專利名稱：基因群檢測結(jié)構(gòu)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種基因群檢測結(jié)構(gòu)，尤指涉及一種結(jié)構(gòu)可改進原尼龍膜片操作平臺的缺點，特別是指建立全新低成本的WEnCA (Weighted Enzymatic Chip Array)操作平臺，可輔以自動化操作使檢測時間大幅降低，并減少人為操作誤差，以達突破芯片檢測技術(shù)在商品化過程所面臨的瓶頸。
背景技術(shù)：
對基因過渡表現(xiàn)(Overexpression)的分析已經(jīng)導致疾病診斷之基本進步與臨床進展。而研究基因過渡表現(xiàn)的技術(shù)包含有北方墨點法(Northern Blot)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈鎖 JxjSCReverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)R^^^mMn-M 鏈鎖反應(yīng)(Real-Time PCR)。其中Northern Blot由于操作步驟十分敏瑣，所需檢體量又過多，因此僅限于研究操作上，無法實際應(yīng)用于臨床診斷。至于RT-PCR及Real-Time PCR由于操作步驟簡便，因此在單一基因檢測的應(yīng)用上，使用相當廣泛，例如肝炎病毒的檢測及感染癥病原菌的鑒定。然而，雖然PCR序列的發(fā)明系作為整體最偉大的實驗，但多數(shù)PCR技術(shù)仍保有特定的共同問題，其主要問題包含有其一是污染，過渡靈敏偵察的偽陽性，例如霧式的DNA或先前的樣品殘余；其二是RT-PCR僅被認為半定量，因為當比較不同的樣品時，難以控制序列放大的效率；以及其三是由于所需引子(Primer)間黏合(Armearling)的干擾， 無論RT-PCR或Real-Time PCR都僅廣泛應(yīng)用于單一基因標的的檢測，當檢測標的為基因群時，則PCR相關(guān)的技術(shù)則有操作耗時、費事及高成本等缺點。隨著近幾年來生物科技的快速發(fā)展，生物芯片于臨床醫(yī)學診斷或藥效評估上的應(yīng)用逐漸被重視，本案的先前研究已開發(fā)并且評估一尼龍膜芯片(Membrane Array)方法，能使用于癌癥診斷，在血液檢體(Peripheral Blood)中同時查出一多種mRNA標記引物的表達水平。其分子標志的表達水平由RT-PCR與尼龍膜芯片評估，數(shù)據(jù)從RT-PCR 與尼龍膜芯片取得，且受制于線性回歸分析，顯示在這兩個方法結(jié)果之間的高度相互關(guān)系(r=0.979，P<0.0001)。另外，以相關(guān)衍生技術(shù)的加權(quán)化學冷光型基因芯片(Weighted Chemiluminescent Membrane Array, WCHMA) M 月市I (Lung Cancer)
析標的治療藥物(Target Therapeutic Drug)的作用標的K-ras之異常情形，也已被接受刊登于肺癌期刊中。雖然尼龍膜芯片于分子診斷及藥效評估上的應(yīng)用已有許多報告提出，然而，由于原始尼龍膜芯片所使用判讀方法上，對于每一基因在特定疾病的重要性皆等值的概念下， 造成檢測特異性在達到一定程度之后便不易提升。另外，由于呈色型芯片(Colorimetric Biochip)操作平臺所需使用的洋地黃毒(Digoxigenin)系統(tǒng)成本十分昂貴，導致檢測成本過高，再加上芯片操作的高技術(shù)門坎，使得即使目前已經(jīng)發(fā)展及評估成熟的診斷芯片仍不易普及于臨床醫(yī)學應(yīng)用。故，一般習用者無法符合使用者于實際使用時所需。
