在本發(fā)明
技術(shù)領(lǐng)域：
包括計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)的突變所進(jìn)行的優(yōu)化和改造。
背景技術(shù)：
：人表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermalgrowthfactorreceptor，egfr）分子量為170kda的跨膜受體，其由原癌基因編碼，并且顯示固有的酪氨酸激酶活。表皮生長(zhǎng)因子（egf），轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α（tgf-α），雙調(diào)蛋白，肝素結(jié)合egf和β動(dòng)物纖維素等均為與egfr結(jié)合的配體。egfr經(jīng)配體激活后，經(jīng)由酪氨酸激酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)許多細(xì)胞過程，包括但不限于激活控制細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞存活、程序性細(xì)胞死亡等。已有大量研究表明，egfr雖然在正常組織的細(xì)胞中表達(dá)，但表達(dá)量很低，而在許多癌癥細(xì)胞表面的egfr異常過量表達(dá)，包括肺癌、乳腺癌、直腸結(jié)腸癌等。針對(duì)egfr表達(dá)過量后，其經(jīng)由配體激活引發(fā)了癌細(xì)胞增殖分化這一現(xiàn)象特點(diǎn)，目前已上市的小分子和抗體藥物是針對(duì)靶向egfr胞外部分的egf結(jié)合位點(diǎn)或胞內(nèi)部分的酪氨酸激酶活性位點(diǎn)。小分子酪氨酸激酶抑制劑如吉非替尼和厄洛替尼能夠阻斷egfr的自磷酸化，抑制下游信號(hào)的傳導(dǎo)。另一方面，單克隆抗體，靶向egfr的胞外部分，阻斷配體結(jié)合并由此抑制下游通路的激活如細(xì)胞增殖。抗體所引發(fā)的egfr內(nèi)化正逐漸被本領(lǐng)域研究者關(guān)注。對(duì)于egfr內(nèi)化的研究為以egfr為靶點(diǎn)的生物藥提供了新的開發(fā)策略。從上世紀(jì)開始，egfr的內(nèi)化行為得到了廣泛研究。egfr的內(nèi)吞主要有網(wǎng)格蛋白依賴和網(wǎng)格蛋白非依賴兩種方式，當(dāng)?shù)蜐舛萫gf作用時(shí)，egfr以網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的方式內(nèi)吞；當(dāng)使用高濃度egf時(shí)，egfr主要以非網(wǎng)格蛋白方式內(nèi)吞，包括小窩和巨胞飲。就內(nèi)吞機(jī)制來說，近年?duì)幷摻裹c(diǎn)在于內(nèi)吞是否依賴于egfr的二聚化，激酶活性，氨基酸位點(diǎn)的磷酸化，泛素化，以及碳端的模體（motif）。當(dāng)同時(shí)使用兩種抗egfr第三結(jié)構(gòu)域抗體時(shí)，egfr不形成活性二聚體，絡(luò)氨酸位點(diǎn)無明顯磷酸化，這與使用單種抗體時(shí)，egfr發(fā)生的現(xiàn)象是一致的。索爾金等人認(rèn)為,不論高低劑量的egf作用，egfr的內(nèi)吞與egfr的激酶活性、主要的絡(luò)氨酸位點(diǎn)的磷酸化有很大程度的相關(guān)性?？梢?，若依賴磷酸化機(jī)制入胞，抗體的內(nèi)吞現(xiàn)象并不能得以解釋。皮埃爾等人認(rèn)為，高濃度egf作用時(shí)，egfr的泛素化修飾能促進(jìn)其內(nèi)吞。泛素化是否能促進(jìn)egfr的內(nèi)吞，存在廣泛爭(zhēng)議，低濃度egf作用時(shí)，egfr以網(wǎng)格蛋白方式內(nèi)吞，泛素化程度低，并不依賴于泛素化；但當(dāng)egfr胞內(nèi)域全切除時(shí)，融合于egfr末端的單個(gè)泛素分子確能幫助egfr以小窩的方式入胞。yosefyarden的數(shù)據(jù)表明，當(dāng)使用兩種抗體作用于egfr時(shí)，egfr能發(fā)生泛素化修飾，但泛素化在抗體作用的egfr內(nèi)吞機(jī)制中扮演的角色尚不清楚。zhixiangwang等人認(rèn)為，egfr的入胞并不依賴于egfr激酶活性，主要賴氨酸的磷酸化修飾，以及egfr胞內(nèi)域碳末端的大部分區(qū)域。但這種機(jī)制依然不能解釋抗體的內(nèi)吞行為，yosefyarden等在2004年時(shí)指出，同時(shí)使用抗her-2的赫賽汀和l26單抗時(shí)，egfr的內(nèi)化不依賴于egfr的胞內(nèi)域，甚至是跨膜區(qū)。paulm.p.vanbergenenhenegouwen等人在研究抗egfr的具有非重疊表位的雙特異性抗體分子內(nèi)吞機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，egfr以網(wǎng)格蛋白方式內(nèi)吞，即使切除egfr的胞內(nèi)域部分，egfr仍然發(fā)生大量?jī)?nèi)化，內(nèi)化量甚至超過胞內(nèi)域完整的egfr，但其指出，egfr的跨膜區(qū)n端的二聚化對(duì)于完整的egfr的內(nèi)化十分重要。因此，當(dāng)抗體與egfr作用時(shí)，egfr的入胞行為難以用egf作用時(shí)egfr的入胞模式來解釋。我們認(rèn)為，抗體作用時(shí)，egfr的內(nèi)吞機(jī)制與其特殊的內(nèi)吞方式有關(guān)。espenstang等人發(fā)現(xiàn)，共同使用cetuximab以及抗cetuximab的igg抗體，egfr以巨胞飲的方式發(fā)生大量?jī)?nèi)吞，不依賴磷酸化，而依賴肌動(dòng)蛋白的聚合。yosefyarden等人猜測(cè)，這種入胞行為與抗體在細(xì)胞表面形成的抗體-受體復(fù)合物大小相關(guān)。當(dāng)使用抗體對(duì)時(shí)，由于表位的非重疊性，使得大量的egfr得以被動(dòng)聚集，從而在細(xì)胞膜上形成巨大分子量的抗體-受體復(fù)合物，這是單獨(dú)使用一種抗體或者使用兩種表位競(jìng)爭(zhēng)的抗體所不能引起的。有質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，具有兩個(gè)非重疊表位的抗her-2雙特異性抗體，能在細(xì)胞膜上形成1716kda的復(fù)合物。這在一定程度上證實(shí)了以上猜測(cè)，但促使egfr以巨胞飲方式入胞的機(jī)制并不清楚，且這種入胞方式伴隨受體的大量降解。有文獻(xiàn)表明，網(wǎng)格蛋白除了參與內(nèi)吞，還能促進(jìn)內(nèi)吞體胞內(nèi)循環(huán)，且以不依賴泛素化的機(jī)制進(jìn)行降解；而以巨胞飲方式內(nèi)吞，能極大提高內(nèi)吞效率以及降解效率。高濃度egf作用下，egfr依然可以發(fā)生巨胞飲，并且可以促進(jìn)egfr在膜上發(fā)生聚集，形成egfr聚合體。與使用兩種非競(jìng)爭(zhēng)抗體促進(jìn)egfr聚合形成復(fù)合物所不同的是，egf作用下，egfr的聚集是一種主動(dòng)的依賴于磷酸化以及肌動(dòng)蛋白聚集的行為。我們認(rèn)為，當(dāng)兩種抗體共同使用時(shí)，在egfr發(fā)生被動(dòng)聚集的過程中，引起了細(xì)胞膜的局部流動(dòng)，微絲的重聚，促進(jìn)egfr以巨胞飲的方式入胞，這是不依賴于胞內(nèi)域的模體以及egfr胞內(nèi)域修飾的入胞行為。以上的研究都是針對(duì)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)的抗體進(jìn)行的內(nèi)吞以及其內(nèi)吞機(jī)制的研究。靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白背景知識(shí)及其前期研究。本發(fā)明中的蛋白藥物，由于其蛋白結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)的免疫球蛋白抗體完全不同,該蛋白質(zhì)來源于靈芝免疫蛋白。在1989年，kino等人從赤靈芝菌絲體提取物中分離純化得到靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白（immunoregulatoryproteinofganodermalucidium），并測(cè)定其氨基酸順序和免疫生理活性，命名該蛋白質(zhì)為lingzhi-8(lz-8)。lz-8由110個(gè)氨基酸殘基組成，氨基端乙?；肿恿繛?2.4kda，等電點(diǎn)為4.4。但kino等人提取的天然lz-8含有1.3%的多糖，我們通過基因工程技術(shù)手段，在畢赤酵母中重組表達(dá)獲得與天然lz-8氨基酸序列相同、活性相似、純度高于99%的重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白rlz-8。而后又通過動(dòng)物藥效學(xué)的實(shí)驗(yàn)證明了重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白（rlz-8）具有抗腫瘤作用（cn101475632）。荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)表明，rlz-8可以抑制小鼠艾氏腹水瘤細(xì)胞s180和移植性肝癌細(xì)胞h22在體內(nèi)生長(zhǎng)。通過蛋白熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明，其抗腫瘤作用是通過與腫瘤細(xì)胞膜特異性結(jié)合誘導(dǎo)其凋亡而殺傷或殺死腫瘤細(xì)胞?？梢?，找到rlz-8自身的抗腫瘤結(jié)構(gòu)域以及在腫瘤細(xì)胞上的靶受體將可能為癌癥治療帶來新的技術(shù)。靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的n端是重要的形成的二聚體結(jié)構(gòu)域，c端是一個(gè)fniii結(jié)構(gòu)域。n端由一個(gè)α-螺旋（由14個(gè)氨基酸組成，氨基酸序列為2-sdtalifrlawdvk-15）和一個(gè)β-折疊（由5個(gè)氨基酸組成，氨基酸序列為16-klsfd-20），其中在α螺旋上的ser殘基被乙酰化。n端的一個(gè)α螺旋和一個(gè)β折疊組成了二聚體中的一個(gè)單體，與另一個(gè)相同單體通過結(jié)構(gòu)域交互，形成啞鈴狀的二聚體。c端的fniii結(jié)構(gòu)域?qū)儆诿庖咔虻鞍紫嗨频娜髦谓Y(jié)構(gòu)。c端由β-平面i和β-平面ii組成，其中β-平面i和β-平面ii分別由β-折疊a-b-e和β-折疊g-f-c-d構(gòu)成。計(jì)算機(jī)分子模擬在蛋白質(zhì)類藥物的研發(fā)中也發(fā)揮著極為重要的作用。