晶體進(jìn)行第五次洗滌；第四次以及第五次的洗滌方式與第三次的洗滌操作可以完全相同；如果需要進(jìn)一步提高洗滌效果，還可以用注射用水作為洗滌液完全按照第三次的洗滌方法進(jìn)行多次的洗滌。

優(yōu)選的，在進(jìn)行第四次洗滌時(shí)，所加入注射用水的體積最好不低于第二次洗滌產(chǎn)生的洗滌液體積的1/3；同樣的，在進(jìn)行第五次洗滌時(shí)，所加入注射用水的體積最好不低于第二次洗滌產(chǎn)生的洗滌液體積的1/3；更優(yōu)選的，在進(jìn)行第四次或第五次洗滌時(shí)，所加入的注射用水的體積為第二次洗滌產(chǎn)生的洗滌液的體積的1/3倍-1倍。

步驟(1)中所述的弱酸鹽溶液的ph值為2.8-4.5，為了達(dá)到較佳的洗滌效果，所述的弱酸鹽溶液的ph值優(yōu)選為3.0-4.0，更優(yōu)選為3.5；所述弱酸鹽溶液選自磷酸鹽、檸檬酸鹽、碳酸鹽或醋酸鹽中的任意兩種按照任意比例組成的混合溶液或兩種以上按照任意比例組成的混合溶液；

優(yōu)選的，所述弱酸鹽溶液(鹽溶液a)的濃度為0.02-0.06mol/l。

所述弱酸鹽溶液由磷酸鹽和檸檬酸鹽按照任何比例組成的混合溶液；優(yōu)選的，在混合溶液中，磷酸鹽的濃度為0.01-0.03mol/l，檸檬酸鹽的濃度為0.01-0.03mol/l；更優(yōu)選的，在混合溶液中，磷酸鹽的濃度為0.02mol/l，檸檬酸鹽的濃度為0.015mol/l；

優(yōu)選的，所述磷酸鹽為磷酸氫二鈉，更優(yōu)選的，所述檸檬酸鹽為檸檬酸銨。

步驟(2)中所述的弱酸鹽溶液(鹽溶液b)的ph值為4.0-7.0，為了達(dá)到更佳的效果，優(yōu)選為5.0-6.0，更優(yōu)選為5.6；

步驟(2)中所述弱酸鹽溶液可以選自磷酸鹽、檸檬酸鹽、碳酸鹽或醋酸鹽中的任意一種或一種以上按照任意比例混合的弱酸鹽溶液；優(yōu)選的，所述弱酸鹽溶液的濃度為0.01-0.03mol/l，所述弱酸鹽溶液最好為檸檬酸鹽溶液；其中，檸檬酸鹽的濃度最好為0.015mol/l；所述檸檬酸鹽可以為檸檬酸銨。

本發(fā)明地特胰島素晶體的洗滌方法，將地特胰島素結(jié)晶后的結(jié)晶溶液或洗滌液大部分都移除，然后加入下一步適量體積的洗滌溶液。本發(fā)明中被移除部分溶液的體積根據(jù)最初的結(jié)晶體積確定，剩余溶液不超過(guò)移除前溶液體積的3％，根據(jù)結(jié)晶總體積進(jìn)行調(diào)整，剩余溶液越少，洗滌效果越好。

地特胰島素結(jié)晶的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，例如可以參見中國(guó)專利cn104761632a中公開的方法。本發(fā)明所述地特胰島素結(jié)晶樣品為參考中國(guó)專利cn104761632a中公開的方法制備獲得，因此結(jié)晶后溶液中含有地特胰島素、酚類物質(zhì)、有機(jī)溶劑、鋅離子、檸檬酸三鈉以及其他鹽等。

具體的，地特胰島素結(jié)晶的制備包括：(1)純化獲得純度為99.5％地特胰島素溶液0.7l，濃度10.4g/l；(2)稱取氯化鈉20.45g，檸檬酸三鈉二水102.92g，6％苯酚溶液40.8ml，加水溶解并定容至2.8l，配制得到鹽溶液；(3)地特胰島素樣品溶液與鹽溶液混合，并用2m氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph至8.6，加入0.5m乙酸鋅19.7ml，加2m鹽酸調(diào)節(jié)ph至7.8，室溫?cái)嚢?小時(shí)，轉(zhuǎn)移至4℃環(huán)境，靜置12小時(shí)，即得。所得的晶體形態(tài)為細(xì)長(zhǎng)型柱狀晶體，長(zhǎng)度60-100um；結(jié)晶的溶液含有約0.5mol/l鈉鹽，7.2％乙腈(v/v)、0.07％苯酚(w/v)。

