一種重組膠原-mRNA復合材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組膠原-mRNA復合材料，該復合材料包括編碼特異蛋白質因子的mRNA和負載該mRNA的蛋白載體，該蛋白載體從氨基端至羧基端依次包括麥芽糖結合蛋白和膠原；該mRNA通過其3’端修飾的氨基與該蛋白載體的膠原的甘氨酸-脯氨酸-半胱氨酸序列中的半胱氨酸共價連接，該復合材料能夠讓特異蛋白質因子在創(chuàng)傷部位持續(xù)、可控的釋放。
【專利說明】-種重組膠原-mRNA復合材料及其制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物材料【技術領域】，具體涉及一種重組膠原-mRNA復合材料及其制備 方法。

【背景技術】
[0002] 組織工程是通過將細胞種植在生物材料支架上或把生長因子與支架復合，移植到 體內(nèi)，重建損傷的組織。使用自體細胞的一個突出問題是難以收獲足夠數(shù)量的細胞，尤其是 病人年齡很大或病情嚴重時。同種異體細胞常用于皮膚組織工程，這種工程化的組織能夠 分泌促進組織修復的生長因子。異種細胞通常用于需要角質形成細胞的上皮組織工程，它 們雖然可以強烈地促進表皮組織生長，但有病毒感染的危險。此外，異體同種和異種細胞都 具有免疫原性，移植后需要進行免疫抑制治療。目前干細胞被廣泛地用于組織工程，因為它 們具有高度的分化能力，能夠不斷增殖。但部分干細胞具有潛在的致癌性，而且數(shù)量不足也 限制了干細胞的臨床應用（Nature Biotechnology，2000,18:56-58)。
[0003] 生長因子（GF)在改善各種生理和病理狀態(tài)、促進組織再生、修復及創(chuàng)傷愈合方面 發(fā)揮著重要的作用。把GF直接注射到創(chuàng)傷組織效果很差，劑量太低生長因子在體內(nèi)會迅 速彌散和降解，靶組織可能沒有足夠的反應。而劑量太高，又會導致嚴重的副作用。并且 絕大多數(shù)生長因子半衰期很短，易失去活性，因此GF不適合單純使用（Science，2000， 289:1498-1500)?；谝陨显?，設計能夠有效釋放GF的仿生支架，在組織工程領域引起 了廣泛的關注。目前有三種釋放生長因子的方法，一種是使用包含生長因子基因的DNA質 粒，直接注射到體內(nèi)，翻譯成GF蛋白。然而，血清里的核酸酶會快速降解DNA，而且人體的 單核吞噬細胞系統(tǒng)會清除DNA質粒，因此裸DNA的表達水平通常是有限的。第二種方法是 利用基因技術把編碼生長因子的基因用病毒載體轉入細胞，然后將處理后的細胞移植到體 內(nèi)，在體內(nèi)釋放生長因子。病毒載體的缺陷包括內(nèi)源性重組、致癌效應和意想不到的免疫反 應。另外，移植正在分裂的細胞有形成腫瘤的風險。第三種方法是把GF與生物材料載體結 合起來，但生長因子的變性和爆發(fā)性釋放仍然是個難題（Journal of the Royal Society Interface，2011，8:153-170 ;Gene Therapy，2002,9:1647-1652)。mRNA 介導的基因轉移與 質粒DNA或病毒載體相比具有很多優(yōu)勢，RNA不能直接整合到染色體DNA上，消除了在轉基 因的細胞中引起插入突變的可能性（Mol Therapy，2012, 20:948-953)。但mRNA在組織中不 穩(wěn)定，易分解或擴散，需要合適的支架材料提供蛋白質合成的場所。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術缺陷，提供一種重組膠原-mRNA復合材料。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述重組膠原-mRNA復合材料的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的具體技術方案如下：
[0007] -種重組膠原-mRNA復合材料，包括：
[0008] 編碼特異蛋白質因子的mRNA，其3'端修飾有氨基；
[0009] 和負載該mRNA的蛋白載體，其從氨基端至羧基端依次包括麥芽糖結合蛋白和膠 原，其中膠原的氨基酸序列如SEQ ID 1所示；