計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)：首先利用計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)可以根據(jù)蛋白質(zhì)藥物的晶體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)其活性結(jié)構(gòu)域，通過模擬蛋白質(zhì)藥物與其作用靶點(diǎn)（如受體與配體）間的相互作用，可以預(yù)測(cè)其結(jié)合形式和結(jié)合部位，并且計(jì)算其結(jié)合能力。利用計(jì)算機(jī)分子模擬軟件可以對(duì)結(jié)合能力突出或位置結(jié)構(gòu)特殊的氨基酸殘基進(jìn)行突變，從而分析該位置的變化對(duì)蛋白質(zhì)藥物與靶點(diǎn)結(jié)合能力的影響，進(jìn)而分析出發(fā)揮活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域及關(guān)鍵氨基酸殘基。通常情況下，選擇將關(guān)鍵氨基酸殘基突變?yōu)楸彼幔╝la）進(jìn)行突變分析，丙氨酸是突變分析中最常用的一種氨基酸，其側(cè)鏈只有一個(gè)甲基，體積小，無其他官能團(tuán)，同時(shí)還可以避免甘氨酸α-c，沒有手性基團(tuán)對(duì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響的問題。通過將目標(biāo)氨基酸突變?yōu)楸彼峥梢苑治鲈邪被釋?duì)結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生的作用。通過計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)還可以對(duì)原有蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行設(shè)計(jì)和改造。如通過計(jì)算和分析靜電相互作用，對(duì)關(guān)鍵位置氨基酸進(jìn)行電性的改造就是一種常見的改造策略。通過將原來產(chǎn)生靜電排斥的氨基酸改成相反電性的氨基酸，可以減少該位置與靶點(diǎn)之間的排斥作用，從而增加蛋白質(zhì)藥物與靶點(diǎn)的結(jié)合能力，得到優(yōu)化的蛋白質(zhì)藥物。此外，還有很多設(shè)計(jì)和改造策略，如根據(jù)蛋白質(zhì)藥物關(guān)鍵位置氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)和側(cè)鏈特點(diǎn)從空間上進(jìn)行改造等等。計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)的另一大優(yōu)勢(shì)在于通過計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)，期待可以優(yōu)化改造已知的蛋白質(zhì)，使其應(yīng)具有理想的抗-egfr抗體的一個(gè)或更多的特點(diǎn)，包括證明其在以egfr為靶點(diǎn)作為抗腫瘤機(jī)制有十分突出的活性，可以十分有效的阻止或延緩病人的腫瘤生長(zhǎng)。證明其阻止或延緩病人的腫瘤生長(zhǎng)中有十分突出的活性，可以抗衡其他的治療藥物及其治療方案用于單獨(dú)抗腫瘤治療，如厄洛替尼、順鉑、阿霉素、曲妥單抗、西妥昔等?？梢詫?duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行工程化改造，以降低其表面疏水性，并且可以提高其工業(yè)生產(chǎn)（比如易于純化和定量、熱力學(xué)和化學(xué)穩(wěn)定性、溶解度、均一性）、制劑的穩(wěn)定性、良好的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)（如：減少體內(nèi)非特異性結(jié)合的清除率），同時(shí)保持或提高其對(duì)egfr的親和力。另外，可以證明其在體內(nèi)的穩(wěn)定性、良好的物理化學(xué)穩(wěn)定性，包括但是不局限于在腫瘤治療中可接受的熱力學(xué)和化學(xué)穩(wěn)定性、溶解度、藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：說明書本發(fā)明是在發(fā)現(xiàn)rlz-8蛋白結(jié)構(gòu)中所存在的抗-egfr結(jié)構(gòu)區(qū)域，特別是該結(jié)構(gòu)區(qū)域通過其正電勢(shì)特征誘導(dǎo)一種對(duì)egfr異常表達(dá)腫瘤的殺傷作用。在以上科學(xué)發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，利用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)獲得了具有更強(qiáng)抗腫瘤作用的rlz-8突變體蛋白。本發(fā)明中，所揭示的rlz-8抗腫瘤機(jī)制為，rlz-8與細(xì)胞膜表面過量表達(dá)的egfr結(jié)合后，通過巨胞飲的方式進(jìn)行了強(qiáng)烈的內(nèi)化，含有rlz-8的細(xì)胞膜并未循環(huán)會(huì)細(xì)胞膜表面，細(xì)胞強(qiáng)烈內(nèi)吞rlz-8后，依次發(fā)生皺縮、變圓，最后膜結(jié)構(gòu)循環(huán)受阻導(dǎo)致細(xì)胞崩解死亡。通過使用不同內(nèi)吞方式的抑制劑，確認(rèn)了rlz-8通過巨胞飲的方式入胞。根據(jù)已報(bào)道的巨胞飲的機(jī)制特點(diǎn)，對(duì)rlz-8內(nèi)化的細(xì)節(jié)與特點(diǎn)進(jìn)行了進(jìn)一步研究。與陰性對(duì)照組結(jié)構(gòu)完整的纖維狀肌動(dòng)蛋白（f-actin）相比，rlz-8作用后細(xì)胞腹部無法觀察到貫穿狀f-actin結(jié)構(gòu)，說明f-actin參與了rlz-8的內(nèi)化，重組后的碎片化肌動(dòng)蛋白參與了內(nèi)吞體的組成。rlz-8與巨胞飲的標(biāo)記物——高分子量的糖苷（dextran）在細(xì)胞內(nèi)有明顯共定位現(xiàn)象。另外，隨著rlz-8的內(nèi)化，巨胞飲相關(guān)的偽足，皺縮以及囊泡均可在電鏡結(jié)果中觀察到。已有報(bào)道認(rèn)為巨胞飲是一個(gè)膽固醇依賴的過程，而rlz-8的內(nèi)化效率可以被一種膽固醇抑制劑——mβcd抑制50%。由于gtp酶（gtpase）參與調(diào)節(jié)了巨胞飲過程，我們研究了其對(duì)rlz-8內(nèi)化的影響。隨著rlz-8和牛血清蛋白（bsa）的內(nèi)化,rasgtp、arf6gtp、rac1gtp均被激活，bsa引發(fā)的激活在內(nèi)化1小時(shí)后回復(fù)到最初的水平，而rlz-8持續(xù)保持著高活性狀態(tài)。綜上，rlz-8應(yīng)該是通過巨胞飲的方式內(nèi)化進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，而這種內(nèi)化方式可能與rlz-8的腫瘤細(xì)胞毒性有關(guān)。本發(fā)明還通過大量的研究工作來揭示rlz-8內(nèi)化與其所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡之間的關(guān)系。100μg/mlrlz-8作用5小時(shí)后，hepg2細(xì)胞發(fā)生了皺縮與脹破死亡。通過實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞依次發(fā)生皺縮，變圓，最后由于細(xì)胞膜的缺乏導(dǎo)致細(xì)胞崩解死亡。為更好的展現(xiàn)細(xì)胞死亡過程，更低劑量的rlz-8（10μg/ml）應(yīng)用于下述實(shí)驗(yàn)。rlz-8作用6小時(shí)后被撤走，更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后，核周紅色熒光囊泡依然存在，內(nèi)化的rlz-8似乎并未被溶酶體降解。與之相對(duì)應(yīng)的是，bsa培養(yǎng)20分鐘后即被降解。但若rlz-8作用4小時(shí)后，再進(jìn)行bsa的孵育，bsa并未被降解，而是與rlz-8存在明確共定位現(xiàn)象。根據(jù)以上結(jié)果，結(jié)合內(nèi)吞體與溶酶體分別在bsa降解中的作用，相關(guān)活性與細(xì)胞成像應(yīng)用于rlz-8內(nèi)化的降解研究。作用于細(xì)胞10分鐘后，rlz-8與rab5開始出現(xiàn)共定位現(xiàn)象，30分鐘后共定位現(xiàn)象逐漸消失，隨之而來，rlz-8與rab7的共定位現(xiàn)象開始出現(xiàn)，并持續(xù)維持下去，而整個(gè)內(nèi)化過程中，rlz-8始終未與lamp1發(fā)生共定位。上述結(jié)果表明rlz-8的內(nèi)化滯留于晚期內(nèi)吞體階段，且不與溶酶體發(fā)生融合。這可能導(dǎo)致rlz-8大量積累在晚期內(nèi)吞體階段。luzio等報(bào)道通過調(diào)控ca2+的釋放能夠抑制le與溶酶體的融合，再加入足夠cacl2可以恢復(fù)兩者融合。本研究中，cacl2的加入并未引起包含rlz-8的le與溶酶體融合。因此，接下來的研究集中于rlz-8內(nèi)化過程中rab7活性的檢測(cè)。圖3e結(jié)果顯示，隨著rlz-8的內(nèi)化，rab7活性維持在較低水平，而相對(duì)的是bsa的內(nèi)化中，rab7活性增高，表明含有bsa的le與溶酶體發(fā)生融合。根據(jù)上述結(jié)果可以初步推斷含有rlz-8的晚期內(nèi)吞體未與溶酶體發(fā)生融合的原因。更重要的是，le的不斷積累對(duì)整個(gè)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)會(huì)造成何影響，我們通過研究rlz-8內(nèi)化過程中細(xì)胞膜的循環(huán)來考察這一影響。選用兩種細(xì)胞膜標(biāo)志物——egfr和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（tfr），隨著rlz-81小時(shí),2小時(shí),4小時(shí)及6小時(shí)的進(jìn)入，rlz-8始終與標(biāo)志物保持高度的共定位現(xiàn)象。另一個(gè)體現(xiàn)晚期內(nèi)吞體異常滯留的重要現(xiàn)象是rlz-8與介導(dǎo)巨胞飲體形成的肌動(dòng)蛋白一直維持明確共定位。因此可以看出，隨著rlz-8的內(nèi)化，含有rlz-8的細(xì)胞膜并未循環(huán)回細(xì)胞膜表面。綜上，rlz-8通過巨胞飲的過度內(nèi)化導(dǎo)致細(xì)胞膜循環(huán)的阻斷，這可能是細(xì)胞皺縮與死亡的誘因。在本發(fā)明的前期實(shí)驗(yàn)中，由于rlz-8的分子量?jī)H為12.4kda，在體內(nèi)半衰期較短，為了提高其體內(nèi)半衰期以及腎清除率等，通過對(duì)重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白（rlz-8）修飾物的研究，構(gòu)建了單甲氧基聚乙二醇丙琥珀酰亞安酯（mpeg-spa-rlz-8），在動(dòng)物藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該修飾物的抗腫瘤效果有所下降。