由于不同胰島素的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)差異較大，且不同胰島素的結(jié)晶工藝也有很大的差異，因此胰島素的結(jié)晶樣品洗滌工藝不具有普適性，而是要根據(jù)胰島素的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、結(jié)晶環(huán)境等采用專屬性的方法進(jìn)行洗滌。

本發(fā)明地特胰島素晶體的洗滌方法，通過(guò)溶液替換的方式達(dá)到洗滌晶體的效果，洗滌前后晶型沒(méi)有質(zhì)的差異，樣品純度沒(méi)有變化、苯酚含量低至7×10^-7-1.2×10^-6(w/v)，鈉鹽含量為1-2.1×10^-4mmol/l，洗滌損失率為0.54-0.87％。本發(fā)明洗滌方法，用適宜緩沖液或注射用水充分洗掉晶體環(huán)境中的高鹽成分和有機(jī)溶劑，使地特胰島素晶體中鹽成分和有機(jī)溶劑等含量在在原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，且洗滌操作中樣品收率穩(wěn)定在99％以上，也不會(huì)降低樣品純度，將為下一步的制劑配制準(zhǔn)備好原料。

本發(fā)明實(shí)驗(yàn)表明，直接采用注射用水進(jìn)行地特胰島素晶體的洗滌，晶體易溶解，晶型易破壞，不易沉降；而采用甘精胰島素結(jié)晶后樣品的洗滌操作，即用ph7.8、濃度0.2mol/l的乙酸銨進(jìn)行地特胰島素晶體的洗滌，晶體沉降慢，晶體溶解、變小、碎裂。證明，其他胰島素的洗滌方法不適用于地特胰島素的洗滌。

本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

本發(fā)明通過(guò)采用合適ph的低濃度弱酸鹽進(jìn)行地特胰島素晶體的兩次洗滌，用酸性或偏酸性的溶液洗滌堿性條件下析出的晶體，保持晶體的完整性，同時(shí)洗滌的損失率控制在1％以下，且樣品純度不會(huì)受到任何影響。本發(fā)明地特胰島素晶體的洗滌方法，操作簡(jiǎn)單，可處理樣品量大，所使用的洗滌溶液環(huán)保易得，后續(xù)處理簡(jiǎn)單，節(jié)省成本；而且整個(gè)洗滌過(guò)程低溫可控，能夠避免在洗滌過(guò)程中的樣品發(fā)生不利反應(yīng)，如脫氨反應(yīng)等，從而避免影響樣品純度和收率，適于工業(yè)化的放大性生產(chǎn)。經(jīng)本發(fā)明方法洗滌后的地特胰島素晶體可直接進(jìn)行凍干操作，凍干后樣品可直接進(jìn)行地特胰島素制劑操作，制劑樣品符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

附圖說(shuō)明

圖1為預(yù)備實(shí)施例制備的地特胰島素結(jié)晶在顯微鏡下200倍放大圖；

圖2為預(yù)備實(shí)施例中反相收集的地特胰島素液相檢測(cè)圖；

圖3為實(shí)施例1洗滌后的地特胰島素結(jié)晶在顯微鏡下200倍放大圖；

圖4為實(shí)施例2洗滌后的地特胰島素結(jié)晶在顯微鏡下200倍放大圖；

圖5為實(shí)施例3洗滌后的地特胰島素結(jié)晶在顯微鏡下200倍放大圖；

圖6為實(shí)施例3一次洗滌時(shí)移除的結(jié)晶上清液相檢測(cè)圖；

圖7為實(shí)施例3完成所有洗滌步驟后的樣品液相檢測(cè)圖；

圖8實(shí)施例4洗滌后的地特胰島素結(jié)晶在顯微鏡下200倍放大圖；

圖9實(shí)施例5洗滌后的地特胰島素結(jié)晶在顯微鏡下200倍放大圖；

圖10實(shí)施例6洗滌后的地特胰島素結(jié)晶在顯微鏡下200倍放大圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