發(fā)明內(nèi)容[0005]本實用新型所要解決的技術(shù)問題是克服已知技術(shù)所遭遇的上述問題，并提供一種基因群檢測結(jié)構(gòu)，一種快速、精確、靈敏、低成本、大量分析且易于結(jié)合自動化的 WEnCA-Chipball 操作平臺。為了解決上述技術(shù)問題，本實用新型所采用的技術(shù)方案是一種基因群檢測結(jié)構(gòu)， 其特點是包括機殼，其活動收容有第一承載部、第二承載部及第三承載部；基因檢測芯片，設(shè)于第一承載部中；檢體前處理單元，設(shè)于第二承載部中；雜合反應(yīng)區(qū)，設(shè)于第三承載部中；芯片呈色單元，設(shè)于機殼中；及分析判讀單元，設(shè)于機殼的一面上。于本實用新型的一實施例中，所述機殼中設(shè)有與第一、二及第三承載部連接的感應(yīng)馬達。于本實用新型的一實施例中，該基因檢測芯片選定一與癌癥相關(guān)的標的基因群， 將包含多種目標基因的標的基因群與一內(nèi)部對照組(Internal Control)及一空白對照組 (Blank Control)三重復(fù)點陣于一尼龍膜片上，形成在該基因檢測芯片上被覆有標定特定序列，且該基因檢測芯片為具有建構(gòu)完整疾病診斷、藥效評估或遺傳性致病基因的篩檢芯片。于本實用新型的一實施例中，該標的基因群給予的個別加權(quán)分數(shù)分為四個等級， 當基因點在80個以上的癌組織中呈現(xiàn)過渡表現(xiàn)，加權(quán)值為4 ；當基因點在70 80個癌組織中呈現(xiàn)過渡表現(xiàn)，加權(quán)值為3 ；當基因點在60 70個癌組織中呈現(xiàn)過渡表現(xiàn)，加權(quán)值為 2 ；以及當基因點在50 60個癌組織中呈現(xiàn)過渡表現(xiàn)，加權(quán)值為1。于本實用新型的一實施例中，該標的基因群為ATP2A2、ATP6V0B、CXCR4、CYR61、 RAPIB、RPL30、BMPR2、CALM2、DVL3、E2F4、SLC25A5、SPP1、CEBPB、CLSTNl、ETS1、H2AFZ、TAF12、 TBX19、C0L4A1、CXCL11、L1CAM&LRP1。于本實用新型的一實施例中，該內(nèi)部對照組為0-肌動蛋白(0-%^11)。于本實用新型的一實施例中，該檢體前處理單元以磁珠純化得檢體中的mRNAdf 此mRNA經(jīng)由反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，再以酵素標定成探針(Probe )。于本實用新型的一實施例中，該檢體可為血液、體液、細胞培養(yǎng)及組織細胞。于本實用新型的一實施例中，該雜合反應(yīng)區(qū)用以將該探針與該基因檢測芯片進行雜合(Hybridization)反應(yīng)。于本實用新型的一實施例中，該芯片呈色單元系用以將該基因檢測芯片上雜合后的探針加上二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)呈色劑進行呈色反應(yīng)(Color Development)。于本實用新型的一實施例中，該分析判讀單元內(nèi)建有分析軟件與影像擷取模式及數(shù)據(jù)傳輸模式，用以擷取該基因檢測芯片呈色反應(yīng)后的影像，并對呈色反應(yīng)后的影像結(jié)果進行自動化分析，將分析后所得的偵測值以基因加權(quán)計算方式，依據(jù)每個基因?qū)τ诩膊⌒纬苫蚩顾幮园l(fā)生的重要性給予個別加權(quán)分數(shù)，再經(jīng)由陽性反應(yīng)基因點乘上基因點之加權(quán)值而得到芯片的總分(Total kore)。于本實用新型的一實施例中，該分析判讀單元系以接受者操作特性曲線 (Receiver Operating Characteristic Curve, ROC Curve)方式算出該基因檢測芯片的陽性判讀標準值(Positive cutoff value)。于本實用新型的一實施例中，該陽性判讀標準值為20士20%。[0019]于本實用新型的一實施例中，該基因群檢測結(jié)構(gòu)的檢測極限值(Detection Limitation)為 2. 4cell/C. C Blood士20%。如此，本結(jié)構(gòu)可提供快速、精確、靈敏、低成本、大量分析且易于結(jié)合自動化的 WEnCA-Chipball操作平臺；不需大型離心機而易于在各個實驗自動化操作；該結(jié)構(gòu)采用包含Poly-T引子的磁珠以利萃取的mRNA純度更高，使反應(yīng)后的芯片背景值降低而準確度高; 以生物素-抗生物素蛋白(Biotin-Avidin)取代Digoxigenin，不僅使用的酵素成本低，且以二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)作為呈色劑的穩(wěn)定度亦高，使顏色容易保存；該結(jié)構(gòu)以基因加權(quán)計算值的決定方式，配合ROC Curve決定陽性判讀標準，并經(jīng)臨床測試結(jié)果顯示的準確度系能更準確地輔助疾病診斷。