這說明修飾物存在的位置與rlz-8的抗腫瘤重要區(qū)域有極大的關(guān)聯(lián)性。因此運(yùn)用了分子對(duì)接技術(shù)，對(duì)mpeg可能形成的空間位阻的位置進(jìn)行了計(jì)算。首先以rlz-8的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，構(gòu)建了mpeg-spa-rlz-8的結(jié)構(gòu)模型，利用分子對(duì)接計(jì)算mpeg聚合物所形成的空間位阻，由于mpeg鏈柔性強(qiáng)，計(jì)算量是普通大型工作站無法承受的，僅截取所用mpeg-spa（分子量：5000da）的十分之一進(jìn)行計(jì)算，因而其計(jì)算結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性未知。將截取的peg16鏈在discoverystudio2.5中通過cdodocker操作方法，對(duì)接到rlz-8可能的活性位點(diǎn)上。而后對(duì)所有可能影響rlz-8的氨基酸位置進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)定點(diǎn)突變，產(chǎn)生的突變體用amber進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬的穩(wěn)定性分析。最后共得到兩個(gè)對(duì)rlz-8抗腫瘤和與egfr結(jié)合可能性最大的區(qū)域：第一個(gè)區(qū)域由第6位-20位氨基酸組成，第二個(gè)區(qū)域?yàn)榈?1—74位氨基酸組成。選取其中5個(gè)具有代表性位置的氨基酸，為了探究這九個(gè)氨基酸每個(gè)氨基酸對(duì)于抗腫瘤熱點(diǎn)區(qū)的影響和作用，將九個(gè)氨基酸進(jìn)行排列組合后，分別設(shè)計(jì)將這九個(gè)氨基酸中的部分氨基酸突變?yōu)楸彼?，重新?gòu)建質(zhì)粒、在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中重組表達(dá)突變后的氨基酸序列，按照rlz-8的純化工藝進(jìn)行制備，獲得了重組表達(dá)的突變體，用重組表達(dá)的突變體在與egfr的親和力、動(dòng)物藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)5個(gè)突變位點(diǎn)所代表的兩個(gè)關(guān)鍵性區(qū)域（圖1）進(jìn)行分析。rlz-8的氨基酸序列如附件中氨基酸序列所示。所選取代表氨基酸為第一個(gè)區(qū)域（第6位-20位氨基酸）中，由第九位的精氨酸(r9)、第16位賴氨酸（k16），第十八位絲氨酸（s18）。第二個(gè)區(qū)域（第41—74位氨基酸組成）中的第41位賴氨酸（k41），第55位天冬氨酸（d55）。共得到五個(gè)突變體，分別為rlz-8(k16a/s18a/k41a/d45a)、rlz-8（k16a/k41a）、rlz-8（d45a）、rlz-8（s18a）和rlz-8（r9a）。這五個(gè)突變體與egfr的親和力測(cè)試結(jié)果顯示，rlz-8(k16a/s18a/k41a/d45a)、rlz-8（k16a/k41a）、rlz-8（d45a）和rlz-8（s18a）這四個(gè)突變體的親和力下降明顯，其中rlz-8(k16a/s18a/k41a/d45a)和rlz-8（k16a/k41a）幾乎與egfr無親和力，親和力常數(shù)（kd）僅分別為和。而僅改變一個(gè)氨基酸后，rlz-8（d45a）和rlz-8（s18a）的親和力也下降了兩個(gè)數(shù)量級(jí)至。rlz-8（r9a）的親和力并未有任何明顯改變。在體外細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)中表明，即使劑量高達(dá)100μg/ml，除rlz-8（r9a）外，其余四種突變體與hepg2細(xì)胞膜結(jié)合和進(jìn)入細(xì)胞的效率大幅下降，特別是rlz-8(k16a/s18a/k41a/d45a)，與hepg2細(xì)胞膜結(jié)合量非常少，而且?guī)缀跤^察不到其進(jìn)入細(xì)胞。rlz-8是否入胞是其腫瘤殺傷的重要因素，因此證明了所預(yù)測(cè)的這兩個(gè)區(qū)域是rlz-8抗腫瘤和與egfr結(jié)合的重要區(qū)域。在肝癌、肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌動(dòng)物藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)中表明，rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a）、rlz-8（k16a/k41a）、rlz-8（d45a）和rlz-8（s18a）組與陰性對(duì)照組相比，腫瘤質(zhì)量差異不顯著，幾乎無抑瘤效果。說明所預(yù)測(cè)的這兩個(gè)區(qū)域，對(duì)rlz-8的抗腫瘤效果起到了決定性作用。當(dāng)無法與egfr結(jié)合后，其入胞和抗腫瘤藥效均顯著下降。通過丙氨酸突變體rlz-8(k16a/s18a/k41a/d45a)與rlz-8比較發(fā)現(xiàn)，rlz-8中由這四個(gè)位置的氨基酸所組成的區(qū)域表面呈正電勢(shì)，而突變成丙氨酸后，該區(qū)域表面呈中性而失去與egfr結(jié)合和抗腫瘤的能力。同時(shí)對(duì)比其相同家族結(jié)構(gòu)相似的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白（fip-fve），fip-fve結(jié)構(gòu)中所在相同區(qū)域呈負(fù)電勢(shì)而同樣不具有與egfr結(jié)合和抗腫瘤的能力。因此，以增強(qiáng)該區(qū)域正電勢(shì)或減弱其周圍負(fù)電勢(shì)作為開發(fā)rlz-8突變體的策略，通過計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)的計(jì)算，對(duì)該區(qū)域及其周圍負(fù)電勢(shì)區(qū)域進(jìn)行定點(diǎn)突變，定點(diǎn)突變位置為：第6-9位氨基酸（6-lifr-9）、第16-20位氨基酸（16-klsfd-20）、第41-46為氨基酸（41-kvltd-46）和第68-74位氨基酸（68-eskgsqk-74）。在這些位置中，選取7個(gè)突變體作為代表進(jìn)行重組表達(dá)純化，對(duì)該突變策略進(jìn)行驗(yàn)證。包括rlz-8丙氨酸突變體在內(nèi)的所有突變體均通過與rlz-8相同的發(fā)酵純化工藝，進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建、蛋白重組表達(dá)純化獲得。經(jīng)驗(yàn)證，7個(gè)突變體經(jīng)過單個(gè)定點(diǎn)突變或者多個(gè)定點(diǎn)突變后，除rlz-8(k41d/k46e/k74e)外，與egfr的親和力均有明顯提高。其中rlz-8（d70k）和rlz-8（l17k/d70k）與rlz-8相比，親和力平衡常數(shù)分別提高了4倍和6倍。而rlz-8(k41d/k46e/k74e)由于破壞了rlz-8關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域，使其親和力反而下降。在肝癌、肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌動(dòng)物藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)中表明，rlz-8（d70k）和rlz-8（l17k/d70k）組較rlz-8對(duì)照組抑瘤效果顯著增強(qiáng)，其余突變體抑瘤效果接近或略好于rlz-8對(duì)照組，并且能在一定程度上顯著或者略微延長(zhǎng)小鼠的存活率。說明通過對(duì)關(guān)鍵的兩個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域進(jìn)行該區(qū)域正電勢(shì)增強(qiáng)或者減弱其周圍負(fù)電勢(shì)作為策略得到的定點(diǎn)突變的突變體，同rlz-8相比，具有顯著的對(duì)于egfr親和力的提高和對(duì)egfr表達(dá)異常癌癥的抗腫瘤藥效的提高?；诶硇栽O(shè)計(jì)和對(duì)rlz-8抗腫瘤機(jī)制的深入研究，進(jìn)而對(duì)其關(guān)鍵的egfr結(jié)合和抗腫瘤結(jié)構(gòu)域進(jìn)行定點(diǎn)突變，最終所得到的突變體具有顯著優(yōu)于rlz-8的抗腫瘤作用。附圖說明圖1靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的關(guān)鍵性區(qū)域展示圖2靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體bl21（de3）原核表達(dá)westernblot鑒定圖注：s為rlz-8標(biāo)準(zhǔn)品，第1泳道為rlz-8，第2泳道為rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a），第3泳道為rlz-8（k16a/k41a），第4泳道為rlz-8（d45a），第5泳道為rlz-8（s18a），第6泳道為rlz-8（r9a），第7泳道為rlz-8（d70k），第8泳道為rlz-8（l17k/d70k），第9泳道為rlz-8（d20h/d68k），第10泳道為rlz-8（d20h），第11泳道為rlz-8（l17k），第12泳道為rlz-8（k41d/k46e/k74e），第13泳道為rlz-8（k46e/k74e），第14泳道為rlz-8（k46e）。圖3靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體x33畢赤酵母表達(dá)westernblot鑒定圖注：s為rlz-8標(biāo)準(zhǔn)品，第1泳道為rlz-8，第2泳道為rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a），第3泳道為rlz-8（k16a/k41a），第4泳道為rlz-8（d45a），第5泳道為rlz-8（s18a），第6泳道為rlz-8（r9a），第7泳道為rlz-8（d70k），第8泳道為rlz-8（l17k/d70k），第9泳道為rlz-8（d20h/d68k），第10泳道為rlz-8（d20h），第11泳道為rlz-8（l17k），第12泳道為rlz-8（k41d/k46e/k74e），第13泳道為rlz-8（k46e/k74e），第14泳道為rlz-8（k46e）。