1、試驗(yàn)材料及儀器

磷酸鹽等緩沖劑物質(zhì)、醋酸鋅和苯酚等購(gòu)自sigma公司，檸檬酸三鈉二水、氯化鈉(nacl)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；火焰光度計(jì)為上海傲普at1200；分析型色譜柱(4.6mm×150mm)填料為購(gòu)自kromasil公司；分析型高效液相儀器為安捷倫1260。

晶型、樣品純度、有關(guān)物質(zhì)殘余和洗滌損失率的檢測(cè)方法：

晶體洗滌前后晶型對(duì)比通過(guò)高倍顯微鏡觀察記錄，儀器為leicadmi3000b。

晶體洗滌前后樣品純度對(duì)比采用反相層析方法對(duì)進(jìn)行檢測(cè)，儀器為安捷倫1260分析型高效液相，柱子采用kromasilc4-3.5μm色譜柱(4.6mm×250mm)。流動(dòng)相a相：10mm無(wú)水硫酸鈉-乙腈(按體積比75：25混合)，采用鹽酸調(diào)節(jié)ph至3.5；流動(dòng)相b相：乙腈-水(按體積比55：45混合)。流速為1.0ml/min，柱溫為40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。25-50％b相梯度洗脫35min。純度計(jì)算采用面積歸一法。

晶體洗滌后的苯酚含量可以根據(jù)液相檢測(cè)結(jié)果計(jì)算(標(biāo)準(zhǔn)曲線法)，鈉鹽含量可以采用火焰光度計(jì)檢測(cè)確定。

洗滌損失率根據(jù)所有洗滌移除的上清中地特胰島素的含量以及洗滌液體積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

預(yù)備實(shí)施例地特胰島素晶體制備

地特胰島素晶體均參考以下方法制備，同時(shí)下述各晶體洗滌實(shí)施例均以此預(yù)備實(shí)施例相同方法獲得的樣品晶體作為出發(fā)樣品。

具體操作步驟：

(1)參考中國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)cn105111305a進(jìn)行樣品純化獲得純度為99.5％地特胰島素溶液0.7l，濃度10.4g/l。

(2)配制鹽溶液：稱取氯化鈉20.45g，檸檬酸三鈉二水102.92g，6％苯酚溶液40.8ml，加水溶解并定容至2.8l。

(3)地特胰島素樣品溶液與鹽溶液混合，并用2m氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph至8.6，加入0.5m乙酸鋅19.7ml，加2m鹽酸調(diào)節(jié)ph至7.8，室溫?cái)嚢?小時(shí)，轉(zhuǎn)移至4℃環(huán)境，靜置12小時(shí)。

所制備的地特胰島素結(jié)晶見圖1；反相收集的地特胰島素液相檢測(cè)結(jié)果見圖2。

實(shí)施例1地特胰島素晶體的洗滌方法

地特胰島素晶體(預(yù)備實(shí)施例制備，下同)形態(tài)為細(xì)長(zhǎng)型柱狀晶體，長(zhǎng)度60-100um。結(jié)晶的溶液含有約0.5mol/l鈉鹽，7.2％乙腈(v/v)、0.07％苯酚(w/v)；參考中國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)cn102219851a將晶體低速離心，去除大部分上清，再用冷的注射用水進(jìn)行洗滌。洗滌后晶體完全溶解。

具體步驟為：

(1)低速離心：分裝晶體及上清于各離心瓶中，4℃，600g，離心15min。

(2)注射用水洗滌：低速離心后樣品去掉上清，采用預(yù)冷的注射用水3.5l洗滌晶體樣品，晶體在加入注射用水半小時(shí)后完全溶解。

低速離心后取少量晶體鏡檢，晶體碎裂較多(圖3)。

實(shí)施例2地特胰島素晶體的洗滌方法

地特胰島素晶體形態(tài)為細(xì)長(zhǎng)型柱狀晶體，長(zhǎng)度60-100um。結(jié)晶的溶液含有約0.5mol/l鈉鹽，7.2％乙腈(v/v)、0.07％苯酚(w/v)；參考中國(guó)專利cn102219851b進(jìn)行晶體洗滌：使用ph7.8濃度0.02mol/l的乙酸銨進(jìn)行晶體洗滌，結(jié)果顯示晶體大部分溶解。