圖1是本實用新型的立體外觀示意圖。圖2是本實用新型的分解示意圖。圖3是本實用新型的基因群檢測結(jié)構(gòu)示意圖。圖4是本實用新型的基因檢測芯片的基因位置排列示意圖。圖5A是本實用新型的標的基因群在癌組織中過渡表現(xiàn)的比例示意圖。圖5B是本實用新型的接受者操作特性曲線示意圖。圖6是本實用新型的癌癥組織反應(yīng)后的芯片影像示意圖。圖7是本實用新型的檢測極限值的判讀結(jié)果示意圖。圖8是本實用新型的線性回歸統(tǒng)計分析示意圖。標號說明基因群檢測結(jié)構(gòu)100基因檢測芯片10檢體前處理單元20雜合反應(yīng)區(qū)30芯片呈色單元40分析判讀單元50接受者操作特性曲線6機殼60第一承載部601第二承載部602第三承載部603感應(yīng)馬達60具體實施方式
請參閱圖1至圖4所示，分別為本實用新型的立體外觀示意圖、本實用新型的分解示意圖、本實用新型的基因群檢測結(jié)構(gòu)示意圖及本實用新型的基因檢測芯片的基因位置排列示意圖。如圖所示本實用新型的基因群檢測結(jié)構(gòu)(WEnCA-ChipkilDlOO，至少包括機殼 60、基因檢測芯片10、檢體前處理單元20、雜合反應(yīng)區(qū)30、芯片呈色單元40及分析判讀單元 50所構(gòu)成。上述所提的機殼60活動收容有第一承載部601、第二承載部602及第三承載部 603，而該機殼60中可設(shè)有與第一、二及第三承載部601、602、603連接的感應(yīng)馬達604，使用者除可以手動方式啟、閉第一、二及第三承載部601、602、603之外，亦可以感應(yīng)馬達604的配合自動啟、閉第一、二及第三承載部601、602、603。上述所提的基因檢測芯片10設(shè)于第一承載部601中，其上被覆有標定特定序列， 為具有建構(gòu)完整疾病診斷、藥效評估或遺傳性致病基因的篩檢芯片。該檢體前處理單元20設(shè)于第二承載部602中，系將檢體加入裂解緩沖液打破細胞，萃取得mRNA，經(jīng)由加入磁珠(Magneti c Part i c 1 es )與細胞內(nèi)的RNA結(jié)合，將磁珠上的核酸與裂解緩沖液沖洗分離，繼而洗提(Elute)出磁珠上的mRNA，并將此純化而得的mRNA經(jīng)由反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，再以酵素標定成探針(Probe)，其中，該檢體可為血液、體液、細胞培養(yǎng)及組織細胞等。該雜合反應(yīng)區(qū)30設(shè)于第三承載部603中，系用以將該探針與該基因檢測芯片10 進行雜合(Hybridization)反應(yīng)，并將未反應(yīng)的探針由芯片上洗凈。該芯片呈色單元40設(shè)于機殼60中，用以將該基因檢測芯片10上雜合后的探針加上二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine, DAB)呈色劑進行呈色反應(yīng)(Color Development)。該分析判讀單元50設(shè)于機殼60的一面上，其內(nèi)建有分析軟件與影像擷取模式及數(shù)據(jù)傳輸模式，用以影像擷取模式擷取該基因檢測芯片10呈色反應(yīng)后的影像，并對呈色反應(yīng)后的影像結(jié)果以分析軟件進行自動化分析，將分析后所得的偵測值以基因加權(quán)計算方式，依據(jù)每個基因?qū)τ诩膊⌒纬苫蚩顾幮园l(fā)生的重要性給予個別加權(quán)分數(shù)，經(jīng)由陽性反應(yīng)基因點乘上基因點的加權(quán)值而得到芯片的總分(Total Score)。以上所述，構(gòu)成一全新的基因群檢測結(jié)構(gòu)100。