[0010] 該mRNA通過其3'端修飾的氨基與該蛋白載體的膠原的甘氨酸-脯氨酸-半胱氨 酸序列中的半胱氨酸共價連接。
[0011] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述膠原的DNA序列為經(jīng)過大腸桿菌密碼子優(yōu) 化的DNA序列。
[0012] 進一步優(yōu)選的,所述膠原的DNA序列如SEQ ID 2所示。
[0013] 一種上述重組膠原-mRNA復合材料的制備方法，包括如下步驟：
[0014] (1)將編碼膠原的氨基酸序列的DNA序列克隆到pET-MBP-TevH質粒中，構建蛋白 載體重組質粒；
[0015] (2)將該蛋白載體重組質粒轉化到感受態(tài)大腸桿菌中培養(yǎng)，并用IPTG誘導表達；
[0016] (3)將表達的蛋白載體通過快速蛋白液相色譜系統(tǒng)的鎳親和層析柱和凝膠過濾層 析柱純化；
[0017] (4)PCR擴增所述編碼特異蛋白質因子的基因，再轉錄成該促進組織修復的蛋白質 因子的mRNA ;
[0018] (5)將該mRNA的3'端修飾上氨基；
[0019] (6)將修飾氨基的mRNA用4-(N-馬來酰亞胺甲基）環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰 亞胺酯鈉鹽共價連接到純化后的所述蛋白載體的半胱氨酸上，即得所述重組膠原-mRNA復 合材料。
[0020] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟（1)的克隆所用的引物的序列為TPF 和TPR，其DNA序列分別如SEQ ID 3和SEQ ID 4所示。
[0021] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述感受態(tài)大腸桿菌為E. coli BL21。
[0022] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟（4)的轉錄為用T7 RNA聚合酶進行體 外轉錄。
[0023] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟（5)為用poly-A聚合酶將所述mRNA 的3'端與NH2-ATP相連，形成3'端修飾的氨基。
[0024] 本發(fā)明的有益效果是：
[0025] 本發(fā)明的重組膠原-mRNA復合材料，包括編碼特異蛋白質因子的mRNA和負載該 mRNA的蛋白載體，該蛋白載體從氨基端至羧基端依次包括麥芽糖結合蛋白和膠原；該mRNA 通過其3'端修飾的氨基與該蛋白載體的膠原的甘氨酸-脯氨酸-半胱氨酸序列中的半胱 氨酸共價連接，該復合材料能夠讓特異蛋白質因子在創(chuàng)傷部位持續(xù)、可控的釋放。編碼特異 蛋白質因子的mRNA可以是促進組織修復的生長因子mRNA、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD) mRNA、胰島素 mRNA、蛋白類激素的mRNA等。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為本發(fā)明實施例1制備的復合材料的蛋白載體的SDS-PAGE和Western blot 結果圖；
[0027] 圖2為本發(fā)明實施例1制備的復合材料的蛋白載體的膠原三聚體和單體的示意 圖。·
[0028] 圖3是本發(fā)明實施例1制備的的復合材料的蛋白載體的膠原圓二色譜（CD)和不 同溫度的SDS-PAGE圖；
[0029] 圖4是RNA、膠原-RNA復合物的瓊脂糖電泳結果；
[0030] 圖5是膠原支架上eGFP的生物合成結果圖。

【具體實施方式】
[0031] 以下通過【具體實施方式】結合附圖本發(fā)明的技術方案進行進一步的說明和描述。
[0032] 下述【具體實施方式】中選用綠色熒光蛋白eGFP模擬所述特異蛋白因子
[0033] (1)將編碼膠原的氨基酸序列的DNA序列克隆到pET-MBP-TevH質粒中，構建蛋白 載體重組質粒：
[0034] 如SEQ ID 1所示，該膠原根據(jù)人I型膠原，包含氨基端的His6標簽、TEV酶切位點、 兩端各增加10個甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸（GPP)來增加膠原的穩(wěn)定性。兩個甘氨酸-脯 氨酸-半胱氨酸（GPC)被插入膠原序列中提供mRNA的交聯(lián)位點，兩個半胱氨酸之間的距離 約為30nm。
