專利名稱：HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白抗原免疫應(yīng)答抗HIV實(shí)驗(yàn)與方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種HIV-Erw基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白抗原免疫 應(yīng)答抗HIV實(shí)驗(yàn)與方法。它涉及生命科學(xué)領(lǐng)域、及醫(yī)藥領(lǐng)域。能夠揭 示HIV感染人體復(fù)制，通過包膜蛋白gpl20——人CD4受體的異種特異 配體抗原，與人CD4+細(xì)胞特異受體特異結(jié)合，觸發(fā)HIV感染者人體免 疫耐受機(jī)制，能夠比HIV具有高度變異性免疫逃逸機(jī)制，更為有效對(duì) -抗人體免疫抑制壓力。證實(shí)迄今HIV疫苗科學(xué)研究設(shè)計(jì)、研制的， 所有各種不同的HIV包膜蛋白gpl60、gp120抗原疫苗的臨床人體試驗(yàn)， 不能證實(shí)可以預(yù)防HIV感染人類,最重要的因素是:HIV包膜蛋白gpl20 或gpl60是人CD4受體的異種特異配體抗原，與人CD4+細(xì)胞特異受體 特異結(jié)合，觸發(fā)人體免疫耐受機(jī)制，不能激發(fā)有效根除HIV的免疫應(yīng) 答機(jī)制。尋找到能夠解決HIV包膜蛋白gpl20觸發(fā)人體免疫耐受機(jī)制 的方法，研制不觸發(fā)人體免疫耐受機(jī)制的，HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組 包膜蛋白抗原抗HIV治療疫苗、抗HIV預(yù)防疫苗，提供足夠充分的直 接動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)科學(xué)依據(jù)、直接臨床人體實(shí)驗(yàn)科學(xué)依據(jù)。
背景技術(shù)：
自1983年人免疫缺陷病毒——艾滋病被發(fā)現(xiàn)以來，客觀的講，人 類在根治、預(yù)防艾滋病科學(xué)研究方面，至今沒有取得解決根本問題的 科學(xué)研究突破。沒有科學(xué)研究跡象表明抗HIV治療可以徹底治愈HIV 感染者；HIV疫苗可能會(huì)有效預(yù)防HIV感染。HIV科學(xué)界，把不能根治、預(yù)防艾滋病AIDS，歸咎于HIV復(fù)制速 度快、HIV基因具有高度變異性病毒的產(chǎn)量平均約為107天，HIV 在體內(nèi)的平均產(chǎn)生時(shí)間約為2. 6天；體外測(cè)定每6000個(gè)核甘酸在逆轉(zhuǎn) 錄過程中有一次錯(cuò)誤的概率，體內(nèi)測(cè)試顯示每輪復(fù)制過程可能產(chǎn)生一 次突變?？僧a(chǎn)生大量具有各種不同基因變異型或表型的毒株，應(yīng)對(duì)藥 物抑制壓力、機(jī)體免疫抑制壓力，不斷衍生出新的耐藥毒株、免疫逃 逸毒株優(yōu)勢(shì)病毒種株。病毒通過特異性突變所獲得的選擇性優(yōu)點(diǎn)將對(duì) 病毒基因組產(chǎn)生有力的影響。HIV感染人體免疫應(yīng)答，出現(xiàn)高滴度的 HIV的特有的抗體是HIV原發(fā)性免疫反應(yīng)的特征，它出現(xiàn)在病毒血癥的 高峰或稍晚時(shí)間。這最初的抗體反應(yīng)不包括HIVgpl20中和抗體?？鼓?轉(zhuǎn)錄病毒藥和IL-2治療雖然可以使CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，卻未能使解 體Ve庫(kù)恢復(fù)。應(yīng)用IL-2治療期間CD4+T細(xì)胞的增加來源于CD4+T細(xì)胞 庫(kù)在胸腺外的擴(kuò)增，因?yàn)門細(xì)胞Ve庫(kù)的PCR分析證明缺失的克隆不能 再生。用IL-2和抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥試圖重建T細(xì)胞Ve庫(kù)的失敗，暗示 免疫系統(tǒng)的損傷可能存在閾值，若超過該閾值，免疫功能便不能重建。 間接感染或各種疫苗免疫的HIV感染個(gè)體都有血漿病毒血癥暫時(shí)增加， 并且與誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫活性程度相關(guān)；類似的發(fā)現(xiàn)也可見于SIV感染的 恒河猴中。上述眾多不可被一一綜述HIV科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，顯示HIV 感染人體復(fù)制，是在最初期、還沒有激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答之前，通過包 膜蛋白gpl20——人CD4受體的異種特異配體抗原，與人CD4+細(xì)胞特異 受體特異結(jié)合，首先觸發(fā)HIV感染者人體免疫耐受機(jī)制，導(dǎo)致感染人 體免疫系統(tǒng)針對(duì)HIV感染復(fù)制體液免疫應(yīng)答反應(yīng)延遲，不能首先產(chǎn)生 針對(duì)gpl20的保護(hù)性中和抗體、抑制gpl20與CD4+細(xì)胞特異受體特異
結(jié)合觸發(fā)的免疫耐受機(jī)制；使HIV可以在人體免疫應(yīng)答產(chǎn)生針對(duì)gpl20 的保護(hù)性中和抗體之前，還沒有被細(xì)胞免疫CTL有效抑制時(shí)、HIV過度 復(fù)制達(dá)到病毒血癥峰值，進(jìn)一步觸發(fā)細(xì)胞免疫耐受機(jī)制-細(xì)胞免疫損傷 機(jī)制；使HIV在感染者體內(nèi)復(fù)制，不能激發(fā)有效根除HIV的體液免疫 應(yīng)答機(jī)制、細(xì)胞免疫應(yīng)答機(jī)制，能夠比HIV具有高度變異性免疫逃逸 機(jī)制，更為有效對(duì)抗機(jī)體免疫抑制壓力。迄今HIV疫苗科學(xué)研究設(shè)計(jì)、 研制的，所有各種不同的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗的各 種臨床人體試驗(yàn)，不能證實(shí)可以預(yù)防HIV感染人類，最重要的因素是 gpl20或gpl60是人CD4受體的異種特異配體抗原，與人CD4+細(xì)胞特異 受體特異結(jié)合，首先觸發(fā)HIV感染者人體免疫耐受機(jī)制，不能激發(fā)有 效根除HIV的免疫應(yīng)答機(jī)制?，F(xiàn)代疫苗科學(xué)研究設(shè)計(jì)、研制的，HAV甲肝滅活疫苗僅需要 100ng 500 ng接種一次，即可使90%以上接種人體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗 體；HBV乙肝重組DNA蛋白HBs抗原疫苗MSD疫苗、C0H疫苗，僅需要 5|ig 20接種三次，即可使90%以上接種人體產(chǎn)生保護(hù)性抗-HBs中和 抗體?，F(xiàn)代疫苗科學(xué)研究設(shè)計(jì)、研制的，HIV重組DNA包膜蛋白gp120 或gpl60抗原疫苗，多數(shù)受試者在用300Pg HIV-IIIB gpl20、 300^g或 60Cmg HIV-麗gpl20接種三次，僅可產(chǎn)生針對(duì)V3環(huán)的抗體、針對(duì)實(shí)驗(yàn) 室同源毒株的中和抗體，不能中和野生hiv毒株、預(yù)防野生hiv毒株 感染人類。例如，HlV包膜蛋白gpl60抗原疫苗，通常需用較高劑量接 種4次以上才能使少數(shù)受試者產(chǎn)生較低滴度的同源中和抗體；Vaxgene公司的hiv包膜蛋白gPi2o抗原疫苗在北美和泰國(guó)進(jìn)行大規(guī)模的m臨床人體試驗(yàn)，公布的北美地區(qū)的試驗(yàn)結(jié)果，其中接種疫苗人群HIV感 染率為5. 7%，未接種疫苗人群HIV感染率為5. 8%。臨床人體試驗(yàn)結(jié)果 表明gpl20抗原疫苗不能有效預(yù)防HIV感染。迄今已經(jīng)有上百次各種 不同HIV包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗臨床人體實(shí)驗(yàn)失敗，不能 一一綜述。HIV包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗接種臨床人體，表現(xiàn) 出體液免疫應(yīng)答延遲、弱免疫原體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，與HIV感染入體 復(fù)制最初表現(xiàn)體液免疫應(yīng)答延遲，不能首先產(chǎn)生針對(duì)gpl20的保護(hù)性 中和抗體，弱免疫原體液免疫應(yīng)答反應(yīng)極為相似，可以為HIV感染人 體，通過包膜蛋白gp120——人CD4受體的異種特異配體抗原，與人 CD4+細(xì)胞特異受體特異結(jié)合，首先觸發(fā)HIV感染者人體免疫耐受機(jī)制， 能夠比HIV具有高度變異性免疫逃逸機(jī)制，更為有效對(duì)抗人體免疫抑 制壓力，提供HIV疫苗相關(guān)臨床人體實(shí)驗(yàn)科學(xué)依據(jù)。己經(jīng)有眾多相關(guān)器官移植免疫耐受動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)給動(dòng) 物注射CD4受體的異種特異配體抗原，動(dòng)物CD4受體的異種特異配體 抗原與動(dòng)物CD4+細(xì)胞特異受體特異結(jié)合，觸發(fā)動(dòng)物機(jī)體針對(duì)CD4異種 特異配體抗原的體液免疫、細(xì)胞免疫耐受機(jī)制；表現(xiàn)出針對(duì)動(dòng)物CD4 異種特異配體抗原的體液免疫應(yīng)答延遲、弱免疫原體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。 與現(xiàn)代HIV疫苗科學(xué)研究實(shí)施過的，所有各種不同的HIV包膜蛋白 gpl20或gpl60抗原疫苗——人CM受體的異種特異配體抗原接種臨床 人體實(shí)驗(yàn)，表現(xiàn)出針對(duì)HIV包膜蛋白gpl20或gpl60抗原——人CD4 受體的異種特異配體抗原體液免疫應(yīng)答延遲、弱免疫原體液免疫應(yīng)答 反應(yīng)極為相似；與FIIV感染人體復(fù)制最初表現(xiàn)體液免疫應(yīng)答延遲，不 能首先產(chǎn)生針對(duì)HIV包膜蛋白gpl20或gpl60抗原的保護(hù)性中和抗體， 弱免疫原體液免疫應(yīng)答反應(yīng)極為相似。