本發(fā)明主要是針對原尼龍膜片操作平臺的缺點，設(shè)計改進策略，例如在判讀時，針對芯片上每一標的基因不同的重要性給予不同程度的加權(quán)(Lung Cancer Ref )，另以生物素-抗生物素蛋白(Biotin-Avidin)呈色系統(tǒng)取代原洋地黃毒(Digoxigenin)系統(tǒng)，建立全新的TOnCA (Weighted Enzymatic Chip Array)操作平臺，另由于此結(jié)構(gòu)易于結(jié)合流體控制平臺，以自動化操作系統(tǒng)進行，使得檢測時間大幅度降低，并減少人為操作差異所產(chǎn)生的誤差，進而突破芯片檢測技術(shù)在商品化過程所面臨的瓶頸。為進一步了解基因群檢測結(jié)構(gòu)于臨床醫(yī)學檢測上的實用性，本實用新型于一較佳實施例中，系取得100個臨床病理科確認為大腸直腸癌(Colorectal Cancer, CRC)患者的血液檢體，以先前建構(gòu)的活化K-ras致癌基因檢測芯片(Activated K-ras Detection Chip) 10分別利用尼龍膜片及本結(jié)構(gòu)100 (即TOnCA-Chiphl 1)檢測檢體中K_ras路徑相關(guān)基因(K_ras Pathway Related Genes)過渡表現(xiàn)(Overexpression)的個青形，并比較靈敏度(Sensitivity)、特異性(Specificity)及準確性(Accuracy)的差異，且分析本結(jié)構(gòu)100 與原尼龍膜片操作的檢測平臺于臨床應(yīng)用時，操作時間與所需成本的不同，以更確立本結(jié)構(gòu)100于臨床應(yīng)用的發(fā)展?jié)摿?。上述建?gòu)的活化K-ras致癌基因檢測芯片10，如圖4所示，系選定與大腸直腸癌相關(guān)的標的基因群，將包含22種目標基因的標的基因群與一內(nèi)部對照組(Internal Control)及一空白對照組(Blank Control)三重復(fù)點陣于一尼龍膜片上，其中，該標的基因群為 ATP2A2、ATP6V0B、CXCR4、CYR61、RAP1B、RPL30、BMPR2、CALM2, DVL3, E2F4, SLC25A5、 SPP1、CEBPB、CLSTNl、ETS1、H2AFZ、TAF12、TBX19、C0L4A1、CXCL11、L1 CAM 及 LRP1，且該內(nèi)部對照組為β -肌動蛋白(β -actin)。請參閱圖5A及圖5B所示，分別為本實用新型的標的基因群在癌組織中過渡表現(xiàn)的比例示意圖、及本實用新型的接受者操作特性曲線示意圖。如圖所示在加權(quán)冷光芯片反應(yīng)的分析上，本實用新型首先整理芯片上22個基因點分別在100個具活化型K-ras突變的癌癥組織(cancer tissue)中過渡表現(xiàn)的比例，并將之分為四個等級，如圖5A所示，基因點在80個以上的癌組織中呈現(xiàn)過渡表現(xiàn)，加權(quán)值為4 ；在70 80個癌組織中呈現(xiàn)過渡表現(xiàn)，加權(quán)值為3 ；過渡表現(xiàn)僅在60 70個癌組織中存在的基因點，加權(quán)值為2 ；若僅能50 60個癌組織中測得過渡表現(xiàn)的基因點，加權(quán)值為1。經(jīng)由兩組各100個反應(yīng)后芯片上陽性反應(yīng)的基因數(shù)，乘上加權(quán)值之后，先計算出每一反應(yīng)后的芯片的總分，而后同樣以組織是否實際具有可測得的突變點作為標準參考值。經(jīng)由生物統(tǒng)計學分析畫出接受者操作特性曲線 (Receiver Operating Characteristic Curve, ROC Curve)6，如圖 5B所示，可看出當判斷此芯片陽性反應(yīng)的基準值(Cutoff Value)定為20時，此芯片在組織中的檢測結(jié)果，其靈敏度可達96%，特異性亦可達97%。請參閱圖6所示，為本實用新型癌癥組織反應(yīng)后的芯片影像示意圖。如圖所示 為上述癌癥組織反應(yīng)后的芯片影像圖，依帶有K-ras基因突變的癌癥組織(cancer tissue with K-ras mutation),以CAKM稱之；以及依帶有原生型K_ras基因的癌癥組織(cancer tissue with wild type K_ras)以CAKWT稱之。