[0035] 如SEQ ID 2所示，DNA序列經(jīng)過大腸桿菌密碼子優(yōu)化后由美國GeneWiz公司 (5〇11讓？1&丨11^1(1，町）克隆到口此57質粒中，并增加了5'83111!11和恥61以及3'53(31內(nèi)切 酶位點。用內(nèi)切酶消后把膠原序列轉移到pET-25b(+) (Novagen)中。然后以transfer-PCR 的方法把膠原片段亞克隆到pET-MBP-TevH質粒，構建麥芽糖結合蛋白（MBP)與膠原融合蛋 白重組質粒，克隆引物TPF和TPR的序列分別如SEQ ID 3和SEQ ID 4所述。以引物T7(SEQ ID 5)和PetRev (SEQ ID 6)進行PCR篩選陽性克隆。挑取單菌落進行PCR反應，條件如下： 10μ1 Master Mix(Ampliqon，Skovlunde，Denmark)、1.25yM T7 和 PetRev 引物，加水使終 體積為20 μ 1。PCR反應程序：95°C變性1分鐘后，95°C加熱30秒、60°C退火1分鐘、72°C延 伸1. 5分鐘，以上三個步驟循環(huán)25次，最后在72°C延伸6分鐘。陽性克隆的菌落培養(yǎng)后提 取質粒進行DNA序列測定，選取包含正確序列克隆的菌落培養(yǎng)后用15%甘油保存于-80°C。 正確的的MBP與膠原的融合蛋白的DNA和氨基酸序列分別如SEQ ID 9和SEQ ID 10所示；
[0036] Transfer-PCR 方法參見文獻 Transfer-PCR(TPCR) :A highway for DNA cloning and protein engineering. , Ariel Erijman, Ada Dantes, Reut Bernheim, et al. Journal of Structural Biology 175(2011) 171 - 177;質粒 pET-MBP-TevH參見文獻Applications of the Restriction Free(RF)cloning procedure for molecular manipulations and protein expression. , Tamar Unger, Yossi Jacobovitch, Ada Dantes, et al. Journal of Structural Biology 172(2010)34 - 44。
[0037] (2)將該蛋白載體重組質粒轉化到感受態(tài)大腸桿菌中培養(yǎng)，并用IPTG誘導表達：
[0038] 把步驟（1)提取的正確序列的質粒轉化到感受態(tài)大腸桿菌E. coliBL21 (DE3)中。 37°C，200rpm，LB培養(yǎng)基（添加 SOyg/ml卡那霉素）中過夜培養(yǎng)。用含相同抗生素的LB 培養(yǎng)基把培養(yǎng)的細菌稀釋100倍，繼續(xù)培養(yǎng)2. 5小時，直到OD6tltlmi達到0. 6-0. 8。用0. 2 μ M 異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)誘導膠原的表達，15°C，200rpm過夜培養(yǎng)。
[0039] (3)將表達的蛋白載體通過快速蛋白液相色譜系統(tǒng)的鎳親和層析柱和凝膠過濾層 析柱純化：
[0040] 收集步驟⑵誘導表達培養(yǎng)的細菌，在50mM Tris-HCl pH7. 4,150mM NaCl，2〇mM imidazole，ImM 二硫蘇糖醇（DTT)，ImM PMSF， protease inhibitor cocktail (Calbiochem)，I. 5 μ g/ml DNase I and 1.5 μ g/ml 溶菌酶混合液中超聲破碎 菌體.。4°C 50 OOOg下離心40分鐘，收集上清液，在快速蛋白液相色譜系統(tǒng)（FPLC，GE Healthcare)中用鎳親和層析柱（HisTrap? HP，GE)和凝膠過濾層析柱（HiLoad 16/60 Superdex?200 pregrade，GE)對表達的蛋白載體進行純化，用Amicon Ultra-15離心柱對 收集的蛋白載體進行濃縮。