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，改變動(dòng)物CD4受體 的異種特異配體抗原分子的某個(gè)或某些個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)，使其失去與動(dòng)物CD4受體結(jié)合的特異氨基酸結(jié)構(gòu)表位、不能與動(dòng)物CD4受體結(jié)合； 它將不能觸發(fā)動(dòng)物機(jī)體免疫耐受機(jī)制。發(fā)明者認(rèn)為1.改變HIV包膜蛋白gpl20或gpl60——人CD4受 體的異種特異配體抗原分子的某個(gè)或某些個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)，使其失去與 人CD4受體結(jié)合的特異氨基酸結(jié)構(gòu)表位、不能與人CD4受體結(jié)合；它 將不能觸發(fā)人體免疫耐受機(jī)制。2.現(xiàn)代HIV疫苗科學(xué)研究，設(shè)計(jì)研制 HIV-Env基因DNA ，重組、能夠改變HIV包膜蛋白gpl20或gpl60 分子的某個(gè)或某幾個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)，使其失去與人CD4受體結(jié)合的特異 氨基酸結(jié)構(gòu)表位、不能與人CD4受體結(jié)合，不觸發(fā)人體免疫耐受機(jī)制 的HIV包膜蛋掃gpl20或gpl60抗原疫苗，將有可能在研制篩選抗HIV 治療疫苗、抗HIV預(yù)防疫苗科學(xué)研究方面，取得科學(xué)創(chuàng)新突破。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開了一種HIV-Erw基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白抗原免疫 應(yīng)答抗HIV實(shí)驗(yàn)與方法。1.用大鼠抗小鼠CD4受體的單克隆抗體 IgG2a/b——小鼠CD4受體的異種特異配體抗原，模擬HIV包膜蛋白 gpl20或gpl60~~—人CD4受體的異種特異配體抗原，多次免疫注射 CBA/Ca小鼠；采血檢測(cè)免疫小鼠針對(duì)大鼠IgG2a/b——小鼠CD4受體 的異種特異配體抗原的體液免疫應(yīng)答、抗體的滴度。2.用大鼠抗人或 抗兔的單克隆抗體IgG2a/b—不能與小鼠CD4受體結(jié)合的異種抗原， 模擬HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組、改變HIV包膜蛋白gpl20或gpl60 分子的某個(gè)或某些個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)，使其失去與人CD4受體結(jié)合的特異 氨基酸結(jié)構(gòu)表位、不能與人CD4受體結(jié)合，不觸發(fā)人體免疫耐受機(jī)制
的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60抗原，多次免疫注射CBA/Ca小鼠；采 血檢測(cè)免疫小鼠針對(duì)大鼠IgC2a/b——-異種抗原的體液免疫應(yīng)答、抗體 的滴度。證實(shí)1.改變HIV包膜蛋白gpl20或gpl60——人CD4異種特 異配體分子的某個(gè)或某些個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)，使其失去與人CD4受體結(jié)合 的特異氨基酸結(jié)構(gòu)表位、不能與人CD4受體結(jié)合，它不能觸發(fā)人體免 疫耐受機(jī)制；提供直接動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)科學(xué)依據(jù)。2.現(xiàn)代'HIV疫苗科學(xué) 研究，設(shè)計(jì)研制HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組、改變HIV包膜蛋白gpl20 或gpl60分子的某個(gè)或某幾個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)，使其失去與人CD4受體結(jié) 合的特異氨基酸結(jié)構(gòu)表位、不能與人CD4受體結(jié)合，不觸發(fā)人體免疫 耐受機(jī)制的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗，將有可能在研制 篩選抗HIV治療疫苗v抗HIV預(yù)防疫苗科學(xué)研究方面，取得科學(xué)創(chuàng)新 突破。3.為研制HIV-Env基因DNA ^i^重組包膜蛋白抗原抗HIV治療 疫苗、抗HIV預(yù)防疫苗，提供可實(shí)施的小鼠、恒河猴、大猩猩與臨床 人體HIV疫苗實(shí)驗(yàn)科學(xué)研究方案。本發(fā)明的目的是，提供一種HIV-Erw基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白 抗原免疫應(yīng)答抗HIV實(shí)驗(yàn)與方法。設(shè)計(jì)、實(shí)施HIV-Env基因DNA變構(gòu) 重組包膜蛋白抗原免疫應(yīng)答抗HIV實(shí)驗(yàn)，揭示HIV感染人體復(fù)制，通 過包膜蛋白gpl20——人CD4受體的異種特異配體抗原，與人CD4+細(xì)胞 特異受體特異結(jié)合，觸發(fā)HIV感染者人體免疫耐受機(jī)制，能夠比HIV 具有高度變異性免疫逃逸機(jī)制，更為有效對(duì)抗人體免疫抑制壓力。證 實(shí)迄今HIV疫苗科學(xué)研究設(shè)計(jì)、研制的，所有各種不同的HIV包膜 蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗的臨床人體試驗(yàn)，不能證實(shí)可以預(yù)防HIV 感染人類，最重要的因素是HIV包膜蛋白gpl20或gpl60是人CD4
受體的異種特異配體抗原，與人CD4+細(xì)胞特異受體特異結(jié)合，觸發(fā)HIV 感染者人體免疫耐受機(jī)制，不能激發(fā)有效根除HIV的體液免疫應(yīng)答機(jī) 制、細(xì)胞免疫應(yīng)答機(jī)制。尋找解決HIV包膜蛋白觸發(fā)人體免疫耐受機(jī) 制的方法，研制不觸發(fā)人體免疫耐受機(jī)制的，HIV-Erw基因DNA皿重 組包膜蛋白抗原抗HIV治療疫苗、抗HIV預(yù)防疫苗，提供足夠充分的 直接動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)科學(xué)依據(jù)、直接臨床人體實(shí)驗(yàn)科學(xué)依據(jù)。
具體實(shí)施例方式
為達(dá)到上述目的，實(shí)施本發(fā)明采用的方案 HIV-Env基因DNA變抱重組包膜蛋白抗原免疫應(yīng)答抗HIV實(shí)驗(yàn)與方法 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與臨床試驗(yàn)人體
1.1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4 6周齡無菌動(dòng)物，CBA/Ca小鼠，C57BL/6小鼠或 BALB/c小鼠，Hu-PBL-SCID小鼠；非人類的靈長(zhǎng)類動(dòng)物，恒河猴，大 猩猩。
1. 2.臨床試驗(yàn)人體未感染HIV- I的正常健康人，感染HIV- I急性 期患者。
2. 實(shí)驗(yàn)生物材料
2. 1.用大鼠抗小鼠CD4受體的單克隆抗體IgG2a/b——小鼠CD4受體 的異種特異配體抗原，模擬HIV包膜蛋白gpl20或gpl60——人CD4 受體的異種特異配體抗原；用大鼠抗人或抗兔的單克隆抗體IgG2a/b ——不能與小鼠CD4受體結(jié)合的異種抗原，模擬HIV-Env基因DNA變 抱重組、改變HIV包膜蛋白gpl20或gpl60分子某個(gè)或某些個(gè)氨基酸 結(jié)構(gòu)，使其失去與人CD4受體結(jié)合的特異氨基酸結(jié)構(gòu)表位、不能與人 CD4受體結(jié)合，不觸發(fā)人體免疫耐受機(jī)制的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60 異種抗原。模擬實(shí)驗(yàn)采用的大鼠抗小鼠CD4受體的單克隆抗體，大鼠抗人或抗兔的單克隆抗體，可以應(yīng)用其它異種動(dòng)物如兔、羊、人的同 種Ig型的單克隆抗體。2. 2.感染體外培養(yǎng)CD4+細(xì)胞的HIV- I病毒由取自HIV- I感染者最 初急性期的血漿、液氮低溫冷凍保存?zhèn)溆?；由取自HIV-I感染者最初 急性期的人PBMC細(xì)胞與CD4+細(xì)胞共同培養(yǎng)獲得；實(shí)驗(yàn)室HIV- I毒株。 猴SIV毒株;將人HIV膜蛋白替換猴SIV膜蛋白所構(gòu)成的鑲嵌病毒-SHIV 雜合毒株。2.3. 體外培養(yǎng)CD4+細(xì)胞取自HIV-I感染者最初急性期的人PBMC 細(xì)胞；取自未感染HIV-I者的正常健康人PBMC細(xì)胞；傳代人CD4+細(xì)胞 系，例如人T淋巴細(xì)胞系MT4。2.3.人淋巴細(xì)胞取自HIV-I感染者最初急性期，經(jīng)非逆轉(zhuǎn)錄酶抑制 劑NRTIs/ NNRTIs抗HIV- I藥聯(lián)合治療，經(jīng)HIV-Env基因DNA變構(gòu)重 組、不能與人CD4受體結(jié)合的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60異種抗原-疫苗多次免疫注射治療后，采血獲取的人淋巴細(xì)胞。 2. 4. C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠血清正常小鼠血清；小鼠經(jīng)HIV-Env 基因DNA變構(gòu)重組、不能與人CD4受體結(jié)合的HIV包膜蛋白gpl20或 gpl60異種抗原疫苗多次免疫注射后，采血獲取的含抗gpl20抗體的小 鼠血清。恒河猴血清正常恒河猴血清；恒河猴經(jīng)HIV-Env基因DNA 變構(gòu)重組、不能與人CD4受體結(jié)合的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60異 種抗原疫苗多次免疫注射后，采血獲取的含抗gpl20抗體的恒河猴血 清。大猩猩血清正常大猩猩血清；大猩猩經(jīng)HIV-Env基因DNA變構(gòu) 重組、不能與人CD4受體結(jié)合的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60異種抗