圖4靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體cho-s哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)westernblot鑒定圖注：s為rlz-8標(biāo)準(zhǔn)品，第1泳道為rlz-8，第2泳道為rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a），第3泳道為rlz-8（k16a/k41a），第4泳道為rlz-8（d45a），第5泳道為rlz-8（s18a），第6泳道為rlz-8（r9a），第7泳道為rlz-8（d70k），第8泳道為rlz-8（l17k/d70k），第9泳道為rlz-8（d20h/d68k），第10泳道為rlz-8（d20h），第11泳道為rlz-8（l17k），第12泳道為rlz-8（k41d/k46e/k74e），第13泳道為rlz-8（k46e/k74e），第14泳道為rlz-8（k46e）。圖5靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體的免疫印跡檢測(cè)結(jié)果圖注：s為rlz-8標(biāo)準(zhǔn)品，第1泳道為rlz-8，第2泳道為rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a），第3泳道為rlz-8（k16a/k41a），第4泳道為rlz-8（d45a），第5泳道為rlz-8（s18a），第6泳道為rlz-8（r9a），第7泳道為rlz-8（d70k），第8泳道為rlz-8（l17k/d70k），第9泳道為rlz-8（d20h/d68k），第10泳道為rlz-8（d20h），第11泳道為rlz-8（l17k），第12泳道為rlz-8（k41d/k46e/k74e），第13泳道為rlz-8（k46e/k74e），第14泳道為rlz-8（k46e），第15泳道為rlz-8（l17k）。圖6靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體的電泳檢測(cè)圖注：m為標(biāo)記物，s為rlz-8標(biāo)準(zhǔn)品，第1泳道為rlz-8，第2泳道為rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a），第3泳道為rlz-8（k16a/k41a），第4泳道為rlz-8（d45a），第5泳道為rlz-8（s18a），第6泳道為rlz-8（r9a），第7泳道為rlz-8（d70k），第8泳道為rlz-8（l17k/d70k）。圖7靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及突變體電泳檢測(cè)結(jié)果圖注：m為標(biāo)記物，s為rlz-8標(biāo)準(zhǔn)品，第1泳道為rlz-8，第2泳道為rlz-8（d20h/d68k），第3泳道為rlz-8（d20h），第4泳道為rlz-8（l17k），第5泳道為rlz-8（k41d/k46e/k74e），第6泳道為rlz-8（k46e/k74e），第7泳道為rlz-8（k46e），第8泳道為rlz-8（l17）。圖8rlz-8純化過程中各階段樣品的電泳檢測(cè)結(jié)果圖注：m為標(biāo)記物，第1泳道為rlz-8標(biāo)準(zhǔn)品，第2泳道為陽離子層析后30%的流動(dòng)相b洗脫樣品，第3泳道為60%流動(dòng)相b洗脫峰2，第4泳道為陽離子層析的流穿樣品，第6泳道為終樣。圖9靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白30%流動(dòng)相洗脫樣品的hplc檢測(cè)圖10靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白60%流動(dòng)相洗脫樣品的hplc檢測(cè)圖11靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白純化終樣的hplc檢測(cè)圖12靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白通過巨胞飲的方式入胞圖13靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白與egfr共定位觀察圖14靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白與其他膜受體的共定位觀察圖15靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白與rab5、rab7、lamp1的共定位現(xiàn)象圖16靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白入胞后細(xì)胞變化實(shí)時(shí)觀察圖17靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白撤走后對(duì)細(xì)胞死亡的影響圖18靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白凍干工藝曲線具體實(shí)施例本發(fā)明中實(shí)施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體的原核與真核表達(dá)本實(shí)施例中“目的蛋白”代表“rlz-8及其突變體”，“目的基因”代表“rlz-8及其突變體基因”。重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體的原核表達(dá)菌株構(gòu)建與表達(dá)本實(shí)施例采用原核表達(dá)系統(tǒng)中具有代表性的大腸桿菌bl21(de3)菌株進(jìn)行目的蛋白表達(dá)。目的蛋白基因經(jīng)密碼子優(yōu)化，并按照pet-28a載體t7啟動(dòng)子方向，在目的基因5’端添加xbai酶切位點(diǎn)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)dna序列，3’端添加終止密碼子和xhoi酶切位點(diǎn)進(jìn)行全基因合成。經(jīng)xbai和xhoi雙酶切并與pet-28a原核表達(dá)載體連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，熱激轉(zhuǎn)化bl21(de3)菌株，卡那霉素抗性篩選陽性克隆，得到含有重組表達(dá)載體的基因工程菌。將所得基因工程菌置于37℃下培養(yǎng)至od600≈0.6時(shí)，采用iptg在30℃條件下誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，收集菌體破碎后，離心取上清液進(jìn)行westernblot鑒定。圖2結(jié)果表明，本發(fā)明中rlz-8及其突變體在原核表達(dá)菌株bl21(de3)中得到表達(dá)。rlz-8及其突變體組成型畢赤酵母菌株構(gòu)建與表達(dá)目的蛋白基因按照畢赤酵母密碼子偏愛性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，按照組成型表達(dá)載體pgapzαa質(zhì)粒中g(shù)ap啟動(dòng)子方向，在目的基因5’端添加xhoi酶切位點(diǎn)和kex2、ste13水解酶位點(diǎn)dna序列，3’端添加終止密碼子和xbai酶切位點(diǎn)進(jìn)行全基因合成。通過酶切連接的方法構(gòu)建重組表達(dá)載體，并測(cè)序驗(yàn)證。按照invitrogen公司pgapzαa質(zhì)粒說明書，電轉(zhuǎn)化x33畢赤酵母，經(jīng)zeocin抗性篩選，獲得組成型重組目的蛋白x33畢赤酵母表達(dá)菌株。將所得基因工程菌置于30℃下培養(yǎng)至od600≈6，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)使目的蛋白分泌表達(dá)，離心取上清液進(jìn)行westernblot鑒定。圖3結(jié)果表明，本發(fā)明中rlz-8及其突變體在畢赤酵母x33中得到表達(dá)。重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)采用invitrogen公司freestyle?maxchoexpressionsystem進(jìn)行目的蛋白表達(dá)。對(duì)目的基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化，并添加asci和xhoi酶切位點(diǎn)進(jìn)行全基因合成。通過酶切連接的方法將目的基因轉(zhuǎn)入psectag2a表達(dá)載體中，獲得重組目的基因表達(dá)載體。使用freestyle?maxreagent將重組目的蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)染導(dǎo)入cho-s細(xì)胞中，利用潮霉素b抗性篩選，獲得重組目的蛋白細(xì)胞株。在37℃8%co2135rpm條件下分泌表達(dá)目的蛋白，離心收集上清液westernblot鑒定目的蛋白表達(dá)情況。圖4結(jié)果表明，本發(fā)明中rlz-8及其突變體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞cho-s中得到表達(dá)。實(shí)施例2利用發(fā)酵工程技術(shù)制備rlz-8及其突變體靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體均采用相同的表達(dá)載體和菌株進(jìn)行構(gòu)建和表達(dá)篩選。該實(shí)施例中采用由畢赤酵母進(jìn)行基因組重組構(gòu)建獲得，所獲得的菌株經(jīng)過前期搖瓶培養(yǎng)，篩選可用于發(fā)酵罐規(guī)模制備使用的工程菌株，以下敘述中使用“目的蛋白”代表rlz-8及其突變體。發(fā)酵工藝的具體流程復(fù)蘇工作種子：從-80℃冰箱取出組成型工作種子，室溫緩慢溶解，取出10μl分別接入10mlypd液體培養(yǎng)基的100ml搖瓶中，28.5℃225rpm震蕩培養(yǎng)24h。組成型種子液培養(yǎng)：復(fù)蘇的工作種子菌液od值在2-6之間，取菌液1ml，加入2l三角燒瓶?jī)?nèi)含400mlypd培養(yǎng)基內(nèi)，28.5℃，225rpm，振蕩培養(yǎng)，至菌液od值≈6，可作為上罐用種子液。罐上培養(yǎng)階段①調(diào)校設(shè)備：校準(zhǔn)發(fā)酵罐的ph電極（在發(fā)酵罐滅菌前用ph校正液進(jìn)行ph6.86和4.00校正）、溶氧電極（在發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基滅菌并冷卻后校正，培養(yǎng)條件的最大通氣量、最適溫度、最適ph值、最高轉(zhuǎn)數(shù)攪拌30min以上校正溶氧電極），并進(jìn)行蠕動(dòng)泵的流量校準(zhǔn)。②配制3.5lbsm基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基加入7.5l發(fā)酵罐，4ml消泡劑（可滅菌），121℃，30min高壓滅菌培養(yǎng)基、發(fā)酵罐及管路。