其中CAKM-1及CAKM-2反應(yīng)后的總分分別為36及32，皆>20，因此芯片反應(yīng)結(jié)果為陽性(Positive);CAKWT-l及CAKWT-2反應(yīng)后的總分分別為8及6，皆<20，因此芯片反應(yīng)結(jié)果為陰性(Negative)。請參閱圖7所示，為本實用新型檢測極限值的判讀結(jié)果示意圖。如圖所示在本實用新型基因群檢測結(jié)構(gòu)的檢測極限值(Detection Limitation)的實驗結(jié)果判讀上，由圖中可見當5C. C全血分別加入100、50、25及12個具活化突變K-ras基因(activated mutant K-ras)的癌細胞所得的總分都大于20，僅在加入的細胞數(shù)為6時，總分等于8，小于20，因此檢測極限值約2. 4cell/C. C Blood，遠較呈色型芯片所測得的5cell/C. C Blood更為靈敏。請參閱圖8所示，為本實用新型線性回歸統(tǒng)計分析示意圖。如圖所示系本實用新型進一步分析上述兩種方法(即本實用新型與已知技術(shù))所得結(jié)果的一致性，經(jīng)線性回歸統(tǒng)計分析后可見，r值為0. 86，有統(tǒng)計學上顯著的一致性呈現(xiàn)，可見本實用新型相較已知技術(shù)明顯具有較高的靈敏度及較佳的準確度。據(jù)此，本實用新型揭露可提供一快速、精確、靈敏、低成本、大量分析且易于結(jié)合自動化的WEnCA-Chipkill操作平臺，可進行快速生物檢體檢測分析，完成傳統(tǒng)生醫(yī)檢測上所無法達成的目標。由于本實用新型不需大型離心機，因此易于在各個實驗操作，并易于自動化，且采用包含Poly-T引子的磁珠以利萃取的mRNA純度更高，使反應(yīng)后的芯片背景值降低，準確度高。此外，本實用新型以Biotin-Avidin取代Digoxigenin，不僅使用的酵素成本低，且以DAB作為呈色劑的穩(wěn)定度亦高，顏色容易保存；再者，本實用新型亦在最后的結(jié)果判讀上以基因加權(quán)計算值的決定方式，配合ROC Curve決定陽性判讀標準，經(jīng)上述臨床測試結(jié)果顯示本結(jié)構(gòu)的準確度能更準確地輔助疾病的診斷。因此本實用新型可于臨床上提高診斷靈敏性、特異性及準確性的同時，加上若結(jié)合自動化操作系統(tǒng)更可使檢測時間大幅降低， 并減少人為操作誤差，以達突破芯片檢測技術(shù)在商品化過程所面臨的瓶頸。綜上所述，本實用新型的基因群檢測結(jié)構(gòu)，可有效改善現(xiàn)有技術(shù)的種種缺點，可提供一快速、精確、靈敏、低成本、大量分析且易于自動化的WEnCA-Chipkill操作平臺，可進行快速生物檢體檢測分析，完成傳統(tǒng)生醫(yī)檢測上所無法達成的目標。
權(quán)利要求1.一種基因群檢測結(jié)構(gòu)，其特征在于包括機殼，其活動收容有第一承載部、第二承載部及第三承載部； 基因檢測芯片，設(shè)于第一承載部中； 檢體前處理單元，設(shè)于第二承載部中； 雜合反應(yīng)區(qū)，設(shè)于第三承載部中； 芯片呈色單元，設(shè)于機殼中；及分析判讀單元，設(shè)于機殼的一面上。
2.如權(quán)利要求1所述的基因群檢測結(jié)構(gòu)，其特征在于所述機殼中設(shè)有與第一、二及第三承載部連接的感應(yīng)馬達。
專利摘要一種基因群檢測結(jié)構(gòu)，至少包括活動收容有第一、二及第三承載部的機殼；一設(shè)于第一承載部中的基因檢測芯片；一設(shè)于第二承載部中的檢體前處理單元；一設(shè)于第三承載部中的雜合反應(yīng)區(qū)；一設(shè)于機殼中的芯片呈色單元；以及一設(shè)于機殼一面上的分析判讀單元。藉此，可提供一快速、精確、靈敏、低成本、大量分析且易于結(jié)合自動化的WEnCA-Chipball操作平臺，可進行快速生物檢體檢測分析，完成傳統(tǒng)生醫(yī)檢測上所無法達成的目標。
文檔編號C12M1/34GK202022938SQ20112014304
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月9日
發(fā)明者張惠人, 曹德安, 林繡茹 申請人:輔英科技大學附設(shè)醫(yī)院