原疫苗多次免疫注射后，采血獲取的含抗gpl20抗體的大猩猩血清。 正常健康人AB血清。未感染HIV- I者的正常健康人，經(jīng)HIV-Env基因 DNA變構(gòu)重組、不能與人CD4受體結(jié)合的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60 異種抗原疫苗多次免疫注射后，采血獲取的含抗gpl20抗體的人AB血 清。HIV-I感染者最初急性期，經(jīng)非逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑NRTIs/麗RTIs 抗HIV-I藥聯(lián)合治療，經(jīng)HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組、不能與人CD4 受體結(jié)合的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60異種抗原疫苗多次免疫注射 治療后，停止用藥治療7d后抽取的，含抗gpl20抗體的人血清。 3.實(shí)驗(yàn)檢測(cè)、藥物和試劑及與培養(yǎng)液3.1. 檢測(cè)gpl20抗體的雙夾心法、或直接夾心法試劑。3.2. HIV前病毒檢測(cè)與試劑。3. 3. HIV病毒載量檢測(cè)HIV-l Qiantiplex實(shí)驗(yàn)與試劑，或Amplicor HIV-IMonitor實(shí)驗(yàn)與試劑，或NucliSens HIV-1實(shí)驗(yàn)與試劑。 3. 4. CD4+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)實(shí)驗(yàn)與試劑。3. 5. RPMI-2加2%血清培養(yǎng)液，RPMI1640加10% 20%血清培養(yǎng)液含青 霉素-G100U/ml、慶大霉素5(mg/ml; Ficoll-Hystopaque密度梯度溶 液d:1.077g/ml Pharmacia,把10ml Ficoll液預(yù)先內(nèi)置于50ml離心 管內(nèi)；淋巴細(xì)胞處理液Nycomed， Birmingham, UK，把15ml淋巴細(xì)胞處 理液預(yù)先內(nèi)置于50ml離心管內(nèi)；EDTA鈉鹽、用生理鹽水配制4%抗凝'液，把O. 4ml抗凝EDTA鈉鹽溶液預(yù)先內(nèi)置于10ml注射器內(nèi)，把0. 6ml 抗凝EDTA鈉鹽溶液預(yù)先內(nèi)置于20ml注射器內(nèi)。4. 制備生物實(shí)驗(yàn)材料4.1.設(shè)計(jì)、研制各種不同HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組、改變HIV包
膜蛋白gpl20或gpl60分子的某個(gè)或某些個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)，使其失去與 人CD4受體結(jié)合的特異氨基酸結(jié)構(gòu)表位、不能與人CD4受體結(jié)合，不 觸發(fā)人體免疫耐受機(jī)制的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗—— HIV-1包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗。4. 2.用大鼠抗小鼠CD4受體的單克隆抗體IgG2a/b——小鼠CD4受體 的異種特異配體抗原，模擬HIV包膜蛋白gpl20或gpl60——人CD4 受體的異種特異配體抗原，在實(shí)施實(shí)驗(yàn)時(shí)分別制備用含有10%小鼠血 清的生理鹽水配制的3Pg/ml、 6Pg/ml、 l(mg/ml溶液；用大鼠抗人或 抗兔的單克隆抗體IgG2a/b——不能與小鼠CD4受體結(jié)合的異種抗原， 模擬HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組、不能與人CD4受體結(jié)合，不觸發(fā)人 體免疫耐受機(jī)制的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60異種抗原，在實(shí)施實(shí) 驗(yàn)時(shí)分別制備:用含有10%小鼠血清的生理鹽水配制的3^/ml、6l^g/ml、 10Pg/ml溶液。4.3. HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組、不能與人的CD4受體結(jié)合的HIV包 膜蛋白gpl20或gP160抗原疫苗，在實(shí)施實(shí)驗(yàn)時(shí)分別制備用含有10% 小鼠血清的生理鹽水配制的50Pg/ml溶液；用含有10%人AB血清的生 理鹽水配制的50Pg/ml、 100Pg/ml、 200Pg/ml溶液。 4. 4.制取人PBMC細(xì)胞應(yīng)用預(yù)先內(nèi)置有0. 4ml抗凝EDTA鈉鹽溶液的 10ml注射器，無菌抽取未感染HIV- I者靜脈血10ml、或感染HIV- I 者靜脈血10ml，加2倍RPMI-2培養(yǎng)液混勻；將其仔細(xì)緩慢加入預(yù)先內(nèi) 置有Ficoll液10ml的50ml離心管上層；20°C、 400g離心30min; 用滅菌吸管小心把離心管Ficoll液和血液分界層間的PBMC細(xì)胞吸 出，置入新離心管加5倍RPMI—2培養(yǎng)液混勻；20°C、 300g離心lOmin，200610170474.6說明書第ll/26頁棄上清液，加5倍RPMI-2培養(yǎng)液混勻；20°C、 200g離心5min，棄上 清液，用含有10%人AB血清的RPMI1640培養(yǎng)液，配制細(xì)胞懸液 1X107ml、并進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。4.5.制取人淋巴細(xì)胞應(yīng)用預(yù)先內(nèi)置有0.6ml抗凝EDTA鈉鹽溶液的 20ml注射器，無菌抽取未感染HIV- I者靜脈血15ml、或感染HIV- I 者靜脈血15ml，加1倍RPMI-2培養(yǎng)液混勻；將其仔細(xì)緩慢加入預(yù)先內(nèi) 置有淋巴細(xì)胞處理液15ml的50ml離心管上層；不要?jiǎng)x車，20°C、 800g 離心25min;用滅菌吸管小心吸取離心管淡黃色層，置入新離心管加5 倍RPMI-2培養(yǎng)液混勻；20°C 、300g離心10min，棄上清液，加5倍RPMI-2 培養(yǎng)液混勻；2(TC、 200g離心5min，棄上清液，用含有l(wèi)(m人AB血清 的RPMI1640培養(yǎng)液，配制細(xì)胞懸液2X107ml、并進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。 會(huì).6.活細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)EB和AO各0. lmg溶于100ml PBS液，制備EB/AO 工作液；待檢測(cè)細(xì)胞懸液20l4 50W，與適量體積2(mi lml的EB/AO 溶液混合，使最終細(xì)胞濃度為2Xl(f 2X107ml;將細(xì)胞懸液加入血 球計(jì)數(shù)器，使用熒光顯微鏡配合紫外線UV和可見光，對(duì)活細(xì)胞綠色、 死細(xì)胞橙色計(jì)數(shù)?；驊?yīng)用2.5g/L臺(tái)盼藍(lán)溶于PBS液，做細(xì)胞染色活細(xì) 胞計(jì)數(shù)；臺(tái)盼藍(lán)是致癌劑，實(shí)驗(yàn)操作需要帶手套。 4.7.制取人血清無菌抽取未感染HIV-I者靜脈血200ml、或感染 HIV- I者靜脈血200ml;分置4只100ml離心管內(nèi)，2000g離心10min， 離心后4。C低溫靜置60min;然后用血管鉗擠壓血凝塊，擠出內(nèi)含的血 清；棄去血凝塊，再分置2只100ml離心管內(nèi)，5 10000g離心60min; 用一系列過濾器進(jìn)行過濾，最后用0.1 U m孔徑無菌過濾器進(jìn)行過濾后; 分置于多個(gè)小無菌高密度聚丙烯容器，放置-7(TC冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 4.8. 制取動(dòng)物血清方法如上。
4.9. 人淋巴細(xì)胞免疫缺陷鼠Hu-PBL-SCID的再構(gòu)建用人淋巴細(xì)胞懸 液2X107ml 、 0.2ml/只，注射到4 6周齡免疫缺陷鼠的腹膜腔內(nèi)。 5.建立HIV- I毒株感染細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)
5.1.建立實(shí)驗(yàn)室HIV- I毒株感染細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)；HIV- I感染者 最初急性期HIV- I毒株感染細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)
5.1.1. 用含有10%胎牛血清、10%含抗gpl20抗體的動(dòng)物血清的 RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整MT4細(xì)胞濃度為5X107ml培養(yǎng)細(xì)胞懸液，每 個(gè)50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入10ml該培養(yǎng)MT4細(xì)胞濃度懸液，在細(xì)胞培 養(yǎng)瓶中接種濃度為1000TCID50的實(shí)驗(yàn)室HIV- I毒株，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放 置37。C， 5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；用含有10%胎牛血清、1(F。不含gpl20 抗體的正常動(dòng)物血清的RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整MT4細(xì)胞濃度為 5X 107ml培養(yǎng)細(xì)胞懸液，每個(gè)50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入10ml該培養(yǎng)MT4 細(xì)胞濃度懸液，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種濃度為1000TCID50的實(shí)驗(yàn)室HIV-I毒株，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置37"C， 5%(:02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每培養(yǎng)3d 吸取細(xì)胞培養(yǎng)瓶中上清液，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)第4d后每天在倒置 顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞病變。培養(yǎng)12d后，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中沒有被HIV-I感染致死的活細(xì)胞計(jì)數(shù)。