③待發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基滅菌并冷卻后，設(shè)置以下參數(shù)：溫度（29℃），轉(zhuǎn)速為800rpm，通氣量8l/min，培養(yǎng)基的ph值為6.0。無菌操作補(bǔ)加0.22μm過濾膜除菌8mlbiotin及17mlptm1微量元素。④無菌操作將發(fā)酵罐接種口和種子液補(bǔ)料口連接，然后將上述2l三角燒瓶?jī)?nèi)含有400mlypd菌液，利用蠕動(dòng)泵補(bǔ)加進(jìn)入發(fā)酵罐，總體積為3.9l進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵罐參數(shù)設(shè)置分別為攪拌速度800rpm，溫度29℃，維持do值（溶解氧）在20%左右，必要時(shí)通入純氧。⑤此階段每6h取樣1次，測(cè)od600、細(xì)胞濕重及細(xì)胞干重，分析酵母菌生長(zhǎng)狀態(tài)，肉眼和鏡下觀察菌液，排除雜菌污染，并留上清。⑥按照每升12ml/lptm1微量元素加入高壓滅菌后冷卻的50%甘油中混勻后，用蠕動(dòng)泵補(bǔ)加進(jìn)培養(yǎng)基中，補(bǔ)加甘油過程中，do值不能低于20%，可以通過提高攪拌轉(zhuǎn)速和通純氧保證氧供給。⑦對(duì)每個(gè)菌株各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣進(jìn)行sds-page電泳，以檢測(cè)其表達(dá)量，分析組成型rlz-8發(fā)酵上清液。⑧當(dāng)本次發(fā)酵進(jìn)行到126h時(shí)，向罐中補(bǔ)加20ml磷酸，以使一定量的氨水進(jìn)入培養(yǎng)液中，作為氮源繼續(xù)支持發(fā)酵，并150h停止培養(yǎng)。結(jié)果及分析由圖5可見，根據(jù)westernblot檢測(cè)，rlz-8及其突變體均標(biāo)成功制備，且表達(dá)量較高。如圖6所示，rlz-8及其丙氨酸突變體，均成功表達(dá)，并且分子量與第2泳道的標(biāo)準(zhǔn)品保持一致。如圖6和7所示，rlz-8及其經(jīng)過表面電勢(shì)優(yōu)化后的突變體，均成功表達(dá)，并且分子量與第1泳道的標(biāo)準(zhǔn)品保持一致。本發(fā)明中構(gòu)建出組成型蛋白的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，無需給予甲醇誘導(dǎo)即可表達(dá)所需蛋白，以甘油作為碳源，其生長(zhǎng)速率相比甲醇誘導(dǎo)更滿足其表達(dá)需要，可同時(shí)進(jìn)行生長(zhǎng)與表達(dá)，提高發(fā)酵效率和效果。實(shí)施例3靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體的分離純化工藝1.實(shí)驗(yàn)方法經(jīng)過實(shí)驗(yàn)摸索，對(duì)發(fā)酵液按照微濾、超濾、陽離子交換層析和疏水作用層析的順序進(jìn)行rlz-8及其突變體的分離純化。由于rlz-8與其突變體之間理化性質(zhì)差別較小，因而純化工藝相似，使用rlz-8的純化工藝均可成功制備突變體，并非每種突變體的最佳分離純化工藝，本實(shí)施例中未對(duì)任何一種突變體的純化工藝進(jìn)行優(yōu)化。以下文字為對(duì)rlz-8的純化工藝細(xì)節(jié)的詳盡敘述。①發(fā)酵液微濾處理工藝用3l注射用水清洗已經(jīng)保存完好的0.7m2中空纖維微濾柱，清洗去除微濾柱里的50ppm次氯酸鈉保護(hù)液，用5l含有2000ppm次氯酸鈉的0.5m氫氧化鈉溶液來清洗柱子，測(cè)定ph值及檢測(cè)內(nèi)毒素含量。微濾：離心后的上清液檢測(cè)電導(dǎo)值和ph值，用微濾柱處理，蠕動(dòng)泵速率40轉(zhuǎn)/分鐘，1擋。壓力表上下都控制在≤0.1mpa。微濾后用注射用水洗柱，收集洗柱液與樣品合并，總體積增加至少為發(fā)酵原液體積的0.25倍。清洗微濾柱，配制5l含有2000ppm次氯酸鈉的0.5m氫氧化鈉溶液清洗柱子，用10l注射用水清洗至ph值至中性，再用一定量的50ppm次氯酸鈉進(jìn)行保存柱子。發(fā)酵離心上清原液、微濾后樣品分別取樣，進(jìn)行sds電泳檢測(cè)，發(fā)酵離心上清原液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)。②發(fā)酵液超濾處理工藝用2l注射用水清洗已經(jīng)保存完好的0.6m2膜包，清洗去除膜包中的0.1m氫氧化鈉保護(hù)液，用1m氫氧化鈉3l清洗膜包，再用酸性洗液清洗至ph為中性，測(cè)定ph值，水通量。超濾：微濾處理后的樣品用切向流過濾系統(tǒng)濃縮、除鹽。設(shè)定選擇conc-difi-conc程序進(jìn)行濃縮，加入20注射用水進(jìn)行除鹽，最后濃縮，根據(jù)蛋白的含量確定濃縮的5倍。超濾結(jié)束后，檢測(cè)樣品終ph值，終電導(dǎo)值。清洗膜包及保存：膜包處理樣品后，用5l的1m氫氧化鈉進(jìn)行清洗至初始的水通量，洗至中性，再用0.1m氫氧化鈉堿液進(jìn)行保存。超濾后的樣品進(jìn)行sds電泳檢測(cè)。③陽離子層析純化工藝將粗純超濾后收集的目的蛋白5l加入陽離子層析的流動(dòng)相a母液（ph為3.6的0.02m無水醋酸鈉溶液）中，進(jìn)行調(diào)節(jié)ph值，用冰醋酸調(diào)節(jié)至ph到3.6，并用0.22μm濾膜通過板式濾器過濾，準(zhǔn)備上樣。平衡色譜柱：用填料captos裝bpg(140/500)柱，裝1.5l填料，用6l注射用水清洗至柱內(nèi)20%乙醇和0.2m乙酸鈉保護(hù)液完全去除，做內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果小于0.25eu/ml后方可使用。用流動(dòng)相a平衡6個(gè)柱體積，流速30l/h，設(shè)定儀器保護(hù)壓為2bar，測(cè)定電導(dǎo)值，ph值和電導(dǎo)值達(dá)到流動(dòng)相a的相應(yīng)值即可。上樣：過濾后的樣品通過a3泵上樣，流速20l/h，上樣完成后，收集流穿峰，測(cè)定ph值，電導(dǎo)值范圍，280nm紫外吸收值范圍，洗脫未結(jié)合用8la相緩沖液進(jìn)行洗脫，流速30l/h，洗至未結(jié)合峰達(dá)到起始的紫外吸收值即可，收集未結(jié)合峰，測(cè)定電導(dǎo)值范圍。洗脫：根據(jù)保護(hù)壓力設(shè)定流速，進(jìn)行階段性洗脫，10%的流動(dòng)相b（ph為3.6的含有0.02m無水醋酸鈉和1.5m氯化鈉溶液）沖洗12l，30%的流動(dòng)相b沖洗6l，分別洗脫至洗脫峰達(dá)到起始的紫外吸收值即可，收集每步洗脫峰。檢測(cè)電導(dǎo)值范圍，280nm紫外吸收值范圍，收集的洗脫峰體積，取出一定量做sds電泳、高效液相（hplc）檢測(cè)。各階段的含有目的蛋白的洗脫峰純度低于50%則棄掉。④疏水層析純化工藝樣品處理：將陽離子超濾后收集的目的蛋白2l按體積加入hic的b相母液，進(jìn)行調(diào)節(jié)ph值，用醋酸調(diào)節(jié)至ph到5.0，并用0.22μm膜板式過濾，準(zhǔn)備上樣。平衡色譜柱：用填料captophenyl裝bpg(140/500)柱，裝1.0l填料，用5l注射用水清洗至柱內(nèi)20%乙醇保護(hù)液完全去除，再用6l1m氫氧化鈉堿液清洗，再用注射用水清洗至ph值至中性，做內(nèi)毒素檢測(cè)，合格后可使用。用流動(dòng)相b平衡8個(gè)柱體積，流速30l/h，設(shè)定儀器保護(hù)壓為2bar。上樣：過濾后的樣品通過上樣泵上樣，流速20l/h，上樣完成后，收集流穿峰，測(cè)定ph值，電導(dǎo)值范圍，洗脫未結(jié)合用6l流動(dòng)相b緩沖液進(jìn)行洗脫，流速20l/h，洗至未結(jié)合峰達(dá)到起始的紫外吸收值即可，收集未結(jié)合峰，測(cè)定電導(dǎo)值范圍及電泳。洗脫：設(shè)定流速為30l/h進(jìn)行階段性洗脫，60%b相洗脫25l，30%b相洗脫6l。分別洗脫至洗脫峰達(dá)到起始的紫外吸收值即可，收集每步洗脫峰。檢測(cè)電導(dǎo)值范圍，280nm紫外吸收值范圍，收集的洗脫峰體積，取出一定量做sds電泳、hplc檢測(cè)。各階段的含有目的蛋白的洗脫峰純度低于90%則棄掉。結(jié)果與分析通過rlz-8對(duì)純化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，根據(jù)圖8中的電泳結(jié)果表明，經(jīng)過陽離子層析30%的流動(dòng)相b洗脫樣品（泳道4）、60%的流動(dòng)相b中峰2洗脫樣品（泳道2）、60%的流動(dòng)相b中峰1洗脫樣品（泳道3）和純化終樣（泳道6），均與標(biāo)準(zhǔn)品（泳道1）中出現(xiàn)的明顯條帶位置一致，其中30%的流動(dòng)相b洗脫樣品（泳道4）、60%的流動(dòng)相b中峰1洗脫樣品（泳道3）還有明顯的雜帶，而60%的流動(dòng)相b中峰2洗脫樣品（泳道2）、純化終樣（泳道6）的明顯且不含雜帶證明純化方法可行。而后對(duì)相同樣品進(jìn)行液相檢測(cè)，30%的流動(dòng)相b洗脫樣品（圖9）中主峰（峰6）高度突出，但存在7個(gè)左右雜峰，根據(jù)峰面積計(jì)算，純度約為91%左右。如圖10和11所示，60%的流動(dòng)相b中峰2洗脫樣品和純化終樣均只含一個(gè)主峰，純度為100%，液相結(jié)果與電泳結(jié)果保持一致。實(shí)施例4靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白通過巨胞飲的方式入胞1.實(shí)驗(yàn)方法借助超高分辨成像系統(tǒng)，通過抑制劑實(shí)驗(yàn)、共定位實(shí)驗(yàn)等篩查rlz-8的入胞方式。①靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白入胞形態(tài)學(xué)觀察使用alexafluor568熒光探針標(biāo)記rlz-8，然后將10μg/ml熒光標(biāo)記rlz-8作用于hepg2細(xì)胞3h，之后使用超高分辨成像系統(tǒng)觀察rlz-8是否入胞，并使用imaris圖像分析軟件對(duì)所得圖像進(jìn)行重構(gòu)擬合與進(jìn)一步分析。②抑制劑篩查選用不同內(nèi)化方式的抑制劑，eipa（巨胞飲抑制劑）、wortmannin/ly294002（pi3k抑制劑）、nystatin+progesterone（小窩抑制劑）、chlorpromazine（網(wǎng)格蛋白抑制劑）等分別作用于hepg2細(xì)胞，來觀察其對(duì)rlz-8入胞的抑制效果。③靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白入胞對(duì)微絲的影響由于巨胞飲入胞過程中微絲起到重要的作用，能夠發(fā)生斷裂重組，因此考察了rlz-8入胞對(duì)微絲的影響，從而判斷其是否為巨胞飲入胞。