[0041] 如圖1至圖3所示，用SDS-PAGE電泳和圓二色譜檢測蛋白載體單體（加熱） 和三聚體（不加熱），并用單克隆抗體Monoclonal Anti-polyHistidine peroxidase conjugate (Sigma，A7058)進行免疫印跡試驗（western blot),確認蛋白載體。圖1中條帶 1和3是未加熱的樣品，膠原保持三聚體狀態(tài)，樣品煮沸后膠原三螺旋解開，形成單體（圖1 中的條帶2和4)，結果證實了膠原三聚體的存在。由圖3A可以看出，20-90°C的加熱過程 中，膠原三螺旋的特征峰逐漸消失，證實了三螺旋解鏈的過程。圖3B顯示196nm膠原的解 鏈曲線，解鏈溫度為55°C，與圖3C的結果相符，圖3C是30-90°C不同溫度下的SDS-PAGE電 泳條帶。
[0042] (4) PCR擴增所述特異蛋白質因子的基因，再轉錄成mRNA :
[0043] 以pIVEX-GFP質粒為模板，用聚合酶鏈式反應擴增eGFP基因，引物GFP-F和 GFP-R的序列分別見SEQ ID 7和SEQ ID 8,純化的eGFP PCR產(chǎn)物（43ng/μ 1)與T7 RNA 聚合酶（〇.lmg/ml)和反應緩沖液（20mM MgC12, ImM spermidine, 5mM DTT，40mM Tris pH7.5, 0.01% Triton X-100,和每種 NTP 4mM)混合，37°C 體外轉錄 2.5 小時，用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)進行純化。
[0044] (5)將該mRNA的3'端修飾上氨基：
[0045] 用 3' -NH2-ATP 修飾 eGFP mRNA，方法如下：2 μ M eGFP mRNA、0· ImM EDA-ATP, Ix 反 應緩沖液和5U大腸桿菌Poly (A)聚合酶混合，在37°C孵育0.5小時。然后用RNeasy Mini Kit純化3'氨基化的mRNA。
[0046] (6)將修飾氨基的mRNA用4- (N-馬來酰亞胺甲基）環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰 亞胺酯鈉鹽（sulfo-SMCC)共價連接到純化后的所述蛋白載體的半胱氨酸上，即得所述重 組膠原-mRNA復合材料：
[0047] 用 Micro BioSpin P-6 柱（Bio-Rad)除去蛋白載體中的 DTT。將 10mg/ml 的 sulfo-SMCC (Thermo Scientific)溶解在 DMSO 中。mRNA 的 3' -NH2 先與 sulfo-SMCC 的 N-羥 基琥珀酰亞胺酯基（NHS)反應，然后SMCC修飾的mRNA通過sulfo-SMCC的馬來酰亞胺基與 蛋白載體的半胱氨酸巰基共價結合。3'-NH 2-RNA (2.83 μ M)與73mM硼酸緩沖液（pH8. 6)混 合，加入2mM sulfo-SMCC，渦旋震蕩，24°C反應lh，然后用RNeasy kit (Qiagen)除掉多余的 sulfo-SMCC。SMCC修飾的mRNA (442nM)與純化的蛋白載體（8.83 μ M)在lx TBS緩沖液中 (50mM Tris-HCl ρΗ7· 4, 150mM NaCl, ρΗ7· 4)混合，蛋白載體和mRNA 的摩爾比為 20:1。24°C 反應2小時。用1 %的瓊脂糖電泳檢測mRNA、蛋白載體和蛋白載體-mRNA復合物。分別用溴 化乙錠和考馬斯蘭染色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。結果見圖4,分別用溴化乙錠（Ethidium bromide)和考馬斯蘭（Commassie blue)染色，圖中條帶1是mRNA，2為蛋白載體-mRNA復 合物，3是蛋白載體?？梢姷鞍纵d體-mRNA復合物滯留在加樣孔中，證實了蛋白載體-mRNA 復合物的形成，該蛋白載體-mRNA即為所述重組膠原-mRNA復合材料。
[0048] (7)蛋白質可控合成實驗：