5.1.2. 用含有1(^正常人AB血清、1()%含抗gpl20抗體的動(dòng)物血清的 RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整正常人PBMC細(xì)胞濃度為5X 106/ml培養(yǎng)細(xì)胞懸 液，每個(gè)50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入10ml該培養(yǎng)正常人PBMC細(xì)胞濃度懸 液，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種2.5X106、取自HIV-I感染者最初急性期液 氮低'溫保存?zhèn)溆脧?fù)蘇的人PBMC細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置37"C， 5%C02
的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；用含有109&正常人AB血清、10%不含gpl20抗體的正 常動(dòng)物血清的RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整正常人PBMC細(xì)胞濃度為 5X107ml培養(yǎng)細(xì)胞懸液，每個(gè)50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入10ml該培養(yǎng)正 常人PBMC細(xì)胞濃度懸液，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種2.5X106、取自HIV-I感染者最初急性期液氮低溫保存?zhèn)溆脧?fù)蘇的人PBMC細(xì)胞，將細(xì)胞培 養(yǎng)瓶放置37t:， 5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每培養(yǎng)3d吸取細(xì)胞培養(yǎng)瓶中 上清液，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)第4d后每天在倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì) 胞病變。培養(yǎng)12d后，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中沒有被HIV- I感染致死的活細(xì) 胞計(jì)數(shù)。5.1.3. 用含有10%正常人AB血清、10%含抗gpl20抗體的人血清的 RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整MT4細(xì)胞濃度為5X107ml培養(yǎng)細(xì)胞懸液，每 個(gè)50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入10ml該培養(yǎng)MT4細(xì)胞濃度懸液，在細(xì)胞培 養(yǎng)瓶中接種濃度為1000TCID50的實(shí)驗(yàn)室HIV- I毒株，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放 置37°C ， 5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；用含有20%正常人AB血清的RPMI1640 培養(yǎng)液，調(diào)整MT4細(xì)胞濃度為5X107ml培養(yǎng)細(xì)胞懸液，每個(gè)50ml細(xì) 胞培養(yǎng)瓶中加入10ml該培養(yǎng)MT4細(xì)胞濃度懸液，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種 濃度為1000TCID50的實(shí)驗(yàn)室HIV- I毒株，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置37°C， 5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每培養(yǎng)3d吸取細(xì)胞培養(yǎng)瓶中上清液，補(bǔ)充新 鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)第4d后每天在倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞病變。培養(yǎng)12d 后，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中沒有被HIV-I感染致死的活細(xì)胞計(jì)數(shù)。5.1.4. 用含有10%正常人AB血清、10%含抗gpl20抗體的人血清的 RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整正常人PBMC細(xì)胞濃度為5X lOVml培養(yǎng)細(xì)胞懸 液，每個(gè)50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入10ml該培養(yǎng)正常人PBMC細(xì)胞濃度懸
液，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種2. 5X106、取自HIV- I感染者最初急性期液 氮低溫保存?zhèn)溆脧?fù)蘇的人PBMC細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置37r， 5%C02 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；用含有209&正常人AB血清的RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整 正常人PBMC細(xì)胞濃度為5X 107ml培養(yǎng)細(xì)胞懸液，每個(gè)50ml細(xì)胞培養(yǎng) 瓶中加入10ml該培養(yǎng)正常人PBMC細(xì)胞濃度懸液，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接 種2.5X106、取自HIV- I感染者最初急性期液氮低溫保存?zhèn)溆脧?fù)蘇的 人PBMC細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置37"C， 5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每培 養(yǎng)3d吸取細(xì)胞培養(yǎng)瓶中上清液，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)第4d后每天 在倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞病變。培養(yǎng)12d后，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中沒有 被HIV- I感染致死的活細(xì)胞計(jì)數(shù)。 6.實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)、結(jié)果評(píng)定6.1.模擬HIV-Erw基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白抗原免疫CBA/Ca小鼠 抗HIV動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)、結(jié)果評(píng)定6.1. 1.用大鼠抗小鼠CD4受體的單克隆抗體IgG2a/b——小鼠CD4受 體的異種特異配體抗原，模擬HIV包膜蛋白gpl20或gpl60——人CD4 受體的異種特異配體抗原。模擬HIV感染人體，人體針對(duì)HIV復(fù)制表 達(dá)包膜蛋白gpl20或gpl60——人CD4受體的異種特異配體抗原的免疫 應(yīng)答機(jī)制，肌肉注射免疫l組10只4 6周齡CBA/Ca小鼠3l^g/ml、 0.2ml/只，Od、 3d、 6d、 9d各一次；6Pg/ml、 0.2ml/只，12d、 15d 各一次；10Pg/ml、 0.2ml/只，18d各一次;6Pg/ml、 0.2ml/只，21d、 44d各一次;3fVml、 0.2ml/只，27d、 30d、 33d各一次。 6.1.2.用大鼠抗人或抗兔的單克隆抗體IgG2a/b——不能與小鼠CD4 受體結(jié)合的異種抗原，模擬HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組、不能與人CD4