④巨胞飲標(biāo)志物dextran和bsa分別與rlz-8的共定位研究dextran和bsa為巨胞飲入胞方式的經(jīng)典標(biāo)志物，為考察rlz-8的入胞方式，將rlz-8和dextran/bsa共同作用于hepg2細(xì)胞，觀察是否有共定位現(xiàn)象。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果按上述方法對(duì)rlz-8的入胞方式進(jìn)行了研究，結(jié)果如圖12所示。由圖12.a可知，rlz-8能夠內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞，并在細(xì)胞核周圍形成中空狀囊泡，說明rlz-8是通過某種內(nèi)化的方式進(jìn)入細(xì)胞的。接下來的抑制劑篩查發(fā)現(xiàn)（圖12.b和12.c），只有巨胞飲的抑制劑eipa有效地抑制了rlz-8的內(nèi)化，而其他內(nèi)化方式的抑制劑并未產(chǎn)生抑制效果，這說明rlz-8極有可能通過巨胞飲入胞。進(jìn)而根據(jù)巨胞飲的特點(diǎn)，對(duì)rlz-8內(nèi)化過程中微絲的變化進(jìn)行了觀察（圖12.d），發(fā)現(xiàn)該過程中細(xì)胞腹部貫穿狀的微絲發(fā)生了斷裂，這說明微絲參與了rlz-8的內(nèi)化。而rlz-8又與巨胞飲的典型標(biāo)志物dextran和bsa存在高度的共定位現(xiàn)象（圖12.e）。以上結(jié)果表明rlz-8是通過巨胞飲內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞的。實(shí)施例5靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白與egfr結(jié)合后入胞1.實(shí)驗(yàn)方法鑒于rlz-8的高內(nèi)化強(qiáng)度可能是由于與細(xì)胞膜上受體結(jié)合后內(nèi)化導(dǎo)致，因此對(duì)rlz-8與細(xì)胞膜上的受體進(jìn)行了篩查。使用免疫熒光的方法對(duì)細(xì)胞膜上不同受體與rlz-8的關(guān)系進(jìn)行了檢測(cè)，分別使用egfr、c-met、pdgfr、n-cadherin以及l(fā)dlr的抗體對(duì)其進(jìn)行熒光標(biāo)記，分別觀察其與rlz-8的共定位情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果免疫熒光結(jié)果如圖13所示。從圖13中可以看出，隨著rlz-8內(nèi)化的進(jìn)行，rlz-8與egfr始終保持了高度的共定位現(xiàn)象。而如圖14，rlz-8與其他內(nèi)化相關(guān)的膜受體卻始終沒有發(fā)生共定位現(xiàn)象。因此說明rlz-8是通過與細(xì)胞膜表面egfr結(jié)合，然后發(fā)生高強(qiáng)度巨胞飲內(nèi)化入胞的。實(shí)施例6靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白內(nèi)化后不與溶酶體發(fā)生融合1.實(shí)驗(yàn)方法正常的巨胞飲內(nèi)化過程中，內(nèi)吞物經(jīng)早期內(nèi)吞體、晚期內(nèi)吞體后會(huì)與溶酶體發(fā)生融合，然后被降解，因此考察了rlz-8內(nèi)化入胞后是否同樣經(jīng)歷了該過程。通過免疫熒光的方法，分別對(duì)rab5（早期內(nèi)吞體標(biāo)志物）、rab7（晚期內(nèi)吞體標(biāo)志物）和lamp1（溶酶體標(biāo)志物）進(jìn)行熒光標(biāo)記，觀察其與rlz-8的共定位現(xiàn)象。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白分別與rab5、rab7、lamp1的共定位現(xiàn)象如圖15所示。由圖15.a可知，作用于細(xì)胞10min后，rlz-8與rab5開始出現(xiàn)共定位現(xiàn)象，30min后共定位現(xiàn)象逐漸消失，隨之而來，rlz-8與rab7的共定位現(xiàn)象開始出現(xiàn)（圖15.b），并持續(xù)維持下去，而整個(gè)內(nèi)化過程中，rlz-8始終未與lamp1發(fā)生共定位（圖15.c）。上述結(jié)果表明rlz-8的內(nèi)化滯留于晚期內(nèi)吞體階段，且不與溶酶體發(fā)生融合。這可能導(dǎo)致rlz-8大量積累在晚期內(nèi)吞體階段。實(shí)施例7靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白內(nèi)化后引起大量膜占用導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡1.實(shí)驗(yàn)方法使用超高分辨成像系統(tǒng)，實(shí)時(shí)觀察rlz-8內(nèi)化后細(xì)胞變化的全過程，并結(jié)合前面的各項(xiàng)研究，判斷出rlz-8引起腫瘤細(xì)胞死亡的原因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察結(jié)果如圖13所示。由圖13可知，rlz-8作用于細(xì)胞后，細(xì)胞依次發(fā)生皺縮，變圓，最后細(xì)胞崩解死亡。結(jié)合實(shí)施例8中rlz-8入胞后不與溶酶體結(jié)合發(fā)生降解，而是始終與晚期內(nèi)吞體發(fā)生融合的結(jié)果進(jìn)行分析，rlz-8內(nèi)化入胞時(shí)形成巨胞飲體的細(xì)胞膜會(huì)隨rlz-8一起入胞，而由于未被溶酶體降解，該部分細(xì)胞膜將不會(huì)被重新降解循環(huán)回細(xì)胞膜表面又由于rlz-8的持續(xù)高強(qiáng)度內(nèi)化，更多的細(xì)胞膜會(huì)被不停地帶入胞內(nèi)，從而引起細(xì)胞膜的大量占用，細(xì)胞會(huì)因此發(fā)生皺縮，進(jìn)而崩解死亡。若確實(shí)是這一作用機(jī)制，當(dāng)rlz-8進(jìn)入停止后，細(xì)胞應(yīng)不會(huì)繼續(xù)皺縮死亡。由圖17所示，一旦rlz-8被撤走，其內(nèi)化行為停止，細(xì)胞不但不會(huì)繼續(xù)發(fā)生死亡，反而會(huì)重新貼壁生長(zhǎng)，恢復(fù)正常狀態(tài)。綜上，rlz-8對(duì)細(xì)胞的殺傷機(jī)制為通過與細(xì)胞膜上egfr結(jié)合，發(fā)生高強(qiáng)度的巨胞飲內(nèi)化入胞，并滯留在晚期內(nèi)吞體中，不與溶酶體發(fā)生融合，從而引起大量的細(xì)胞膜占用，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生皺縮、變圓，最終崩解死亡。實(shí)施例8靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對(duì)人肝癌細(xì)胞原位移植瘤模型小鼠的影響1、實(shí)驗(yàn)方法①實(shí)驗(yàn)材料與試劑選用6-8周齡的nog小鼠，體重18-22g，購自于北京維通利華，在東北師范大學(xué)spf級(jí)條件下飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間控制溫度在（20±2）℃，濕度48%，12小時(shí)交替照明。人肝癌hepg2細(xì)胞株，dmem培養(yǎng)基，胎牛血清，pbs，胰酶-edta，dmso，0.05%胰蛋白酶，rlz-8，rlz-8突變體，陽性對(duì)照藥為索拉菲尼。②儀器設(shè)備與器具二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀，臺(tái)式離心機(jī)，電子天平，微量移液器，培養(yǎng)瓶，移液管、固定架，注射器，剪刀，鑷子等。③實(shí)驗(yàn)步驟人肝癌細(xì)胞hepg2細(xì)胞選用含10%胎牛血清的dmem培養(yǎng)基，置于37℃、5%co2恒溫箱中培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hepg2細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，以無血清dmem培養(yǎng)液洗滌，調(diào)整活細(xì)胞濃度為1×108個(gè)/ml，取20μl細(xì)胞懸液（dmem培養(yǎng)基：matrigel=1：1）接種于nog小鼠肝臟原位，建立nog小鼠hepg2肝癌細(xì)胞原位移植瘤模型。2周后，將模型小鼠隨機(jī)分組，每組10只。給藥方式為尾靜脈注射，每天一次，連續(xù)注射28天（qd×28,i.v.），陰性對(duì)照組注射生理鹽水，rlz-8和其突變體按照0.5mg/kg的劑量給藥，索拉菲尼對(duì)照組按照50mg/kg劑量給藥。對(duì)實(shí)驗(yàn)中途死亡小鼠，在死亡當(dāng)天稱量體重并取出腫瘤組織稱重；對(duì)給藥28天后依然存活的小鼠，經(jīng)脫頸處死小鼠取出腫瘤組織并稱重。詳細(xì)記錄各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中小鼠的死亡時(shí)間和死亡數(shù)量，分析實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的小鼠生存情況計(jì)算存活率，存活率=（小鼠總數(shù)-死亡小鼠數(shù)量）/小鼠總數(shù)。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果①靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對(duì)小鼠體重影響分析小鼠經(jīng)尾靜脈注射連續(xù)給藥28天，陰性對(duì)照組與索拉菲尼對(duì)照組小鼠體重明顯降低，rlz-8對(duì)照組小鼠體重?zé)o明顯變化；rlz-8突變體中，rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a）、rlz-8（k16a/k41a）、rlz-8（d45a）和rlz-8（s18a）組小鼠體重較實(shí)驗(yàn)前出現(xiàn)顯著降低，rlz-8（d70k）和rlz-8（l17k/d70k）組小鼠體重較實(shí)驗(yàn)前略有增加。以上結(jié)果表明，rlz-8和其突變體能調(diào)節(jié)小鼠的身體狀態(tài)。而兩個(gè)突變體（d70k）和rlz-8（l17k/d70k）與索拉菲尼的聯(lián)用同樣顯示出較好的效果。表格1靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對(duì)hepg2肝癌移植瘤模型小鼠體重的影響②靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對(duì)小鼠腫瘤重量的影響瘤體重量方面：剝離下來的瘤體稱重后，每個(gè)組計(jì)算瘤體重的平均數(shù)，可以看出給藥28天后，rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a）、rlz-8（k16a/k41a）、rlz-8（d45a）和rlz-8（s18a）組與陰性對(duì)照組相比，腫瘤質(zhì)量差異不顯著，幾乎無抑瘤效果；rlz-8（d70k）和rlz-8（l17k/d70k）組較rlz-8對(duì)照組抑瘤效果顯著增強(qiáng)，其余突變體抑瘤效果接近或略好于rlz-8對(duì)照組。