[0049] 制備含氨基酸（每種氨基酸ImM)、醋酸鎂（20mM)、谷氨酸鉀（200mM)、大腸桿菌 tRNA 混合物（0. 17mg/mL)、二硫蘇糖醇（I. 8mM)、葉酸（35 μ g/mL)、cAMP (0. 65mM)、醋酸銨 (28mM)、磷酸肌酸（80mM)、HEPES (ρΗ7· 5, 28mM)、2 % w/v PEG-8000、酪氨酸（0· 04mg/mL)、 肌酸激酶（〇. 25mg/mL)和17% S12大腸桿菌提取液（v/v)的混合物。加入步驟（6)制得 的重組膠原-mRNA復合材料或eGFP mRNA(250ng/l·! L)，在96孔板進行蛋白質的翻譯，溫度 37°C。用熒光分光光度計檢測熒光強度（激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長528nm)，可見eGFP在 膠原支架上成功地合成，見圖5,從圖5A中可以看出，隨著時間的延長和RNA濃度的增加 (10-90ng/uL)，eGFP熒光強度逐漸增加，證實eGFP蛋白可以通過控制表達時間和mRNA的 濃度進行可控的合成；圖5B是RNA和膠原-RNA復合物表達eGFP的動力學曲線，可見膠原 支架上RNA能夠持續(xù)、穩(wěn)定的合成綠色熒光蛋白。
[0050] 以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實施的范圍，即 依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。
【權利要求】
1. 一種重組膠原-mRNA復合材料，其特征在于：包括： 編碼特異蛋白質因子的mRNA，其3'端修飾有氨基； 和負載該mRNA的蛋白載體，其從氨基端至羧基端依次包括麥芽糖結合蛋白和膠原，其 中膠原的氨基酸序列如SEQ ID 1所示； 該mRNA通過其3'端修飾的氨基與該蛋白載體的膠原的甘氨酸-脯氨酸-半胱氨酸序 列中的半胱氨酸共價連接。
2. 如權利要求1所述的一種重組膠原-mRNA復合材料，其特征在于：所述膠原的DNA序 列為經(jīng)過大腸桿菌密碼子優(yōu)化的DNA序列。
3. 如權利要求2所述的一種重組膠原-mRNA復合材料，其特征在于：所述膠原的DNA序 列如SEQ ID 2所示。
4. 如權利要求1至3中任一權利要求所述的一種重組膠原-mRNA復合材料的制備方 法，其特征在于：包括如下步驟： (1) 將編碼膠原的氨基酸序列的DNA序列克隆到pET-MBP-TevH質粒中，構建蛋白載體 重組質粒； (2) 將該蛋白載體重組質粒轉化到感受態(tài)大腸桿菌中培養(yǎng)，并用IPTG誘導表達； (3) 將表達的蛋白載體通過快速蛋白液相色譜系統(tǒng)的鎳親和層析柱和凝膠過濾層析柱 純化； (4) PCR擴增編碼特異蛋白質因子的基因，再轉錄成mRNA ; (5) 將該mRNA的3'端修飾上氨基； (6) 將修飾氨基的mRNA用4-(N-馬來酰亞胺甲基）環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺 酯鈉鹽共價連接到純化后的所述蛋白載體的半胱氨酸上，即得所述重組膠原-mRNA復合材 料。
5. 如權利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述步驟（1)的克隆所用的引物的序 列為TPF和TPR，其DNA序列分別如SEQ ID 3和SEQ ID 4所示。
6. 如權利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述感受態(tài)大腸桿菌為E.coli BL21。
7. 如權利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述步驟（4)的轉錄為用T7 RNA聚合 酶進行體外轉錄。
8. 如權利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述步驟（5)為用poly-A聚合酶將所 述mRNA的3'端與NH2-ATP相連，形成3'端修飾的氨基。
【文檔編號】A61L27/24GK104225684SQ201410388983
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權日:2014年8月8日
【發(fā)明者】孫莉萍, 約納特·阿達, 巴山·安娜特, 提莫門·艾拉, 約阿夫·佩雷格 申請人:廈門大學