受體結(jié)合的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60異種抗原，肌肉注射免疫2 組10只4 6周齡CBA/Ca小鼠3Pg/ml、 0.2ml/只，Od、 3d、 6d、 9d 各一次；6Pg/ml、 0.2ml/只，12d、 15d各一次;膨g/ml、 0.2ml/只， 18d各一次;6Pg/ml、 0. 2ml/只，21d、 44d各一次;3Pg/ml、 0. 2ml/ 只，27d、 30d、 33d各一次。6.1.3.在免疫接種第14d、 21d、 28d、 35d、 42d，分別對(duì)1組、2組 各自10只小鼠，尾部微量采血，檢測(cè)每只小鼠針對(duì)大鼠IgG2a/b—— 異種抗原的體液免疫應(yīng)答、抗體的滴度。實(shí)驗(yàn)1組免疫小鼠針對(duì)大鼠 IgG2a/b——小鼠CD4受體的異種特異配體抗原的體液免疫應(yīng)答延遲、 血清抗大鼠IgG2a/b異種抗原的抗體滴度，明顯低于實(shí)驗(yàn)2組免疫小鼠 針對(duì)大鼠IgC2a/b——異種抗原的體液免疫應(yīng)答、血清抗大鼠IgG2a/b 異種抗原的抗體滴度。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)論l.注射動(dòng)物CD4受體的異種特 異配體抗原，異種特異配體抗原與動(dòng)物CD4+細(xì)胞特異受體特異結(jié)合， 觸發(fā)動(dòng)物機(jī)體針對(duì)CD4異種特異配體抗原的免疫耐受機(jī)制；表現(xiàn)出針 對(duì)CD4異種特異配體抗原的體液免疫應(yīng)答延遲、弱免疫原體液免疫應(yīng) 答反應(yīng)。與HIV疫苗科學(xué)研究實(shí)施過的，各種不同的HIV包膜蛋白gpl20 或gpl60抗原-疫苗臨床人體實(shí)驗(yàn)，免疫接種人體表現(xiàn)出針對(duì)HIV包膜 蛋白gpl20或gpl60——人CD4受體的異種特異配體抗原體液免疫應(yīng)答 延遲、弱免疫原體液免疫應(yīng)答反應(yīng)極為相似；與HIV感染人體復(fù)制最 初表現(xiàn)體液免疫應(yīng)答延遲，不能首先產(chǎn)生針對(duì)HIV包膜蛋白gpl20或 gpl60抗原的保護(hù)性中和抗體，弱免疫原體液免疫應(yīng)答反應(yīng)極為相似。 2.實(shí)驗(yàn)證實(shí)，改變動(dòng)物CD4受體的異種特異配體抗原分子的某個(gè)或某 些個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)，使其失去與動(dòng)物CD4受體結(jié)合的特異氨基酸結(jié)構(gòu)表 位、不能與動(dòng)物CD4受體結(jié)合；它將不能觸發(fā)動(dòng)物機(jī)體免疫耐受機(jī)制。3.實(shí)驗(yàn)證實(shí)，改變HIV包膜蛋白gpl20或gp160——人CD4受體的異 種特異配體抗原分子的某個(gè)或某些個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)，使其失去與人CD4 受體結(jié)合的特異氨基酸結(jié)構(gòu)表位、不能與人CD4受體結(jié)合；它將不能 觸發(fā)人體免疫耐受機(jī)制，提供直接動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)科學(xué)依據(jù)。4.設(shè)計(jì)研 制HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組、改變:HIV包膜蛋白gpl20或gpl60抗 原分子的某個(gè)或某些個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)，使其失去與人CD4受體結(jié)合的特 異氨基酸結(jié)構(gòu)表位、不能與人CD4受體結(jié)合，不觸發(fā)人體免疫耐受機(jī) 制的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60抗原-疫苗，將有可能在研制篩選抗 HIV治療疫苗——抗HIV預(yù)防疫苗科學(xué)研究方面，取得重大科學(xué)創(chuàng)新突 破。提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)科學(xué)依據(jù)。6. 2. HIV-Erw基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗免 疫C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠抗HIV動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)、結(jié) 果評(píng)定6. 2.1.對(duì)1組30只4 6周齡C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠，實(shí)施斷頭 采血，制取正常動(dòng)物血清。6. 2. 2.用HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫 苗免疫C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠，肌肉注射免疫2組30只4 6周 齡C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠50l^g/ml、 0.2ml/只,Od、 14d、 28d、 42d各一次。在免疫接種第14d、 21d、 28d、 35d、 42d，尾部微量采血， 檢測(cè)每只小鼠針對(duì)HIV-Env基西DNA變構(gòu)重組包膜蛋白gpl20或gpl60 抗原的體液免疫應(yīng)答、抗體的滴度。49d，分別各自斷頭采血處死30 只小鼠，制取含抗gpl20抗體的動(dòng)物血清。6. 2. 3.分別用1組30只小鼠的混合正常動(dòng)物血清、2組30只小鼠的 含抗gpl20抗體混合動(dòng)物血清，實(shí)施5. 1. 1. / 5. 1. 2. HIV- I毒株感染 細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)2種HIV- I毒株感染T4細(xì)胞體外培養(yǎng)、每種 3個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，2種HIV- I毒株感染人PBMC細(xì)胞體外培養(yǎng)、每種3 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶。各自培養(yǎng)12d后，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中沒有被HIV- I感染 致死的活細(xì)胞計(jì)數(shù)。檢測(cè)用HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白gpl20 或gpl60抗原疫苗免疫C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠抗HIV模型，體液 免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗gpl20抗體，抑制實(shí)驗(yàn)室HIV- I毒株感染細(xì)胞的能 力、抑制感染人體野生HIV-I毒株感染細(xì)胞的能力。6.2.小鼠抗HIV動(dòng)物模型，應(yīng)用做實(shí)驗(yàn)檢測(cè)、篩選研制各種不 同的HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組、改變HIV包膜蛋白gpl20或gpl60 抗原分子的某個(gè)或某些個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)、使其失去與人CD4受體結(jié)合的 特異氨基酸結(jié)構(gòu)表位，能夠具有最好解除HIV免疫抑制的強(qiáng)免疫原性、 最好抑制感染人體野生HIV- I毒株感染細(xì)胞能力的，HIV-Env基因DNA 變構(gòu)重組包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗，提供初步相關(guān)動(dòng)物模型 實(shí)驗(yàn)科學(xué)依據(jù)。6. 3. HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗免 疫恒河猴抗HIV動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)、結(jié)果評(píng)定6.3.1. 對(duì)12只恒河猴各自抽取靜脈血30ml，制取正常動(dòng)物血清。6.3.2. 用小鼠抗HIV動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)的，HIV-Env基因DNA變 構(gòu)重組包膜蛋白gpl20或gpl60抗原-疫苗，肌肉注射免疫12只恒河 猴50Pg/ml、 lml/只，Od、 21d、 42d各一次。在免疫接種第14d、 21d、 28d、 35d、 42d、 49d，采血檢測(cè)每只恒河猴針對(duì)HIV-Env基因DNA變
構(gòu)重組包膜蛋白gpl20或gpl60抗原的體液免疫應(yīng)答、抗體的滴度。 60d，分別各自抽取靜脈血30ml，制取含抗gpl20抗體的動(dòng)物血清。分 別對(duì)12只恒河猴實(shí)施SHIV毒株攻毒實(shí)驗(yàn)。6.3.3.分別用每只恒河猴的正常動(dòng)物血清、含抗gpl20抗體的動(dòng)物血 清，實(shí)施5. 1.1./ 5. 1.2. HIV-I毒株感染細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)2 種HIV- I毒株感染T4細(xì)胞體外培養(yǎng)、每種3個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，2種HIV-I毒株感染人PBMC細(xì)胞體外培養(yǎng)、每種3個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶。各自培養(yǎng)12d 后，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中沒有被HIV-I感染致死的活細(xì)胞計(jì)數(shù)。檢測(cè)用 HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白gpl20、或gpl60抗原免疫恒河猴 抗HIV模型，體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗gpl20抗體，抑制實(shí)驗(yàn)室HIV-I 毒株感染細(xì)胞的能力、抑制感染人體野生HIV- I毒株感染細(xì)胞的能力。 6.3.恒河猴抗HIV動(dòng)物模型，應(yīng)用做實(shí)驗(yàn)檢測(cè)、篩選研制各種 不同的HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組、改變HIV包膜蛋白gpl20或gpl60 抗原分子的某個(gè)或某些個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)、使其失去與人CD4受體結(jié)合的 特異氨基酸結(jié)構(gòu)表位，能夠具有最好解除HIV免疫抑制的強(qiáng)免疫原性、 最好抑制感染人體野生HIV- I毒株感染細(xì)胞能力的，HIV-Env基因DNA 變構(gòu)重組包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗，提供進(jìn)一步與人類相關(guān) 的靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)科學(xué)依據(jù)。