以上結(jié)果表明：k16/s18/k41/d45為影響rlz-8抗腫瘤活性的關(guān)鍵氨基酸，在rlz-8結(jié)構(gòu)上與此區(qū)域臨近的正電勢(shì)增強(qiáng)突變或周圍負(fù)電勢(shì)的減弱表現(xiàn)出了更好的抗腫瘤效果。而兩個(gè)突變體（d70k）和rlz-8（l17k/d70k）與索拉菲尼的聯(lián)用同樣顯示出較好的效果。表格2靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對(duì)hepg2肝癌移植瘤小鼠腫瘤重量的影響③靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對(duì)小鼠存活率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rlz-8抗腫瘤活性結(jié)構(gòu)域附近的正電勢(shì)增強(qiáng)突變體，如rlz-8（d70k）、rlz-8（l17k/d70k）等對(duì)于延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間能夠起到一定作用。表格3靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對(duì)hepg2肝癌移植瘤小鼠存活率的影響綜上所述，rlz-8抗腫瘤活性結(jié)構(gòu)域附近的正電勢(shì)增強(qiáng)突變體，如rlz-8（d70k）、rlz-8（l17k/d70k）等，對(duì)人肝癌細(xì)胞原位移植瘤模型小鼠表現(xiàn)出了相對(duì)于rlz-8更加良好的抗腫瘤活性，并且對(duì)于延長(zhǎng)荷瘤小鼠存活時(shí)間能夠起到一定作用。而突變體與索拉菲尼的聯(lián)用同樣顯示出較好的效果。實(shí)施例9靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對(duì)人肺癌細(xì)胞原位移植瘤模型小鼠的影響1、實(shí)驗(yàn)方法①實(shí)驗(yàn)材料與試劑人肺癌a549細(xì)胞株，選用6-8周齡的nog小鼠，體重18-22g，購自于北京維通利華，在東北師范大學(xué)spf級(jí)條件下飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間控制溫度在（20±2）℃，濕度48%，12小時(shí)交替照明。dmem培養(yǎng)基，胎牛血清，pbs，胰酶-edta，dmso，0.05%胰蛋白酶，rlz-8，rlz-8突變體。②儀器設(shè)備與器具二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀，臺(tái)式離心機(jī)，電子天平，微量移液器，培養(yǎng)瓶，移液管、固定架，注射器，剪刀，鑷子等。③實(shí)驗(yàn)分組及給藥方式人肺癌a549細(xì)胞選用含10%胎牛血清的dmem培養(yǎng)基，置于37℃、co2恒溫箱中培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的a549細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，以無血清dmem培養(yǎng)液洗滌，調(diào)整活細(xì)胞濃度為1×108個(gè)/ml，取20μl細(xì)胞懸液接種于nog小鼠肺原位，2周后，建立nog小鼠a549肺癌細(xì)胞原位移植瘤模型。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果①靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對(duì)小鼠體重影響分析靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白和其突變體能調(diào)節(jié)a549肺癌移植瘤模型小鼠的身體狀態(tài)，其中rlz-8抗腫瘤活性結(jié)構(gòu)域附近的正電勢(shì)增強(qiáng)突變體對(duì)小鼠體重的增加具有一定的正向調(diào)節(jié)作用。表格4靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對(duì)a549癌移植瘤模型小鼠體重的影響②靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對(duì)小鼠腫瘤重量的影響可以看出給藥28天后，rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a）、rlz-8（k16a/k41a）、rlz-8（d45a）和rlz-8（s18a）組與陰性對(duì)照組相比，腫瘤質(zhì)量差異不顯著，幾乎無抑瘤效果；rlz-8（d70k）和rlz-8（l17k/d70k）等突變體組較rlz-8對(duì)照組抑瘤效果顯著增強(qiáng)，其余突變體抑瘤效果接近或略好于rlz-8對(duì)照組。表格5靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對(duì)a549肺癌移植瘤小鼠腫瘤重量的影響③靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對(duì)小鼠存活率的影響rlz-8抗腫瘤活性結(jié)構(gòu)域附近的正電勢(shì)增強(qiáng)突變體，如rlz-8（d70k）、rlz-8（l17k/d70k）等相對(duì)于rlz-8可顯著延長(zhǎng)a549肺癌移植瘤小鼠的存活時(shí)間。表格6靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對(duì)a549肺癌移植瘤小鼠存活率的影響實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)后小鼠存活率（%）陰性對(duì)照組20rlz-8對(duì)照組50rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a）10rlz-8（k16a/k41a）20rlz-8（d45a）30rlz-8（s18a）30rlz-8（r9a）50rlz-8（d70k）80rlz-8（l17k/d70k）80rlz-8（d20h/d68k）70rlz-8（d20h）70rlz-8（l17k）70rlz-8（k41d/k46e/k74e）40rlz-8（k46e/k74e）50rlz-8（k46e）40實(shí)施例10靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對(duì)人乳腺癌細(xì)胞原位移植瘤模型小鼠的影響1、實(shí)驗(yàn)方法①實(shí)驗(yàn)材料與試劑人乳腺癌mcf7細(xì)胞株，17β雌二醇緩釋片，balb/c雌性裸鼠，dmem培養(yǎng)基，胎牛血清，pbs，胰酶-edta，dmso，0.05%胰蛋白酶，rlz-8，rlz-8突變體。②儀器設(shè)備與器具二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀，臺(tái)式離心機(jī)，電子天平，微量移液器，培養(yǎng)瓶，移液管、固定架，注射器剪刀，鑷子等。③實(shí)驗(yàn)分組及給藥方式人乳腺癌mcf7細(xì)胞選用含10%胎牛血清的dmem培養(yǎng)基，置于37℃、co2恒溫箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前1天在balb/c裸鼠頸部皮下埋植0.5mg17β雌二醇緩釋片。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的mcf7細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，以無血清dmem培養(yǎng)液洗滌，將5×106個(gè)mcf7細(xì)胞接種于balb/c裸鼠左側(cè)第二乳房墊內(nèi)，建立balb/c裸鼠mcf7乳腺癌細(xì)胞原位移植瘤模型。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果給藥28天后，rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a）、rlz-8（k16a/k41a）、rlz-8（d45a）和rlz-8（s18a）組與陰性對(duì)照組相比，腫瘤質(zhì)量差異不顯著，幾乎無抑瘤效果；rlz-8（d70k）和rlz-8（l17k/d70k）組較rlz-8對(duì)照組抑瘤效果顯著增強(qiáng)。表格7靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對(duì)mcf7乳腺癌移植瘤小鼠腫瘤重量的影響實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)后小鼠腫瘤質(zhì)量（g）陰性對(duì)照組1.03±0.24rlz-8對(duì)照組0.74±0.35rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a）1.02±0.33rlz-8（k16a/k41a）1.12±0.37rlz-8（d45a）1.08±0.28rlz-8（s18a）1.04±0.30rlz-8（r9a）0.79±0.31rlz-8（d70k）0.52±0.28rlz-8（l17k/d70k）0.49±0.26rlz-8（d20h/d68k）0.60±0.27rlz-8（d20h）0.61±0.22rlz-8（l17k）0.63±0.31rlz-8（k41d/k46e/k74e）1.10±0.42rlz-8（k46e/k74e）0.73±0.24rlz-8（k46e）0.75±0.32實(shí)施例11靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞移植瘤模型小鼠的影響1、實(shí)驗(yàn)方法①實(shí)驗(yàn)材料與試劑人結(jié)腸癌sw480細(xì)胞株，balb/c雄性裸鼠，rpmi1640培養(yǎng)基，dmem培養(yǎng)基，胎牛血清，pbs，胰酶-edta，dmso，0.05%胰蛋白酶，rlz-8，rlz-8突變體。②儀器設(shè)備與器具二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀，臺(tái)式離心機(jī)，電子天平，微量移液器，培養(yǎng)瓶，移液管、固定架，注射器，剪刀，鑷子等。③實(shí)驗(yàn)分組及給藥方式人結(jié)腸癌sw480細(xì)胞選用含10%胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基，置于37℃、co2恒溫箱中培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，以無血清rpmi1640培養(yǎng)液洗滌，將2×106個(gè)細(xì)胞接種于balb/c裸鼠背部皮下，待觀察瘤塊成型，直徑大于0.5cm時(shí)，隨機(jī)分組，建立人結(jié)腸癌sw480細(xì)胞移植瘤balb/c裸鼠模型。