具體乙酸銨洗滌步驟為：

采用約3.4l乙酸銨溶液(ph7.8、0.02mol/l)等體積替換結(jié)晶溶液，乙酸銨溶液與晶體混合后輕微攪拌，靜置過(guò)程發(fā)現(xiàn)晶體沉降慢，同時(shí)晶體變少。

靜置0.5-1小時(shí)，取少量晶體鏡查看晶體狀態(tài)，晶體溶解、變小、碎裂(圖4)。

實(shí)施例3地特胰島素晶體的洗滌方法

地特胰島素晶體形態(tài)為細(xì)長(zhǎng)型柱狀晶體，長(zhǎng)度60-100um。結(jié)晶的溶液含有約0.5mol/l鈉鹽，7.2％乙腈(v/v)、0.07％苯酚(w/v)；晶體洗滌溶液：鹽溶液a為磷酸氫二鈉(0.02mol/l)，檸檬酸銨(0.015mol/l)，ph3.5；鹽溶液b為檸檬酸銨(0.015mol/l)，ph5.6，第三次洗滌液至第五次洗滌液均為預(yù)冷注射用水(4-8℃)。洗滌操作都需在4-8℃冷室進(jìn)行。

具體步驟為：

(1)一次洗滌：采用3.4l鹽溶液a等體積替換結(jié)晶溶液，鹽溶液a與晶體混合后輕微攪拌，靜置3小時(shí)。

(2)二次洗滌：采用3.4l鹽溶液b等體積替換一次洗滌液，鹽溶液b與晶體混合后輕微攪拌，靜置3小時(shí)。

(3)注射用水洗滌：采用1.8l注射用水替換二次洗滌液，注射用水與晶體混合后輕微攪拌，靜置3小時(shí)。相同條件的操作重復(fù)三次，最后一次洗滌靜置后，轉(zhuǎn)移大部分上清即可冷凍凍干樣品。

結(jié)晶后、一次洗滌前取少量晶體鏡檢，洗滌結(jié)束后、凍干前取少量晶體鏡檢，對(duì)比晶型狀態(tài)，凍干后取少量?jī)龈删w溶解，檢測(cè)純度、鈉鹽、苯酚含量等指標(biāo)，結(jié)果顯示(圖5、圖6、圖7)：洗滌前后晶型沒(méi)有質(zhì)的差異，液相檢測(cè)結(jié)果樣品純度沒(méi)有變化、苯酚含量已低至8×10^-7％(w/v)，鈉鹽含量為1.2×10^-4mmol/l，洗滌損失率為0.54％。

實(shí)施例4地特胰島素晶體的洗滌方法

地特胰島素晶體形態(tài)為細(xì)長(zhǎng)型柱狀晶體，長(zhǎng)度60-100um。結(jié)晶的溶液含有約0.5mol/l鈉鹽，7.2％乙腈(v/v)、0.07％苯酚(w/v)；晶體洗滌溶液：鹽溶液a為磷酸氫二鈉(0.015mol/l)，醋酸鈉(0.018mol/l)，ph3.0；鹽溶液b為醋酸鈉(0.015mol/l)，ph5.0，第三次洗滌液至第五次洗滌液均為預(yù)冷注射用水(4-8℃)。洗滌操作都需在4-8℃冷室進(jìn)行。

具體步驟為：

(1)一次洗滌：采用3.4l鹽溶液a等體積替換結(jié)晶溶液，鹽溶液a與晶體混合后輕微攪拌，靜置2小時(shí)。

(2)二次洗滌：采用3.4l鹽溶液b等體積替換一次洗滌液，鹽溶液b與晶體混合后輕微攪拌，靜置2小時(shí)。

(3)注射用水洗滌：采用1.5l注射用水替換二次洗滌液，注射用水與晶體混合后輕微攪拌，靜置2小時(shí)。相同條件的操作重復(fù)三次，最后一次洗滌靜置后，轉(zhuǎn)移大部分上清即可冷凍凍干樣品。

結(jié)晶后、一次洗滌前取少量晶體鏡檢，洗滌結(jié)束后、凍干前取少量晶體鏡檢，對(duì)比晶型狀態(tài)，凍干后取少量?jī)龈删w溶解，檢測(cè)純度、鈉鹽、苯酚含量等指標(biāo)，結(jié)果顯示(圖8)：洗滌前后晶型沒(méi)有質(zhì)的差異，液相檢測(cè)結(jié)果樣品純度沒(méi)有變化、苯酚含量已低至1×10^-6％(w/v)，鈉鹽含量為2×10^-4mmol/l，洗滌損失率為0.87％。