6. 4. HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗免 疫大猩猩抗HIV動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)、結(jié)果評(píng)定6.4.1. 對(duì)4 6只大猩猩各自抽取靜脈血30ml，制取正常動(dòng)物血清。6.4.2. 用恒河猴抗HIV動(dòng)物模型進(jìn)一步證實(shí)的，HIV-Erw基因DNA變 構(gòu)重組包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗，肌肉注射免疫4~6只大猩 猩20(mg/ml、 2ml/只，0d、 21d、 42d各一次。在免疫接種第14d、 21d、 28d、 35d、 42d、 49d，采血檢測(cè)每只大猩猩針對(duì)HIV-Env基因DNA 變構(gòu)重組包膜蛋白gpl20或gpl60抗原的體液免疫應(yīng)答、抗體的滴度。 60d，分別各自抽取靜脈血30ml，制取含抗gpl20抗體的動(dòng)物血清。分 別對(duì)4 6只大猩猩實(shí)施取自臨床人體感染HIV-1毒株急性期血漿攻毒 保護(hù)實(shí)驗(yàn)。6.4.3.分別用每只大猩猩的正常動(dòng)物血清、含抗gpl20抗體的動(dòng)物血 清，實(shí)施5. 1. 1. / 5. 1. 2. HIV- I毒株感染細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)2 種HIV- I毒株感染T4細(xì)胞體外培養(yǎng)、每種3個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，2種HIV-I毒株感染人PBMC細(xì)胞體外培養(yǎng)、每種3個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶。各自培養(yǎng)12d 后，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中沒有被HIV-I感染致死的活細(xì)胞計(jì)數(shù)。檢測(cè)用 HIV-Erw基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白gpl20或gpl60抗原免疫大猩猩抗 HIV模型，體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗gpl20抗體，抑制實(shí)驗(yàn)室HIV- I毒 株感染細(xì)胞的能力、抑制感染人體野生HIV- I毒株感染細(xì)胞的能力。6.4.大猩猩抗HIV動(dòng)物模型，應(yīng)用做實(shí)驗(yàn)檢測(cè)、篩選研制各種 不同的HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組、改變HIV包膜蛋白gpl20或gpl60 抗原分子的某個(gè)或某些個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)、使其失去與人CD4受體結(jié)合的 特異氨基酸結(jié)構(gòu)表位，能夠具有最好解除HIV免疫抑制的強(qiáng)免疫原性、 最好抑制感染人體野生HIV- I毒株感染細(xì)胞能力的，HIV-Env基因DNA 變構(gòu)重組包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗，提供更進(jìn)一步與人類最 接近的靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)科學(xué)依據(jù)。6.5. HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白gpl20或gpl60抗原，作為 抗HIV治療疫苗，與抗HIV藥聯(lián)合治療HIV急性期感染患者，I臨床 人體抗HIV治療實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)、結(jié)果評(píng)定6. 5.1.在實(shí)施治療前抽血制取HIV-[感染急性期患者的人PBMC細(xì) 胞，液氮低溫冷凍保存?zhèn)溆谩?. 5. 2.選擇經(jīng)非逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑NRTIs/ NNRTIs抗HIV- I藥聯(lián)合治 療，可在14d內(nèi)病毒載量下降為不可檢測(cè)、28d內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞檢測(cè) 計(jì)數(shù)可恢復(fù)》800AH的，40 60位患者。分2組，用猩猩抗HIV動(dòng)物 模型更進(jìn)一步證實(shí)的，HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白gpl20或 gpl60抗原疫苗，與抗HIV藥聯(lián)合治療HIV急性期感染患者1組lOCHig /人、2組200Pg/人，Od、 7d、 14d、 21d、 42d各一次。在免疫接種第 14d、 21d、 28d、 35d、 49d，采血檢測(cè)每位患者針對(duì)HIV-Env基因DNA 變構(gòu)重組包膜蛋白gpl20或gpl60抗原的體液免疫應(yīng)答、抗體的滴度。 60d，分別各自抽取靜脈血30ml，制取淋巴細(xì)胞。 6. 5. 3.用每位經(jīng)非逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑NRTIs/麗RTIs抗HIV- I藥聯(lián)合治 療，與HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白gpl20或gpl60抗原—— 抗HIV治療疫苗治療患者的淋巴細(xì)胞，各自分別實(shí)施3 5只SCID鼠的， 人淋巴細(xì)胞免疫缺陷鼠Hu-PBL-SCID的再構(gòu)建。21d，分別抽血處死 Hu-PBL-SCID鼠，分別做HIV前病毒檢測(cè)、HIV病毒載量檢測(cè)。 6. 5. 4.患者淋巴細(xì)胞重建Hu-PBL-SCID鼠的HIV前病毒、HIV病毒載 量為不可檢測(cè)者，停止非逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑NRTIs/ NNRTIs抗HIV- I藥 聯(lián)合治療7d后，抽取靜脈血30ml，制取血清。實(shí)施5. 1. 3. / 5. 1. 4. HIV-I毒株感染細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)2種HIV- I毒株感染T4細(xì)胞體外 培養(yǎng)、每種3個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶；l種患者本人實(shí)施治療前預(yù)留、液氮保存 的PBMC細(xì)胞HIV- I毒株感染人PBMC細(xì)胞體外培養(yǎng)、每種3個(gè)細(xì)胞培
養(yǎng)瓶，1種他人PBMC細(xì)胞HIV- I毒株感染人PBMC細(xì)胞體外培養(yǎng)、每 種3個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶。各自培養(yǎng)12d后，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中沒有被HIV-I 感染致死的活細(xì)胞計(jì)數(shù)。檢測(cè)用HIV-Erw基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白 gpl20或gpl60抗原""抗HIV治療疫苗，治療HIV感染者，體液免疫 應(yīng)答產(chǎn)生的抗gpl20抗體，抑制實(shí)驗(yàn)室HIV- I毒株感染細(xì)胞的能力、 抑制感染人體野生HIV- I毒株感染細(xì)胞的能力。 6. 5. 5.患者的血清抗gpl20抗體，具有抑制患者本人實(shí)施治療前預(yù)留、 液氮保存的PBMC細(xì)胞HIV- I毒株感染細(xì)胞的能力，征求患者同意停止 非逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑NRTIs/麗RTIs抗HIV- I藥聯(lián)合治療。對(duì)患者實(shí)施 定期抽血檢測(cè)HIV前病毒、HIV病毒載量1年，觀察是否會(huì)發(fā)生HIV 前病毒、HIV病毒載量反跳恢復(fù)？如果患者的HIV前病毒、HIV病毒載 量仍為不可檢測(cè)，可被認(rèn)為是應(yīng)用HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜 蛋白gpl20或gpl60抗原——抗HIV治療疫苗，臨床治愈的首例或幾 例HIV-I感染者。6.5.抗HIV治療疫苗I臨床人體實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用做實(shí)驗(yàn)檢測(cè)、篩選 研制各種不同的HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組、改變HIV包膜蛋白gpl20 或gpl60抗原分子的某個(gè)或某些個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)、使其失去與人CD4受 體結(jié)合的特異氨基酸結(jié)構(gòu)表位，能夠具有最好解除HIV免疫抑制的強(qiáng) 免疫原性、最好抑制感染人體野生HIV-I毒株感染細(xì)胞能力的， HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗，提供直 接臨床人體實(shí)驗(yàn)科學(xué)依據(jù)。