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果給藥28天后，rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a）、rlz-8（k16a/k41a）、rlz-8（d45a）和rlz-8（s18a）組與陰性對(duì)照組相比，腫瘤質(zhì)量差異不顯著，幾乎無抑瘤效果；rlz-8（d70k）和rlz-8（l17k/d70k）組較rlz-8對(duì)照組抑瘤效果顯著增強(qiáng)。表格8靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對(duì)sw480結(jié)腸癌移植瘤小鼠腫瘤重量的影響實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)后小鼠腫瘤質(zhì)量（g）陰性對(duì)照組3.13±0.64rlz-8對(duì)照組1.94±0.43rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a）3.12±0.54rlz-8（k16a/k41a）3.12±0.47rlz-8（d45a）3.26±0.56rlz-8（s18a）3.01±0.39rlz-8（r9a）1.89±0.37rlz-8（d70k）1.22±0.29rlz-8（l17k/d70k）1.09±0.33rlz-8（d20h/d68k）1.60±0.29rlz-8（d20h）1.54±0.45rlz-8（l17k）1.62±0.41rlz-8（k41d/k46e/k74e）3.10±0.48rlz-8（k46e/k74e）2.23±0.54rlz-8（k46e）2.15±0.62實(shí)施例12親和力測(cè)定實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)方法選用biacoret200儀器（ge公司），通過表面等離子共振技術(shù)，對(duì)rlz-8及其突變體對(duì)egfr胞外結(jié)構(gòu)域的親和力測(cè)試。采用cm5芯片作為親和力測(cè)定芯片。①偶聯(lián)ph篩選以egfr胞外結(jié)構(gòu)域（氨基酸序列25~645）作為配體偶聯(lián)，將1mgegfr凍干粉用hepes緩沖液溶液稀釋為濃度400μg/ml待用。準(zhǔn)備三個(gè)1.5mlep管，分別取10μl配體，加入90μl不同ph(ph4.5,5.0,5.5)的10mm醋酸鈉,充分混勻，配體最終濃度為40μg/ml。另取1個(gè)1.5mlep管，加入200μl50mm醋酸鈉。結(jié)果顯示選擇ph5.0的條件進(jìn)行配體偶聯(lián)。②偶聯(lián)配體配體分子量是70kda，分析物分子量（rlz-8為12.4kda），每個(gè)rlz-8抗體理論上可以結(jié)合1個(gè)egfr，因此化學(xué)計(jì)量比sm等于1.通過下面的公式進(jìn)行配體偶聯(lián)量rl的計(jì)算。即通過實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)摸索，設(shè)定最佳試劑偶聯(lián)量為3*rl，因此偶聯(lián)量設(shè)定為1700ru。egfr胞外結(jié)構(gòu)域成功偶聯(lián)在cm5芯片上。③待檢測(cè)樣品的準(zhǔn)備在親和力測(cè)試中，為了排除不同濃度對(duì)親和力的影響，每個(gè)rlz-8或者其突變體選用8個(gè)濃度進(jìn)行測(cè)試，其中7濃度為梯度濃度，第8個(gè)濃度為測(cè)試參比濃度，具體濃度如下述表格9所示。表格9待檢測(cè)樣品的梯度濃度樣品編號(hào)樣品濃度c1256nmc2128nmc364nmc432nmc516nmc68nmc74nmc8(對(duì)照)128nm2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過對(duì)結(jié)果曲線進(jìn)行擬合和計(jì)算后，所測(cè)試rlz-8及其突變體的親和力結(jié)果如下表10。表格10靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體的親和力共對(duì)12種突變體進(jìn)行親和力測(cè)定，結(jié)果顯示對(duì)于關(guān)鍵的抗腫瘤結(jié)合區(qū)域進(jìn)行的丙氨酸隱性突變體（rlz-8(k16a/s18a/k41a/d45a)、rlz-8(k16a/k41a)、rlz-8(d45a)、rlz-8(s18a)），親和力下降明顯，下降了兩到三個(gè)數(shù)量級(jí)。而通過對(duì)蛋白質(zhì)表面電勢(shì)的計(jì)算，選擇幾個(gè)代表性的突變位置（如第70位、20位等），對(duì)極大可能增強(qiáng)表面正電勢(shì)的氨基酸進(jìn)行的突變，結(jié)果顯示突變體rlz-8(d70k)、rlz-8(l17k/d70k)、rlz-8(d20h/e68k)的親和力分別提高了2.3倍、6倍和1.4倍。實(shí)施例13靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體的凍干粉劑型1.實(shí)驗(yàn)方法選用美國virtiswizard2.0凍干機(jī)對(duì)rlz-8及其突變體的凍干處方、凍干工藝進(jìn)行摸索和確定。①靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體的凍干處方通過單因素實(shí)驗(yàn)的考察，對(duì)影響凍干處方劑型的穩(wěn)定劑、表面活性劑進(jìn)行考察，確定添加不同的輔料對(duì)于蛋白質(zhì)含量、純度、不溶性微粒和活性的影響。其中主要活性物質(zhì)與穩(wěn)定劑采用質(zhì)量比1：5，主要活性物質(zhì)與穩(wěn)定劑采用質(zhì)量比20：1。通過處方組合后進(jìn)行的篩選，確定最佳的凍干處方?；A(chǔ)處方設(shè)計(jì)如下表。表格11靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體的處方設(shè)計(jì)處方編號(hào)海藻糖（mg）甘露醇（mg）乳糖（mg）吐溫80（mg）泊洛沙姆188（mg）rlz8（mg）150501025050103505010450500.510550500.510650500.510750500.510850500.510950500.510②靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體的凍干工藝通過對(duì)凍干過程中生化干燥溫度選取-23℃、-25℃、-27℃、-29℃、-31℃、-33℃六個(gè)水平，真空度選取100mtorr、150mtorr、200mtorr、250mtorr、300mtorr、350mtorr六個(gè)水平，凍干時(shí)間選取50h、60h、70h、80h、90h、100h六個(gè)水平，以性狀為考察指標(biāo)分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。解析干燥溫度選取25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃六個(gè)水平，干燥時(shí)間選取15h、20h、25h、30h、35h、40h六個(gè)水平，真空度選取100mtorr、150mtorr、200mtorr、250mtorr、300mtorr、350mtorr六個(gè)水平，以水分為考察指標(biāo)分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果①rlz-8及其突變體的凍干處方根據(jù)表13的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，在高溫條件下，各個(gè)穩(wěn)定劑對(duì)rlz8的影響，10天與0天對(duì)比各指標(biāo)降幅較小，均可應(yīng)用于處方篩選的后續(xù)工作中。表格12穩(wěn)定劑對(duì)靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的影響根據(jù)表13的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，在高溫條件下，各個(gè)表面活性劑對(duì)靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的影響，10天與0天對(duì)比各指標(biāo)降幅較小，可應(yīng)用于處方篩選的后續(xù)工作中。表格13表面活性劑對(duì)靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的影響處方組合篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表14，數(shù)據(jù)表明，處方3、6、9在放樣過程中各個(gè)數(shù)據(jù)指標(biāo)變化較大，1、2與4、5、7、8相比不溶性微粒量及變化量無明顯差別，處方4、5、7、8中含有表面活性劑，可能會(huì)對(duì)后續(xù)毒性實(shí)驗(yàn)差生影響。處方1、2均可用作備用處方，但由于處方2中注射級(jí)乳糖來源較為困難，因此選用處方1作為凍干處方。表格14靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的凍干處方篩選結(jié)果②靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體的凍干工藝經(jīng)過凍干條件摸索后，確定最佳凍干工藝為升華干燥條件確定為溫度-30℃，真空度300mtorr，干燥時(shí)間90h，解析干燥溫度40℃，真空度250mtorr，干燥時(shí)間30h。圖18為凍干曲線，在此條件下的凍干樣品性狀水分均達(dá)到合格要求。靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的突變體在相同凍干處方和凍干工藝條件上，同樣可以得到凍干性狀和水分合格的凍干粉。metseraspthralaleuilepheargleualatrpaspvallyslysleuserpheasptyrthrproasntrpglyargglyasnprpasnasnpheileaspthrvalthrpheprolysvalleuthrasplysalatyrthrtyrargvalalavalserglyargasnleuglyvallysprosertyralavalgluseraspglyserglnlysvalasnpheleuglutyrasnserglytyrglyilealaaspthrasnthrileglnvalphevalvalaspproaspthrasnasnasppheileilealaglntrpasn當(dāng)前第1頁12