實(shí)施例5地特胰島素晶體的洗滌方法

地特胰島素晶體形態(tài)為細(xì)長(zhǎng)型柱狀晶體，長(zhǎng)度60-100um。結(jié)晶的溶液含有約0.5mol/l鈉鹽，7.2％乙腈(v/v)、0.07％苯酚(w/v)；晶體洗滌溶液：鹽溶液a為醋酸鈉(0.02mol/l)，檸檬酸銨(0.015mol/l)，ph3.9，鹽溶液b為檸檬酸銨(0.015mol/l)，ph5.2，三次洗滌液至五次洗滌液均為預(yù)冷注射用水(4-8℃)。洗滌操作都需在4-8℃冷室進(jìn)行。

具體步驟為：

(1)一次洗滌：采用3.4l鹽溶液a等體積替換結(jié)晶溶液，鹽溶液a與晶體混合后輕微攪拌，靜置4小時(shí)。

(2)二次洗滌：采用3.4l鹽溶液b等體積替換一次洗滌液，鹽溶液b與晶體混合后輕微攪拌，靜置4小時(shí)。

(3)注射用水洗滌：采用2.5l注射用水替換二次洗滌液，注射用水與晶體混合后輕微攪拌，靜置4小時(shí)。相同條件的操作重復(fù)三次，最后一次洗滌靜置后，轉(zhuǎn)移大部分上清即可冷凍凍干樣品。

結(jié)晶后一次洗滌前取少量晶體鏡檢，洗滌結(jié)束后凍干前取少量晶體鏡檢，對(duì)比晶型狀態(tài)，凍干后取少量?jī)龈删w檢測(cè)純度、鈉鹽、苯酚含量等指標(biāo)，結(jié)果顯示(圖9)：洗滌前后晶型沒(méi)有質(zhì)的差異，液相檢測(cè)結(jié)果樣品純度沒(méi)有變化、苯酚含量已低至7×10^-7％(w/v)，鈉鹽含量為1×10^-4mmol/l，洗滌損失率為0.81％。

實(shí)施例6地特胰島素晶體的洗滌方法

地特胰島素晶體形態(tài)為細(xì)長(zhǎng)型柱狀晶體，長(zhǎng)度60-100um。結(jié)晶的溶液含有約0.5mol/l鈉鹽，7.2％乙腈(v/v)、0.07％苯酚(w/v)；晶體洗滌溶液：鹽溶液a為碳酸鈉(0.02mol/l)，檸檬酸銨(0.015mol/l)，ph4.0，鹽溶液b為醋酸銨(0.015mol/l)，ph6.0，三次洗滌液至五次洗滌液均為預(yù)冷注射用水(4-8℃)。洗滌操作都需在4-8℃冷室進(jìn)行。

具體步驟為：

(1)一次洗滌：采用3.4l鹽溶液a等體積替換結(jié)晶溶液，鹽溶液a與晶體混合后輕微攪拌，靜置3小時(shí)。

(2)二次洗滌：采用3.4l鹽溶液b等體積替換一次洗滌液，鹽溶液b與晶體混合后輕微攪拌，靜置3小時(shí)。

(3)注射用水洗滌：采用1.2l注射用水替換二次洗滌液，注射用水與晶體混合后輕微攪拌，靜置3小時(shí)。相同條件的操作重復(fù)三次，最后一次洗滌靜置后，轉(zhuǎn)移大部分上清即可冷凍凍干樣品。

結(jié)晶后一次洗滌前取少量晶體鏡檢，洗滌結(jié)束后凍干前取少量晶體鏡檢，對(duì)比晶型狀態(tài)，凍干后取少量?jī)龈删w檢測(cè)純度、鈉鹽、苯酚含量等指標(biāo)，結(jié)果顯示(圖10)：洗滌前后晶型沒(méi)有質(zhì)的差異，液相檢測(cè)結(jié)果樣品純度沒(méi)有變化、苯酚含量已低至1.2×10^-6％(w/v)，鈉鹽含量為2.1×10^-4mmol/l，洗滌損失率為0.69％。