6.6. HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白gpl20或gpl60抗原，作為 可以預(yù)防HIV感染人類的HIV疫苗，臨床人體實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)、結(jié)果 評(píng)定6.6.1.用被臨床抗HIV治療疫苗治療HIV感染者人體實(shí)驗(yàn)證實(shí)的， HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白gpl20或gpl60抗原，作為可以預(yù) 防HIV感染人類的HIV疫苗，實(shí)施I、 II、 III期臨床人體試驗(yàn)。實(shí)施 上述相關(guān)HIV疫苗實(shí)驗(yàn)科學(xué)研究、生物檢測(cè)。6.6. I、 II、 III期臨床人體試驗(yàn)應(yīng)用做檢驗(yàn)、篩選設(shè)計(jì)、研制 的，各種不同的HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組、改變HIV包膜蛋白gP120 或gpl60抗原分子的某個(gè)或某些個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)，使其失去與人CD4受 體結(jié)合的特異氨基酸結(jié)構(gòu)表位、不能與人CD4受體結(jié)合，能夠具有最 好解除HIV免疫抑制的強(qiáng)免疫原性、最佳抑制感染人體野生HIV- I毒 株感染細(xì)胞能力的，HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白gpl20或gpl60 抗原，將能夠作為抗HIV治療疫苗一—抗HIV預(yù)防疫苗，提供足夠充 分的直接臨床人體實(shí)驗(yàn)科學(xué)依據(jù)。 發(fā)明創(chuàng)新討論自上個(gè)世紀(jì)70年代，Gershon提出"感染性免疫耐受(infection tolerance)"及"抑制性T細(xì)胞(suppressor T cells)",免疫耐受新 概念；Hall等1985年最先描述介導(dǎo)移植免疫耐受中抑制性CD4+T細(xì)胞 的存在;Qin等1993年實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CD4+T細(xì)胞的存在能夠明顯抑制小鼠 移植免疫排斥反應(yīng)，用非剔除的抗CD4和抗CD8抗體處理受者可以誘 導(dǎo)免疫耐受……。迄今世界各國(guó)從事器官移植免疫耐受研究的學(xué)者們， 針對(duì)CD4+細(xì)胞及CD4特異受體同特異配體抗CD4的mAb結(jié)合與器官移植免疫耐受的關(guān)系，在分子生物學(xué)科學(xué)研究層面，在細(xì)胞模型的細(xì)胞 生物學(xué)、分子生物學(xué)科學(xué)研究層面，在動(dòng)物模型及臨床人體的組織學(xué)、
細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)科學(xué)研究層面，已經(jīng)研究分析揭示的比較全 面。大量動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)、及臨床人體實(shí)驗(yàn)表明非剔除性抗T細(xì)胞輔 助分子的mAb，如抗CD4的mAb同CD4特異受體結(jié)合，使T細(xì)胞產(chǎn)生不 應(yīng)答性，或誘導(dǎo)抑制性T細(xì)胞，建立T細(xì)胞免疫耐受、B細(xì)胞免疫耐受， 可以避免同種異體移植物的排斥反應(yīng)，其免疫抑制功能失去抗原特異 性，即可以抑制對(duì)第三者抗原特異的T細(xì)胞免疫應(yīng)答……等；誘導(dǎo)"感 染性免疫耐受"，誘導(dǎo)CD4+T前細(xì)胞Thl/Th2極性分化偏離，抗CD4單 克隆抗體可以阻止T細(xì)胞在胸腺的分化成熟，……等。有眾多不可被 一一綜述的，CD4+細(xì)胞及CD4特異受體同抗CD4的mAb特異配體抗 原結(jié)合，促發(fā)免疫耐受關(guān)系的科學(xué)研究文獻(xiàn)、科學(xué)研究報(bào)告，可以供 HIV科學(xué)研究者學(xué)習(xí)借鑒，開拓HIV科學(xué)研究者的創(chuàng)新綜合科學(xué)研究思 維，全面揭示HIV感染人體復(fù)制，通過表達(dá)包膜蛋白gpl20——人CD4 受體的異種特異配體抗原，與人CD4+細(xì)胞特異受體特異結(jié)合，觸發(fā)HIV 感染者人體免疫耐受機(jī)制，導(dǎo)致感染機(jī)體免疫系統(tǒng)針對(duì)HIV感染體液 免疫應(yīng)答反應(yīng)延遲，不能首先產(chǎn)生針對(duì)gpl20的保護(hù)性中和抗體、抑 制gpl20與CD4+細(xì)胞特異受體特異結(jié)合觸發(fā)的免疫耐受機(jī)制；使HIV 可以在免疫應(yīng)答產(chǎn)生針對(duì)gpl20的保護(hù)性中和抗體之前，還沒有被CTL 細(xì)胞免疫有效抑制時(shí)、過度復(fù)制達(dá)到病毒血癥峰值，進(jìn)一步觸發(fā)細(xì)胞 免疫耐受機(jī)制-細(xì)胞免疫損傷機(jī)制，不能激發(fā)有效根除HIV的體液免疫 應(yīng)答機(jī)制、細(xì)胞免疫應(yīng)答機(jī)制；能夠比HIV具有高度變異性免疫逃逸 機(jī)制，更為有效對(duì)抗機(jī)體免疫抑制壓力的，現(xiàn)代細(xì)胞免疫學(xué)、分子免 疫學(xué)生物機(jī)制?？梢越梃b器官移植免疫學(xué)的實(shí)驗(yàn)科學(xué)方法，利用現(xiàn)有的SIV、 HIV-
n恒河猴動(dòng)物模型，SIV-mac239Anef減毒株疫苗、SIV包膜蛋白抗原 疫苗、HIV-II包膜蛋白抗原疫苗，實(shí)施揭示SIV包膜蛋白、HIV-II包 膜蛋白——猴CD4受體的異種特異配體抗原，與猴CD4+細(xì)胞特異受體 特異結(jié)合，觸發(fā)猴機(jī)體免疫耐受機(jī)制相關(guān)的器官移植實(shí)驗(yàn)，為模擬證 實(shí)HIV感染人體，通過包膜蛋白gpl20-——人CD4受體的異種特異配體 抗原，與人CD4+T淋巴細(xì)胞受體特異結(jié)合，觸發(fā)HIV感染者人體免疫耐 受機(jī)制，能夠比HIV具有高度變異性免疫逃逸機(jī)制，更為有效應(yīng)對(duì)機(jī) 體免疫抑制壓力，提供可令人信服的，足夠充分的相關(guān)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn) 科學(xué)依據(jù)。通過"HIV-Erw基因DNA，重組包膜蛋白抗原免疫應(yīng)答抗 HIV實(shí)驗(yàn)"，證實(shí)HIV感染人體，通過包膜蛋白gp120^人CD4受體 的異種特異配體抗原L與人CD4+T淋巴細(xì)胞受體特異結(jié)合，觸發(fā)HIV 感染者人體免疫耐受機(jī)制，能夠比HIV具有高度變異性免疫逃逸機(jī)制， 更為有效應(yīng)對(duì)機(jī)體免疫抑制壓力，提供足夠充分的直接動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn) 科學(xué)依據(jù)、直接臨床人體實(shí)驗(yàn)科學(xué)依據(jù)。但是它將會(huì)不幸的證實(shí)，HIV 疫苗科學(xué)研究設(shè)計(jì)、研制的，所有各種不同HIV包膜蛋白gpl20、 gpl60 抗原疫苗臨床人體試驗(yàn)不能預(yù)防HIV感染人類，最重要的因素是 gpl20、 gpl60是人CD4受體的異種特異配體抗原，與人CD4+細(xì)胞特異 受體特異結(jié)合，觸發(fā)HIV人體免疫耐受機(jī)制，不能激發(fā)有效根除HIV 的免疫應(yīng)答機(jī)制。世界HIV疫苗科學(xué)研究在過去20多年里，關(guān)于是先 加強(qiáng)基礎(chǔ)研究，搞清HIV致病機(jī)制和免疫機(jī)制，還是盡快開始人體試 驗(yàn)，在試驗(yàn)中積累知識(shí)，以便改進(jìn)疫苗設(shè)計(jì)和工藝技術(shù)，各國(guó)專家的 意見趨于一致，錯(cuò)誤的主張采取后者；在沒有尋找到能夠解決HIV包 膜蛋白gpl20觸發(fā)人體免疫耐受機(jī)制問題的方法前，現(xiàn)有的疫苗科學(xué)
研究思維、科學(xué)研究方法，不能研制出可能會(huì)有效預(yù)防HIV感染人類 的HIV疫苗，是客觀存在的必然科學(xué)現(xiàn)實(shí)。是被HIV科學(xué)界疏漏的， 極重要的科學(xué)研究"盲區(qū)"。因此，在沒有揭示HIV感染通過gpl20與 人CD4+細(xì)胞特異受體特異結(jié)合，觸發(fā)人體免疫耐受機(jī)制，尋找到能夠 解決它觸發(fā)免疫耐受機(jī)制問題的方法前，沒有科學(xué)研究跡象表明HIV 疫苗可能會(huì)有效預(yù)防HIV感染人類。
發(fā)明者認(rèn)為HIV感染人體，通過包膜蛋白gp120——人CD4受體 的異種特異配體抗原，與人CD4+細(xì)胞特異受體特異結(jié)合，觸發(fā)HIV感 染者人體免疫耐受機(jī)制，導(dǎo)致感染機(jī)體免疫系統(tǒng)針對(duì)HIV感染體液免 疫應(yīng)答反應(yīng)延遲，不能首先產(chǎn)生針對(duì)gpl20的保護(hù)性中和抗體、抑制 gpl20與CD4+細(xì)胞特異受體特異結(jié)合觸發(fā)的免疫耐受機(jī)制；使HIV可以 在人體免疫應(yīng)答產(chǎn)生針對(duì)gpl20的保護(hù)性中和抗體之前，還沒有被細(xì) 胞免疫CTL有效抑制時(shí)、過度復(fù)制達(dá)到病毒血癥峰值，進(jìn)一步觸發(fā)細(xì) 胞免疫耐受機(jī)制-細(xì)胞免疫損傷機(jī)制;誘導(dǎo)抑制性T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)"感 染性免疫耐受"，由HIV過度復(fù)制表達(dá)所編碼的超抗原，能夠與某些 特定的T淋巴細(xì)胞受體Ve克隆反應(yīng)，導(dǎo)致某些特定的T淋巴細(xì)胞受體 Ve克隆損傷、漸至枯竭，從而使T細(xì)胞Ve庫(kù)不可被再生恢復(fù)；因而確 實(shí)存在HIV感染者免疫系統(tǒng)損傷的閾值，若超過該閾值，HIV感染者的 免疫功能便不可被恢復(fù)重建。因而發(fā)明者認(rèn)為HIV感染者急性期達(dá)到 病毒血癥峰值期，可能是使T淋巴細(xì)胞受體Ve克隆損傷、轉(zhuǎn)向漸至枯 竭不可被重建損傷，至無癥狀期達(dá)到免疫系統(tǒng)損傷不可被重建的閾值。 因而發(fā)明者認(rèn)為在HIV感染者急性期、至達(dá)到免疫系統(tǒng)損傷不可被 重建的閾值之前，可能會(huì)存在一個(gè)可以被抗HIV藥有效根治、能夠重
建HIV感染者受損免疫系統(tǒng)的，很暫短的抗HIV藥有效根治早期HIV 感染者的"窗口期"。是被HIV科學(xué)研究疏漏的，極重要的科學(xué)研究 "盲區(qū)"。
"HIV-Erw基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白抗原免疫應(yīng)答抗HIV實(shí)驗(yàn)" 方法，能夠揭示上述被HIV科學(xué)研究疏漏的，極重要的科學(xué)研究"盲 區(qū)"；尋找到能夠解決HIV包膜蛋白gpl20觸發(fā)人體免疫耐受機(jī)制的方 法，研制不觸發(fā)人體免疫耐受機(jī)制的，HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜 蛋白抗原——抗HIV治療疫苗——抗HIV預(yù)防疫苗，提供足夠充分的 直接動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)科學(xué)依據(jù)、直接臨床人體實(shí)驗(yàn)科學(xué)依據(jù)。可行性科 學(xué)分析理論、方法依據(jù)是HIV相關(guān)生物學(xué)科不需要科學(xué)論證的基本 科學(xué)常識(shí)，與相關(guān)實(shí)用科學(xué)技術(shù)；不存在不可實(shí)施的現(xiàn)代生物科學(xué)的， 應(yīng)用科學(xué)理論疑點(diǎn)、應(yīng)用科學(xué)技術(shù)難點(diǎn)。
將可以在HIV科學(xué)研究理論、科學(xué)認(rèn)識(shí)思維、方法論、方法方面
取得科學(xué)突破。
權(quán)利要求
1. 一種HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白抗原免疫應(yīng)答抗HIV實(shí)驗(yàn)與方法，其特征在于應(yīng)用HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白抗原(1)免疫接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(2)、采血檢測(cè)免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(2)針對(duì)HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白抗原(1)的血清(3)抗體(4)的滴度(5)。
2. —種HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白抗原免疫應(yīng)答抗HIV 實(shí)驗(yàn)與方法，其特征在于應(yīng)用HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白抗 原(1)免疫接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(2)，采血檢測(cè)免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(2)針對(duì)HIV-Env 基因認(rèn)A變構(gòu)重組包膜蛋白抗原(1)的血清(3)抗體(4)的滴度(5)， 應(yīng)用免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(2)的血清(3)培養(yǎng)液(6)感染CD4+細(xì)胞的HIV-I毒株(7)、體外培養(yǎng)CD4+細(xì)胞(8)，檢測(cè)免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(2)的血清(3) 抗體(4)抑制HIV-I毒株(7)感染培養(yǎng)CD4+細(xì)胞(8)的能力。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l、 2中所述的HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋 白抗原免疫應(yīng)答抗HIV實(shí)驗(yàn)與方法，其特征在于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(2)是小鼠(9)0
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、 2中所述的HIV-Erw基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋 白抗原免疫應(yīng)答抗HIV實(shí)驗(yàn)與方法，其特征在于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(2)是非人 類的靈長(zhǎng)類動(dòng)物(10)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l、 2中所述的HIV-Erw基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋 白抗原免疫應(yīng)答抗HIV實(shí)驗(yàn)與方法，其特征在于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(2)是臨床 試驗(yàn)人體(11)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中所述的HIV-Erw基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋 白抗原免疫應(yīng)答抗HIV實(shí)驗(yàn)與方法，其特征在于HIV-Erw基因DNA變構(gòu) 重組包膜蛋白抗原(1)是HIV-I-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白gpl20 抗原(12)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中所述的HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋 白抗原免疫應(yīng)答抗HIV實(shí)驗(yàn)與方法，其特征在于HIV-Env基因DNA變構(gòu) 重組包膜蛋白抗原(1)是HIV- I -Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白gpl60 抗原(13)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2至7中所述的HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋 白抗原免疫應(yīng)答抗HIV實(shí)驗(yàn)與方法，其特征在于培養(yǎng)CD4+細(xì)胞(8)是 傳代人CD4+細(xì)胞系(14)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2至7中所述的HIV-Erw基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋 白抗原免疫應(yīng)答抗HIV實(shí)驗(yàn)與方法，其特征在于培養(yǎng)CD4+細(xì)胞(8)是 人PBMC細(xì)胞(15)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求2至9中所述的HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜 蛋白抗原免疫應(yīng)答抗HIV實(shí)驗(yàn)與方法，其特征在于感染CD4+細(xì)胞的HIV-I毒株(7)是實(shí)驗(yàn)室HIV-I毒株(16)。
11. 根據(jù)權(quán)利要求2至9中所述的HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜 蛋白抗原免疫應(yīng)答抗HIV實(shí)驗(yàn)與方法，其特征在于感染CD4+細(xì)胞的HIV-I毒株(7)是取自HIV-I感染者血液成分(17)的HIV-I毒株(7)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的HIV-Erw基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白 抗原免疫應(yīng)答抗HIV實(shí)驗(yàn)與方法，其特征在于HIV-Erw基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白抗原(1)是模擬實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的異種動(dòng)物的單克隆抗體(18)。
全文摘要
本發(fā)明為HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白抗原免疫應(yīng)答抗HIV實(shí)驗(yàn)與方法。它涉及生命科學(xué)領(lǐng)域、及醫(yī)藥領(lǐng)域。證實(shí)HIV包膜蛋白gp120、gp160抗原疫苗臨床人體試驗(yàn)，不能證實(shí)可以預(yù)防HIV感染人類，最重要的因素是HIV包膜蛋白gp120、gp160是人CD4受體的異種特異配體，與人CD4⁺細(xì)胞特異受體特異結(jié)合，觸發(fā)人體免疫耐受機(jī)制，不能激發(fā)有效根除HIV的免疫應(yīng)答機(jī)制。尋找解決觸發(fā)人體免疫耐受機(jī)制的方法，研制不觸發(fā)人體免疫耐受機(jī)制的，HIV-Env基因DNA變構(gòu)重組包膜蛋白抗原抗HIV治療疫苗、抗HIV預(yù)防疫苗，提供足夠充分的直接動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)科學(xué)依據(jù)、直接臨床人體實(shí)驗(yàn)科學(xué)依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101210919SQ20061017047
公開日2008年7月2日 申請(qǐng)日期2006年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月30日
發(fā)明者葉新新 申請(qǐng)人:葉新新